用甲醇酵母（Pichia pastoris）生产人脑源性神经营养因子BDNF的方法及应用

摘要

本发明属于基因工程药物领域，具体地说，涉及利用工程菌甲醇酵母(Pichia pastoris)生产制备人脑源性神经营养因子BDNF，以及在制备治疗维持和促进外周神经嵴和基板来源的多种感觉神经元的发育、生长和分化，神经中枢基底前脑、胆碱能神经元、GABA能神经元、中脑黑质多巴胺能神经元和一些如早老性痴呆、帕金森病、外周神经损伤等神经性疾病药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程药物领域，具体地说，涉及利用工程菌甲醇酵母(Pichia pastoris)生产制备人脑源性神经营养因子BDNF，以及在制备治疗维持和促进外周神经嵴和基板来源的多种感觉神经元的发育、生长和分化，神经中枢基底前脑、胆碱能神经元、GABA能神经元、中脑黑质多巴胺能神经元和一些如早老性痴呆、帕金森病、外周神经损伤等神经性疾病药物中的应用。

背景技术

BDNF国外研究状况：1989年，Leibrock首先克隆并在猴肾COS细胞表达猪BDNF。1991年Rosenthal等在CHO细胞中表达hBDNF，经过阴离子DEAE柱，阳离子S-Sepharose柱，以及S-300 Sephacryl凝胶柱和C₄反相HPLC，最终得到纯度大于95％的rh BDNF，得率50ug/L，EC₅₀为1ng/ml。Kuüsel在人胚胎肾细胞中表达rh BDNF，5升培养液纯化仅得到1ug BDNF。用昆虫细胞表达系统，Meyer在sf-2细胞表达BDNF，经过CM-Sepharose柱和C₄反相HPLC纯化得到EC₅₀为44pg/ml的BDNF10-15ug/L。Negro在sf-g细胞表达，经过S-Sepharose柱和C₈反相HPLC纯化得到2mg/LBDNF。1992年，Neguolt等首次在原核系统大肠杆菌BL21(DE3)中表达mBDNF，T₇启动子，IPTG诱导，表达产物为包含体，纯化，复性后仅得到10ug/L。1995年，Fukuzono等构建了一株rBDNF的重组大肠杆菌，受体菌HB101，分泌型载体，Trp启动子，色氨酸诱导，表达产物仍主要以包含体形成(80％)存在，从包含体纯化每升菌液约得180ug rBDNF。

近年来国内也有一些实验室从事BDNF表达的研究。陈燕、何晓龙等以PET为载体在大肠杆菌中表达了包涵体形式的BDNF；陈谦等在COS7细胞中表达了生物活性的BDNF，但表达量极低，培养上清浓缩后，蛋白电泳经银染才看得见带型；李金照等在雏鸡的肌肉中表达BDNF，产物可促进损伤运动神经元的存活和再生，表明有生物活性；刘健等在成肌细胞中稳定表达了BDNF，产物也具生物活性，但表达量低，约为25ng(10⁶细胞数每ml每24h)。

从目前已有技术而言，虽然动物细胞表达系统得到的BDNF蛋白活性较高。但动物细胞培养条件要求高，成本高，表达量低，当前还主要处在实验室摸索阶段；大肠杆菌表达系统本身较成熟，易培养，对大规模生产更有利，但是仍然存在严重的缺陷，必须解决复性问题，而且产率也不高。

作为真核表达系统，甲醇酵母具有许多其它蛋白表达系统所不可比拟的优点。可概括如下：(1)具有强有力的乙醇氧化酶基因(AOX1)启动子，可严格调控外源蛋白的表达；(2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；(3)营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产；(4)可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达130g/L以上；(5)表达量高，许多蛋白可达到每升克以上水平，如破伤风毒素C片段表达量高达12g/L；(6)在Pichia Pastoris中表达的蛋白既可存在于胞内，又可分泌至胞外。Pichia自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有利于纯化。如表达的重组水蛭素(HIR)，仅经过二步层析纯化，纯度就高达97％以上；(7)糖基化程度低。和酿酒酵母相比，甲醇酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8-14个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均50-150甘露糖残基短得多。

甲醇酵母系统是近年来发展起来的一种蛋白表达宿主。它兼顾了动物细胞表达系统和大肠杆菌表达系统的优点而克服了彼此的不足(动物细胞表达系统：成本高、表达量低、培养条件高，难于工业化生产；大肠杆菌表达系统：产率也不高，纯化繁琐，需要复杂的变性和复性才能恢复生物活性)。本发明在克隆BDNF基因的基础上，在甲酵酵母系统中尝试着表达了这种神经营养因子。

