在转基因动物中产生靶分子和纯化该靶分子的方法

摘要

本发明提供制备和纯化生物系统中存在的靶分子的系统和方法。根据本发明的系统和方法利用转基因表达的多价结合多肽作为纯化该靶分子的亲和介质,以纯化该靶分子。该转基因多价结合多肽既与靶分子(例如靶分子的可结合表位)结合,又与基质结合。

说明书

                         发明背景

近年来制备和纯化用于治疗和诊断目的的多肽已成为一项重要产业。重组多肽表达的早期尝试是利用质粒表达载体在细菌中进行的。例如，美国专利4,816,397公开了免疫球蛋白在细菌中的重组表达。这些方法由于需要打开或裂解细菌以获得作为含有细菌蛋白质和其它细菌成分的复杂混合液的一部分存在的重组多肽而受到限制。再一个限制是由重组多肽在细菌中的非天然氧化状态造成的，这种状态会导致不正确的多肽折叠。

这些问题中的一些通过多肽在哺乳动物细胞培养发酵系统中的重组表达而得到减轻。美国专利5,639,640公开了人促滤泡激素(FSH)在哺乳动物细胞培养物中的重组表达。不幸的是，操作这些哺乳动物细胞培养发酵系统极为昂贵，而且由此产生的多肽仍是含有生长培养基中存在的蛋白质的复杂混合物的一部分。

为了克服这些系统中存在的问题而作的努力导致了重组多肽在各种转基因动物系统中的转基因表达。这种努力使得可以高水平地转基因表达多肽，籍此消除制备重组多肽时对昂贵的哺乳动物细胞培养发酵系统的需求。然而，为了成为哺乳动物细胞培养系统的可行替代方法，维持这些动物的健康是重要的。而且，由此产生的多肽仍是奶蛋白质复杂混合物的部分(substituent)，因此需要方法从该混合物中纯化出这些多肽。

                         发明概述

本发明涉及在转基因动物中产生靶分子的方法及纯化该靶分子的方法。靶分子优选是靶多肽。本发明部分基于以下发现，即可以使靶多肽以无活性形式表达并分泌至转基因动物的奶中，然后再加以激活。这就使得可以避免由于在动物中以活性形式产生多肽而造成的复杂性。例如，已经发现在转基因动物的奶中生产某些蛋白质包括酶、生长因子、激素和细胞因子，会引起动物的健康问题。本发明的方法可以使这些问题最小化。本发明还涉及纯化生物系统如奶中存在的这些和其它靶分子的系统和方法。例如，这些系统和方法可以利用多价结合多肽，例如亲和配体，在奶中的转基因表达来纯化这些靶分子。优选地，该转基因多价结合多肽既能够结合靶分子又能结合预先选择的配体，例如可相分离(phase separable)的基质上的预先选择配体。

因此，一方面，本发明涉及在转基因动物中产生靶多肽的方法。该方法包括：产生处于无活性状态的多肽；获得此无活性多肽；和激活该多肽，以籍此提供靶多肽。

在一个优选实施方案中，多肽以无活性状态在转基因动物的组织或产物如体液(如奶)中产生。在一个优选实施方案中，从转基因动物获取含有无活性蛋白的组织或产物如奶。

在一个实施方案中，通过共表达靶多肽和结合多肽(该结合多肽可以结合该靶多肽并使之失活)，使靶多肽失活。在一个优选实施方案中，结合多肽和靶多肽以复合物形式存在于组织或产物如体液如奶中。

在一个优选实施方案中，靶多肽和结合多肽是配体和反配体(counterligand)，例如结合多肽是受体或配体、或它们的片段。在另一优选实施方案中，结合多肽是抗体或其片段。

在一个优选实施方案中，编码靶多肽的核酸处于组织特异性启动子的控制下，例如指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子的控制下。在一个优选实施方案中，编码结合多肽的核酸处于组织特异性启动子的控制下，例如指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子的控制下。优选地，编码靶多肽的核酸和编码结合多肽的核酸处于相同类型的启动子例如同一类型的组织特异性启动子的控制下。例如，两者均可以处于指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子的控制下，如两者可以处于相同的或不同的奶特异性启动子的控制下。奶特异性启动子可以是例如酪蛋白、乳球蛋白、乳清蛋白或乳清酸性蛋白(WAP)的启动子。

在一个优选实施方案中，编码结合多肽的核酸还在结合多肽之外编码一段序列，其中该序列编码至少一个氨基酸。例如，该核酸可以再包括一个对于结合多肽的纯化有用的氨基酸。在一个优选实施方案中，可以在结合多肽之外添加至少一个氨基酸，例如可以与预先选择的配体如用于纯化结合多肽的配体(如6×HIS配体、纤维素结合域(CBD)配体、麦芽糖结合蛋白(MBP)的配体)结合的一个额外的氨基酸或多个氨基酸。可以与预先选择的配体结合的该氨基酸(或多个氨基酸)在本文中又称作结合部分(binding moiety)，例如能够结合预先选择的配体或基质的结合部分。

在一个优选实施方案中，该方法还包括在激活前从组织或产物如体液如奶中分离无活性多肽。在一个优选实施方案中，无活性多肽通过结合多肽/靶多肽复合物的结合部分与预先选择的配体的结合，自体液如奶中被分离出来，其中所述配体例子有6×HIS配体(如金属螯合柱)、CBD配体(例如纤维素)、或MBP配体(例如麦芽糖)。

在再一实施方案中，通过修饰激活多肽所必需的位点，例如修饰切割位点，使靶多肽失活。该切割位点可以是例如允许去除多肽的一部分的切割位点，如允许去除多肽的前(pre)和/或原(pro)区域的位点。在一个优选实施方案中，对切割位点进行修饰以便它不再被加工酶如天然存在于组织或产物中的内源性加工酶所识别。

在优选实施方案中，通过修饰位点如切割位点而失活的靶多肽可以再包括一个允许激活发生的其它位点，例如允许切割如多肽前和/或原区域的切割得以发生的位点。在一个优选实施方案中，可以使蛋白水解切割的内源性位点失活并提供一个新位点。该新位点可以通过修饰内源性切割位点和/或通过加入一个额外的氨基酸或多个氨基酸来提供。优选地，新位点不能被天然存在于组织或产物中的任何内源性加工酶切割。例如，可以对转基因动物的奶中存在的蛋白酶所切割的位点进行修饰，并可以在该多肽中加入能够通过与外源性化学药品或酶接触而切割的位点。在一个优选实施方案中，外源性化学药品是：酸，如溴化氰。在另一优选实施方案中，外源性酶是外源性蛋白酶如凝乳酶。

在一个优选实施方案中，切割此额外位点以便靶多肽不包括任何外来序列。在另一优选实施方案中，切割该位点以便靶多肽包括少于20、10、5、4、3、2或1个外来氨基酸残基。

在一个优选实施方案中，靶多肽是人多肽。在一个优选实施方案中，该多肽是：激素、生长因子、细胞因子。在优选实施方案中，该多肽是：骨基质蛋白(BMP)如BMP-2；促红细胞生成素；胰岛素；人生长因子；转化生长因子β。

在一个优选实施方案中，该转基因动物是哺乳动物，如山羊、奶牛、绵羊、兔、猪、马、骆驼、美洲驼(llama)、小鼠或大鼠。

另一方面，本发明涉及转基因生产靶多肽的方法。该方法包括：提供具有处于组织特异性启动子(例如指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子)控制下编码靶多肽的核酸、和处于组织特异性启动子(例如指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子)控制下编码与靶多肽结合的多肽的核酸的转基因动物；使靶多肽和结合多肽可以在转基因动物的组织或产物例如转基因动物的奶中表达；将靶多肽与结合多肽分离开来，以籍此提供靶多肽。

