免疫原性的乙型肝炎表面抗原在转基因植物中的表达

摘要

本发明提供了包含至少两种表达盒的植物表达载体,该载体的功能是可降低多聚核苷酸表达的转录抑制。此外,还提供了包括HBsAg在内的,有免疫原性多肽表达的新的植物表达载体。在可食用的植物组织中,植物表达载体,能用于产生包括HBsAg在内的免疫原性多肽。当植物组织被食用后,这种可食用的植物组织,能激发人和动物体内的免疫应答。

说明书

相关申请

本申请要求引用、整体合并的美国申请60/113,507的所有权利。

技术领域

本发明涉及的是口服疫苗，尤其是可食用植物提供的疫苗。本发明使用基因工程技术，生产能够表达免疫原性多肽的转基因植物，人类或动物在食用了全部或部分的植物后，这种包括乙型肝炎表面抗原在内的免疫原性多肽，足以激发免疫应答。

发明的背景

乙型病毒性肝炎疫苗，是经FDA认证，能给人应用的第一个“新生代”的重组疫苗。通过在重组酵母中表达编码乙型肝炎表面抗原的基因，来产生这种形式的免疫原性亚单位；自遗传工程酵母纯化这种蛋白质，并用于肠胃外传输。在发达的国家中，重组疫苗已经取代了早期应用的、来源于感染个体血浆中的疫苗。已经表明，在高危成年群体和新生儿，应用血浆来源的和重组的乙型肝炎表面抗原疫苗，都是相当安全和有效的。然而，重组乙型肝炎表面抗原疫苗的价格，妨碍了它在发展中国家的广泛应用。

乙型肝炎病毒(HBV)的外壳含有三种大小的蛋白质，它们共有羧基端序列。这些蛋白质称为乙型肝炎表面抗原(HBsAgs)，包括大(L，含一个前-S2编码区)、中(M1，含一个前-S1编码区)和小(S，仅含S编码区)三类。在感染者的血中，发现这三种蛋白质都在感染的病毒颗粒(一般称为丹氏颗粒)上，病毒颗粒为42纳米的球形体。乙型肝炎病毒感染者的血样中也有空的球形颗粒，平均22纳米，主要含有S类蛋白质。专用编码S蛋白质的DNA转染的哺乳动物细胞系，释放20纳米的空颗粒，与从感染的细胞中释放的相似。而且，用具有同样基因形式的类似球形体转化酵母细胞，发现有与感染细胞22纳米球形体相同的免疫原性。酵母来源的物质构成了当前商业上可以买到的疫苗ENGERIX(SKB)和RECOMBIVAX(Merck)的活性成分。

在哺乳动物细胞中，将新近合成的L、M或S蛋白质插入内质网膜(ER)。S-蛋白含226个氨基酸，它的N末端和C末端被认为是位于内质网的管腔面，并且有4个横跨膜的螺旋。这三种蛋白质在S编码区的146位置上都有一个糖基化位点，这三种蛋白质在糖基化作用的程度和可利用的位点上存在不同。不正确的糖基化作用能够妨碍病毒颗粒的形成，这大概是由于蛋白质的折叠不当造成的。还有，蛋白质中半胱氨酸之间的多个二硫键，据认为对组装病毒颗粒或颗粒的结构以及蛋白质中抗原环的结构很重要。错误组装的颗粒可能影响细胞的附件，原因是错误的折叠妨碍分泌。

乙型肝炎病毒中的前S1和前S2水平，比17-25纳米HBsAg颗粒中的水平高，因此，应用HBsAg颗粒的免疫，可能不会产生针对在乙型肝炎病毒上表达的前S序列的高滴度抗体。在人类感染乙型肝炎病毒期间，前S蛋白质的水平在复制活动期增加，并且在S蛋白特异性应答之前，产生抗-前S抗体和T细胞。一旦抗-HBsAg抗体升高，抗-前S抗体就下降。

前S1和前S2在病毒粘附和中和中的作用，引起了含有这些序列还有全部S编码区的疫苗的研制。合并前S序列的疫苗包括HEPAGEN(Merck)和BIO-HEP-B(BTG)；这两种都可在哺乳动物细胞系产生，在规划含S和前S蛋白质的完整颗粒中，重要的是，应该注意影响HBsAg组装的S、M和L蛋白质的相对数量，例如：高水平的L蛋白质，可减少HBsAg颗粒形成和分泌的数量。

在复合体开始进入内质网期间，发生S、M和L表面蛋白质组装入颗粒，继之通过高尔基(Golgi)复合体将颗粒运输到细胞外。纳米级的生物结构，例如病毒外壳，应用少量的明确的键的接触，通过类似折叠的蛋白质亚单位的聚合作用组装。当游离亚单位合并入生长的聚合体时，驱动聚合作用的力，是形成满意的键间相互作用。对于诸如HBsAg这样的外壳蛋白质，聚合作用的过程中所必须的步骤是，多肽适当的整合入内质网膜，随后在蛋白质亚单位之间建立连接。内膜体系中蛋白质的正常运输和储存，可能有助于这个过程。

Murray的U.S Patent No.4,710,463提出了一个生产乙型肝炎核心或表面抗原多肽的方法，使用的是一个单细胞的宿主。Szu等的U.SPatent No.5,738,855则提出了一个改良的寡聚糖免疫原，与伤寒杆菌中的Vi抗原相似，能够被结合到一个载体上，例如乙型肝炎表面抗原。在U.S Patent No.4,847,080,EU 0154902 B1和Neurath等的后来的论文中，不仅识别了在一种疫苗中所含的肽，还识别了供肝细胞结合和中和的前S1和前S2区上的肽表位。

