特效菌剂的制备与处理化工废水或常规有机废水的方法

摘要

一种特效菌剂的制备方法，由白腐真菌(亲株1)、土著细菌YZ1(亲株2)、酿酒酵母(亲株3)三个亲株菌体的原生质体融合，通过基因在同一个细胞内的重组整合，构建获得的基因工程菌。其发酵工艺参数为：发酵温度，33±2℃；pH值，7.0±1；反应器中溶解氧，≥2mg/L；矿物盐流量，0.001－0.005V/(V.d)；菌体浓度，2－10g/L；在含C、P、N培养液中培养。NJU－Fhhh1特效菌剂生降解精对苯二甲酸石化废水的最大比降解率qmax＝0.226h－1，具有高降解、高絮凝、高适应优势；提高处理效率和节约费用25％以上。

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种制备特效微生物菌剂的生物技术及其应用。

二、背景技术：

国际上已有多种处理废水特效菌剂，但是没有制备与应用原生质体融合菌剂处理废水的专利。典型的如日本的EM，又如美国PARADISF公司的高智能微生物制剂HIMP(High-Intelligence Microorganism Preparation)，1升/24元。由于成本和售价太高，国内厂家一般不用进口的处理废水特效菌剂，而国内这方面产品目前仍是空白。

三、发明内容

本发明目的是提供一种制备与应用NJU-Fhhh1特效菌剂高效处理废水的方法。尤其是应用本发明构建的原创性的基因工程特效菌NJU-Fhhh1为出发菌株，制备NJU-Fhhh1特效菌剂，具有白腐真菌的高降解性、土著细菌YZ1的高适应性、酿酒酵母的高絮凝性，利于高效处理有机废水。本发明目的还在于本特效菌剂，成本低，可供国内厂家广为使用，并配套相关的应用技术，在国内有持久性。

本发明的技术实质：将原创性特效菌，发酵制备成处理废水的特效菌剂。

(1).技术构思：以本课题构建的原创性的基因工程特效菌NJU-Fhhh1为出发

菌株，制备处理废水的NJU-Fhhh1特效菌剂，具有白腐真菌的高降解性、土

著细菌YZ1的高适应性、酿酒酵母的高絮凝性，利于高效处理有机废水。在

国内生产NJU-Fhhh1特效菌剂，成本仅为进口的1/4左右，国内的厂家用得

起。配套相关的应用技术，在国内有持久性。

(2).技术构成：

出发菌株NJU-Fhhh1特效菌：是本课题组的原创性科研成果。NJU-Fhhh1特效菌由白腐真菌(亲株1)、土著细菌YZ1(亲株2)、酿酒酵母(亲株3)三个亲株菌体的原生质体融合，通过基因在同一个细胞内的重组整合，构建获得的基因工程菌。NJU-Fhhh1特效菌集中了三个亲株的高降解性、高适应性、高絮凝性的三高优势，利于高效处理有机废水。国际公认原生质体融合构建的新菌株，不存在基因污染问题，所以NJU-Fhhh1特效菌剂也不存在基因污染问题。

NJU-Fhhh1特效菌由亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)、亲株2土著细菌YZ1(Pseudomonas)、亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)原生质体融合而成。先经原生质体制备：用蜗牛酶脱去真菌的细胞壁或用溶菌酶脱去细菌的细胞壁、生成原生质体并经离心收集原生质体、缓冲液清洗后获得，然后进行二次融合，第一次融合：等量的亲株1白腐真菌细胞和亲株2土著细菌YZ1细胞的原生质体混合、并在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl₂、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、高渗缓冲液离心清洗后分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落，为第一次双亲跨界融合的产物Fhh；而亲株1白腐真菌细胞和亲株2土著细菌YZ1细胞，只能分别在SIM1和SIM2上生长；第二次融合：上次得到的等量的Fhh和亲株3酿酒酵母细胞的原生质体混合、在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl₂、蔗糖配配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、含蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上，同时能在SIM1、SIM2、SIM3三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的产物NJU-Fhhh1或Fhh。 