目前，国内外还未见有BDNF和用作医药产品出售，美国Promega公司有分子生物学试剂级产品，BDNF为$240/5ug包装($4.8万/mg)，抗体为$255/200ug包装。因为用大肠杆菌表达BDNF表达量低，纯化繁琐，需要复杂的变性、复性才能恢复生物活性，并且复性率也不高(成熟BDNF含三对二硫键，容易形成不正确的二硫键连接)。这些问题造成成本过高，价格如此昂贵也就不足为奇了。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于提供一个新的具有实用价值的甲酵酵母表达系统，提供一个由甲酵酵母表达BDNF的制备方法，以及BDNF在制备治疗神经营养因子药物中的应用。

发明人克隆BDNF基因于质粒pUC，序列测定后，构建了甲醇酵母Pichia Pastoris重组胞内表达载体pPIC3.5K-BDNF。原生质球转化，G418、点杂交筛选。选出的高拷贝转化子经诱导后，在甲醇酵母中表达了BDNF。该工程菌已交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，登记入册编号为CGMCC No 0550。实现本发明的方法包括以下步骤：1.脑基因组DNA的提取和纯化；2.BDNF基因的扩增，克隆和测序；3.甲醇酵母重组表达载体的构建；4.重组表达载体pPIC3.5K-BDNF用SacI酶切线性化，原生质球方法转化甲醇酵母，G418筛选。得到的高抗性转化子抽提其DNA，用特异引物PCR扩增，以确证BDNF基因的整合；5 BDNF在甲醇酵母中的胞内表达；6 表达产物经盐沉淀，离子交换柱纯化，纯度达95％以上；7 BDNF表达产物的生物学活性测定。

到目前为止，国内外用甲醇酵母生产BDNF未见任何报道。本发明BDNF在甲醇酵母中的表达，无论表达生物量以及提取制备步骤都优于其它表达体系，所以为BDNF药物的生产和应用成为现实。

以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

具体实施方式(1)基因组DNA的提取和纯化。取0.6g液氮冻存的人胎儿脑组织，研磨后加入盛有5ml提取裂解液(3M异硫氰酸胍，0.01M醋酸钠)的离心管中，30℃摇床中温和振荡1h。用大口径吸管将脑组织裂解液加入盛有18ml乙醇的离心管液面以下，用玻棒缓慢搅拌至完全混匀。回收DNA，滴干乙醇后溶于2mlTE中，过DEAE微型柱纯化。(2)BDNF基因的扩增，克隆和测序。根据文献报道的BDNF基因序列，设计了BDNF基因5′末端引物，引物I：5′-ACTATG CAC TCT GAC CCT GCC AGA AGA G-3′虚线为BamHI位点。和BDNF基因3′末端引物(引物II)，引物II：5′-CACTTA TCT TCC CCT TTT AAT G-3′虚线为EcoRI位点。用PCR法，以纯化的DNA为模板，扩增BDNF基因。PCR条件为：94℃ 60s，50℃ 50s，72℃ 90s，反应30个循环，结束后72℃延伸10min。利用PCR产物两端的EcoRI和BamHI位点，将其克隆于pUC载体。连接、转化均按《分子克隆》进行。序列测定以pUC-BDNF为模板，T7 Primer为正向产物，α-³²P-dCTP为同位素标记。参照Pharmacia公司T7 Sequencing Kit说明书进行操作。经序列测定，BDNF基因是由如图1所示的357bp的核苷酸组成。(3)重组表达载体的构建(见图2)，转化和转化子的筛选。质粒pUC-BDNF和表达载体pPIC3.5K用EcoRI和XhoI双酶切，回收、连接、转化，在含卡那抗生素的平板上筛选阳性克隆pPIC3.5K-BDNF，并双酶切鉴定。重组表达载体用SacI酶切线性化，用原生质球方法转化甲醇酵母，转化子长出后在含G418的抗性平板上筛选，并不断提高G418的浓度，以得到高抗性的转化子。高抗性转化子用原位点杂交进一步确证，其中BDNF基因探针按随机引物标记Kit制备。原生质球法转化甲醇酵母GS115：试剂a)SOS：1M山梨醇，0.3X YPD，10mmol/L CaCl2b)SE： 1M山梨醇，25mmol/L EDTA(pH8.0)c)SCE：1M山梨醇，10mmol/L柠檬酸钠缓冲液pH5.8d)CaS：1M山梨醇，10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，10mmol/L CaCl2e)CaT：20mmol/L Tri-HCl(pH7.5)，20mmol/L CaCl2原生质球的制备a)将甲醇酵母SMD1168接种YPD平板，30℃培养2-3天，挑取单一克隆并接种到盛有10ml YPD培养基的100ml摇瓶，30℃，300rpm培养过夜。b)接种10μl上述菌悬液到含200ml YPD的500ml摇瓶。30℃300rpm培养至OD₆₀₀为0.2-0.3时，1500g离心5min，去掉上清。c)分别用20ml无菌水、20mlSED、20ml 1M山梨醇各洗涤细胞一次，每次洗完1500g离心5min，去上清。最后加20ml SCE重悬细胞。分成10ml的A、B两管。d)取19支无菌干净的1.5ml EP管，每管加800μl 5％SDS，并分别标上0、2、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、28、30、32、35、38、40、45分别代表Zymolyase消化细胞壁的时间(min)。从上述A管中取200μl菌悬液加入后，放入冷冻中，作为Zymolyase消化分钟的对照管。加7.5μl Zymolyase(2.25 Units)到A管，轻轻混匀，根据管中标记的时间，每次从A管取200μl正在消化的细胞悬液至装有0.8ml 5％SDS的EP管中，并立即放置冰中，以终止酶反应。e)依下列公式计算每个时间点形成原生质球的百分比：

