一种人白细胞介素－10基因序列及含该基因序列的大肠杆菌

摘要

本发明涉及一种人白细胞介素－10基因序列的人工合成及含该序列的大肠杆菌，其主要特征在于：在Humaninterleukin－10的35个位点进行密码子替换，替换成大肠杆菌偏爱密码子；并在以上基础上进行pTRX－hIL－10表达质粒的构建，在大肠杆菌中获得稳定高效表达，经分离纯化，制备高纯度、高活性的hIL－10重组蛋白。本发明实现了人白细胞介素－10的体外表达，为该物质的药品化生产奠定了基础。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种人白细胞介素-10基因序列及含该基因的具有能产生免疫抑制及抗炎活性物质的大肠杆菌工程菌。

背景技术：

人白细胞介素-10(hIL-10)是直接源于人类基因的表达产物，传统的生物制药技术是无法制备的。运用人工合成基因、分子克隆、目的蛋白表达及纯化等多种先进的现代分子生物学技术，获得有天然生物学活性和疗效的重组人白介素-10(rhIL-10)是现代生物技术之一种。真核短肽基因的高效表达和分离纯化是基因工程中的关键问题。针对不同多肽的结构特点，需要采取不同的表达方式。对于分子量较小的多肽蛋白，若采用非融合方式表达，由于表达产物很难形成包涵体，因而极易被胞内蛋白酶降解，且包涵体的变复性处理是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高，易造成重组蛋白的变性失活。采用分泌表达方式可部分克服这一问题，但表达量偏低，且表达量差异很大，实际应用难度较大，特别是表达一些分子量较小、二硫键较多的蛋白时，非融合表达系统很难得到有生物学活性的蛋白。hIL-10是一个分子量仅有18KD的小分子糖蛋白，分子内部有两对二硫键，等电点为8.1。人白细胞介素-10(human Interleukin-10，hIL-10)是由Th2细胞和单核巨噬细胞、Th1、B等多种细胞分泌产生的具有多向性生物学活性的强免疫抑制因子，能改变机体的免疫应答和MHC II类抗原的表达，介导Th1和Th2两类细胞之间的相互调节，抑制IL-2、IL-6、IL-β、IFN-γ、TNF-α等炎症介质因子及其它促炎因子的分泌释放，把体内原有的、但未活化的针对自身反应性T细胞的抑制机制重新激活，达到抑制免疫反应的目的，是非常有效的抗炎介质。研究还显示人白细胞介素-10(hIL-10)参与单核细胞介导的抗体依赖的细胞毒作用以及通过激活自然杀伤细胞(NK)来杀死肿瘤细胞(Mosmann T R，New York：Academic Press，1994：224)。在临床应用方面，IL-10是抑制炎症发生和减轻炎症程度的良好药物，非常有效地用于治疗各种急性和慢性炎症性疾病，如过敏反应、类风湿关节炎、自身免疫疾病、移植排斥反应、牛皮藓及肝炎等(Lalani I et al，Annals of allergy，Asthma & Immunology，1997，79：469)；用于防治败血症休克和中毒休克；治疗分支杆菌感染；对肺组织损伤有保护作用；临床上IL-10与IL-2合用来进行继承性治疗癌症。生物工程制药是新药研制的新趋势，据统计，已获准上市的生物工程药品已达数百种之多，产业年收益达二千多亿。由于此类疾病患者数量巨大，如类风湿关节炎(RA)是最常见的系统性免疫疾病，呈世界性分布，在美国，RA的发病率为0.3-0.5％，在我国RA的发病率为0.4-0.7％，患者人数达500万以上，目前还没有治疗这些疾病的特效药，而且，人白细胞介素-10在生物技术领域尚未形成可以产业化生产的药品，因而该药的开发将带来巨大的经济效益和社会效益。