病原体感染的哺乳动物，当战胜入侵的微生物时，通过启动免疫系统的三个分支中的至少一个，即粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫，而发动免疫应答。在呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道和分泌腺体的粘膜表面充满着分泌物，在这些分泌物中有分泌性IgA抗体的产生，它是引起粘膜免疫的主要原因。这些粘膜抗体的作用，是使病原体克隆局限在粘膜表面，这样以来就建立了抵抗病原体入侵的第一道防线。分泌腺体或分泌组织的局部免疫作用、或者提呈到肠管相关的淋巴结组织(GALT；Peyer′s Patches)或支气管相关的淋巴组织(BALT)的抗原，可以启动粘膜抗体的产生。

口服提呈抗原能够获得粘膜的免疫作用。专门的上皮细胞(M细胞)，覆盖在沿着肠道的有组织的粘膜淋巴组织中，通过细胞吞噬感染的细菌、病毒和大分子，来选择抗原。这些抗原被传递到下面的滤泡中，在那里启动免疫应答，并且将细胞分散到粘膜和全身的免疫部位。上皮细胞也是细胞因子调节网络的一个完整部件，包括那些在B细胞分化中起重要作用的细胞因子。

口服免疫法也能诱导强大的体液免疫应答。体液免疫是血清中产生循环的抗体的结果(尤其是IgG和IgM)，从而加速对入侵病原体的吞噬作用、中和病毒或激发针对病原体的补体介导的细胞毒性作用。在乙型肝炎病毒的保护，与充足的全身性抗体及T细胞对HBsAg蛋白的免疫应答之间，存在着一种很好的关系，并且口服免疫法很可能得到这种保护。

与当前可利用的提供全身免疫力的多种多样的注射疫苗相对比，刺激粘膜免疫力的非全身性应用的疫苗很少见。然而，目前作为首选的疫苗服用途径的口服服用，对发展研制疫苗的新对策，产生极大的兴趣。在设计一种成功的口服疫苗时，应该特别注意两个方面：一个合适的佐剂的应用和一个合适的抗原传递系统的开发。

当研究用于大量口服佐剂的绝大多数蛋白质抗原时，它们不能引起粘膜抗体应答，而是诱导了一个无应答或口服耐受状态。而霍乱毒素(CT)和埃希氏大肠杆菌热易变性毒素(LT)除外。食用CT或LT不诱导对抗体应答的耐受，并且另外能够防止对不相关抗原诱导的口服耐受，这些不相关抗原指的是与CT或LT一道服用的抗原(Elson，C.等，Immunol.133：2892-2887(1984))。这些结果表明，CT/LT支配的全部结果，是支持免疫应答而不是免疫耐受。在其它的研究中也发现，对于以前所食用的不含CT的抗原，CT并不增加对它的免疫应答(Xu-Amano，J.Exp.Med 178：1309-1320(1993))。这具有特殊的重要意义，原因是它表明了在CT存在的情况下，不会产生对正常食用抗原的免疫应答。一般来讲，在口服抗原后，诱导对抗免疫作用的免疫耐受，可采取两种不同的方法：诱导口服耐受，单独使用可溶性或水溶性抗原；然而按照接种疫苗的规程，抗原通常是和粘膜佐剂一起服用的。

最近，基因工程上的进展，已经给表达免疫原性蛋白质相对低成本的转化植物的选择，提供了有用的工具。单子叶植物和双子叶植物，都可以稳定地被转化。例如，应用编码S蛋白质的基因已经可以转化烟草，一种双子叶植物，并且能够分裂细胞释放球形体(或病毒样颗粒；VLPs)(Mason等PNAS USA，89：11745-11749(1992))。当将颗粒注射入小鼠体内时，它实质上模仿了商业疫苗的免疫原特性(Thanavala等，PNAS USA，92：3358-3361(1995))。这就表明，在植物和哺乳动物细胞中，蛋白质合成和组装的过程可能是相似的。遗憾的足，转基因植物中蛋白质的合成率低，已经阻碍了体内形成VLPs的详细研究。

Curtiss，III的U.S Patent No.5,679,880提出了一个转基因植物，它表达有一种病原微生物的抗原或抗原决定簇，在动物体内，可以激发分泌性免疫应答。Lam等的U.S Patent No.5,484,719和5,612,487公开了从转化了表达HBsAg的转基因马铃薯中，可以获得抗原性颗粒。目前，由于率-限制因子不知道，所以采用新方法合成的HBsAg蛋白，聚合入植物细胞的抗原性结构，还没有方法来预测其功效。另外，以前的研究显示的转基因植物中(抗原性)颗粒的构成，可能涉及到新法合成的蛋白，非特异性地插入各种的细胞膜中，这就解释了，在现有资料中描述的、转基因植物的颗粒积聚的低水平的原因。

人们渴望研制一种廉价的、安全的和高效的口服疫苗，来激发全身性的、最好是粘膜的免疫活动，以预防乙型肝炎病毒的感染。而这种疫苗应该是基于一种乙型肝炎病毒，或它的主要的抗原决定簇的。一种能增加HBsAg病毒样颗粒的方法，是可以运用融合蛋白，来改变新合成的蛋白亚单位的细胞靶位。例如，融合蛋白可以有一个N-末端引导肽，以进入内膜系统或者C-末端KDEL(SEQ ID NO：22)，它还可以调节微粒体的保留序列。在发展中国家，一种特别满意的运用方法，是开发转基因植物的可食用部分，当食用时，就会始终如一地建立起针对HBV的口服免疫。

本发明的概述

本发明的一个目的是，提供植物的表达载体，该表达载体包含有至少两个表达盒，可功能性的降低多聚核苷酸表达的转录抑制。本发明的另一个目的是，为包括HBsAg在内的免疫原性多肽的表达，提供新的植物表达载体。在可食用的植物组织中，该植物表达载体，能够用于产生包括HBsAg在内的免疫原性多肽。本发明更深一层的目的是，当食用植物组织时，在可食用的植物组织中，提供的这种的免疫原性多肽，可激发人和动物的免疫应答。本发明中的这些和其它的目的，通过下面所描述的一个或者多个实施例表现出来。