原生质球％＝100-[(OD800(tmin)/OD800(0min))×100]并决定形成70％原生质球的反应时间。加7.5μl Zymolyase到B管，30℃保温，反应时间的长短依上述步骤确定(形成70％原生质球)。f)室温750g离心10min，去上清，分别用10ml 1M山梨醇、10ml CaS洗涤原生质球，去上清，最后用0.6ml CaS重悬原生质球，在30分钟之内用于转化。转化a)将10μg线性化的pPIC3.5K-BDNF载体与100μl刚制备的原生质球轻轻混合，室温放置10min。b)加1ml新配制的PEG/CaT(1∶1)溶液，轻轻混合，室温再放置10min。c)750g离心10min，尽可能吸去上清，用150μl SOS重悬细胞并静置20min，加850μl 1M山梨醇。d)每150μl已转化的原生质球与10ml熔化的RD琼脂糖培养基混合，并铺在RDB平板上层，28-30℃，培养4-6天并观察结果。转化子原位点杂交(Dot Blot)分析a.  选取经鉴定的转化子，以及阴性对照菌GS115接种到含600uL YEPD的Eppendorf管中，30℃培养24小时后，取30μL菌液转接到600μL YEPD中，30℃培养24小时。b.  取20μL菌液均匀点到硝酸纤维素薄膜上，同时将目的基因PCR扩增产物100℃变性5分钟后点到膜上，作阳性对照。待膜干燥后，有菌落的一面朝上，依次置于下列溶液饱和的几张滤纸上：

在50mmol/L EDTA，2.5％疏基乙醇，Ph9.0溶液中放置15分钟；

在1mol/L山梨醇，50mmol/L EDTA，pH7.5溶液中放置5分钟；

在1％的蜗牛酶，1mmol/L山梨醇，50mmol/L EDTA，pH7.5溶液中37℃放置2-3小时；

在0.2mol/L NaOH，0.6mmol/L NaCl溶液中放置5分钟；

在1ml/L Tris-HCl(pH7.5)，1.5mol/L NaCl溶液中放置5分钟；

用2×SSC溶液洗滤膜两次，每次5分钟。街滤膜在空气中干燥后，夹在滤纸中间，80℃烘烤2小时，备杂交用。c.  放射性探针的标记

按Promega公司生产的prime-a-Gene Labeling System Kit提供的方法，α-³²P-dCTP标记到目的基因的PCR扩增片段上，制备杂交探针。

