用多孔膜处理的无病毒血浆蛋白组合物及其生产方法

摘要

利用孔径大小大于单个病毒颗粒直径的多孔膜处理有病毒污染危险的血浆蛋白组合物，特别地，在用多孔膜处理前先将该血浆蛋白组合物通过沉淀进行分级分离，可有效除去污染病毒，而几乎不丢失蛋白活性。特别地，可因此提供没有无包膜病毒，所有细小病毒的血纤蛋白原组合物。因此，可方便地提供无任何病毒的安全的血浆蛋白制剂。

说明书

                       技术领域

本发明涉及一种在血浆蛋白组合物中生产无病毒，特别是无感染性病毒的血浆蛋白组合物的方法，由本方法获得的实质上是无病毒的，特别是无感染性病毒的血浆蛋白组合物，实质上是没有无包膜病毒的，特别是无细小病毒和/或甲型肝炎病毒的血纤蛋白原组合物；并涉及一种在血浆蛋白组合物中除去病毒的方法。

                       背景技术

蛋白制剂，特别是以人血浆作为起始材料的血浆分级分离制剂有可能被对人有感染能力的病原体污染，因此病毒感染问题特别重要。到目前为止，我们已经有由于输血而被人免疫缺陷病毒(HIV)，甲型肝炎病毒(HAV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)及相似的病毒感染的事故。

在过去这些不是事故。尽管在引进大量的技术后，事故的频率成指数显著下降，但即便到目前为止，这种事故的发生仍没有被完全阻止。

已知有多种方法通过灭活或除去可能的污染病毒来阻止这些病毒的增殖。已知例如，在液态下加热含蛋白组合物的方法(JP-A-55-145615，JP-A-56-139422，JP-A-56-106594等)，在干燥状态下加热的方法(P CT公开日本专利申请kohyo No 58-500548，JP-A-213721等)，包括与三烷基磷酸盐和/或表面活性剂等接触的方法(JP-A-60-51116等)，包括紫外线照射的方法(JP-A-7-196531等)，包括病毒清除膜的方法(JP-A-9-100239等)，以及相似方法。

然而，每一种单独的灭活或除去病毒的处理，在完全灭活或除去污染病毒而不丢失蛋白活性方面均存在困难，因为热处理会遗漏下高度耐热的病毒，表面活性剂处理会遗漏下无包膜病毒，而只进行紫外线照射处理可能使蛋白失活等等。

因此，目前将上述灭活或除去污染病毒的方法适当联合使用，以达到此目标。

血纤蛋白原是在乙醇血浆分级分离时首先沉淀的级分中获得的。因此，一旦病毒侵染血浆，它是容易被污染的。细小病毒B19(下文中为B19)在近来受到特别关注。该病毒是无包膜的，抗热，并有约18-25nm的极小的单-颗粒大小，由于这些性质，它的灭活/除去是需要的，而且在血浆分级分离制剂领域得到了特别的研究。

使用病毒清除膜的方法当然能够通过过滤除去分子大小大于孔大小的病毒，但当病毒大小小于孔大小时不起作用。另外，使用孔径太小的清除膜会使样品阻塞或产生相关问题，使过滤本身发生困难。另外，在膜处理过程中，相对于样品的量，较低的流速将导致很多问题，如有限的处理样品的量及更长的处理时间。

特别是，当使用目前可商品化获得的孔大小小于35nm的多孔膜进行血纤蛋白原的纯化时，由于血纤蛋白原的分子量及相关情况，实际上发生了上述阻塞，限制的样品的处理量和更长的处理时间的问题。因此，只能使用膜孔大小不小于35nm的多孔膜。如上所述，细小病毒(B19)的单-病毒颗粒大小约18-25nm。因此，该病毒仅通过使用Planova 35N或Planova 75N(均为商标，目前商品化获得的多孔膜，孔大小为35nm或75nm的，由Asahi Kasei公司制造)不能被除去，或甚至通过在多步使用这些病毒清除膜的方法中也不能被除去。