SIM1＝SM+100u链霉素/ml(streptomycin，Sm)；

SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)；

SIM3＝SM+100u链霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)。

制备NJU-Fhhh1特效菌剂的液体培养基：1000ml中：K₂HPO₄ 3g；KH₂PO₄ 1g；NH₄NO₃ 0.5g；Na₂SO₄ 0.1g；MgSO₄·7H₂O 10mg；MnSO₄·4H₂O 1mg；CaCl₂ 0.5mg；FeSO₄·7H₂O 1mg；CH₃COONa 5g；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；葡萄糖10g；200g马铃薯浸出汁，调pH至7.0；121℃、103kPa、湿热灭菌20min。最适培养温度：35℃；最适pH：7.0。

制备NJU-Fhhh1特效菌剂的发酵工艺：

发酵设备：全自控生物反应器；

发酵工艺：连续稳定发酵系统；发酵温度，33±2℃；pH值，7.0±1；反应

器中溶解氧，≥2mg/L；，矿物盐流量，0.001-0.005V/(V.d)；菌体浓度，

2-10g/L；在含C、P、N培养液中培养。

               表1.NJU-Fhhh1特效菌剂发酵工艺参数

工艺参数              数值      工艺参数                      数值T，发酵温度，℃           33±2      Sp，培养液P源浓度，gTP/L     0.10P，罐压，(1大气压＝10⁵   5×10⁵＜ Sf，C/N/P培养液流            0.33Pa)，Pa                              量，V/(V.d)Fa，清洁空气供气量，      75≤       Mr，矿物盐流量，V/(V.d)      0.003m³/kgCODRr，搅拌转速，rpm         1000       X，菌体浓度，g/L             4.99PH                        7.0±1     HRT，反应液发酵时间，h       8DO，反应器中溶解氧，mg/L  ≥2        Fr，加硅油消泡剂流速         Sf＜Va，反应液装量，％        80≤       μ，比增长率，mg/mgL h^-1    0.1 27So，培养液C源浓度，gCOD/L 8.48       q，培养液比利用率，h^-1      0.211Sn，培养液N源浓度，gTN/L  0.50       Yo，菌体产量率系数，％       59发明的有益效果：

(1)NJU-Fhhh1特效菌剂的生产成本低，仅为500元/吨左右，售价可以远低于进口的菌剂；

(2)NJU-Fhhh1特效菌剂具有三亲株的三高优势；提高处理效率和节约费用25％以上；

(3)NJU-Fhhh1特效菌剂既可处理有毒有机废水，也可处理常规有机废水；

(4)NJU-Fhhh1特效菌剂应用原生质体融合工程菌，不产生新基因，没有基因污染问题。

总之，本发明菌剂比土著菌提高降解废水效率和节约运行费用25％以上。本发明是应用原生质体融合的原创性特效菌，是制备处理废水特效菌剂的首例。尤其是应用具有国际原创性的特效菌，制备的特效菌剂在成本和售价上具有国内推广的优势。降解精对苯二甲酸(PTA)石化废水等有机废水具有高降解、高絮凝、高适应优势。

四、附图说明

图1为本发明亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)电子显微镜照片

图2为本发明亲株2土著细菌YZ1(Pseudomonas)，电子显微镜照片

图3为本发明亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)电子显微镜照片

图4为本发明三株融合后得到的NJU-Fhhh1菌株电子显微镜照片图

五、具体实施方式

NJU-Fhhh1特效菌剂制备技术的发酵工艺流程

实例名称：NJU-Fhhh1特效菌剂制备及其降解精对苯二甲酸PTA石化废水

(1)应用NJU-Fhhh1特效菌株制备NJU-Fhhh1特效菌剂的条件控制制备菌剂的

生物反应器：德国产B.Braun全自控生物反应器，有效容积1L；自控参数设定：DO(溶解氧)＝2mg/L；pH＝7.0；T＝35℃；Sf(液体培养基流量)＝0.33(V/V)；

搅拌转速：1000rpm；除泡沫：硅油；液面：达1L有效容积；矿物盐流量：0.003(V/V)；液体培养基：同于上述液体培养基

(2)NJU-Fhhh1特效菌剂制备物的参数测定NJU-Fhhh1特效菌体生物量浓度X：4.99g/L；比增长率μ：0.127h^-1；培养基的比利用率q：0.211h^-1；产率系数Yo：59.84％；制备液中底物剩余浓度Se：0.15g(COD)/L.