本发明的一个实施例是，提供了一种植物表达载体，它包含有两个表达盒。第一个表达盒包含有一个编码一个抗原的多聚核苷酸；以及第二个表达盒包含有一个多聚核苷酸，编码与第一个表达盒的多聚核苷酸相同的抗原。第二个表达盒的多聚核苷酸，与第一个表达盒的多聚核苷酸是不相同的。第一个表达盒中，任意包含有一个编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的多聚核苷酸，并且其中的第二个表达盒中，包含有一个编码HBsAg不相同的多聚核苷酸。随意地是，第一个表达盒中包含的多聚核苷酸，编码了一个植物优选化的HBsAg多肽，更可取的是，该多聚核苷酸包含有至少一个植物优选化的密码子；其中第二个表达盒中的多聚核苷酸，编码了一个天然病毒源性的HBsAg多肽。甚至更为可取的是，第一个表达盒中的多聚核苷酸包含有SEOID NO：3，并且第二个表达盒中的多聚核苷酸包含有SEQ ID NO：1。

更可取的是，基因抑制，包括由RNA-介导的转录基因抑制，在两种多聚核苷酸在一个细胞中表达时，其中的基因抑制被降低或消除。随意地是，植物表达载体可能有一个第一种表达盒的多聚核苷酸以及一种第二个表达盒的多聚核苷酸，其中以上所提及的多聚核苷酸，均包含有不多于90个或者不多于60个毗邻的相同的核苷酸。

植物表达载体可进一步包包括：第一个表达盒进一步包含有一个5′转录、非翻译区，并且第二个表达盒中，包含有一个不完全一样的5′转录非翻译区。植物表达载体还可能包含：第一个表达盒进一步包含有一个3′转录非翻译区，并且第二个表达盒中，包含有一个不完全一样的3′转录非翻译区。另外，植物表达载体可能包含：第一个表达盒中，进一步包含有一个5′转录非翻译区和一个3′转录非翻译区。第二个表达盒中，可包含有一个与第一个表达盒不相同的、5′转录非翻译区和一个不相同的3′转录非翻译区。第一个表达盒中，可能包含有一个TEV的5′转录非翻译区和一个vspB的3′转录非翻译区，并且第二个表达盒中，包含有一个TMV的5′转录非翻译区和一个pin2的3′转录非翻译区。此外，植物表达载体可能包含：第一个表达盒中，包含有一个植物优选化的HBsAg多肽，并且第二个表达盒中，包含有一个天然的病毒源性的HBsAg多肽。

本发明的另一个实施例是，一埃希氏大肠杆菌细胞，应用上述的植物表达载体进行转化。病毒样颗粒是在细胞内被装配的。

本发明的另一个实施例是，一土壤杆菌细胞，应用上述的植物表达载体进行转化。病毒样颗粒是在细胞内被装配的。

本发明的另一个实施例是，一种植物细胞，应用上述的植物表达载体进行转化。病毒样颗粒是在细胞内被装配的。更可取的是，植物细胞是从一组包括西红柿、马铃薯、香蕉和胡萝卜细胞中选择出来的。甚至更为可取的是，植物表达载体被整合入植物细胞的细胞核基因组中。

本发明的另一个实施例是，提供了一种植物种子，它包含有上述的植物表达载体。

本发明的另一个实施例是，提供了包含有一个核酸序列的一个多聚核苷酸，该核酸序列编码一个乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。该多聚核苷酸可操纵性地连接了一个植物功能性的启动子；一个翻译增强序列；和一个终止序列。多聚核苷酸缺乏一个在翻译增强序列和HBsAg编码序列之间的非转录区。编码HBsAg的核酸序列，可能包含有至少一个已改变了的密码子，其中已改变的密码子是一个植物优选化的密码子。植物-功能性的启动子，可能是从一组包括菜花花叶病毒(CaMV)35S、西红柿E8、泛化蛋白、甘露糖松(mannopine)合成酶、patatin、和颗粒-限制性淀粉合成酶(GBSS)的启动子中选择出来的。该启动子可能包括一个双启动子区。翻译增强序列，可能是从一组包括烟草蚀刻病毒(TEV)和烟草花叶病毒(TMV)的Ω翻译启动子中选择出来的。终止序列，可能是从一组包括胭脂碱合成酶(nos)、植物的贮藏蛋白(vsp)，或者一种蛋白酶抑制剂-2(pin2)的终止序列中选择出来的。

此外，多聚核苷酸可能缺乏一个在HBsAg编码序列和终止序列之间的非转录区。该多聚核苷酸可进一步包含有一个编码微粒体保留信号的核酸序列，被可操纵性地连接到HBsAg编码序列的3′末端。

微粒体保留信号，可以是丝氨酸-谷氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(SEQ ID NO：4)。该多聚核苷酸，可能缺乏一个在微粒体保留信号和终止序列之间的非翻译区。多聚核苷酸，可进一步包含有一个编码信号肽的核酸序列，被可操纵性地连接到HBsAg编码序列的5′末端。而信号肽可能是从一组包括植物贮藏蛋白(VSP)αS信号肽，和VSPαL信号肽中选择出来的。

另外，该多聚核苷酸可包含有一HBsAg编码序列，后者进一步包含有一个前-S区。随意地是，该多聚核苷酸，可包含有一个HBsAg编码序列，后者包含有一个核酸序列，可在植物中最佳的表达，见SEQID NO：3。该多聚核苷酸，可能是从一组包括HB104、HB105、HB106、HB107、HB111、HB114、HB115、HB116、HB117、HB118、HB119、HB120、HB121、HB122、HB123、HB131、HB140.3HB145和HB165中的多聚核苷酸中选择出来的。