因此需要一种通过方便的处理方法能够提供更少的病毒-感染和安全的蛋白制剂的方法。

                        发明概述

本发明人进行了深入研究，试图解决这些问题，并发现多孔膜处理可以有效除去污染病毒，而且几乎没有丢失蛋白活性，这导致了本发明的完成。本发明人进一步发现多孔膜处理可以提供一种实际上没有无包膜病毒，特别是细小病毒和/或甲型肝炎病毒的血纤蛋白原，这导致了本发明的完成。

因此，本发明提供以下方法。

(1)一种无病毒的血浆蛋白组合物的生产方法，包括用孔大小大于病毒的单-颗粒大小的多孔膜处理血浆蛋白组合物。

(2)根据上述(1)中的生产方法，其中多孔膜是一种多孔的中空纤维膜。

(3)根据上述(1)或(2)中的生产方法，其中血浆蛋白组合物在多孔膜处理前，通过沉淀进行分级分离处理。

(4)根据上述(1)到(3)中的任何生产方法，其中血浆蛋白组合物在多孔膜处理前，通过沉淀进行分级分离处理，并且获得的沉淀用水进行萃取。

(5)根据上述(1)到(4)中的任何生产方法，其中血浆蛋白组合物包含至少一种选自纤连蛋白，血纤蛋白原，凝固因子V，凝固因子VIII，von Willebrand因子，凝固因子XIII，视黄醇结合蛋白，α-球蛋白，β-球蛋白和γ-球蛋白的蛋白。

(6)根据上述(5)中的生产方法，其中血浆蛋白组合物至少包含血纤蛋白原。

(7)根据上述(1)到(6)中任一的生产方法，其中病毒是一种无包膜病毒。

(8)根据上述(7)中的生产方法，其中无包膜病毒是细小病毒和/或甲型肝炎病毒。

(9)一种用孔大小大于该病毒的单-颗粒大小的多孔膜处理得到的实际上不含有病毒的血浆蛋白组合物。

(10)根据上述(9)中的血浆蛋白组合物，其中多孔膜是一种多孔的中空纤维膜。

(11)根据上述(9)或(10)中的血浆蛋白组合物，其中血浆蛋白组合物在多孔膜处理前，通过沉淀进行分级分离处理。

(12)根据上述(9)到(11)中任一的血浆蛋白组合物，其中血浆蛋白组合物在多孔膜处理前，通过沉淀进行分级分离处理，并且获得的沉淀用水进行萃取。

(13)根据上述(9)到(12)中任一的血浆蛋白组合物，其中血浆蛋白组合物包含至少一种选自纤连蛋白，血纤蛋白原，凝固因子V，凝固因子VIII，von Willebrand因子，凝固因子XIII，视黄醇结合蛋白，α-球蛋白，β-球蛋白和γ-球蛋白的蛋白。

(14)根据上述(13)中的血浆蛋白组合物，其中血浆蛋白组合物至少包含血纤蛋白原。

(15)根据上述(9)到(14)中的任一的血浆蛋白组合物，其中病毒是一种无包膜病毒。

(16)根据上述(15)中的血浆蛋白组合物，其中无包膜病毒是细小病毒和/或甲型肝炎病毒。

(17)血纤蛋白原组合物，实际上不含有细小病毒。

(18)一种在血浆蛋白组合物中除去病毒的方法，包括用孔大小大于病毒的单-颗粒大小的多孔膜处理血浆蛋白组合物。

(19)根据上述(18)中的方法，其中多孔膜是一种多孔的中空纤维膜。

(20)根据上述(18)或(19)中的方法，其中血浆蛋白组合物在多孔膜处理前，通过沉淀进行分级分离处理。

(21)根据上述(18)到(20)中的任何方法，其中血浆蛋白组合物在多孔膜处理前，通过沉淀进行分级分离处理，并且获得的沉淀用水进行萃取。

在本发明中，血浆蛋白组合物中的血浆蛋白没有被特别限定，可以是血液中含有的任何一种蛋白。例如，根据本发明中的方法，特别是能够实现预期效果的血浆蛋白具有高分子量，并具有高的被病毒污染的危险。其中的例子包括纤连蛋白，血纤蛋白原，凝固因子V，凝固因子VIII，von Willebrand因子，凝固因子XIII，视黄醇结合蛋白，α-球蛋白，β-球蛋白和γ-球蛋白等。特别是，由于血纤蛋白原是在醇血浆分级分离过程中首先沉淀的级分中获得的，所以当病毒混合在血浆中时，它是容易被病毒污染的。因此，本发明通过便利的方法对无包膜病毒的清除是十分有用的。