(3)NJU-Fhhh1特效菌剂制备物的保存配方(4℃)

配方1：NJU-Fhhh1特效菌剂发酵液，不加任何其它成份；

配方2：NJU-Fhhh1特效菌剂发酵液+抗氧化剂巯基乙醇(SH)；(终浓度0.2‰)；

配方3：NJU-Fhhh1特效菌剂发酵液+Fe³⁺，(终浓度0.14％)；

配方4：NJU-Fhhh1特效菌剂发酵液+Fe³⁺+巯基乙醇(SH)；(终浓度0.2‰)；

(4)最佳保存配方的NJU-Fhhh1特效菌剂降解精对苯二甲酸PTA石化废水参数：经过2002/5/11-2002/7/21的70天(4℃)的保存，测定配方2：NJU-Fhhh1特效菌剂原发酵液体产物+抗氧化剂巯基乙醇(SH)为最佳配方。降解精对苯二甲酸PTA石化废水参数为：NJU-Fhhh1特效菌体最大比增长率μ_max，为0.067_h^-1；最大比降解率q_max，为0.226_h^-1；产率系数Y为29.64％；自身衰减系数为0.0026_h^-1。

(5)NJU-Fhhh1特效菌剂制备实例总结  

制备特效菌剂的发酵工艺控制条件是：DO(溶解氧)＝2mg/L；pH＝7.0；T＝35℃；Sf(液体培养基流量)＝0.33(V/V)；搅拌转速：1000rpm；硅油除泡沫；矿物盐流量：0.003(V/V)；保存NJU-Fhhh1特效菌剂的最佳条件是：4℃保存，特效菌发酵液+巯基乙醇(SH)；

NJU-Fhhh1特效菌剂解精对苯二甲酸石化废水参数：μ_max＝0.067_h^-1；最大比降解率q_max＝0.226_h^-1；产率系数Y为29.64％；自身衰减系数为0.0026_h^-1。NJU-Fhhh1特效菌剂具有高降解、高絮凝、高适应优势；提高效率节约费用25％以上。

    Fhhh1特效菌剂处理废水实例的应用研究结果

废水种类       PTA废水      剥绒废水      汰头废水

时间地点      2002南京     2002张家港     2001金湖

  工艺        活性污泥法    活性污泥法    活性污泥法原废水COD，kg/m³    4.344        1.030          9.45原废水BOD，kg/m³    2.828        0.4777         8.18原废水SS，kg/m³     0.103        0.035          21.69原废水pH             4.9          ＞14           12原废水流量，m³/d    10,000       960            8废水反应温度，℃     35           35             35Yobs，％             0.1976       0.4638         0.6687Qmax，d^-1           0.226        1.078          22.46Ksq，kg/m³          0.01         0.1            2.70μmax，d^-1          0.067        0.6            15.02Ksμ，kg/m³         0.02         0.02           2.7Yt，％               0.2046       0.5566         0.6688Kd，d^-1             0.002        0.0455         0.0001q，d^-1                 0.113     0.4000    0.1651μ，d^-1                0.0223    0.8624    0.1104出水COD，mg/L          0.01      0.04      0.02出水SS，mg/L            0.0005    0.0818    0.067出水pH                  7.0       7.0       7.0Qr，m³/d               10000     90        8Xr，m³/d               0.57      0.76      5.35Θc，d                  44.78     2.5       9.05HRT，d                  0.04      1.34      0.11X，kg/m³               0.2855    0.1399    2.708土著菌所需体积V，m³    2293      1900      156Fhhh所需体积V，m³      1624      1524      19.4Fhhh节约建设投资，％    29.18     19.79     87.56

本发明的微生物保藏资料：2002年7月26日保减，保藏编号是CGMCCNo.0783三亲株跨界融合特效菌是白腐真菌(phanerochaete chrysoporium)酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、土著细菌(YZ1)三者原生质体融合产物。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所。