本发明的另一个实施例是，提供了一种表达载体，包含有上述多聚核苷酸。该表达载体可能包含有一种可选择的标记物、一种埃希氏大肠杆菌的复制起点，和/或一种土壤杆菌的复制起点。

本发明的另一个实施例是，一种埃希氏大肠杆菌细胞，应用上述的表达载体进行转化。病毒样颗粒可能是在细胞内被装配的。

本发明的另一个实施例是，一种土壤杆菌细胞，应用上述的表达载体进行转化。病毒样颗粒可能是在细胞内被装配的。该土壤杆菌细胞进一步包含有一个辅助性Ti质粒。

另外，本发明的另一个实施例是，提供了一种包含有上述多聚核苷酸的转基因植物细胞。病毒样颗粒可在细胞内被装配的。该植物细胞是从一组包括西红柿、马铃薯、香蕉和胡萝卜细胞中选择出来的。而植物表达载体，可被整合入植物细胞的细胞核基因组中。

本发明的另一个实施例是，一种植物种子，它包含有上述的植物表达载体。

另外，本发明的另一个实施例是，提供了一种包含一些上述的植物细胞的免疫原性成分。植物细胞可呈现在植物组织中，是从一组包括果实、叶片、块茎、植物器官、种子原生质体和愈伤组织中选择出来的。该免疫原性成分，可包括植物细胞的汁液或者提取物。而免疫原性成分，还可包含有一种佐剂。该佐剂可作为一种带有一免疫原性成分抗原的融合蛋白被表达。

本发明的另一个实施例是，提供了一种在哺乳动物中激发免疫应答的方法。此方法包括给哺乳动物、服用上述的免疫原性成分的步骤，该免疫应答是被激发的。该免疫原性成分可以是口服服用的。所服用的，可包括食用转基因的植物细胞。而多肽的服用方式，是从一组包括肌肉内、口服、皮内、腹膜内、皮下、鼻腔内的服用方式中选择出来的。更可取的是，可以服用一种佐剂。该佐剂是从一组包括霍乱毒素(CT)、埃希氏大肠杆菌热易变性毒素(LT)、抗独特型抗体2F10、移生因子、志贺氏菌样毒素和intimin中选择出来的。而免疫应答的激发，可以从一组包括体液的、粘膜的、细胞的、体液和粘膜的、体液和细胞的、粘膜和细胞的、以及体液粘膜细胞的针对免疫原性成分的免疫应答中选择出来。

本发明的另一个实施例是，提供了一种分离一重组、在植物原料中表达的HBsAg多肽的方法。该方法包括，把植物原料放入一种浓度高于0.1％并小于0.5％的清洁剂中。

本发明的另一个实施例是，提供了一种转基因植物或者转基因细胞。当作为一种食物，食用4次或更少次时，，可在哺乳动物中激发一免疫应答，所含有的抗HBsAg血清抗体的量，应高于50毫国际单位/毫升。该免疫应答是初次免疫应答。转基因植物细胞，可以包括上述的一些植物细胞。

本发明的另一个实施例是，提供了一种转基因植物或者植物细胞，当作为一种食物，食用4次或更少次时，可在哺乳动物中激发一抗-HBsAg的免疫应答，血清抗HBsAg抗体的水平，至少应增加4倍，或者应达到高于500毫国际单位/毫升。该转基因植物或者植物细胞，可以包括上述的植物细胞。

正如此处所应用的，“抗原”是一个大分子的物质，在人或动物中，有能力引发免疫应答。

“抗原决定簇”是抗原的一个部分，即抗原所含有的能与抗体相结合的特定部位。

“集群抗原”或者“毒力抗原”是一种致病微生物的抗原，该致病微生物与这种微生物克隆或侵入它的宿主的能力有关。

“多聚核苷酸”、“核酸”等是编码多肽的多聚核苷酸。多聚核苷酸或者核酸均可能包含有内含子、标记基因、信号序列、调节元件，如启动子、启动子和终止序列等等。

第一种多聚核苷酸与第二种多聚核苷酸是“不相同的”，第一种多聚核苷酸中至少有一个核苷酸和高至包括85％个核苷酸的完全特性是与第二种多聚核苷酸的不一样的。

“表达载体”是一种质粒，例如pBR322、pUC或ColE1；或一种病毒如腺病毒、辛德毕斯病毒、猿病毒40，α病毒载体以及巨细胞病毒和逆转录病毒的载体，例如小鼠肉瘤病毒、鼠乳腺癌病毒、莫洛尼鼠白血病病毒和劳斯肉瘤病毒。也可应用细菌性载体，例如沙门氏菌属、小肠结肠子尔赞氏菌、志贺氏痢疾杆菌属、霍乱弧菌、分支杆菌株BCG、李斯特单细胞基因株。微染色体，例如MC和MCI，抗菌素、病毒颗粒、病毒样颗粒，装配型质粒(质粒)和复制子也能够被用作表达载体。更可取地是，一个表达质粒有转化真核细胞的能力，该真核细胞包括诸如植物组织的细胞等。

“食物”和“食用性植物”等是指可以作为营养来源或作为膳食补充，而被动物或人类直接摄取的任何植物。一种可食用的植物原料包括一种植物或一些由植物所获得的原料，它适于被哺乳动物(包括人类)或其它动物摄取。这一术语既包括可以直接喂养动物的未加工植物，也包括动物和人类食用的加工植物。