在本发明的方法中，接受处理的血浆蛋白组合物没有任何特别的限定，只要担心有病毒，特别是感染性病毒的污染，并且组合物可进行多孔膜处理。该组合物一般是液相的，如包含根据各种分级分离方法处理血浆或组织抽提物所获得级分的溶液，通过培养遗传重组的宿主或组织所获得的培养液，商品化获得的蛋白制剂等。

纯化水平没有特别限定，组合物可以是任何纯化水平的。纯化水平可以通过适当的选择和应用一般的纯化方法，如PEG(聚乙二醇)分级分离，乙醇分级分离，甘氨酸分级分离，凝胶过滤，离子交换层析，亲和层析，疏水层析等方法来完成。

沉淀方法包括那些本身已知的用作蛋白分级分离的方法的方法。其中的例子包括用中性盐的沉淀方法(使用该盐的沉淀方法是所谓的盐析法，使用硫酸盐，亚硫酸盐，硫代硫酸盐，磷酸盐，碱金属盐，氨水，镁，卤素化合物及相关物质)，水溶性有机溶剂(如乙醇，甲醇，乙基醚，丙酮等)，水溶性非离子多聚化合物(如聚乙二醇(PEG)，右旋糖苷，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，壬基酚乙氧基化物等)，金属离子(如硫酸钡，氢氧化铝等)，有机阳离子(雷佛奴尔(rivanol)，鱼精蛋白，其他阳离子表面活性剂等)，阴离子(例如，低分子量的阴离子如苦味酸，三氯乙酸，磺基水杨酸，高氯酸及相关物质，多聚阴离子如多聚丙烯酸，多聚苯乙烯磺酸酯，多聚磷酸盐及相关物质)，等等，通过除盐的沉淀方法(透析，稀释法等)，甘氨酸沉淀方法(甘氨酸-氯化钠沉淀方法)，等等方法。

本发明中使用的沉淀方法与通常蛋白质分级分离处理所用的方法相似，其中使用了相似的条件。在本发明的沉淀方法中所用的每种物质都可以根据被分离的目标蛋白的溶解度来确定为合适的。例如，可以使用可通过改变蛋白分子的表面电荷和疏水性来使目标蛋白成为沉淀的，或在上清中沉淀出不需要的蛋白而得到目标蛋白的，其中沉淀处理的条件根据各个蛋白来确定为合适的。因此，可根据目标蛋白确定对沉淀方法有影响的各种不同的因素，如氢离子浓度或pH值，离子强度，介电常数，温度，蛋白浓度，其它离子等等。其使用的条件也可以根据目标蛋白进行确定。

特别地，当蛋白是血纤蛋白原时，甘氨酸沉淀方法是优选的，并且甘氨酸-氯化钠沉淀方法是更优选的。甘氨酸的浓度不低于50g/L，优选地，不低于75g/L，并且氯化钠浓度是10g/L，优选的是不低于30g/L。对甘氨酸来说，上限是250g/L，优选的是225g/L，而对氯化钠来说，上限是175g/L，优选的是150g/L。

将通过上述沉淀方法分离的各个蛋白进行典型的离心处理和各种过滤步骤以得到所需的级分。

当目标蛋白作为沉淀被获得时，在随后的纯化中需要在合适的溶剂中进行萃取和溶解。溶剂没有任何特别限定，可以使用一般蛋白纯化中所用的溶剂，缓冲液等等。当蛋白是血纤蛋白原时，通常用柠檬酸盐缓冲液和水进行萃取和溶解。