在一个优选实施方案，靶多肽和结合多肽是配体和反配体，例如结合多肽是受体或配体、或它们的片段。在另一优选实施方案中，结合多肽是抗体、或其片段。

在一个优选实施方案中，编码结合多肽的核酸在结合多肽之外还编码一段序列，该序列编码至少一个氨基酸。例如，该核酸还可以包括在结合多肽的纯化中有用的氨基酸。在一个优选实施方案中，可以在结合多肽之外添加至少一个氨基酸，例如能够与预先选择的配体结合的额外氨基酸或多个氨基酸，所述配体的例子有用于纯化结合多肽的配体如6×HIS配体、纤维素结合域(CBD)配体、麦芽糖结合蛋白(MBP)配体。能够与预先选择的配体结合的该氨基酸(或多个氨基酸)在本文中又称作结合部分，例如能够结合预先选择的配体或基质的结合部分。

在一个优选实施方案中，结合多肽和靶多肽作为复合物存在于转基因动物的组织如奶中。

在一个优选实施方案中，该方法还包括在激活前从组织或产物如体液如奶中分离无活性的靶多肽。在一个优选实施方案中，无活性多肽通过结合多肽/靶多肽复合物的结合部分与预先选择的配体的结合，自体液如奶中被分离出来，其中所述配体的例子有6×HIS配体(如金属螯合柱)、CBD配体(例如纤维素)、或MBP配体(例如麦芽糖)。

在一个优选实施方案中，指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子是：酪蛋白启动子，如β酪蛋白启动子；乳球蛋白启动子，如β乳球蛋白启动子；乳清酸性蛋白启动子；乳清蛋白启动子。

在一个优选实施方案中，结合多肽和靶多肽处于相同类型的组织特异性启动子的控制下，例如两者均处于指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子的控制下，如两者处于相同或不同的奶特异性启动子的控制下。

在一个优选实施方案中，转基因动物是非人哺乳动物。在一个优选实施方案中，哺乳动物是：山羊、奶牛、绵羊、兔、猪、马、美洲驼、骆驼、小鼠、大鼠。

另一方面，本发明涉及获得(如纯化)靶多肽的转基因系统。该系统包括表达转基因多价结合多肽的动物如哺乳动物。该多价结合多肽包括与靶多肽结合的第一结合部分、和与预先选择的配体如基质上预先选择的配体结合的第二结合部分。

在一个优选实施方案中，转基因哺乳动物以组织特异性方式表达转基因多价结合多肽，例如转基因哺乳动物在组织或产物如体液(如奶、尿或血液)中表达多价结合多肽。在一个优选实施方案中，哺乳动物在奶中表达转基因多价多肽，而且编码多价结合多肽的核酸处于指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子的控制下，如酪蛋白、乳球蛋白、乳清蛋白或乳清酸性蛋白(WAP)启动子的控制下。

在一个优选实施方案中，转基因哺乳动物是山羊、奶牛、绵羊、兔、猪、马、骆驼、美洲驼、小鼠或大鼠。

在一个优选实施方案中，多价结合多肽以高水平，如至少0.1、1、5、10mg/ml的水平，在产物如体液中表达。

在一个优选实施方案中，该系统还包括多价结合多肽的第二结合部分能与之结合的基质。

在一个优选实施方案中，靶多肽包括可结合表位，例如与多价结合多肽的第一结合部分结合的表位。在一个优选实施方案中，可结合表位是可去除的，例如可以从靶多肽的剩余部分除去如切除该可结合表位。在一个优选实施方案中，可以由催化部分除去可结合表位。优选地，该催化部分是第二多价结合多肽，例如转基因产生的第二多价结合多肽，的一部分。在一个优选实施方案中，第二多价结合多肽，如第二转基因产生的多价结合多肽，包括第一催化域及第二结合域，该结合域特异结合预先选择的配体，例如基质(如与第一转基因多价结合多肽的第二结合部分所特异结合的基质不同的基质)上预先选择的配体。

在一个优选实施方案中，靶多肽和多价结合多肽均通过转基因方式在奶中表达。靶多肽和多价多肽可以由不同的动物或由相同动物表达。在另一优选实施方案中，靶多肽和第一及第二多价多肽均通过转基因方式在奶中表达。所有这些多肽可以由不同的动物表达，或者两个或多个多肽可以由相同动物产生。

尽管以下系统涉及多价结合多肽和基质及随后和靶标的结合，但相反的顺序同样适合所有实施方案中。

另一方面，本发明涉及从生物系统中获得，如纯化，靶多肽的方法。优选地，靶多肽包括可结合表位。该方法包括：用转基因表达的多价结合多肽接触来自生物系统的包括靶多肽在内的组合物，以形成反应混合物，籍此从生物系统中获得靶多肽。优选地，多价结合多肽包括结合靶分子(例如结合靶分子的表位)的第一结合部分，和结合基质的第二结合部分。

在一个优选实施方案中，该方法还包括：保持组合物和多价结合多肽的混合物，以便多价结合多肽的第一结合部分能够结合靶多肽，例如靶多肽的可结合表位。在一个优选实施方案中，该方法还包括：用能够和多价结合多肽的第二结合部分结合的基质接触该混合物，并允许多价结合多肽的第二结合部分与基质结合。在一个优选实施方案中，该方法还包括：去除混合物中所有未结合的成分，并从混合物中获得，如洗脱，靶多肽，籍此获得靶多肽。

在一个优选实施方案中，靶多肽包括可结合表位，如与多价结合多肽的第一结合部分结合的表位。在一个优选实施方案中，可结合表位可以被去除，例如可以从靶多肽的剩余部分去除，如切除，可结合表位。在一个优选实施方案中，可结合表位可以通过催化部分去除。优选地，催化部分是第二多价结合多肽，例如第二转基因产生的多价结合多肽，的一部分。在一个优选实施方案中，第二多价结合多肽，例如第二转基因产生的多价结合多肽，包括第一催化域及第二特异结合基质(例如不同于第一转基因多价结合多肽的第二结合部分所特异结合的基质的基质)的结合部分。

在一个优选实施方案中，来自生物系统的组合物可以是从转基因动物如转基因哺乳动物获得的产物。例如，该产物可以是液体，如奶、尿或血。

在一个优选实施方案中，用含有转基因多价结合多肽的样品如体液(如奶、尿或血)接触来自生物系统的组合物。

优选地，奶含有高水平，例如至少0.1、1、5、10mg/ml，的转基因多价结合蛋白。

在一个优选实施方案中，靶多肽和多价结合多肽均在奶中表达。靶多肽和多价结合多肽可以由不同的动物或相同的动物表达。在另一个优选实施方案中，靶多肽和第一及第二多价多肽均通过转基因方式在奶中表达。所有这些多肽均可以由不同的动物表达，或两个或多个多肽可以由相同动物产生。

尽管以下系统涉及多价结合多肽和基质及随后和靶标的结合，但相反的顺序同样适合所有实施方案。

另一方面，本发明涉及能够用于表达和/或获得，如纯化，靶多肽(如包括可结合表位的靶多肽)的多动物转基因系统。

该系统包括表达转基因多价结合多肽的第一转基因动物如转基因哺乳动物，该多价结合多肽包括结合靶多肽(如结合靶多肽的可结合表位)的第一结合部分，以及结合基质的第二结合部分。优选地，该第一转基因动物在产物如体液(如奶、血、尿)中表达多价结合多肽。在一个优选实施方案中，多价结合多肽以高水平，例如至少0.1、1、5、10mg/ml的水平，存在于第一转基因动物的奶中。

在一个优选实施方案中，第一转基因动物是转基因哺乳动物。优选地，转基因哺乳动物以组织特异方式表达转基因多价结合多肽，例如该转基因哺乳动物在体液如奶、尿或血中表达多价结合多肽。在一个优选实施方案中，该哺乳动物在奶中表达转基因多价多肽，而编码多价结合多肽的DNA序列处于指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子的控制下，例如酪蛋白、乳球蛋白、乳清蛋白或乳清酸性蛋白(WAP)启动子的控制下。

该系统还包括表达靶多肽(例如包括可结合表位的靶多肽)的第二转基因动物，如转基因哺乳动物。优选地，第二转基因动物在样品如体液(如奶、血、尿)中表达靶多肽。在一个优选实施方案中，靶多肽以高水平，例如至少0.1、1、5、10mg/ml的水平，存在于第二动物的奶中。