“免疫应答”是宿主对抗原发生的反应。体液免疫表现为针对抗原发生反应而产生抗体，细胞免疫应答包括产生T辅助细胞(CD4⁺)和细胞毒T细胞(CD8⁺)等。粘膜免疫应答(或分泌性免疫应答)产生分泌性抗体(sIgA)。一个免疫应答可以包括上述一种或多种反应。

“免疫原”或者“免疫原性多肽”是指一种抗原或者一种可以诱发免疫应答的抗原。口服食用真核生物表达的抗原，更适于诱发人类或动物产生免疫应答。“免疫原性成分”包含有一种或多种免疫原，并随机地与载体、佐剂等联合在一起。

“融合蛋白”是这样一种蛋白质，它包含至少2、3、4、5、10或更多相同或不同的氨基酸序列，这些氨基酸序列与多肽相连，并不天然地表达为某单一的蛋白。融合蛋白可以通过已知的基因工程技术获得。

附图的简单描述

图1描绘了本发明中的表达盒的图形。缩写：35S＝菜花花叶病毒的35S启动子；GBSS＝颗粒-限制性淀粉合成酶，是块茎中活性特异性的启动子；TEV＝烟草蚀刻病毒；Ω＝烟草花叶病毒Ω非翻译引导序列；NOS＝胭脂碱合成酶；VSP＝植物的贮藏蛋白；PIN2＝蛋白酶抑制剂-2；TPSS＝核酮糖1的小亚单位转换信号肽序列；VSPαS和αL是带有αL的信号肽，包括一个假定的空泡靶信号。图1B显示了一个带有限制性核酸内切酶位点的pHB131和pHB140.3的图形。

图2描绘了一个限制性pHB103质粒图。图2B则描绘了限制性pHB104质粒图。图2C描绘了一个限制性pHB117质粒图。

图3描绘了抗-HBsAg抗体应答，该免疫应答在小鼠，在0、10、20天，通过经口喂食HBsAg转基因的马铃薯(每只鼠5克)加10微克的CT所激发的，并且在60天腹腔注射了0.5微克的酵母源性的rHBsAg(Merck，Sharpe和Domme)进行激发。对照组小鼠则接受了对照的马铃薯(每只鼠5克)加同样的佐剂，并且在60天再结合激发。实验组和对照组小鼠，在喂食马铃薯前禁食过夜。监视每一只小鼠以核实进食的总量。其结果测定492∶660纳米的光密度值来表示。

图4A-E描绘了喂食转基因马铃薯片的小鼠的各种免疫方案。用5克重组马铃薯加10微克霍乱毒素(CT)喂食Balb/c小鼠，每周3次间隔喂食，得出抗体滴度的峰值为70-110毫国际单位/毫升，通过一种单亚免疫原性的腹膜内注射(从重组酵母(Merck)中提纯的HBsAg)，抗体的滴度可急剧上升至1700-3400毫国际单位/毫升(其实际的抗体滴度是与马铃薯中HBsAg的表达水平相关)。免疫应答的水平是存在剂量相关性的，即每克马铃薯传递1.1微克HBsAg马铃薯，比每克马铃薯传递8.3微克HBsAg的马铃薯，免疫应答的水平要低并且反应较短。在同样的喂食体系(8.3微克/克)下，发现通过一单纯的皮下应用由重组酵母提纯的HBsAg，抗体滴度升高，其峰值为1000毫国际单位/毫升(图4C)。喂食煮熟的块茎(5分钟，100℃)，则没有监察到免疫应答(图4D)，但在随后的单纯腹腔注射由重组酵母提纯的HBsAg，则观察到了一显著的增强(图4E)。

图5描绘了一植物优选化的前-S(前S1/S2)肽编码序列和相关的氨基酸序列。为得到所描绘的序列，检测了前-S野生型的编码序列，并且发现了一个RNA多聚酶II终止序列，还有12个“CG”潜在性的甲基化作用位点。植物优选化序列包括没有隐蔽信号和没有CG序列。

图6显示的是pHB117质粒图。

图7显示的是pHB118质粒图。

图8显示的足pHB119质粒图。

图9显示的足pHB120质粒图。

图10显示的是pHB121质粒图。

图11显示的是pHB122质粒图。

图12显示的是pHB123质粒图。

图13所示的表证实，产生病毒样颗粒的HB114-16块茎的蔗糖梯度。

图14显示了HB114-6块茎提取物的western印迹杂交试验。

图15显示了HB114-6块茎和叶片RNA的northern印迹杂交试验。

图16显示了经PCR扩增的HB114-16的基因组DNA的凝胶电泳，它证实了转基因的出现。

图17所示的HB114-6的Southern印迹杂交试验，证实至少4个HB114的插入物。

图18所示的图表证实了储存9个月的HBsAg转基因块茎的稳定性。

图19所示的western印迹杂交试验，分析了转基因NT1细胞表达的3种不同形式的HBsAg。

图20所示的western印迹杂交试验，分析了转基因NT1细胞表达的6种不同形式的HBsAg。

图21显示的是本发明中的合成的HBsAg结构。

图22显示的是一野生型的HBsAg核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，以及一植物优选化的HBsAg核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。

图23显示的是一野生型的HBsAg氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，以及一植物优选化的HBsAg氨基酸序列(SEQ ID NO：40)。

对发明的详细描述本发明的免疫原性多肽

本发明中所包含的细菌、病毒和寄生虫抗原，均能激发动物，如小鼠、兔、豚鼠、小鸡、鹅、鸭、黑猩猩、短尾猿、狒狒或人的免疫应答。更可取地是，免疫应答是在哺乳动物中被激发的。