发明内容：

为了将人白细胞介素-10从人体基因表达改变为体外表达，从而实现其药品化，本发明提供一种能高效表达于微生物的人白细胞介素-10基因序列，该基因序列做了如下密码子的改造，根据Genbank发表的Human interleukin-10(hIL-10)基因序列(见图1)，在以下核苷酸位点：51，72，78，81，91，94，136，139，142，144，159，193，210，234，249，252，285，294，304，306，310，312，315，318，330，339，342，378，393，423，450，465，471，474，477进行密码子的替换，替换成大肠杆菌偏爱的密码子。遗传密码具有通用性，从最简单的生物例如病毒，一直到人类，在蛋白质的生物合成中都使用同一套遗传密码。而对遗传密码简并性的研究发现，不同的生物在翻译过程中对密码子有“偏爱性”。针对大肠杆菌偏爱且使用频率高的密码子，在不改变基因所编码的氨基酸序列的情况下，进行人白细胞介素-10基因的上述碱基序列的改造(见图2)，以达到在大肠杆菌中高效表达。

为了获得人白细胞介素-10的基因克隆并进行序列测定，在本发明的一种人白细胞介素一10基因序列的5’端加上AATTC以构成EcoR I识别位点，3’端加上AGCTT以构成Hind III识别位点，即可直接克隆至pUC18质粒，用于hIL-10合成序列的测定，以及经PCR扩增获得大量hIL-10目的基因。

本发明的一种优选人白细胞介素-10基因序列如下：

TCTCCGGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGTAACCTGCCT      60

AACATGCTTCGTGATCTGCGTGATGCCTTCAGCCGTGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGG    120

ATCAGCTGGACAACCTGCTGCTGAAGGAGTCCTTGCTCGAGGACTTTAAGGGTTACCTGG     180

GTTGCCAAGCCCTGTCTGAGATGATCCAATTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCGCAAGCTG     240

AGAACCAGGATCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGCGAGAACCTTAAGACCC   300

TCCGTCTGCGTCTGCGTCGCTGTCATCGTTTTCTTCCGTGCGAAAACAAGAGCAAGGCCGT  360

GGAGCAGGTGAAGAACGCCTTTAATAAGCTGCAGGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGA    420

GCGAGTTTTGACATCTTCATCAACTACATCGAAGCCTACATGACTATGAAAATCCGTAAC   480

TGA

为了构建pTRX-hIL-10表达克隆，本发明在上游引物中加入了KpnI识别序列GGT ACC，在下游引物中加入了Not I识别序列G CGG CCG C，以便PCR扩增获得的hIL-10目的基因能直接克隆于pTRX表达载体的相应克隆位点。

为了切去融合蛋白中的伴体蛋白，在上游引物KpnI识别序列之后设计了肠激酶切割位点GAT GAC GAT GAC AAG，肠激酶能特异性地识别多肽链中N-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C五个氨基酸残基位点，切割点在Lys的羧基端，切割下来的外源蛋白在氨基端无额外的氨基酸，从而使其氨基酸序列与天然蛋白完全一致。

为了使人白细胞介素-10基因能在大肠杆菌中表达，必须先将人白细胞介素-10基因序列插入到质粒载体中，本发明提供一种载有上述基因序列的表达质粒pTRX-hIL-10(见图6)。其特征是pTRX原核融合表达载体中含有具有优化翻译起始序列(TIR)的T7强启动子、TRX伴体蛋白(后接柔韧区)、6个组氨酸纯化位点、连接外源基因的多克隆位点的一段组合序列(见图5)。pTRX是由本室构建的高效原核融合表达载体，其强启动子及优化的翻译起始序列(TIR)有利于重组蛋白在原核生物中的高效稳定表达(Calvez H L et al，Gene，1996，170：51)。融合伴体是来自大肠杆菌的硫氧还蛋白(TRX)，分子量约为12KD，其构象严紧，热稳定性好。融合伴体既可以保护外源蛋白免受细菌蛋白酶的降解，又能协助外源蛋白的正确折叠(Smith et al，Gene1988，67：31)，因此，表达的重组蛋白溶解性好，更接近于天然蛋白的构象，对保证其生物学活性具有极为重要的作用，非常适合重组蛋白的大量生产和制备。本发明中hIL-10重组蛋白的表达量达40％，95％以上可溶，约占细菌总可溶蛋白的40％。融合伴体基因后设计了一个GSGSG(甘氨酸、丝氨酸)序列的柔韧区，其分子量小，空间位阻小，柔韧性好，减少了融合伴体和外源蛋白空间结构上的相互干扰以及可能出现的一些刚性结构，更有利于外源蛋白的正确折叠，保证了外源蛋白天然构象形成和生物学活性。pTRX的连接区设计了由6个组氨酸组成的纯化位点，组氨酸能提供配位电子与一些金属离子如Ni²⁺螯合，6个连续的组氨酸可以使蛋白很好地吸附于含金属Ni²⁺的层析填料上，因而可以利用金属螯合层析来纯化融合蛋白，从而大大简化了重组蛋白的下游纯化工作，纯度达95％以上，且纯化效率高，成本低，非常适合大规模制备。基因序列连接于TRX伴体蛋白之后的柔韧区，使融合伴体和外源蛋白之间的连接区空间位阻小，更有利于肠激酶对伴体蛋白的有效切割而获得目的蛋白单体。