在一个优选实施方案中，第二转基因动物是转基因哺乳动物。优选地，第二转基因哺乳动物以组织特异性方式表达靶多肽，例如该转基因哺乳动物在体液如奶、尿或血中表达靶多肽。在一个优选实施方案中，该哺乳动物在奶中表达靶多肽，而编码靶多肽的DNA序列处于指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子，如酪蛋白、乳球蛋白、乳清蛋白或乳清酸性蛋白(WAP)启动子，的控制下。

在一个优选实施方案中，该系统还包括多价结合多肽的第二结合部分能够结合的基质。

在一个优选实施方案中，可结合表位是可以去除的，例如可以从靶多肽的剩余部分去除，如切除，该可结合表位。在一个优选实施方案中，可结合表位可以通过催化部分除去。优选地，该催化部分是第二多价结合多肽(如第二转基因产生的多价结合多肽)的一部分。在一个优选实施方案中，第二多价结合多肽，例如第二转基因产生的多价结合多肽，包括第一催化域和第二特异结合基质(例如不同于第一转基因多价结合多肽的第二结合部分所特异结合的基质的基质)的结合部分。第二多价结合多肽可以：由表达第一多价结合多肽的同一转基因动物产生；由产生靶多肽的转基因动物产生；或由不同于产生第一多价结合多肽或靶多肽的动物的转基因动物产生。

尽管以下系统涉及多价结合多肽和基质及随后和靶标的结合，但相反的顺序同样适合所有实施方案。

另一方面，本发明提供从产物如体液(如奶、血、尿)中表达和/或获得靶多肽(例如包括可结合表位的靶多肽)的方法。该方法包括：从转基因动物获得包括靶多肽的产物如体液(如奶)；和用转基因多价结合肽接触包括靶多肽的产物如体液(如奶)，以形成反应混合物。优选地，多价结合多肽包括能够结合靶多肽的第一结合部分，及能够结合预先选择的配体如基质的第二结合部分。在一个优选实施方案中，该方法还包括：保持靶多肽和多价多肽的混合物，以便多价结合多肽的第一结合部分与靶多肽结合，例如与靶多肽的可结合表位结合。在一个优选实施方案中，该方法还包括：用第二结合部分可结合的基质接触该混合物，并允许多价结合多肽的第二结合部分与基质结合。该方法还可以包括除去混合物中所有未结合的成分，并从混合物中选择性地移出，如洗脱，靶多肽。

在一个优选实施方案中，多价结合多肽在转基因动物的奶中表达。在一个优选实施方案中，多价多肽在表达靶多肽的同一转基因动物的奶中表达，或在不同转基因动物的奶中表达。在一个优选实施方案中，转基因多价结合多肽以高水平，例如至少0.1、1、5、10mg/ml的水平，存在于动物的奶中。

尽管以下方法涉及多价结合多肽和基质及随后和靶标的结合，但相反的顺序同样适合所有实施方案。

另一方面，本发明涉及用于表达和/或获得，如纯化，靶多肽(如包括可结合表位的靶多肽)的转基因动物系统。该系统包括在乳腺组织中表达转基因多价结合多肽的转基因动物。优选地，多价结合多肽包括特异结合靶多肽(例如结合靶多肽的可结合表位)的第一结合部分，及结合基质的第二结合部分。此外，该转基因动物还在其乳腺组织中表达靶多肽，例如包括可结合表位的靶多肽。

在一个优选实施方案中，该哺乳动物在奶中表达转基因多价多肽，而编码多价结合多肽的DNA序列处于指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子，如酪蛋白、乳球蛋白、乳清蛋白或乳清酸性蛋白(WAP)启动子，的控制下。在一个优选实施方案中，该哺乳动物在奶中表达靶多肽，而编码靶多肽的DNA序列处于指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子，如酪蛋白、乳球蛋白、乳清蛋白或乳清酸性蛋白(WAP)启动子，的控制下。

在一个优选实施方案中，多价结合多肽以高水平，例如至少0.1、1、5、10mg/ml的水平，存在于转基因动物的奶中。在另一优选实施方案中，靶多肽以高水平，例如至少0.1、1、5、10mg/ml的水平，存在于同一转基因动物的奶中。优选地，多价结合多肽和靶多肽均以高水平，例如每个以至少0.1、1、5、10mg/ml的水平，存在。

在一个优选实施方案中，该系统还包括第二结合部分能特异结合的基质。

在一个优选实施方案中，靶多肽的可结合表位是可以去除的，例如可以从靶多肽的剩余部分去除如切除该可结合表位。在一个优选实施方案中，可结合表位可以通过催化部分除去。优选地，该催化部分是第二多价结合多肽(如第二转基因产生的多价结合多肽)的一部分。在一个优选实施方案中，第二多价结合多肽，例如第二转基因产生的多价结合多肽，包括第一催化域和特异结合基质(例如不同于第一转基因多价结合多肽的第二结合部分所特异结合的基质的基质)的第二结合部分。第二多价结合多肽可以：由表达第一多价结合多肽和/或靶多肽的同一转基因动物表达；或由表达第一多价结合多肽和/或靶多肽的转基因动物以外的转基因动物表达。

尽管以下系统涉及多价结合多肽和基质及随后和靶标的结合，但相反的顺序同样适合所有实施方案。

另一方面，本发明涉及表达和/或获得，如纯化，靶多肽(如包括可结合表位的靶多肽)的方法。该方法包括：从转基因动物获得包括有转基因多价结合多肽和靶多肽(如包括可结合表位的靶多肽)的混合物的奶。优选地，多价结合多肽包括能够结合靶多肽如靶多肽上的可结合表位的第一结合部分，及能够结合基质的第二结合部分。该方法还可以包括：允许多价结合多肽的第一结合部分和靶多肽如靶多肽的可结合表位结合。在一个优选实施方案中，该方法还包括：用第二结合部分所特异结合的基质接触该混合物，并允许多价结合肽的第二结合部分与基质结合。在一个优选实施方案中，该方法还包括除去混合物中所有未结合的成分，并选择性地从混合物中移出如洗脱靶多肽。

在一个优选实施方案中，多价结合多肽以高水平，例如至少0.1、1、5、10mg/ml的水平，存在于转基因动物的奶中。在另一优选实施方案中，靶多肽以高水平，例如至少0.1、1、5、10mg/ml的水平，存在于同一转基因动物的奶中。优选地，多价结合多肽和靶多肽均以高水平存在，例如每个都以至少0.1、1、5、10mg/ml的水平存在。

尽管以下方法涉及多价结合多肽和基质及随后和靶标的接触，但相反的顺序同样适合所有实施方案。

这些系统和方法提供了许多优于现有系统的优点。尤其是，由于避免了单独纯化亲和配体以及使它们与功能化的亲和基质偶联的需要，所以根据本发明的系统和方法极大地降低了纯化这些生物学分子的时间和费用。

为了本发明的目的，除非明确说明，以下术语具有本节段所述的意义。“表位”或“可结合表位”是指结合部分所特异结合的三维分子形状。“结合部分”是指转基因多价结合多肽中特异与表位结合的多肽部分。

“多肽”、“蛋白”和“肽”在本文中可互换使用。多肽可以是糖基化的或未糖基化的。这些多肽可以包括约3、4、5、6或更多个氨基酸，并还可以包括二级、三级或四级结构、以及与其它肽或其它非肽分子的分子间缔合。这些分子间缔合可以通过，但不限于，共价键(如通过二硫键)、或通过螯合、静电相互作用、疏水相互作用、氢键、离子-偶极相互作用、偶极-偶极相互作用、或以上的任何组合来实现。“多肽部分(portion)”包含约3至约100个连续和/或不连续的氨基酸，并可以是糖基化的或未糖基化的。

“含肽表位”是指该表位至少部分地由来自肽的氨基酸残基的免疫学决定簇组成。“含糖表位”是指该表位至少部分地由来自分子的糖部分的免疫学决定簇组成。“含脂表位”是指该表位至少部分地由来自分子的脂部分的免疫学决定簇组成。“免疫学决定簇”是指对表位整个三维形状有贡献的一种三维形状。

“来自氨基酸残基的免疫学决定簇”是指这样一种免疫学决定簇，其中氨基酸残基的所有或部分侧链和/或α碳原子和/或两个肽键之一或两个肽键和/或氨基和/或羧基端对该免疫学决定簇的三维形状有贡献。