将模板DNA于100℃处理2分钟，迅速放入冰中，按kit说明加入各反应液；

轻轻混合反应物，室温反应60分钟后，100℃变性2分钟，迅速放入冰中冷却，备杂交用。d.放射性标记的探针与固定在硝酸纤维素滤膜上的核酸进行杂交

将含有靶DNA的硝酸纤维素滤膜飘浮在一盘6×SSC的液面上，待其由下至上完全浸湿，将滤膜浸入液体内泡2分钟。

将湿润滤膜装入杂交袋中，按每平方厘米膜面积加入0.2ml预杂交液，放入42℃水浴中温育2小时，间或温和地摇动。预杂交液：6×SSC

      5×Denhardt试剂

      0.5％SDS

      100μg/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNA

      50％甲酰胺

取出杂交袋，剪去袋的一角，向预杂交液中加入经变性的探针，重新封口，再封于另一个未污染的袋内，放入42℃水浴中温育20小时，间或温和地摇动。e.  从水浴中取出杂交袋，并迅速剪开杂交袋，取出滤膜，放入400ml 2×SSC和0.5％SDS中，室温浸泡5分钟。

将滤膜转移到400mL 0.1×SSC和0.1％SDS中，37℃温育1小时。

再将滤膜转移到400mL 0.1×SSC和0.1％SDS中，68℃温育。用小型检测器检测膜上的放射性活度，直到阴性对照和阳性对照信号分别为阴性、阳性时，终止洗涤。f)将硝酸纤维素膜置于滤纸上，除去大部分液体，做好标记，置暗盒压上X光片，于-70曝光℃48小时后显影和定影。(4)BDNF的诱导表达。    高拷贝转化子接种于BMGY培养基，30℃摇瓶培养约24h后，离心，弃上清，用BMMY培养基悬浮酵母菌体，摇床培养，每隔24h加一次甲醇，并且每隔24h取2ml发酵液，离心去上清，得菌体。用酸洗的玻璃珠破细胞。0.1％SDS-15％PAGE和Western Blotting分析上清(见图3，4)。(5)表达产物的内切糖苷酶分析。    破细胞后的上清用终浓度为10％的三氯乙酸沉淀浓缩后，溶解。比色法测蛋白浓度。取约20ug的蛋白溶液，加入变性缓冲液(0.5％SDS，10％巯基乙醇)，100℃变性10分钟。然后加入0.05M的醋酸钠溶液(PH5.5)和3ul的内切糖苷酶H，37℃保温三小时。0.1％SDS-15％PAGE和Western Blotting分析结果(见图5，6)。(6)表达产物的纯化。    发酵培养液离心去除菌体，上清加硫酸铵至80％饱和度，4℃下沉淀6小时。离心得沉淀。沉淀溶解后，对25mM硼酸钠，pH9.0溶液长时间透析。透析好的样品上DEAE-Sephadex阴离子交换柱(2.5×12cm，已用25mM，pH9.0硼酸钠溶液平衡)。用0.1-1.0M NaCl(溶于平衡缓冲液中)梯度分部洗脱。合并有ELISA反应的分管，浓缩后对25mM磷酸缓冲液(PBS)、pH7.0溶液透析。透析好的样品上S-sepharose柱(2.5×20cm，预先用25mM PBS，pH7.0溶液平衡)，用0.1-0.5MNaCl溶液洗脱。收集有ELISA反应的部分，电泳分析。(7)表达产物的生物学活性测定。    样品分三种，即阳性对照NGF、胞内表达的55kD hBDNF、胞内表达55kD蛋白经内切糖苷酶消化后的14kD hBDNF。三者均经离子交换纯化，纯度达95％以上。培养细胞传3-4代后，调整细胞悬液至浓度为0.8×10⁵-1×10⁵个/mL，加入24孔培养板，每孔1mL，培养箱中培养1天。待细胞贴壁后，吸去培养液，加入1mL新鲜培养基，并加入不同量的四种样品(1至100ng范围之内)，以不加样品的培养孔为对照，继续培养2-4天。相差倒置显微镜下进行观察、计数(见图7-13)。结果重复三次，计数结果取平均值。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述：

附图说明

图1  BDNF基因序列测定结果

图2  重组胞内表达载体pPIC3.5K-BDNF的构建

图3  BDNF诱导表达结果

图4  BDNF的Western blotting鉴定

图5  表达产物经糖苷酶处理后的电泳分析

图6  表达产物经糖苷酶处理后的Western blott ing分析

图7  未加NTF处理的PC12细胞(阴性对照)

图8  阳性对照NGF促进PC12细胞长出突起

图9  阳性对照NGF促进PC12细胞分化曲线

图10 胞内表达的BDNF(55kD产物)促进PC12细胞长出突起

图11 胞内表达的BDNF(55kD产物)促进PC12细胞分化曲线

图12 胞内表达的BDNF(14kD产物)促进PC12细胞长出突起

图13 胞内表达的BDNF(14kD产物)促进PC12细胞分化曲线