基质金属蛋白酶组织抑制剂在制备预防和治疗关节炎病药的应用

摘要

本发明涉及一种基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP－4在制备预防和治疗关节炎病药的应用，通过给予TIMP－4来抑制促进炎症反应的调节因子interleukin－1α和TNF－α和关节炎患者中关节组织中MMP酶的活性，以预防和治疗关节炎。TIMP－4既可以通过肌内注射裸DNA然后进行电穿孔的方法有效的给予，也可以通过常规的蛋白质如纯化的重组TIMP－4蛋白。本发明优点是没有用病毒做载体，操作简单，没有毒性，本发明用已知的蛋白因子TIMP－4用于预防和治疗关节炎。

说明书

技术领域

本发明涉及物质的医药用途，更具体说是用基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-4在预防和治疗关节炎方面的应用。

背景技术

无效治疗后的关节表层损伤是关节组织受损的主要症状。研究表明基质金属蛋白酶MMPs在风湿性关节炎发病机理中起重要作用。其主要功能是水解基质蛋白包括胶原蛋白。下面的发现能证明这一点：1)从风湿性关节炎患者身上获得的润滑液显示，液体中含有大量的MMPs和基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMPs，但其中的MMPs的比例远远高于TIMPs的比例(1-4)(J Rheumatol，1999.26：34-40.)，2)与非免疫性的关节炎患者、正常对照物相比，风湿性关节炎患者体内的MMPs和TIMPs的循环水平比上述两者高出许多(5-8)(ArthritisRheum，1995.38：1031-9.)。

TIMPs是一种分泌型的多项功蛋白，最常见的是能抑制MMPs(Biochim Biophys Acta，2000.1477：267-83.)。由于MMP与TIMP的比例不均衡，明显高于TIMP比例的MMP是造成关节组织破坏的重要因素。探索发现若改变这种不均衡比例，提高TIMP的比例，会抑制关节炎。早些时候，我们克隆了基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-4，(Cell，1996.85：307-10.)，并运用全身肌内基因治疗方法说明TIMP-4对裸鼠体内肿瘤生长起到的作用(Oncogene，2001.20：4337-43.)也可以通过电穿孔的疗法注射TIMP-4表达质粒达到维持的TIMP-4血清水平(Oncogene，2001.20：4337-43.)。在此项研究中，以辅剂关节炎模式，通过注射裸DNA可抑制关节炎，并且探索出TIMP-4基因抑制关节炎的病理机制。因此，人们至今未揭示基质金属蛋白酶组织抑制TIMP-4在预防和治疗关节炎的应用。

发明内容

本发明目的在于弥补现有技术之不足，提供一个已知蛋白因子即基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-4在预防和治疗关节炎方面的应用。

本发明另一目的是提供一种对受治疗者系统给予TIMP的途径。

风湿性关节炎病理机制表明，MMPs不仅破坏关节炎表层，还破坏恢复治疗。由于T细胞的活性释放出促进炎症反应的调节因子引起关节炎。TNF-α与IL-1激活巨噬细胞和成纤维细胞释放MMPs，从而造成关节组织被破坏。抑制促进炎症反应的调节因子的表达早已应用于临床，(J Clin lmmunol，1999.19：305-13.)，但抑制MMPs活性的试验正在进行中(Br J Pharmacol，2000.131：1513-20.)。

在关节炎的病人中，血中和组织中促进炎症反应的调节因子Interleukin-1α和TNF都很高。本发明描述了一种抑制血中和组织中Interleukin-1α和TNF水平的方法，通过体内导入能有效抑制炎症反应的适量的TIMP-4。

关节组织中的MMP酶的升高是关节炎病人关节软组织直接受损伤的关键原因。TIMP特意性的抑制MMP酶的活性。本发明描述了一种抑制血中和组织中升高的MMP酶活性的方法，通过给予受治疗者一定量的能有效抑制MMP的TIMP如TIMP-4。发明者证实在用TIMP后，患有关节炎的动物血中和组织中升高的MMP酶会降到正常水平。

本发明目的可以通过以下措施来达到：

基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-4在预防和治疗关节炎中的应用，关节炎包括风湿性关节炎和非风湿性关节炎；

TIMP-4进入受治疗者的途径是：

介导和表达一个编码TIMP-4蛋白的DNA序列进入受治疗者足够数量的细胞内，细胞为平滑肌细胞；所述的编码TIMP-4蛋白的DNA序列是通过肌内注射裸DNA然后进行电穿孔的方法介导的，或者是通过包括肌内注射脂质体配方的裸DNA的方法介导的；TIMP-4可以作为纯化的重组TIMP-4蛋白或从天然物质分离的TIMP-4蛋白给予受治疗者。

本发明相比现有技术具有如下优点：

本发明采用的是基因疗法，并且通过裸DNA肌内注射然后电穿孔的方法来转移基因，而没有用病毒做载体，可以有效地抑制促进炎症反应的调节因子interleukin和TNF-α，亦可以有效的抑制关节炎患者关节组织中MMP酶的活性，因此操作简单，没有毒性。

附图说明

图1肌内注射TIMP-4表达质粒后大鼠血清中的TIMP-4蛋白水平。密度单元(Densitometric units).