“转基因多价结合多肽”是通过转基因产生的多肽，该多肽包括结合生物系统中存在的靶分子的可结合表位的第一结合部分、和结合基质的第二结合部分。

“靶分子”是待纯化的任何分子。尽管在对本发明系统和方法的上述整个描述中采用了术语“靶多肽”，但本文所述的其它靶分子也可以在所有的实施方案中使用。

“生物系统”包括体外细胞或组织提取物、真核或原核细胞培养物、组织培养物、器官培养物、活的植物和动物、以及活的植物或动物的提取物。

“基质”是能够与生物系统进行相分离(phase separated)的物质。

“特异结合”是指在实施结合的条件下，例如pH4-9及离子强度50mM-1M的条件下，(这些条件具体地包括了奶中存在的条件)，以至少10⁴M^-1、更优选10⁶M^-1、最优选至少10⁹M^-1的亲和力形成共价或非共价缔合。

“可去除的表位”是指该表位能够，优选通过化学或酶学切割的方式，与分子物理地分离。

“高水平”表达是指至少约0.1mg/ml、优选至少约0.5mg/ml、最优选至少约1mg/ml。

“选择性地洗脱”是指从转基因多价结合多肽上解离靶分子，优选该转基因多价结合多肽并不从基质上解离下来。

本文所用“转基因动物”是非人动物，其中该动物的一个或多个、优选基本上所有的细胞含有由于人类干预(例如通过本领域已知的转基因技术)而引入的异源核酸。转基因可以通过有意的遗传操作，如通过显微注射或重组病毒感染，直接地或通过导入细胞前体中间接地，被引入细胞中。

哺乳动物在本文中定义为除人之外具有乳腺并产奶的所有动物。

本文所用“产奶动物”是指产生奶的动物。在优选实施方案中，产奶动物产生大量的奶并具有长的泌乳期，例如奶牛或山羊。

本文所用术语“植物”是指整株植物、植物的部分、植物细胞、或一组植物细胞。能够在本发明方法中使用的植物类型一般广泛到易于接受转化技术作用的高等植物类型，包括单子叶植物和双子叶植物。它包括了各种倍性水平(包括多倍体、二倍体和单倍体)的植物。

术语“纯化的”靶多肽，在本文中用于指当由表达该靶多肽的细胞产生时该多肽基本上不含有细胞物质。词“基础上不含有细胞物质”包括与产生它的细胞的细胞成分分离开来的靶多肽制品。在一个实施方案中，词“基本上无细胞物质”包括含有少于约30％(按干重计)非靶多肽(本文中又称作“蛋白杂质”或“污染蛋白”)、更优选少于约20％非靶多肽、再更优选少于约10％非靶多肽、最优选少于约5％非靶多肽的靶多肽制品。

通过以下详述和权利要求书，本发明的其它特性和优点将是明显的。

                        附图简述图1描述了其中靶分子和多价结合多肽来自不同来源的实施方案。图2描述了其中靶分子和转基因多价结合多肽来自同一来源的实施方案。图3描述了其中靶分子的可去除表位由第二多价结合多肽的催化部分去除的实施方案，其中该第二多价结合多肽还与基质结合。第二多价多肽结合的基质与靶分子/第一多价结合多肽结合的基质不同。

                        发明详述

本发明涉及从生物系统中转基因表达和纯化多肽。更具体地，本发明涉及表达和纯化多肽的转基因系统、和使用这些系统的方法。本文引用的专利和出版物反映了本领域技术人员已有的知识，特此完整地并入本文作用参考。

本发明提供纯化生物系统中存在的靶分子的系统和方法。根据本发明的系统和方法利用存在的多价结合多肽，如转基因产生的多价结合多肽，作为亲和介质，以纯化这些靶分子。优选地，多价结合多肽既结合靶分子又结合基质，如可进行相分离的基质。这些系统和方法提供了许多优于现有系统的优点。根据本发明的系统和方法由于不需要单独纯化亲和配体和使亲和基质功能化，而极大地降低了纯化靶分子的时间和费用。在某些实施方案中，待纯化的生物分子是多肽。在这些实施方案中，本发明提供表达和纯化这些靶分子的系统和方法，由此进一步简化了生产过程并降低了费用。靶多肽和多价结合多肽可以通过转基因方式在如动物的奶中表达，所述动物可以是不同动物或是相同动物。尽管以下方法和系统一般涉及多价结合多肽与基质及随后与靶标的接触，但相反的顺序同样适合所有实施方案。

本发明提供纯化包括有可结合表位的靶分子的转基因系统。该系统包括表达，例如在乳腺组织中表达，转基因多价结合多肽的转基因动物。该多价多肽包括结合靶多肽(如结合靶多肽的可结合表位)的第一结合部分，和结合基质的第二结合部分。优选地，该系统还包括多价结合多肽的第二结合部分特异结合的基质。

该转基因动物可以以组织特异性方式表达多价结合多肽。该组织特异性表达可以通过将编码靶蛋白的序列置于组织特异性启动子，例如指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子，的控制下来实现。奶特异性启动子可以包括：酪蛋白启动子(例如α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白或λ-酪蛋白启动子)；WAP启动子；β-乳球蛋白；和乳清蛋白。

靶分子可以包括：核酸、核苷酸、核苷、糖、脂、激素、生长因子、酶辅因子、其它天然存在的配体、和多肽。靶分子的可结合表位可以包括：含糖表位、含脂表位和含肽表位、以及含有这些的任意组合的表位。靶分子可以是内源性或外源性分子。

本发明还可以包括表达和/或纯化靶多肽，如具有可结合表位的靶多肽，的多动物转基因系统。该系统可以包括表达，例如在乳腺组织中表达，转基因多价结合多肽的第一转基因动物。该转基因多价结合多肽可以包括特异结合靶多肽，如靶多肽的可结合表位，的第一结合部分，和特异结合基质的第二结合部分。该系统还可以包括表达，例如在乳腺组织中表达，具有可结合表位的靶多肽的第二动物。该系统还可以包括第二结合部分特异结合的基质。

第二动物可以是表达靶多肽的转基因动物。例如，第二个动物可以是以组织特异性方式表达靶多肽的转基因动物，例如它在乳腺组织中表达靶多肽。靶分子的可结合表位可以是可去除表位。例如，该表位可以由第二多价结合多肽，如转基因产生的第二多价多肽，的催化部分去除。第二转基因多价结合多肽可以包括第一催化域和特异结合基质的第二结合部分。优选地，该第二多价结合多肽的第二结合部分所特异结合的基质不同于第一转基因多价结合多肽的第二结合部分所特异结合的基质。第二多价结合多肽的催化域可以催化将可结合表位和可去除表位切开。例如，该催化域可以具有酰胺酶活性。

本发明还可以涉及表达和/或纯化靶多肽，如包括可结合表位的靶多肽，的单动物转基因系统。该系统包括：表达(例如在乳腺组织中表达)转基因多价结合多肽、并表达(例如在乳腺组织中表达)靶多肽的转基因动物。多价结合多肽可以包括结合靶多肽的可结合表位的第一结合部分和结合基质的第二结合部分。

多价结合多肽和靶多肽可以在相同或不同的组织中表达。例如靶多肽编码序列可以处于通用启动子的控制下，而多价结合多肽编码序列可以处于组织特异性启动子的控制下，或相反；靶多肽编码序列可以处于组织特异性启动子的控制下，而多价多肽编码序列可以处于不同组织类型的组织特异性启动子的控制下，例如靶多肽编码序列可以处于尿特异性启动子的控制下，而多价结合多肽编码序列可以处于奶特异性启动子的控制下；多价结合多肽编码序列和靶多肽编码序列可以处于相同组织类型的组织特异性启动子的控制下，例如多价结合多肽编码序列可以处于奶特异性启动子的控制下，而靶多肽编码序列可以处于另一或相同的奶特异性启动子的控制下。