为了获得表达人白细胞介素-10重组蛋白的工程菌，本发明提供一种载有上述质粒(pTRX-hIL-10)转化的大肠杆菌。其特征在于：将pTRX-hIL-10原核表达载体转化大肠杆菌，然后进行重组克隆的筛选，获得大肠杆菌工程菌。由于PTRX上的T7 Promoter是T7噬菌体RNA聚合酶基因启动子，所以利用T7启动子的表达载体需要以缺陷型λ噬菌体DE3的溶源菌株，如BL21(DE3)作为宿主，其携带的T7 RNA聚合酶基因受Lac UV5启动子和操纵基因控制，而插入的外源基因受T7 RNA聚合酶的强启动子Ф10的控制，用IPTG诱导，可使外源基因表达增强10⁵倍。上述转化可以采用传统的质粒转化生物技术。

为了获得人白细胞介素-10重组蛋白的高效表达，本发明提供一种上述含pTRX-hIL-10质粒的大肠杆菌的最佳诱导培养条件，其特征在于：工程菌于35-39℃摇菌培养至对数生长期，取培养菌液按1∶50-100放大培养至菌密度为OD_600nm＝0.4-0.8时，加入IPTG和葡萄糖至终浓度分别为0.1-0.5mM和0.1-0.5％，于20-28℃，200-280rpm诱导培养7h-12h，离心收获菌体。35-39℃的培养温度和200-280rpm的摇床速度范围内大肠杆菌能正常繁殖生长，1∶50-100倍的放大培养利于大肠杆菌快速达对数生长期。温度优化试验表明，20-28℃为最佳诱导表达温度，重组蛋白的表达量高，凝胶密度扫描分析为占总蛋白的40％，可溶性最好，95％以上可溶，且低温有利于重组蛋白的稳定存在。种子菌放大培养至菌密度OD_600nm＝0.4-0.8时细菌处于最佳生长状态，此时重组蛋白的诱导表达量最高，菌密度太高，菌体老化，不利于外源蛋白的表达。IPTG浓度优化试验显示，IPTG的诱导浓度为1.0mM-0.1mM时，重组蛋白均可达到高效表达，但IPTG价格昂贵，选择0.1-0.5mM IPTG诱导浓度最合理，即保证了重组蛋白的高效率表达，又大大降低了生产成本。诱导时添加适量的葡萄糖作为碳源物质，利于大肠杆菌表达外源蛋白。