图1中的上图：用Western blot测定血中TIMP-4蛋白的水平。

图1中的下图：用Western blot中TIMP-4的带进行密度测定来表达血中TiMP-4蛋白的相对含量。    

图2肌内注射TIMP-4表达质粒可以有效的抑制诱发的关节炎。

控制：正常大鼠；模拟：诱发关节炎的大鼠，給予不含TIMP-4基因的质粒；TIMP-4，诱发关节炎的大鼠，给予TIMP-4的质粒氟联苯丙酸诱发关节炎的大鼠，给予抗炎药氟联苯丙酸，纵坐标是大鼠关节的直径。

图3A：肌内注射TIMP-4表达质粒对MMP酶和胶原蛋白水解酶活性的抑制作用示意图。

关节组织中Gelatinase(MMP)酶的活性。辅剂：用辅剂诱发关节炎。Pcl-neo(模拟)：对诱发关节炎的大鼠处理不含TIMP-4基因的质粒。Pcl-neo-TIMP-4：对诱发关节炎的大鼠处理含有TIMP-4基因的质粒。和模拟比较*：P＝0.0003

图3B：肌肉注射TIMP-4表达质粒对MMP酶和胶原蛋白水解酶活性的抑制作用示意图。关节组织中胶原蛋白水解酶活性。

控制：正常大鼠关节组织中的胶原蛋白。只有辅剂：诱发关节炎的大鼠关节组织中胶原蛋白。TIMP-4+辅剂：诱发关节炎的大鼠被TIMP-4治疗后，其关节组织中的胶原蛋白。

图4A：肌内注射TIMP-4表达质粒对促进炎症反应的调节因子Interleukin-1α和TNF的表达水平的抑制作用示意图。

关节组织中Interleukin-1α和TNF的表达水平。控制：正常大鼠；模拟：诱发关节炎的大鼠，给予不含TIMP-4基因的质粒；TIMP-4诱发关节炎的大鼠，给予TIMP-4的质粒。和Sham比较，*P＝0.019。

图4B：肌内注射TIMP-4表达质粒对促进炎症反应的调节因子，Interleukin-1α和TNF的表达水平的抑制作用示意图。

血中Interleukin-1α和TNF的表达水平

控制：正常大鼠；模拟：诱发关节炎的大鼠，给予不含TIMP-4基因的质粒；TIMP-4诱发关节炎的大鼠，给予TIMP-4的质粒。和模拟比较*：P＝0.046；**：P＝0.001

具体实施方式

下面列举四个实施例，结合表和图，对发明加以进一步说明。

实施例1  肌内注射TIMP-4表达质粒的试验

利用一次性胰岛素注射器以及一支25号针，将50μl(150μg)TIMP-4表达质粒DNA(TIMP-4 cDNA插入pCI-neo哺乳动物表达载体，Promega Corporation，Madison，WI)或仅质粒DNA注射入10周大的雄性Lewis大鼠的双侧胫骨前肌肉(单次肌内注射脂质体)，然后进行电穿孔法：一对电极插入肌肉，在DNA注射部位相距5mm间隙，用一个电脉冲发生器Electro Square Porator ECM 830(Genetronics，Inc.San Diego，CA)给予电脉冲。三次脉冲，每秒一次，电压为100V，传导到注射部位，每个脉冲持续50ms。然后，给予三次反向的脉冲。

图1显示肌内注射TIMP-4表达质粒后血清中的TIMP-4蛋白水平。单次肌内注射150μg TIMP-4表达质粒前以及在不同时间后收集10μl的血清，用TIMP-4抗体进行western blot分析。图1表示一只鼠中血清TIMP-4水平在不同时间的变化。一次注射TIMP-4可以在5星期后在血中观察到很高水平的TIMP-4蛋白。所有5只鼠在每个时间点上均观察到相似的TIMP-4水平。