特别地，在用水萃取后进行典型的离心或澄清过滤步骤，可以增强本发明所提供的效果。

在本发明中，多孔膜处理是指有病毒污染危险的血浆蛋白的过滤，其通过一个多孔膜来进行。

本发明中所用的多孔膜的材料没有特别的限定，可使用合成的多聚化合物，如再生纤维素，醋酸纤维素，聚偏氟乙烯，聚醚砜，聚丙烯腈，聚砜，聚甲基丙烯酸甲酯及相关材料。优选的是再生纤维素。

膜的形式可以是中空纤维，薄片或相似形式，中空纤维是优选的。例如，由再生纤维素制备的多孔中空纤维膜可通过微-相分离方法从纤维素的二价铜铵溶液中制备[Am.Chem.Soc.，9，197-228(1985)]。

尽管所用多孔膜的平均孔大小随蛋白的种类和要除去的病毒种类而改变，但是其一般为1-100nm，优选的为10-100nm。特别地，当从具有高分子量的蛋白，如血纤蛋白原及相关物质中除去细小病毒，HAV及相关病毒时，孔大小是35-100nm，优选为35-75nm。

当多孔膜是中空纤维时，组件(module)形式的膜是优选的。例如，许多多孔中空纤维膜平行成束，装在筒中，并且用粘合剂整合成组件。

可所用的商品化获得的膜包括Planova系列(商标，由Asahi Kasei公司制造)，它是具有多于100层周边壁的多层结构的膜，Viresolve系列(商标，由Millipore公司制造)，它是一种已知的病毒清除膜，Omega VR系列(商标，由Pall公司制造)，Ultipor系列(商标，由Pall公司制造)及相关的膜。特别优选的是Planova系列。

血浆蛋白组合物用多孔膜处理或者通过多孔膜过滤的温度是4-50℃，优选的是4-37℃。

过滤压是10-100kpa，优选的是10-90kpa。过滤方法包括交叉流过滤(循环方法)，其中溶液是在应变率下过滤的，及死端(dead-end)过滤(非循环方法)，其中溶液是在没有应变率下过滤的。优选的是用压缩空气等进行死端过滤。

在进行通过多孔膜的过滤中，离液序列高的离子或氨基酸可以加到样品中。这可以增强本发明中污染病毒可以通过多孔膜被有效除去，而几乎不损失蛋白的活性的效果的表达。

在这种情况下的离液序列高的离子或氨基酸的种类没有特别限定，可以使用一般用于蛋白纯化中的那些物质。特别地，氯离子，精氨酸及相关物质是优选的。

过滤处理可以进行一次或多次。重复的处理可以通过过滤提供一个更好的病毒除去的效果。

特别地，本发明中用孔大小大于病毒的单-颗粒大小的多孔膜处理血浆蛋白组合物，从而其中单-颗粒大小小于多孔膜的孔大小的病毒可以被除去。因此，可以获得实际上没有病毒的血浆蛋白组合物。

当病毒是单-颗粒时，“孔大小大于病毒的单-颗粒大小的多孔膜”是指允许病毒通过的多孔膜。

因此根据本发明，污染的病毒可以被有效除去，而且不丢失蛋白的活性，并且从而可以提供一种作为更安全的血浆蛋白制剂的起始材料的血浆蛋白组合物。

通过本发明中的方法所除去的病毒的具体实例包括痘苗病毒，腮腺炎病毒，单纯性疱疹病毒，ECHO病毒，细小病毒，HIV，HAV，HBV，HCV，TTV及相关病毒。特别地，与有污染的危险相关的无包膜的病毒的实例包括细小病毒，HAV及相关病毒。

这样所获得的血浆蛋白组合物可以直接使用，或者通过传统的蛋白纯化方法进行纯化，如PEG(聚乙二醇)分级分离，乙醇分级分离，甘氨酸分级分离，凝胶过滤，离子交换层析，亲和层析，疏水层析及相关方法来完成，并且可以用作血浆蛋白制剂。