病毒抗原可以来自诸如正粘病毒，例如流感病毒(例如红细胞凝集素和核蛋白抗原)；逆转录病毒，如RSV和SIV；疱疹病毒，如EBV、CMV，或者单纯疱疹病毒(例如胸腺嘧啶核苷酶抗原)；Lenti病毒，如HIV(例如，Nef，p24，gp120，gp41，Tat，Rev，和Pol抗原)；棒状病毒，如脊髓灰质炎病毒；痘病毒，如牛痘；轮状病毒和肝炎病毒如乙型肝炎病毒(例如HBsAg)。

细菌病毒可以来自诸如，例如分支杆菌属、幽门螺旋杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏痢疾杆菌属(例如宋内氏志贺氏痢疾杆菌1抗原)、埃希氏大肠杆菌(例如CFA/I丝毛抗原和热易变毒素)、立克次体属、李斯特菌属、嗜肺军团菌、假单胞菌属、弧菌属(如O-抗原或者霍乱毒素)、Borellia burgdorferi、百日咳杆菌(例如pertactin和腺苷酸环化酶-溶血素)和破伤风杆菌(例如破伤风毒素)。

寄生虫抗原可以来自，诸如疟原虫属(例如环孢子体抗原，裂殖子表面抗原)、锥体虫属、梨形鞭毛虫属、方头蜱属、巴贝西虫属、内阿米巴属(例如半乳糖特异性凝集素)、艾美虫属、利什曼虫属(例如gp63)、血吸虫属(例如丙糖-磷酸盐异构酶)、布鲁格氏丝虫属(例如副肌球蛋白)、片吸虫属、Dirofilaria属、吴策属和盘尾丝虫属。

本发明的一个最佳实施例是一种包含有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的免疫原性多肽。HBsAg的核酸序列见SEQ ID NO：1(图22)，HBsAg的氨基酸序列见SEQ ID NO：2(图23)。HBsAg的抗原决定簇包含在三个HBV编码的被膜多肽中，并有各自的糖基化形式。两种最小的多肽(24000和27000道尔顿)，代表了一种有226个氨基酸的多肽和同一多肽的糖基化形式。这些多肽是通过HBV的S开放阅读框的S区进行编码的。两种其它的蛋白质，代表了一种33000道尔顿、281个氨基酸的多肽，它包括由HBV的前S2区编码的55个氨基酸和由S区编码的226个氨基酸，以及同一多肽(36000道尔顿)的糖基化形式。两种其它的蛋白质，则代表了一种39000道尔顿(389-400个氨基酸)的多肽，它包括由HBV的前S1区编码的约119个氨基酸和由前S2和S区编码序列，以及同一多肽(36000道尔顿)的一种糖基化形式。在受感染病人的血清中，可发现所有的这些蛋白均在感染的病毒颗粒(经常称为丹氏颗粒)上，病毒颗粒恢复成42纳米的球形体。血清的样本中还包含有空的球形颗粒，平均22纳米，它主要含有S类蛋白质。专用编码S蛋白质的DNA转染的哺乳动物细胞系，释放20纳米的空球颗粒，与从感染的细胞中释放的相似。而且，用具有同样基因形式的类似球形体转化的酵母细胞，与受感染细胞的22纳米球形体，有着相同的免疫原性。

本发明中的免疫原性多肽至少含有一个抗原决定簇，可以被抗体所识别。多肽中的抗原决定簇可以通过多种方法确定，例如：本发明中的一种多肽，可以采用诸如该多肽的单克隆抗体的免疫亲和纯化法进行分离。然后对分离的多肽序列进行筛查。共同涵盖整个多肽序列的一系列短肽，可以通过蛋白裂解制备。例如，从50-mer多肽片段开始，可以用抗-HBsAg的酶联免疫法(ELISA)检测每一个片段上的抗原决定簇。逐渐地，可以从已经确定的50-mer，检测更小的片段和重叠的片段，从而描绘出感兴趣的抗原决定簇。

本发明中的HBsAg多肽，可包含有一个S多肽，并且进一步包含有一个前-S1多肽。发明中的多肽还可进一步包含有一个前S2多肽。HBsAg则可能是包含有所有S、前S1和前S2多肽的结合体。随意地是，HBsAg多肽可以包含有多于一个的S、前S1或者前S2多肽。而S、前S1和前S2多肽，可以来自于相同的或不同种群的HBV。S、前S1和前S2多肽，还可以作为一种融合蛋白或者作为分离多肽加以制备。

在S、前S1和前S2区的一些抗原决定簇，可有效地连接肝细胞，并可以被中和。Neurath等的U.S.Pat.No.4,847,080和EU-BI-0154902。前S1序列跨度残基1-21、12-32、21-47、27-49、32-53、94-117和120-153，已作为免疫原被识别。(Neurath等，1986)。同样地，前S2序列跨度残基120-145，也已作为免疫原被识别。因此，依照本发明，作为免疫原性多肽，这些残基是有用的。其它涉及上述序列的插入、删除或者替代，也可以显示出免疫原性，并且这样采用定点诱变的突变的合成，是在专业人员的熟练操作下进行的。(Maniatis，T(1988)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory)。一种抗原决定簇与一种携带者，如与KLH或者脂质体相接合，可能是必需的，但应该意识到它对免疫原性的影响。上述的抗原决定簇怎样引发免疫应答，是不十分清楚的，然而，这可能会涉及到IgA受体、IL-6受体、去唾液酸糖蛋白受体和GAPD。

本发明的一个最佳的多肽，含有一个15个氨基酸的肽，还是一含有8个残基的肽，它与特异性的“一个”HBsAg决定子簇存在部分的同源。据报道，这种有AVYYCTRGYHGSSLY(SEQ ID NO：6)序列的肽，有着与特异性的“一个”决定子簇相似的抗原特性，并且能使B细胞和T细胞，对抗独特型抗体2F10和HBsAg的激发活性加倍(例如，见Thanavala，等的U.S.Pat.No.5744153；5531990；5668253)。此外，这种肽以及它的变异形式，可以成为一种这里论述的免疫原性多肽，和在本发明中完成的用一种多聚核苷酸来编码这样一种肽。当与另一个HBsAg或者与一本发明中的免疫原性多肽服用时，与抗体2F10相似的是，该多肽本身也可以作为一种佐剂使用。