优选地，多价结合多肽和靶多肽在转基因动物的奶中表达。转基因多价结合多肽优选以充足的水平存在于奶中，以便结合至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或所有的靶分子。例如，多价结合多肽可以以高水平，例如至少0.1、1、5、10mg/ml的水平，存在于转基因动物的奶中。此外，靶多肽也优选以高水平，例如至少0.1、1、5、10mg/ml的水平，存在于相同转基因动物的奶中。

该系统还可以包括多价结合多肽的第二结合部分特异结合的基质。

靶分子的可结合表位可以是可去除的表位。例如，该表位可以由第二多价结合多肽，如第二转基因产生的多价多肽，的催化部分去除。第二转基因多价结合多肽可以包括第一催化域和特异结合基质的第二结合部分。优选地，该第二转基因多价结合多肽的第二结合部分所特异结合的基质不同于第一转基因多价结合多肽的第二结合部分所特异结合的基质。第二多价结合多肽的催化域可以催化将可结合表位和可去除表位切开。例如，该催化域可以具有酰胺酶活性。

靶多肽可以以无活性形式在动物的乳腺组织中表达。在不期望靶多肽在乳腺组织中行使其生物学功能的情况下，该方面可能是尤其有利的。例如，多价结合多肽的第一结合部分可以以防止靶多肽行使其生物学功能的方式结合靶多肽，直到靶多肽被选择性洗脱为止；或者可结合表位可以是可去除表位，在该表位被去除之前具有此可结合表位的靶多肽是无生物学活性。在一些实施方案中，结合部分可以除去可去除表位。

本发明还涉及从生物学系统中获得，如纯化，包括有可结合表位的靶分子的方法。该方法可以利用上述任一个系统。该方法可以包括：用来自生物系统的物质组合物接触多价结合多肽，如本文所述的任何多价结合多肽，以形成反应混合物。该物质组合物可以包括具有可结合表位的靶分子。在该混合物中，多价结合多肽的第一结合部分可以与靶分子的可结合表位结合。优选地，保持反应混合物，以致多价结合多肽的第一结合部分与靶分子的可结合表位结合。还可以用第二结合部分结合的基质接触该混合物。在基质存在时，多价结合多肽的第二结合部分可以与基质结合，然后可以除去混合物中任何未结合的成分。之后可以从物质组合物中获得，如洗脱，靶分子。

该方法还可以包括提供包括有靶分子的样品，如体液如奶、尿、血。可以用本文所述多价结合多肽接触样品，以获得靶分子。例如，可以从动物如转基因动物获得包括有靶多肽的样品。优选地，可以从在其奶中表达靶分子的动物获得样品，例如可以通过给动物挤奶获得样品。该动物可以是包含有处于奶特异性启动子控制下的编码靶多肽的核苷酸序列的任何转基因动物。

本发明还涉及获得，如纯化，靶分子，如具有可结合表位的靶分子，的方法。该方法可以包括：提供含有靶分子(如靶多肽)和多价结合多肽(即本文所述多价结合多肽)的体液如奶。例如，可以从在体液如奶中表达靶多肽和多价结合多肽的转基因动物获得该体液如奶。该方法还包括用第二结合部分与之结合的基质接触该体液。在基质存在时，多价结合肽的第二结合部分可以与基质结合，然后可以除去混合物中任何未结合的成分。之后可以从物质组合物中获得如洗脱靶分子。

优选地，用含有足够水平的多价结合多肽的奶接触来自生物学系统的物质组合物，以从该物质组合物中获得至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或所有的靶分子。例如，由于转基因结合蛋白在乳腺组织中表达并分泌至奶中，所以奶中可以含有高水平的该蛋白。优选地，转基因多价结合多肽以至少0.1、1、5、10mg/ml的水平存在于奶中。

生物学系统包括例如植物、真菌、细菌和动物产物。来自生物系统的组合物可以包括：条件培养基、组织提取物、器官和体液(如血液、血浆、血清、汗液、唾液、尿、奶等)。这些植物、真菌、细菌和动物产物可以包括内源性基因或外源提供的基因表达的多肽。

在所有这些方法中，靶分子的可结合表位可以是可去除表位。例如，该表位可以由第二多价结合多肽，如第二转基因产生的多价多肽，的催化部分除去。第二转基因多价结合多肽可以包括第一催化域和特异结合基质的第二结合部分。优选地，该第二转基因多价结合多肽的第二结合部分所特异结合的基质不同于第一转基因多价结合多肽的第二结合部分所特异结合的基质。第二多价结合多肽的催化域可以催化将可结合表位和可去除表位切开。例如，该催化域可以具有酰胺酶活性。当该表位是可去除表位时，可以通过从靶分子上除去该表位而从混合物中获得靶多肽。

靶多肽可以以无活性形式在动物的乳腺组织中表达。在不期望靶多肽在乳腺组织中行使其生物学功能的情况下，该方面可能是尤其有利的。例如，多价结合多肽的第一结合部分可以以防止靶多肽行使其生物学功能的方式与靶多肽结合，直到该靶多肽被选择性洗脱为止；或者可结合表位可以是可去除表位，在该表位被去除之前具有此可结合表位的靶多肽是无生物学活性的。在一些实施方案中，结合部分可以除去可去除表位。多价结合多肽中结合靶分平的结合部分

本发明的多价结合多肽包括可以结合靶分子，如靶分子的可结合表位，的第一结合部分。优选的第一结合部分包括：抗体、其Fab或F(ab)₂片段、或包含特异结合靶分子的可结合表位的抗体互补决定区的多肽部分、与靶分子的可结合表位结合的配体或受体、或与靶分子的可结合表位特异结合的任何其它多肽部分，例如在例如噬菌体展示或双杂交分析中选出的发生结合的多肽。

抗体或其片段

本领域熟知如何制备抗体和各种抗体衍生物。例如，Jones等，Nature321：522-525(1986)公开了用小鼠抗体的CDR替代人抗体的CDR。Marx，Science 229：455-456(1985)讨论了具有小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。Rodwell，Nature 342：99-100(1989)讨论了从抗体CDR信息获得的较低分子量识别元件。Clackson，Br.J Rheumatol.3052：36-39(1991)讨论了遗传工程单克隆抗体，包括Fv片段衍生物、单链抗体、融合蛋白嵌合抗体和人源化啮齿类动物抗体。Reichman等，Nature332：323-327(1988)公开了其上嫁接了大鼠超变区的人抗体。Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988)给出了在人抗体上嫁接小鼠抗原结合位点的指导。多价结合多肽中结合基质的结合部分

本发明多价结合多肽还包括结合基质的第二结合部分。当基质含有抗体特异结合的抗原或其表位时，第二结合部分可以包括例如抗体或抗体衍生物。在这些实施方案中，抗体和抗原的相互作用必需足够强以防止它们在洗脱靶分子的条件下发生解离。其它优选的第二结合部分-基质对包括，但不限于，聚组氨酸-镍金属螯合物(用＜250mM的咪唑或低pH洗脱)、链霉亲和素-生物素(用6M尿素、pH4.0洗脱)、Flag^TM肽-特异的MAb(用pH3.0或2-5mM EDTA洗脱)、S-肽-S-蛋白核酸酶(自切割后洗脱)、谷胱苷肽-S-转移酶-谷胱苷肽(用5-10mM还原谷胱苷肽洗脱)、蛋白A或合成的蛋白A的ZZ域-IgG(以低pH洗脱)、IgG Fc区-蛋白A(以低pH洗脱)、麦芽糖结合域-交联的直链淀粉(用10mM麦芽糖洗脱)、和纤维素结合域(CBD)-纤维素或几丁质(用水或＞4M胍或1M或更高的NaOH洗脱)。目前纤维素结合域-纤维素或几丁质对是最优选的。对于抗体的纯化，一个最优选的实施方案包含来自蛋白L的第一结合部分和来自CBD的第二结合部分。靶分子

靶分子可以是内源性分子如内源性多肽、或外源性分子如多肽。例如，外源性多肽可以是这样一种多肽，该多肽天然情况下在动物中表达，但并不在特定组织中表达，或在正表达它的组织中以较低水平表达；或者外源性多肽可以是该动物中不表达的多肽，例如该动物是表达人多肽的非人动物。优选地，靶分子包括可结合表位。