血浆蛋白制剂通过传统的方法制成液体制剂或者干燥制剂，根据需要，它可以包括典型的药理学上可接受的药物活性剂的添加剂，如防腐剂，抗细菌制剂，螯合剂，增稠剂，等渗剂及相关试剂，或者制药所需的成分。

本发明中的生产方法可以生产一种实际上无病毒的血浆蛋白组合物。通常所用的病毒灭活或除去方法，如干燥加热法，液体加热法，表面活性剂处理，紫外线照射处理，病毒清除膜的处理及相关方法，可以在本发明的方法之前或之后适当联合使用，由此可使病毒的灭活或除去更加完全。

在本发明中，“实际上无病毒”是指在用已知的病毒检测方法进行检测时，低于检测极限。

                          实施例

通过下面的实验实施例，参照实施例等，对本发明进行更详细的解释，这些例子不能理解成是对本发明的范围的限定。实施例1

将来源于正常人血浆的Cohn’s Fr.I级分(100g)溶解到1.5L柠檬酸盐缓冲液中，并加入磷酸三-(正丁基)酯(TNBP)到0.3w/v％和加入Tween80到1w/v％。在30℃进行表面活性剂处理6小时。

在表面活性剂处理后，向样品中加入细小病毒(10^2.7拷贝/ml)作为监测病毒。

用15％甘氨酸-1M氯化钠对该样品通过沉淀进行分级分离处理，并且血纤蛋白原通过离心进行沉淀(4000rpm，20min)并进行回收。回收的血纤蛋白原溶解到1.0升柠檬酸盐缓冲液中，得到1.0％的溶液。该溶液作为在过滤前的一个样本，并测定其病毒的数量。

该溶液用Planova 75N(平均孔大小为72±4nm)在温度23℃，滤压10Kpa下进行死端过滤，以除去病毒。滤液作为过滤后的一个样本，并测定其病毒量。实施例2

将来源于正常人血浆的Cohn’s Fr.I级分(100g)溶解到1.5L柠檬酸盐缓冲液中，并加入磷酸三-(正丁基)酯(TNBP)到0.3w/v％和Tween 80到1w/v％。在30℃下进行表面活性剂处理6小时。

用15％甘氨酸-1M氯化钠对该样品通过沉淀进行分级分离，血纤蛋白原通过离心进行沉淀(4000rpm，20min)并进行回收。回收的血纤蛋白原溶解到1升柠檬酸盐缓冲液中，得到1.0％的溶液。

向该溶液中加入细小病毒(10^5.7拷贝/ml)作为监测病毒。

随后，用15％甘氨酸-1M氯化钠对该样品进行分级分离，血纤蛋白原通过离心进行沉淀(4000rpm，20min)并进行回收。回收的血纤蛋白原溶解到1升柠檬酸盐缓冲液中，得到1.0％的溶液。该溶液作为一个在过滤前的样本，并测定其病毒的数量。

获得的溶液用Planova 75N(平均孔大小为72±4nm)在温度23℃，滤压10Kpa下进行死端过滤，以除去病毒。该滤液作为一个过滤后的样本，并测定其病毒量。实施例3

将来源于正常人血浆的Cohn’s Fr.I级分(100g)溶解到1.5L生理盐水中，并加入磷酸三-(正丁基)酯(TNBP)到0.3w/v％和Tween 80到1w/v％。在30℃进行表面活性剂处理6小时。

在表面活性剂处理后，向样品中加入细小病毒作为监测病毒。

用15％甘氨酸-1M氯化钠沉淀对该样品进行分级分离，血纤蛋白原通过离心进行沉淀(4000rpm，20min)并进行回收。回收的血纤蛋白原溶解到1.0升柠檬酸盐缓冲液中，得到1.0％的溶液。该溶液作为一个在过滤前样本，并测定其病毒的数量。另外，该溶液作为一个在过滤前样本，在280nm测定其吸收值以得到其蛋白量。