本发明中的一些多肽，与以前通过病毒的各种前导信号和保留信号分类蛋白所获得的多肽，是不一样的。例如，一种这样的包含一HBsAg氨基酸序列的多肽，与C-末端的丝氨酸-谷氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸序列(SEQ ID NO：4)共轭连接，该序列则把蛋白作为靶蛋白运送至内质网。在一些实例中，本发明中的多肽，还可能与以前利用有不同糖基化模式的病毒而得到的蛋白不同，这可能是由于它们在内质网中的停留时间或者不同的糖基化酶(可以在内质网中出现)造成的结果。此外，所获得的免疫原性多肽，在它们的免疫原性特性上，可能与以前的蛋白质相比稍有改变。然而，只要这种免疫原与那些天然的免疫原性多肽有足量的抗原决定簇，不管它们与抗原的足够多的交叉反应，也可以发动一次免疫应答。

可取地是，本发明中的HBsAg多肽有形成病毒样颗粒(VLPs)的能力。甚至更为可取地是，本发明中的HBsAg多肽，当被一种植物细胞合成时，就有能力形成VLPs。本发明的一个最佳实施例是，HBsAg多肽通过二硫键，有形成交联单体的能力。高度交联的HBsAg，可以更加稳固和更有免疫原性。见例12。

由肝炎的各种致病菌株和分离物以及其它的病原体所提供的、在本发明中所出现的抗原，以及所有这些菌株和分离物的多肽，均可用于本发明。本发明中的免疫原性多肽，例如HBsAg，既可以是全长的多肽、多肽的片段，也可以是多肽截去的片段。例如，免疫原性多肽的片段，可以包括免疫原性多肽至少6、10、25、50、75、100、150、200、250、300或者350、400、500、750、1000或者1500个或者更多的氨基酸。本发明进一步包含一种或者多种突变，如在一种免疫原性多肽中的氨基酸的替换、添加、删除、切除或者是重组。

本发明中的免疫原性多肽，可以应用另一种切除过的免疫原性多肽、另一个免疫原性多肽的片段、或者一免疫原性多肽的全长，进行重组和合成。例如，一种免疫原性多肽的片段，可以包括免疫原性多肽至少6、10、25、50、75、100、200、300、400、500、1000个氨基酸。两种免疫原性多肽可以来自同一种或不同种的菌株。另外，本发明中的一种或更多种(例如2、3、4、5、10、25、或50)的免疫原性多肽，来自同一种或不同种的菌株，均可以被重组。

更为可取地是，本发明中的多肽可以通过重组来制取。利用这一领域中很普遍的技术，我们能够将一个编码多肽的多聚核苷酸，导入一个能在一定表达系统中表达的表达载体中。有多种的细菌的、酵母的、植物的、哺乳动物的和昆虫的表达系统，都是可以应用在这一技术和任意这样可用的表达系统。本发明中的多肽，可以应用这一领域中最常用的方法，如免疫亲合纯化法，从真核细胞如植物细胞中分离、纯化出来。随意地是，编码本发明中多肽的多聚核苷酸，能在细胞外翻译体系中进行翻译。

如果需要，本发明中的多肽，可以被制成一个融合蛋白，即也能包含其它的氨基酸序列，如氨基酸衔接物或者信号序列，还有在蛋白质纯化中很有用的配体，例如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标记物和葡萄球菌A蛋白。随意地是，一个或多个抗原，如HBsAg、移生性抗原、病毒性抗原，以及它们的抗原决定簇，和其它能够引起人或动物的分泌性免疫反应的成分，都可能在一个融合蛋白中呈现出来。在一个融合蛋白中，可呈现不止一个的免疫原性多肽，如HBsAg多肽。若有必要的话，在一个融合蛋白中，可以包含有来自不同肝细胞株或分离株的、HBsAg多肽的重组体。多聚核苷酸编码免疫原性多肽

本发明中的多聚核苷酸，包含小于一个整细菌、病毒或者是原生动物的基因组，而且可以是单链DNA或双链DNA。更可取地是，多聚核苷酸可以从其它成分，如蛋白质中纯化出来。多聚核苷酸编码上述的免疫原性多肽。本发明中的多聚核苷酸，可以从如培养的细菌、病毒或原生动物的核酸序列的基因组文库中分离出来。可取地是，该多聚核苷酸，还可以从如血浆、血清或者有HBV感染的个体肝脏或用HBV感染的培养细胞的、核酸序列的基因组文库中分离出来。例如PCR的扩增方法，可以用编码免疫原性多肽的细菌、病毒或原生动物的基因组RNA或cDNA，来扩增多聚核苷酸。多聚核苷酸也可以在实验室中合成，比如使用自动合成仪。如果需要的话，该多聚核苷酸抗原被克隆入一种表达载体，并转化入如细菌的、酵母的、昆虫的、植物的或者哺乳动物的细胞中，以致于在这些细胞中，可以表达本发明中的多肽，并从细胞培养中分离出来。

该多聚核苷酸，可以包括编码能自然生成的免疫原性多肽的序列，或可以编码已变的免疫原性多肽，而后者是不会在自然状态下产生的。利用传统技术的定点诱变，可以造成LT或CT多聚核苷酸的一个或多个突变。一个包括单突变、双突变或更多突变位点的突变多聚核苷酸文库，也能用随机诱变的技术得到。诱变技术通常描述在Curent Protocol in Molecular Biology，Ausubel等eds.，John Wiley(1998)中，随机诱变(也指“DNA移动”)是Stemmer等的美国专利Nos.5,605,793，5,811,238，5,830,721，5,834,252和5,837,458的主题。一个包含有免疫原性多肽的突变的多聚核苷酸，也能够在实验室中合成。