为了制备纯化的人白细胞介素-10重组蛋白，本发明提供一种上述条件诱导培养的菌体所表达的重组蛋白的分离纯化方法，关键步骤：(1)hIL-10重组蛋白的hIL-10重组蛋白的Ni²⁺-Chelating Sepharose亲和层析；(2)hIL-10重组蛋白的SP-Sephadex阳离子交换层析。亲和层析具有特异性高、纯化效率高、产物纯度高等优点，但价格贵、成本高。本发明所采用的金属Ni²⁺螯合亲和层析是利用表达的融合蛋白上6个组氨酸能提供配位电子与一些金属离子如Ni²⁺螯合，6个连续的组氨酸序列可以使重组蛋白很好地吸附于含金属Ni²⁺的层析填料上，因而可以利用金属螯合层析来纯化融合蛋白，从而大大简化了重组蛋白的下游纯化工作，纯度达95％以上，且纯化效率高，成本低，非常适合大规模制备。SP-Sephadex阳离子交换层析是蛋白分离纯化技术中非常常用的方法。在50mM PB，100mM NaCl，pH＝6.0的缓冲液条件下，经肠激酶切割后的融合伴体(TRX)和hIL-10蛋白单体所带电荷不同，经SP-Sephadex阳离子交换柱纯化，穿流峰为TRX伴体蛋白，用50mM PB，500mM NaCl，pH＝7.0的缓冲液洗脱，即可获得纯化的hIL-10蛋白，纯度达95％以上，得率约为10mg/升发酵液，操作简单快速。

为了获得具有高效生物学活性的人白细胞介素-10蛋白，本发明提供了一种有效的酶切条件。肠激酶是一种丝氨酸蛋白酶，它能特异性识别肽链中N-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C五个氨基酸残基，特异性强，切割效率高，反应条件温和。本发明在2-10℃的温度下肠激酶作用10-15小时，既保证了重组蛋白的活性，又利于肠激酶的完全切割。

附图说明

图1本发明所依据的人白细胞介素-10(hIL-10)基因序列图。

图2本发明的一种对人白细胞介素-10(hIL-10)基因序列进行密码子替换的示意图。

图3本发明的一种人白细胞介素-10(hIL-10)基因序列图

图4本发明hIL-10 PCR电泳结果图。

泳道M：分子量标准；泳道1：hIL-10 PCR产物

图5本发明融合表达载体pTRX的物理图谱。

图6本发明pTRX-hIL-10重组质粒构建图。

图7本发明pTRX-hIL-10重组质粒酶切鉴定电泳结果图。

泳道M：分子量标准；

泳道1：pTRX/Kpn I+Not I；泳道2：pTRX-hIL-10/Kpn I+Not I

图8本发明hIL-10重组蛋白诱导表达的电泳分析图。

泳道M：蛋白质标准；泳道1，3，5，7：总细菌蛋白；

泳道2，4，6，8：总可溶性细菌蛋白；泳道9：对照

图9本发明不同诱导温度下hIL-10重组蛋白表达的电泳分析图。

泳道M：蛋白质标准；泳道9：对照

泳道1，3，5，7：分别为37℃、30℃、25℃、16℃总细菌蛋白；

泳道2，4，6，8：分别为37℃、30℃、25℃、16℃总可溶性细菌蛋白；

图10本发明不同IPTG浓度诱导下hIL-10重组蛋白表达的电泳分析图

泳道M：蛋白质标准；泳道15：对照

泳道1，3，5，7，9，11，13：分别为1.0mM，0.5mM，0.3mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM，0.01mM等

                           IPTG浓度下诱导表达的总细菌蛋白；

泳道2，4，6，8，10，12，14：分别为1.0mM，0.5mM，0.3mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM，0.01mM