将该溶液用Planova 75N(平均孔大小为72±4nm)，在温度23℃，滤压10Kpa下进行死端过滤，以除去病毒。滤液作为一个过滤后样本，并测定其病毒量。另外，在280nm测定其吸收值以得到该滤液的蛋白量。

将该滤液用Planova 35N(平均孔大小为35±2nm)，在温度23℃，滤压10Kpa下进行死端过滤，以除去病毒。滤液作为一个过滤后样本，并测定其病毒量。另外，在280nm测定其吸收值以得到该滤液的蛋白量。

在这种情况下，通过Planova 75N和Planova 35N联合过滤，在过滤前后表现的病毒清除效果不小于10⁶拷贝/ml。实施例4

将来源于正常人血浆的Cohn’s Fr.I级分(100g)溶解到1.5L生理盐水中，并加入磷酸三-(正丁基)酯(TNBP)到0.3w/v％和Tween 80到1w/v％。在30℃进行表面活性剂处理6小时。

在表面活性剂处理后，向样品中加入细小病毒(10^10.1拷贝/ml)作为监测病毒。

用8％甘氨酸-1M氯化钠对该样品通过沉淀进行分级分离，血纤蛋白原通过离心进行沉淀(4000rpm，20min)并进行回收。回收的血纤蛋白原溶解到1.5升注射用水中，得到血纤蛋白原溶液。通过离心处理除去该溶液中的不溶物质，并加入氯化钠(0.9g/l)。该溶液作为一个在过滤前样本。

将该溶液用Planova 35N(平均孔大小为35±2nm)，在温度23℃，滤压10Kpa下进行死端过滤，以除去病毒。滤液作为一个过滤后的样本，并测定其病毒量。

在这种情况下，通过甘氨酸-氯化钠分级分离，沉淀的水萃取，离心去除和Planova 35N联合处理，在过滤前后表现的病毒清除效果不小于10⁶拷贝/ml。实施例5

将来源于正常人血浆的Cohn’s Fr.I级分(100g)溶解到1.5L生理盐水中，并加入磷酸三-(正丁基)酯(TNBP)到0.3w/v％和Tween 80到1w/v％。在30℃进行表面活性剂处理6小时。

在表面活性剂处理后，向样品中加入EMC(10^8.4 TCID₅₀/ml)作为监测病毒。

用8％甘氨酸-1M氯化钠对该样品通过沉淀进行分级分离，血纤蛋白原通过离心进行沉淀(4000rpm，20min)并进行回收。回收的血纤蛋白原溶解到1.5升注射用水中，得到血纤蛋白原溶液。通过离心处理除去该溶液中的不溶物质，并加入氯化钠(0.9g/l)。该溶液在作为一个过滤前样本。

将该溶液用Planova 35N(平均孔大小为35±2nm)，在温度23℃，滤压10Kpa下进行死端(dead-end)过滤，以除去病毒。滤液作为一个过滤后的样本，并测定其病毒量。

在这种情况下，通过甘氨酸-氯化钠沉淀分级分离，沉淀的水萃取，离心去除和Planova 35N的联合处理，在过滤前后所示的病毒清除效果不小于10⁴ TCID₅₀/ml。参照实施例1

将来源于正常人血浆的Cohn’s Fr.I级分(100g)溶解到1.5L生理盐水中，并加入TNBP到0.3w/v％和Tween 80到1w/v％。在30℃下进行表面活性剂处理6小时。

用15％甘氨酸-1M氯化钠对该样品通过沉淀进行分级分离，血纤蛋白原进行沉淀和回收。回收的血纤蛋白原溶解到1.0升柠檬酸盐缓冲液中，得到1.0％的溶液。

向该样品中加入细小病毒(10^10.7拷贝/ml)作为监测病毒。

该溶液作为一个在过滤前样本，并测定其病毒的数量。

将该溶液用Planova 75N(平均孔大小为72±4nm)，在温度23℃，滤压10Kpa下进行死端(dead-end)过滤，以除去病毒。滤液作为一个过滤后的样本，并测定其病毒量。参照实施例2