可结合表位可以是可去除表位。该可去除表位可以在选择性洗脱靶分子后被除去。这些可去除表位能够来源于可在翻译后通过自我拼接发生编辑的蛋白质多肽部分，例如含有所谓的“内含肽(intein)”的蛋白质。或者，该可去除表位可以通过特异的蛋白酶识别和切割位点和靶分子的剩余部分连接在一起，但是要求靶分子中没有该蛋白酶可作用的其它此类位点。优选地，该蛋白酶可以附着于基质上。在一些实施方案中，转基因多价结合多肽本身可以兼有蛋白酶活性，该蛋白酶活性可以是第一结合部分的一部分，或可以是一个独立的柔性结合的额外结合部分。当蛋白酶活性是第一结合部分的一部分时，优选它在一组条件下具有结合可结合表位的能力，而在另一组的不同条件下具有切割可结合表位的能力。转基因哺乳动物

制备非人转基因哺乳动物的方法是本领域已知的。这些方法可以涉及将DNA结构导入哺乳动物的生殖系中以产生转基因哺乳动物。例如，可以用标准的转基因技术将一或几个拷贝的该结构掺入哺乳动物胚胎的基因组中。

尽管优选牛和山羊，但也可以使用其它非人哺乳动物。优选的非人哺乳动物是反刍动物，如奶牛、绵羊、骆驼或山羊。优选的非人动物的其它例子包括牛、马、美洲驼、猪、小鼠和大鼠。对于核转移技术，用作细胞(例如遗传改造细胞)来源的哺乳动物，将取决于有待获得的转基因哺乳动物。例如，应使用牛的基因组和牛卵母细胞一起进行核转移。

多种转基因动物的制备方法是本领域已知的。产生转基因山羊的操作程序是本领域已知的。例如，可以通过如Ebert等(1994)Bio/Technology 12：699中所述的显微注射、或通过如PCT申请WO98/30683中所述的核转移技术，将转基因导入山羊的生殖系中。产生转基因猪的操作程序可以参见White和Yannoutsos，补体研究的当前话题：免疫学第64次论坛(Current Topics in Complement Research：64thForum in Immunology)，第88-94页；美国专利5,523,226；美国专利5,573,933；PCT申请WO 93/25071；和PCT申请WO 95/04744。产生转基因大鼠的操作程序可以参见Bader和Ganten，临床和实验药物学和生理学(Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology)，Supp.3：S81-S87，1996。产生转基因奶牛的操作程序可以参见美国专利5,741,957、PCT申请WO 98/30683、和转基因动物技术手册(TransgenicAnimal Technology，A handbook)1994，编者Carl A.Pinkert，AcademicPress Inc。产生转基因绵羊的操作程序可以参见PCT公开文本WO97/07669、和转基因动物技术手册(Transgenic Animal Technology，Ahandbook)1994编，Carl A.Pinkert，Academic Press Inc。转染的细胞系

可以从引入了目的核酸如编码蛋白质的核酸的细胞系获得用于通过核转移产生转基因哺乳动物的遗传工程细胞。

可以通过传统转化或转染技术将结构导入细胞中。本文所用术语“转染”和“转化”包括将转基因序列导入宿主细胞中的各种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、或电穿孔。此外，正如下述还可以使用生物学载体如病毒载体。转化或转染宿主细胞的适合方法可以参见Sambrook等，分子克隆实验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)，和其它合适的实验室手册。

两种有用的方法是电穿孔和脂转染。以下描述了它们的简单实例。

可以采用以下操作程序通过电穿孔将DNA结构稳定地导入供体细胞系如胚胎细胞(如胚胎体细胞系)中：将细胞以约4×10⁶个细胞/ml的量重悬在PBS中。在0.5ml细胞悬液中加入50μg线性化的DNA，并将悬浮液置于0.4cm电极间隔杯(Biorad)中。采用Biorad Gene Pulser电穿孔仪，以330伏电脉冲、25mA、1000微法拉和无穷大电阻，进行电穿孔。如果DNA结构含有用于筛选的新霉素抗性基因，则在与350μg/mlG418(Gibco BRL)孵育15天后选择新霉素抗性克隆。

可以采用诸如以下的操作程序通过脂转染将DNA结构稳定地导入供体细胞中：将大约2×10⁵个细胞接种在一个3.5cm直径的孔中，并用2μg线性化的DNA以LipfectAMINE^TM(Gibco BRL)进行转染。转染后48小时，将细胞按1∶1000和1∶5000的比例分开，如果DNA结构含有可供筛选用的新霉素抗性基因时，则加入G418达到0.35mg/ml的终浓度。分离新霉素抗性克隆并扩增用于细胞深低温保存及核转移。

蛋白质的组织特异性表达

常常期望在转基因动物的特异组织或体液如奶、血液或尿中表达蛋白质如异源蛋白质。可以从表达异源蛋白质的组织或体液中回收该蛋白。例如，常常期望在奶中表达异源蛋白质。以下描述了在奶特异性启动子的控制下产生异源蛋白质的方法。此外，以下还描述了其它组织特异性启动子、以及其它调节元件如信号序列和促进非分泌蛋白质分泌的序列。

奶特异性启动子

有用的转录启动子是优选在乳腺上皮细胞中激活的那些启动子，包括控制编码奶蛋白质的基因的启动子，所述奶蛋白质的例子有酪蛋白、β-乳球蛋白(Clark等(1989)Bio/Technology 7：487-492)、乳清酸性蛋白(Gordon等(1987)Bio/Technology 5：1183-1187)和乳清蛋白(Soulier等(1992)FEBS Letts.297：13)。酪蛋白启动子可以来源于任何哺乳动物物种的α、β、γ或κ酪蛋白基因；优选的启动子来源于山羊β酪蛋白基因(DiTullio(1992)Bio/Technology 10：74-77)。可以从cDNA或基因组序列获得奶特异性蛋白启动子或在乳腺组织中被特异激活的启动子。优选地，它们是基因组来源的。

以上列出的乳腺特异性基因的DNA序列信息在至少一种、通常在几种生物中是可以获得的。见例如Richards等，J.Biol.Chem.256，526-532(1981)(大鼠α-乳清蛋白)；Campbell等，Nucleic Acids Res.12，8685-8697(1984)(大鼠WAP)；Jones等，J.Biol.Chem.260，7042-7050(1985)(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee和Rosen，J.Biol.Chem.258，10794-10804(1983)(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，Biochem，J.242，735-742(1987)(人α-乳清蛋白)；Stewart，Nucleic Acids Res.12，389(1984)(牛αs1和κ酪蛋白cDNA)；Gorodetsky等，Gene 66，87-96(1988)(牛β酪蛋白)；Alexander等，Eur.J.Biochem.178，395-401(1988)(牛κ酪蛋白)；Brignon等，FEBS Lett.188，48-55(1977)(牛αs2酪蛋白)；Jamieson等，Gene 61，85-90(1987)，Ivanov等，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369，425-429(1988)，Alexander等，NucleicAcids Res.17，6739(1989)(牛β乳球蛋白)；Vilotte等，Biochimie69，609-620(1987)(牛α乳清蛋白)。Mercier和Vilotte，J.DairySci.76，3079-3098(1993)(为了所有的目的将其完整地并入作为参考)综述了各种奶蛋白质基因的结构和功能。如果其它侧翼序列在优化异源蛋白质的表达中有用时，可以采用现有序列作为探针克隆这些序列。可以采用已知的同源核苷酸序列、或同源蛋白质的抗体作为探针，筛选这些生物的文库获得来自不同生物的乳腺特异性调节序列。

信号序列

有用的信号序列是奶特异性信号序列或导致真核或原核蛋白分泌的其它信号序列。优选地，信号序列选自奶特异性信号序列，例如它可以来自编码分泌至奶中的产物的基因。最优选地，奶特异性信号序列与该结构中使用的奶特异性启动子相关，见下述。信号序列的大小并不关键。所需要的仅是该序列足够大以实现目的重组蛋白质在如乳腺组织中的分泌。例如，可以使用来自编码酪蛋白(如α、β、γ或κ酪蛋白、β乳球蛋白、乳清酸性蛋白、和乳清蛋白)的基因的信号序列。优选的信号序列是山羊β-酪蛋白信号序列。