这里所说的“裸DNA”定义为：包含于一个非病毒载体的DNA。正如本领域专业技术人员所知，任何以上DNA转导方法都可以结合起来。

为检验给予TIMP后是否可以抑制在大鼠上诱发的关节炎，我们建立的关节炎大鼠的辅剂模型来评价全身注射TIMP-4基因在抑制关节炎方面的影响。在治疗8个星期大的lewis大鼠在辅剂接种之前也应用了TIMP-4质粒或不含TIMP-4的对照质粒，时间为0星期。这种治疗将应用在整个关节炎发展过程中，在被辅剂诱发关节炎后的三个星期，动物的体重平均降低5g，而没有诱发关节炎的正常大鼠体重增加了60g。给诱发关节炎的大鼠注射TIMP-4，能抑制其关节炎导致的体重降低并保持平均体重增加45g左右。

实施例2。TIMP-4表达质粒在体内的表达可以有效的抑制诱发的关节炎。在用辅剂诱发关节炎前两周，给大鼠注射TIMP-4表达质粒或没有TIMP-4的空质粒。用辅剂诱发关节炎后两周观察各实验组关节炎的发生情况。用辅剂诱发关节炎的组和用没有TIMP-4的空质粒处理的诱发关节炎组，八只大鼠全部患有关节炎，致病100％。(表1和图2).但是在用TIMP-4表达质粒处理的诱发关节炎组中，十只大鼠没有一只患有关节炎。

更重要的是全身给药TIMP-4可以很有效地抑制在大鼠身上诱发的关节炎(表1和图2)。表1：不同大鼠实验组关节炎发生频率和关节直徑

    大鼠实验组*  正常大鼠关节炎大鼠  空质粒关节炎大鼠  TIMP-4  关节炎大鼠  TIMP-4(CIA)  关节炎大鼠  Flurbiprofen  实  验.   I关节炎发生频率    NA**    8/8    0/10    ND***    8/8关节直徑，mm    5.18±    0.17    9.46±    1.77 5.5±0.13    ND 8.15±0.99  实  验.  II关节炎发生频率    NA    4/5    0/5    3/5    ND关节直徑，mm    7.18±0.15    8.62±    0.88 7.3±0.20  9.26±0.7    N  D*：大鼠实验组：正常大鼠，没有诱发关节炎，没有质粒；空质粒，诱发关节炎+PCI-neo质粒；TIMP-4：诱发关节炎+TIMP-4必要质粒；TIMP-4(C1A)，诱发关节炎+TIMP-4(C1A)质粒；Flurbiprofen，诱发关节炎+flurbiprofen.**：NA＝不适合。***：ND＝没有测定。

我们还选用了一种抗炎症药物flurbiprofen(氟联苯丙酸，一种能够抑制关节炎的甾体制剂)，在抗关节炎方面的作用与TIMP-4对比。我们在动物关节炎模型中也成功的使用了氟联苯丙酸。所有的患有关节炎的动物在接受了氟联苯丙酸治疗后，其关节炎症状明显减轻。(表1，图2)虽然人们发现了氟联苯丙酸抗关节炎的作用，但是其治疗作用明显小于TIMP-4。

TIMP有各种不同的生物学功能，除了其抗MMP活性以外，还包括细胞生长和凋亡的调节作用等。包括TIMP-4在内所有TIMP的抑制MMP的活性已证实由其N末端区域所介导，该末端区域与活化的MMP形成紧密复合物(Murphy et al.，Methods Enzymol.248：496-510，1995；Hutton et al.，Biochemistry，37：10094-8，1998)。想研究TIMP抗关节炎的作用是否与其抗MMP酶的作用有关。基于这点，构建了TIMP-4的突变体C1A。选择TIMP-4的突变体C1A是基于：1位上的半胱氨酸在TIMPs抑制MMP活性方面起重要作用，同时氨基酸上的突变体导致抑制活性功能的丧失。

将突变的TIMP-4 C1A基因打入诱发关节炎的大鼠上，15只患有关节炎的动物，5只为一组，分别用不含TIMP-4的对照质粒、TIMP-4、TIMP-4的突变体C1A进行治疗，其中用对照质粒治疗的关节炎发病率为4/5，用TIMP-4治疗的关节炎发病率为0，用TIMP-4(C1A)治疗的关节炎发病率为3/5(如表1所示)。