与参照实施例1中的方式相同，除了加入细小病毒(10^11.7拷贝/ml)作为监测病毒，及将该溶液用Planova 35N(平均孔大小为35±2nm)，在温度23℃，滤压10Kpa下进行死端(dead-end)过滤，并测定每个样本的病毒量。参照实施例3

将来源于正常人血浆的Cohn’s Fr.I级分(100g)溶解到1.5L生理盐水中，并加入磷酸三-(正丁基)酯(TNBP)到0.3w/v％和Tween 80到1w/v％。在30℃下进行表面活性剂处理6小时。

用15％甘氨酸-1M氯化钠对该样品通过沉淀进行分级分离处理，血纤蛋白原进行沉淀和回收。回收的血纤蛋白原溶解到1.0升柠檬酸盐中，得到1.0％的溶液。

向该样品中加入细小病毒(10^5.7拷贝/ml)作为监测病毒。

将该溶液用Planova 75N(平均孔大小为72±4nm)，在温度23℃，滤压10Kpa下进行死端(dead-end)过滤，以除去病毒。滤液作为一个过滤后的样本，并测定其病毒量。

将该滤液用Planova 35N(平均孔大小为35±2nm)，在温度23℃，滤压10Kpa下进行死端(dead-end过滤，以除去病毒。滤液作为一个过滤后的样本，并测定其病毒量。病毒量的测定方法：

(1)对细小病毒的病毒量的测定，通过聚合酶链式反应(PCR)测定方法(Transfusion Vol.32，p.824-828(1992))来测定每个样品中残余的病毒核酸的量。在10²拷贝/ml量的细小病毒的核酸量低于检测极限。

(2)EMC病毒(脑心肌炎病毒)的测定是通过用Vero细胞检测感染滴度(TCID₅₀)来进行的。

EMC病毒对Vero细胞的感染滴度低于在10^1.5TCID₅₀/ml的检测极限。

上述实施例1-2，4-5及参照实施例1-3的结果列于表1中。蛋白量的检测方法

每个样品用生理盐水进行适当稀释，并在280nm处测定其吸收值。上述实施例3中的结果列于表2中。

                                  表1

      予处理    多孔膜   纤维(孔   大小)                          病毒量          75nm             35nm   过滤前过滤后  过滤前过滤后  (加入的)  (加入的)实施例1  甘氨酸-  氯化钠    75nm    10^2.7  低于检测极限     -   -                 (细小病毒B19：拷贝/ml)实施例2  甘氨酸-  氯化钠    75nm    10^5.7  低于检测极限     -   -                 (细小病毒B19：拷贝/ml)实施例4甘氨酸-氯  化钠+  水萃取    35nm    -    -    10^10.1  低于  检测  极限                (细小病毒B19：拷贝/ml)实施例5甘氨酸-氯  化钠+  水萃取    35nm    -    -    10^8.4  低于  检测  极限                (EMC：TCID₅₀/ml)  参照实施例1    无    75nm    10^10.7  10^10.7     -   -                 (细小病毒B19：拷贝/ml)  参照实施例2    无    35nm    -    -    10^11.7  10^11.7                 (细小病毒B19：拷贝/ml)  参照实施例3    无    75nm+    35nm    10^5.7  10^5.7    10^5.7  10^5.7                 (细小病毒B19：拷贝/ml)

                                  表2

予处理 多孔膜纤维  (孔大小)                 280nm的吸收值               75nm                35nm  过滤前  过滤后  过滤前   过滤后实施例3甘氨酸-氯化钠    75nm   +35nm  10.4  10.2   10.2    10.0

                        工业实用性

根据本发明，通过用多孔膜处理血浆蛋白组合物，可以有效地除去血浆蛋白中的污染病毒，而几乎不损失蛋白活性。因此，本发明提供一种没有病毒感染危险的血浆蛋白。特别地，通过本发明的多孔膜处理，可以提供一种实际上没有其中包括细小病毒和/或甲型肝炎病毒的无包膜病毒的血纤蛋白原组合物。

本申请基于日本专利申请No.360950/1999，其内容以参考文献的形式并入本发明。