也可以使用来自其它分泌蛋白，例如肾细胞、胰腺细胞或肝细胞分泌的蛋白质，的信号序列。优选地，信号序列导致蛋白质分泌至如尿或血液中。

其它组织特异性启动子

可以使用提供在特定组织中表达的其它组织特异性启动子。组织特异性启动子是在特定组织中比在其它组织中表达强度更高的启动子。通常，组织特异性启动子基本上仅在特异组织中表达。例如，如果使改变的蛋白质正常在肝中表达，则可以使用肝特异性启动子。当抑制型tRNA被用于改变血清白蛋白时，情况就是这样。在此情况下，可以将编码抑制型tRNA的转基因序列置于肝特异性启动子的控制下。

可以使用的组织特异性启动子包括：神经特异性启动子如nestin、Wnt-1、Pax-1、Engrailed-1、Engrailed-2、Sonic hedgehog；肝特异性启动子如白蛋白、α1抗胰蛋白酶(antirypsin)；肌特异性启动子如肌细胞生成素、肌动蛋白、MyoD、肌球蛋白；卵母细胞特异性启动子如ZP1、ZP2、ZP3；睾丸特异性启动子如鱼精蛋白、fertilin、联会复合物蛋白1；血液特异性启动子如球蛋白、GATA-1、胆色素原脱氨酶；肺特异性启动子如表面活性物质蛋白C；皮肤或毛发特异性启动子如角蛋白、弹性蛋白；内皮细胞特异性启动子如Tie-1、Tie-2；和骨特异性启动子如BMP。

此外，还可以使用通用启动子以便在几种组织中获得表达。通用启动子的例子包括β-肌动蛋白、ROSA-21、PGK、FOS、c-myc、Jun-A和Jun-B。

间隔序列(insulator sequences)

用于制备转基因动物的DNA结构可以包括至少一个间隔序列。术语“间隔子(insulator)”、“间隔序列”和“间隔元件”在本文中可互换使用。间隔元件是间隔处于其作用范围内的基因的转录的控制元件，但它并不以负或正方式干扰基因表达。优选地，将间隔序列插在待转录DNA序列的每一侧。例如，可以将间隔子放置离启动子5’端约200bp至约1kb的位置、和目的基因3’末端距启动子至少约1kb-5kb的位置上。间隔序列距离启动子和目的基因3’末端的长度可以由本领域技术人员根据目的基因的相对大小、该结构中使用的启动子和增强子来决定。此外，还可以在启动子的5’端或在转基因的3’末端放置一个以上的间隔序列。例如，可以将两个或更多个间隔序列放置在启动子的5’端。可以将位于转基因3’末端的一个间隔子或多个间隔子放置在目的基因的3’末端、或3’调节序列如3’非翻译区(UTR)或3’侧翼序列的3’末端。

优选的间隔子是包含鸡β珠蛋白座位的5’末端并相应于PCT公开文本94/23046中描述的鸡5’组成型超敏位点的DNA区段，该公开文本的内容并入本文作为参考。

DNA结构

可以将编码异源蛋白质的盒组装为包括启动子如用于特异组织如乳腺上皮细胞的启动子(如酪蛋白启动子如山羊β酪蛋白启动子)、奶特异性信号序列如酪蛋白信号序列(如β酪蛋白信号序列)、和编码异源蛋白质的DNA在内的结构。

该结构还可以包括编码非分泌蛋白质的DNA序列的下游3’非翻译区。这些区域可以稳定该表达系统的RNA转录本，并由此增加该表达系统的目的蛋白质产量。在本发明所用结构中有用的3’非翻译区包括了提供poly A信号的序列。这些序列可以来源于如SV40小t抗原、酪蛋白的3’非翻译区、或本领域熟知的其它3’非翻译区。一方面，该3’非翻译区来源于奶特异性蛋白质。3’非翻译区的长度并不关键，但其polyA转录本的稳定作用对于稳定表达序列的RNA似乎是重要的。

任选地，该结构可以在启动子和编码信号序列的DNA序列之间包括5’非翻译区。这些非翻译区可以来自与启动子所取自的相同控制区、或可以来自不同的基因，如它们可以来自其它合成、半合成或天然的来源。再有，尽管它们的具体长度并不是关键的，但它们似乎对于表达水平的提高是有用的。

该结构还可以包括优选在乳腺上皮细胞中表达的基因的约10％、20％、30％或更多N端编码区。例如，N端编码区可以与使用的启动子相对应，例如山羊β酪蛋白的N端编码区。

可以采用本领域已知的方法制备该结构。可以将该结构制备为更大质粒的一部分。该制备使得可以以有效的方式克隆和选择正确结构。可以将该结构定位在质粒的方便限制性位点之间，以便可以容易地将它与剩余的质粒序列分离开，用于导入目的哺乳动物。

异源靶蛋白

可以将编码异源靶蛋白的转基因序列导入非人哺乳动物的生殖系中、或可以将其转染至上述细胞系中。

该蛋白质可以是复合蛋白或多聚体蛋白，如同或异多聚体，如天然以同或异多聚体形式如同或异二聚体、三聚体或四聚体形式存在的蛋白质。该蛋白质可以是通过除去(如切除)N端、C端或内部片段而加工产生的蛋白质。甚至可以以活性形式表达复合蛋白质。可以导入哺乳动物如牛或山羊的基因组中的蛋白质编码序列包括血清蛋白质、奶蛋白质、糖基化或未糖基化的蛋白质。该蛋白质可以是人或非人来源的。该异源蛋白质可以是潜在的治疗剂或药剂，例如但不限于：α1蛋白酶抑制剂、α1抗胰蛋白酶、碱性磷酸酶、血管紧张肽、抗凝血酶III、包括因子VIII、因子IX和因子V在内的所有凝血因子、骨基质蛋白(例如BMP1-15)、几丁质酶、促红细胞生成素、细胞外超氧化物歧化酶、纤维蛋白原、葡糖脑苷脂酶、谷氨酸脱羧酶、人生长因子、人血清白蛋白、免疫球蛋白、胰岛素、髓磷脂碱性蛋白、胰岛素原、催乳素、可溶性CD4或其成分或复合物、乳铁传递蛋白(lactoferrin)、乳球蛋白、溶菌酶、乳清蛋白、转化生长因子(TGF)如TGF-β、组织纤溶酶原激活物或其变体。

编码以上所列异源蛋白质的多种基因的核酸信息在至少一种、通常几种生物中是可获得的。见例如Long等(1984)Biochem.23(21)：4832-4837(α1抗胰蛋白酶)；Mitchell等(1986)Prot.Natl.Acad.Sci USA 83：7182-7186(碱性磷酸酶)；Schneider等(1988)EMBOJ.7(13)：4151-4156(血管紧张肽)；Bock等(1988)Biochem.27(16)：6171-6178(抗凝血酶III)；Olds等(1991)Br.J.Haematol.78(3)：408-413(抗凝血酶III)：Lin等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(22)：7580-7584(促红细胞生成素)；美国专利5,614,184(促红细胞生成素)；Horowitz等(1989)Genomics 4(1)：87-96(葡糖脑苷脂酶)；Kelly等(1992)Ann.Hum.Genet.56(3)：255-265(谷氨酸脱羧酶)；美国专利5,707,828(人血清白蛋白)；美国专利5,652,352(人血清白蛋白)；Lawn等(1981)Nucleic Acid Res.9(22)：6103-6114(人血清白蛋白)；Kamholz等(1986)Prot.Natl.Acad.Sci.USA 83(13)：4962-4966(髓磷脂碱性蛋白)；Hiraoka等(1991)Mol.Cell Endocrinol.75(1)：71-80(催乳素)；美国专利5,571,896(乳铁传递蛋白)；Pennica等(1983)，Nature 301(5897)：214-221(组织纤溶酶原激活物)；Sarafanov等(1995)Mol Biol.29：161-165，这些文献的内容并入本文作为参考。

多价结合多肽

可以通过标准的重组DNA技术采用编码融合蛋白质的核酸分子，制备多价结合多肽融合蛋白。编码融合蛋白质的核苷酸序列可以通过标准DNA合成方法合成。确定无活性的蛋白质是否能够分泌的方法