                           等IPTG浓度下诱导表达的总可溶性细菌蛋白；图11本发明hIL-10重组蛋白表达和纯化的SDS-PAGE分析图。

泳道M：蛋白质标准；泳道1：对照；泳道2：总细菌蛋白；泳道3：总可溶性蛋白；

泳道4：亲和层析洗脱的杂蛋白；泳道5：亲和纯化的pTRX-hIL-10融合蛋白；

泳道6：pTRX-hIL-10/EK酶切；泳道7：离子交换纯化的hIL-10重组蛋白

图12本发明hIL-10重组蛋白的Ni²⁺-Chelating Sepharose亲和层析图谱。

A：用50mM PB，500mM NaCl(pH7.8)洗脱；B：用50mM PB，500mM NaCl(pH6.0)洗脱；

C：用50mM PB，500mM NaCl，150mM咪唑(pH6.0)洗脱；D：用50mM PB，500mM NaCl，300mM

   咪唑(pH6.0)洗脱

图13本发明hIL-10重组蛋白的SP-Sephadex阳离子交换图谱。

A：pTRX穿流峰；B：50mM PB，500mM NaCl(pH7.5)洗脱峰

图14本发明hIL-10重组蛋白Western-blot图谱。

泳道M：蛋白质标准；泳道1：pTRX-hIL-10融合蛋白；

泳道2：纯化的hIL-10重组蛋白；泳道3：对照

图15本发明重组hIL-10活性鉴定分析——对内毒素引起的小鼠炎症休克死亡的保护作用示

    意图

OLPS 1mg；□LPS 1mg+hIL-10 150ul；▲LPS 1mg+hIL-10 300ul

实施例1.hIL-10基因的克隆与测序

根据Genbank报道的人白细胞介素-10基因序列，替换序列中的某些稀有密码子，由上海生工生物工程有限公司合成含大肠杆菌偏爱且使用频率高的密码子的IL-10基因，5’端加上EcoR I识别位点(AATTC)，3’端加上Hind III识别位点(AGCTT)，克隆至pUC18质粒。测序结果与预期一致(见图3)。2.pTRX-hIL-10重组质粒的构建与鉴定

按常规方法克隆至本实验室构建的原核融合表达载体pTRX上，构建表达质粒pTRX-hIL-10(见图6)。上游引物5’CGG GGT ACC GAT GAC GAT GAC AAG TCT CCG GGC CAG GGC 3’

             Kpn I    Enterokinase site下游引物5’TGG CGG CCG CCT TGC CAA GCT TCT ATC AGT TAC GGA 3’

            Not I

引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物设计Kpn I识别位点和肠激酶特异切割位点，下游引物设计Not I识别位点。两步法扩增目的基因，反应参数为94℃变性5min，94℃50s，68℃2s，35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。PCR产物电泳分析，可见500bp目的带(见图4)，产物经琼脂糖电泳回收。目的片段和pTRX载体分别用Kpn I和Not I双酶切，电泳回收，经连接、转化、重组克隆筛选，构建重组质粒pTRX-hIL-10。经Kpn I和Not I双酶切鉴定，电泳分析表明结果正确(见图7)3.hIL-10重组蛋白的表达及工程菌的筛选

按常规方法，将pTRX-hIL-10质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。接pTRX-hIL-10-BL21(DE3)单菌落于100ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，250rpm培养12h-14h至对数生长期，取培养菌液按1∶100放大培养至菌密度为OD_600nm＝0.6时，加入100mMIPTG和20％葡萄糖至终浓度分别为1.0mM和0.2％，于37℃，250rpm诱导培养9h-10h，离心收获菌体。取适量菌体悬于TE中，超声破菌(200W，99次一个循环)，离心收集上清。总菌体和超声上清经SDS-PAGE电泳分析表明，经诱导后有明显的目的蛋白带，分子量约为31kD(见图8)，与预期相符，经Western-blot鉴定，表达蛋白为hIL-10(见图14)。经大量筛选，获得表达量高且稳定的工程菌。该工程菌于2001年9月保藏于武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010344.诱导表达条件的优化

通过优化诱导条件的摸索发现，不同的IPTG诱导浓度和不同的诱导温度对重组蛋白的表达有明显影响。接pTRX-hIL-10-BL21(DE3)工程菌落于100ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，250rpm培养12h-14h至对数生长期，取培养菌液按1∶50-100，例如1∶100放大培养至菌密度为OD_600nm＝0.4-0.8时，加入100mM IPTG的终浓度分别为1.0mM，0.5mM，0.3mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM，0.01mM，于37℃、30℃、25℃、16℃下，250rpm诱导培养8h-10h，离心收获菌体。取适量菌体悬于TE中，超声破菌(500W，99次5个循环)，离心收集上清。总菌体和超声上清经SDS-PAGE电泳分析表明，实验表明最佳诱导培养条件为：0.1-0.5mM IPTG诱导下hIL-10重组蛋白的表达量最高(见图10)，20-28℃诱导培养hIL-10重组蛋白的可溶性较好，温度控制在25℃左右为最好(见图9)。凝胶密度扫描分析，重组蛋白表达量占菌体总蛋白的40％，基本上处于可溶状态，可溶性高达95％以上。5.hIL-10重组蛋白的纯化