TIMP-4的突变体失去了其抗关节炎的作用，从而证明TIMP-4抗关节炎的作用与其抗MMP酶的作用密切有关。

实施例3 TIMP-4表达质粒在体内的表达可以有效的抑制MMP酶的活性。用以前报道过的方法(Liu and Shi et al，J.Biol.Chem.，272：20479-20483，1997)，我们测定了不同实验组关节组织中的MMP酶和胶原蛋白水解酶的活性。结果见图3A、图3B。大鼠被诱发关节炎后，关节组织中Gelatinase(MMP)酶的活性比正常的关节组织增高了十倍。但是对诱发关节炎的大鼠给于TIMP-4治疗后，Gelatinase(MMP)酶的活性几乎降到正常关节组织中酶的活性(图3A)。在诱发关节炎的大鼠关节组织中，被胶原蛋白水解酶的活性也有显著的增高(图3B)。正常的胶原蛋白在电泳上只有两条高分子的带，在诱发关节炎后的三只大鼠上，由于胶原蛋白水解酶活性的显著增高，正常的两条高分子胶原蛋白被水解成很多条小分子的带。但是在对四只诱发关节炎的大鼠给予TIMP-4全身基因治疗后，这些被水解形成的多条小分子带基本上消失了。从而证明TIMP-4有效的抑制了被诱发关节炎后而升高的胶原蛋白水解酶活性。

接着在建立的关节炎大鼠模型中检验了TIMP-4抑制MMP酶活性的有效性。大鼠被诱发关节炎后，关节组织中MMP酶的活性比正常的关节组织增高了十倍(图3A)。胶原蛋白水解酶的活性也有显著的增高(图3B)。全身给药TIMP-4后，MMP酶的活性和胶原蛋白水解酶的活性显著下降，其酶活性和没有诱发关节炎的大鼠关节一样。

另外在建立的关节炎大鼠模型中检验了TIMP-4抑制促进炎症反应的调节因子Interleukin-1α和TNF的有效性。由于关节炎中的MMP的表达是通过由巨噬细胞产生的因子进行的(Cell，1996.85：307-10.)，所以我们探索了两种促炎症反应调节因子即TNF-α和IL-1α在关节炎病生理学中的表达全程。

实施例4 TIMP-4表达质粒在体内的表达可以有效的抑制促进炎症反应的调节因子Interleukin-1α和TNF-α的表达水平。文献已提到细胞因子在关节炎中的作用，此文献重点论述了炎症过程中的TNF-α(Cell，1996.85：307-10.)。炎症过程中MMP的表达、促炎症反应的调节因子、抗炎因子均受TNF-α的调控。如图4A，图4B所示，用辅剂诱发关节炎后，如果只给动物注射不含TIMP-4的对照质粒，TNF-α在组织中的含量为6.85ng/ml，在血清中的含量为29.2ng/ml，没有关节炎的正常对照物组织中含0.9ng/ml，血清中含10.4ng/ml相比，TNF-α水平要高的多。用TIMP-4治疗后的动物与正常对照物体内的TNF-α水平相当(组织中2.4，血清中10.4ng/ml)。患有关节炎的动物和正常对照物的组织、血清相比也有较高的IL-1α水平。在未接受治疗的健康动物的组织中没有发现促进反应的调节因子IL-1α，而在血清中有2ng/ml的IL-1αl。患有关节炎的动物，血清中的IL-1α水平明显增加到3.6ng/ml，组织中的IL-1α增加到1.3ng/ml。统计来看，注射TIMP-4后，血清中IL-1α水平明显降低(1.8ng/ml)。虽然在注射TIMP-4后，组织中IL-1α的水平也有所下降(0.475ng/ml)，但并不明显。

如图4A所示，大鼠被诱发关节炎后，关节组织中和血中的IL-1和TNF的表达水平都有显著升高。但是在经过TIMP-4的全身基因治疗后，血中IL-1和TNF的表达水平降到了正常水平(图4B)。所以TIMP-4是一个抗炎症反应的有效因子，可以有效的抑制促进炎症反应的调节因子Interleukin-1α和TNF-α。

为达到将TIMP基因介导入受治疗者的目的，可以将一个包含编码TIMP的核酸的重组载体与一种无菌水溶液组合，该溶液最好是与接受者的血液等渗。可以将重组载体悬浮于含有生理上可配伍的物质如氯化钠、甘氨酸等以及与生理条件相配的缓冲PH的水中，并将该溶液灭菌。本发明的较好例子，重组载体与20-25％蔗糖组合配制于生理盐水中用以介导入哺乳动物。所给予的编码TIMP的核酸的量或者载体中编码TIMP的核酸的量足以抑制受治疗者的MMP和TNF-α。但是，确切的剂量依赖于各种因素诸如给药的目的、给药方式、组合的有效性、以及受治疗者个体药代动力学参数。本领域专业人员可以按治疗的需要决定治疗的频率和时间。

实施例1-4，分别用于风湿性关节炎或非风湿性关节炎患者。

本发明用已知的蛋白因子用于预防和治疗关节炎。