使用组织培养测定

采用哺乳动物组织培养瞬时表达系统可以设计一种结构以表达无活性蛋白质。例如，可以将基因结构连入载体如pcDNAII1或pCEP4中。采用标准技术进行转染，然后可以获得上清液和细胞沉淀的代表性样品。由于组织培养系统相对快速，因此可以快速地确定无活性蛋白质的特性。

体内测定

一旦确定了无活性蛋白质可以分泌、并且之后可以采用例如组织培养系统获得活性蛋白质如BMP，则可以将表达无活性蛋白质的结构放置在乳腺表达系统，如包括山羊β酪蛋白在内的系统，的克隆位点中。可以使用这些结构制备转基因小鼠。这就使得可以测试蛋白质在奶中的表达。此外，还可以监测乳腺和动物的健康情况。

确定表达水平的方法

Western印迹分析

采用上述试验获得足够多的材料，以便通过Western印迹检测表达水平。Western应足够灵敏以检测出分泌的野生型蛋白质的信号。如果表达水平是如10mg/L，则该测定中蛋白质的水平将是10ng/μl。通过每孔电泳10μl，应可以在印迹上观察到100ng。

此外，还可以使用活性分子的特异性单克隆抗体来确定活性蛋白质的表达水平。这些抗体可以用于监测分泌蛋白的相对折叠效率。拥有活性蛋白质的特异性单克隆抗体将有助于确定在酶处理无活性蛋白质后是否获得了活性蛋白质。

确定蛋白质生物学活性的方法

可以通过以下方法监测表达蛋白的生物学活性。由于蛋白质无活性并之后被激活，所以可以进行蛋白质生物学活性的测试。可以在基于细胞的测定中或在体内模型中测量此生物学活性。通过位点修饰制备无活性蛋白

可以通过修饰蛋白质激活所必需的位点如切割位点，转基因产生无活性形式的蛋白质。例如，为了获得活性形式的蛋白质，几种蛋白质需要切除蛋白质的前和/或原区域。这些蛋白质包括分泌过程中通过切割激活的TGF-β家族分子。可以对这些分子的切割位点进行修饰，以便在分泌过程中不发生切割。例如，制备KKRK切割位点被替换为凝乳酶的10个氨基酸识别序列的TGF-β。该蛋白质以未剪切形式分泌，然后在具有凝乳酶的试管中加工产生激活的蛋白质。相似系列的实验也应用于胰岛素原。优选地，采用能够对已折叠的分子发挥作用并且能够随后导致蛋白质活性的酶切。

还可以修饰BMP-2的激活位点，以便在BMP-2分泌过程中不发生切割，使其以原形式分泌。通过将正常的切割位点替换为另一识别序列(例如不被内源性蛋白酶切割的识别序列)的氨基酸，可以在纯化后进行原形式的切割。BMP-2的激活位点具有以下序列：RKRLK。可以修饰该序列以提供一个不同的切割位点，使得BMP-2在分泌过程中不被切割、但可以在分泌后通过正常不在特异组织或产物中表达的蛋白水解酶进行切割。

为了获得无活性蛋白质，可以尝试几种外源性蛋白质水解位点。这些位点包括酸、溴化氰、因子X或凝乳酶的切割位点。通过分析蛋白质序列，可以设计潜在的位点。可以构建具有新切割位点的多种不同形式蛋白质如BMP，并通过组织培养系统进行运作。此外，还可以测试蛋白质以确定它是否以无活性原形式分泌。可以测试培养物上清液和细胞沉淀两者的蛋白质水平。还可以测试原形式以显示它们不具有生物学活性。

如果在乳腺中表达无活性蛋白质，由于奶中具有低水平的血清蛋白质，因此优选此额外的切割位点不被血清蛋白酶切割。

优选地，切割此额外的位点，以致蛋白质包括少于20、10、5、4、3、2、1个的外来氨基酸残基或无外来氨基酸残基。例如，如果期望得到在其N端具有额外氨基酸的活性BMP蛋白质，则必需设计一个位点以便切割后仅存在BMP序列。

可以通过Western分析监测切割步骤是否成功。优选地，使用能够识别激活的蛋白质如活性BMP的抗体。一旦蛋白质被切割后，则可以测试其生物学活性。为了确保没有失活发生，在整个系统中运行野生型活性蛋白质是重要的。还可以测试未加工的蛋白质的活性。此外，如果发现蛋白质可以以之后能够被激活的无活性原形式分泌至组织培养物中，则可以在小鼠奶系统中测试该结构。还可以将蛋白质与小鼠和山羊的奶混合，测试该蛋白质的激活。

可以使用转基因小鼠测试蛋白质以原形式进行分泌的能力。例如，可以将修饰的BMP-2 DNA连接至山羊β酪蛋白表达载体中。该DNA可以用于制备应当在其奶中产生该蛋白质的转基因小鼠。而且，可以使用表达野生型BMP-2的对照小鼠。可以从代表系获得奶以及活检组织用于Northern分析。可采用Western分析测定奶或组织样品中BMP-2蛋白的表达。具体地，可以采用合适的切割酶测试奶中活性蛋白质的产生。可以按组织培养表达实验所用的方法对激活进行监测。

在乳腺中以活性形式产生BMP-2的早期尝试，导致乳腺发育的抑制。因此，可以监测野生型以及新形式蛋白质的产生水平、以及它们对乳腺组织产生的影响。通过其表达蛋白和结合蛋白制备无活性蛋白质

可以通过共表达蛋白质和结合并失活该蛋白质的结合蛋白，转基因制备无活性形式的蛋白质。例如，蛋白质和结合蛋白可以是受体和配体、或它们的片段。结合蛋白还可以是抗体。

一方面，可以将蛋白质与结合蛋白表达为融合蛋白。例如，可以将BMP蛋白和其自身受体表达为融合蛋白。前提是该受体可以结合BMP并防止BMP与乳腺或动物中的受体结合。可以通过可切割的接头将受体和BMP连接起来。一旦产生了无活性蛋白版本后，可以切割接头，使受体和BMP解离并籍此激活BMP分子。一方面，可切割接头不被转基因动物的组织或产物中天然存在的内源性加工酶识别，但可被该无活性多肽的施用对象中的加工酶识别。因此，可以给对象如人施用该无活性多肽，以便该对象中的加工酶可以将结合多肽和靶多肽切开，籍此激活靶多肽。

可以例如在COS细胞中测试结合蛋白/蛋白融合物的表达。可以通过采用针对蛋白质或结合蛋白，如BMP或其受体，的单克隆抗体进行的分析，来测试表达。还可以测试融合蛋白质的活性。

此外，为了获得活性蛋白质如活性BMP，可以采用合适的酶切割融合蛋白，并通过Western印迹监测切割。预期的是在该融合蛋白被蛋白酶切割之前它将是无活性的。

还可以测试包括有蛋白质和结合蛋白的融合蛋白在奶中的表达。例如可以将融合结构连接至β酪蛋白表达载体中。然后使用该载体制备转基因小鼠。可以测试这些小鼠表达该蛋白质的能力。此外，还可以测试在这些动物中该蛋白质对乳腺和整个动物产生的影响。

还可以将该蛋白质与能够结合并失活该蛋白质的抗体一起表达。例如，可以使用BMP和抗BMP抗体制备无活性BMP。可以在COS细胞中一起表达目的抗体和蛋白质如BMP。然后可以监测抗体对BMP活性的影响。

可以在与抗体一起表达后，使用例如选择性结合蛋白质/抗体复合物的抗体部分的蛋白A，获得活性蛋白质如活性BMP。

结合蛋白还可以包括至少一个对于该结合蛋白而言外来的氨基酸。例如，BMP受体还可以包括对于纯化结合蛋白和/或结合蛋白/蛋白质复合物有用的外源氨基酸序列。例如，该额外氨基酸序列可以用于结合预先选择的配体，如6×HIS配体、纤维素结合域配体、或麦芽糖结合域配体。

可以对各种结合蛋白结合和抑制蛋白质的能力进行测试。

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