将收获的总菌体用TE(pH8.0)洗涤，悬浮于PBS(5omMPB，500mMNaCl，pH7.8)中，超声破菌(500W，99次，5cycles)，裂解液离心(10000rpm，40min)，得上清，上Ni²⁺ ChelatingSepharose亲和层析柱(上样速度5ml/min)，在紫外检测仪监控下分别用A液(50mMPB，500mMNaCl，pH7.8)，B液(50mMPB，500mMNaCl，pH6.0)，C液(50mMPB，500mMNaCl，150mM咪唑，pH6.0)，D液(50mMPB，500mMNaCl，300mM咪唑，pH6.0)洗脱蛋白。根据载体质粒pTXR所表达的外源蛋白与Ni²⁺Chelating Sepharose亲和柱结合较强的特点以及SDS-PAGE电泳检测分析，重组蛋白在D液被洗脱下来(见图11，12)。收集50mMPB，500mMNaCl，300mM咪唑(pH6.0)重组蛋白洗脱峰，上Sephadex G-25柱脱盐，转换成50mM Tris-Cl，150mMNaCl缓冲液(pH7.5)。利用Folin-酚法测定蛋白浓度。根据Invitrogen公司肠激酶(EK)产品使用说明书，加入肠激酶及酶切Buffer，在低温下肠激酶作用12小时，用SDS-PAGE电泳检测酶切结果(见图11)，可明显见到hIL-10单体蛋白带(18kD)和TRX融合伴体蛋白带(14KD)。反应液经G-25柱换成50mMPB，100mMNaCl缓冲液(pH6.0)，上SP-Sephadex离子交换柱(见图13)，收集穿流峰，用50mMPB，500mMNaCl，pH7.5缓冲液洗脱蛋白，经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测(见图14)，穿流峰为TRX伴体蛋白，蛋白峰为纯化的hIL-10重组蛋白。上G-25柱脱盐转换成50mMPB，150mMNaCl，pH7.5缓冲系统(PBS)，过滤即可直接用于动物和细胞实验。以上每步均做SDS-PAGE电泳检测，经凝胶扫描分析，纯度达95％以上，得率约为10mg/升发酵液(见图11)。

本工艺流程操作简单、快速，只需两步纯化即可获得高纯度的hIL-10重组蛋白，且成本低，效率高，非常适合大规模生产制备。6.hIL-10重组蛋白的活性检测

据资料报道，hIL-10是非常有效的抗炎症药物，特别是对慢性炎症有非常明显的疗效。

雌性NIH小鼠，20.0±2.0g，分3组，每组30只，分别为NS组(ip LPS1mg+PBS 0.2ml)、hIL-10低剂量组(ip LPS1mg+hIL-10 150ul)和高剂量组(ip LPS1mg+hIl-10 300ul)。腹腔注射和Not I I给药后观察记录72小时动物死亡数(见表1)。动物实验结果表明，纯化的重组hIL-10对内毒素引起的小鼠炎症休克死亡有明显的保护作用(p＜0.0001)，作用呈剂量依赖性(见图15)。表1重组hIL-10对内毒素引起的小鼠炎症休克死亡的保护作用Tab.1 The protective effect of the recombinant hIL-10 on mice inflammatory lethal induced by endotoxemia

      组别                                        动物数                      72小时死亡动物数LPS1mg+PBS 200 μl                                      30                               17LPS1mg+IL-10 150μl                                     30                               9^*LPS1mg+IL-10 300μl                                     30                               1^***与NS比，^*p＜0.05，^***p＜0.0001