更为可取地是，本发明中的免疫原性的多聚核苷酸，可以被设计成为能应用植物优选化的密码子，系统地替换掉细菌的密码子。例如，HBsAg的编码序列，或其一部分的密码子，能应用它的使用率加以分析。然后，可以拿它与特定植物中的“富产”蛋白的密码子使用的频率相比较。例如见WO96/12801。在植物中使用频率低或根本不被使用的密码子，可以通过诸如定点诱变或实验室合成的技术来修饰。密码子的修饰是与在植物中大量表达的蛋白的基因所采用的密码子一致的。此外，带有可能的poly-A信号序列的密码子片段，可以被修饰成其他携带同一氨基酸信号的密码子。进一步说，隐蔽信号序列、内含子剪接位点和潜在的甲基化位点，也能够被修饰，见WO96/12801；SEQ ID NO：3(图22)。(显示了一个编码HBsAg的核酸序列，已在植物中优选化表达)。对植物优选化密码子的替换，以使其符合病毒、细菌或者原生动物-优选化的密码子，以增强免疫原性多聚核苷酸的表达量，并且使其编码的多肽，在植物的特定部位，例如在果实或块茎中的编码多肽或多肽的表达更加容易。一种免疫原性多聚核苷酸序列，例如HBsAg，至少有1、2、3、4、5、10、20、50个或更多的密码子，修改为植物优选化的密码子，被称为植物最优选化。可取地是，植物优选化，进一步包括修改编码可能的信号序列的密码子，内含子剪接位点和甲基化位点。

更可取地是，编码一种免疫原性多肽的本发明中的多聚核苷酸，例如HBsAg，可操纵性地与一个植物功能性的启动子相连接。如同此处所用的，“可操纵性地连接”是指免疫原性多肽的编码序列，被融合如一启动子、转录或者翻译启动子、终止序列等等的结构中，以致于各自的编码序列均被精确地转录和翻译。此外，各自的核苷酸序列不需要被连续地融合(如共价结合)成相邻接的确定的序列，但是可以通过合成衔接头或衔接物，以促进该结构和表达载体的装配。

一种启动子可以是一种结构型的启动子，由此，在一个细胞内可出现一种免疫原性多肽的持续性表达。另外，启动子可以被诱导，由一种化学诱导剂或一种组织特异性物质激活启动子，例如在植物达到一个所希望的分化阶段。可诱导的启动子，包括一些有能力增加多聚核苷酸的产量的启动子，是通过将所提供的多聚核苷酸暴露给一种诱导剂来实现的。可诱导的启动子还包括，但不只限于一种热休克启动子、糖皮质激素系统、创伤诱导的、类固醇诱导的、磷酸盐缺乏诱导的以及一些化学诱导的启动子，包括但不只限于四环素、乙烯、铜、水杨酸、苯基-1，2，3-硫化二唑。见U.S Pat.No.5,942,662，5,977,441，5,684,239和5,922,564。

一种植物优选的启动子是CaMV35S，它包含一个双启动子区。这种启动子是一种结构型启动子，在植物的叶片和块茎中可有效引起表达。其它的植物优选化的启动子，包括patatin、mas、西红柿E8(Giovanni等Plant Cell，1：53-63(1989))、泛素(Quail等，U.SPat.No.5,510,474)、甘露糖合酶(Ellis等，Mol.Gen.Genet.195：466-473(1984))，胭脂碱合酶(Ebert等，PNAS，84：5745-5749(1987))、玄参花叶病毒(FMV)(Rogers等，U.S Pat.No.5,378,619)、蔗糖合酶(Yang等，PNAS，87：4144-4148(1990))、肌动蛋白(Wang，等Mol.Cell.Biol.，12：3399-3406(1992))，异柠檬酸裂解酶(Harada，等U.SPat.No.5689040)和颗粒限制性淀粉合酶(GBSS)启动子。更可取的是，启动子包含有一双(或者两个)启动子。见Artzen，U.SPat.No.5,914,123；Lam，U.S Pat.No.5,612,487；和Maiti，U.SPat.No.5,994,521。

一些可效仿植物功能的启动子，能够用于表达一种本发明中的结构基因，如下：U.S Pat.No.5,352,605和U.S Pat.No.5,530,196-CaMV35S和19S启动子；U.S Pat.No.5,436,393-patatin启动子；U.SPat.No.5,436，393-B33来源于马铃薯的一个patatin基因的启动子序列，并且引起块茎特异性表达序列，融合到B33启动子；WO94/24298-西红柿E8启动子；U.S Pat.No.5,556,653-西红柿果实启动子；U.S Pat.No.5,614,399和U.S Pat.No.5,510,474-植物泛素启动子系统；U.S Pat.No.5,824,865脱落酸应答基因表达的-5′顺式调节因子；U.SPat.No.5,824,857-badnavirus、水稻tungro杆状病毒(RTBV)；U.SPat.No.5,789,214-化学诱导的启动子片段，来自烟草PR-la基因编码区附近的5′侧区；U.S Pat.No.5,783,394-覆盆子drul启动子；WO 98/31812草莓启动子和基因；U.S Pat.No.5,773,697-napin启动子、phaseolin启动子和DC3启动子；U.S Pat.No.5,723,765-LEA启动子；U.SPat.No.5,723,757-5′转录调节下沉器官特异性表达的区域；U.SPat.No.5,723,751-与共同基序序列，尤其是作为顺式因素启动子的Iwt和PA基序相关的G-盒，它调节异质性基因，在转基因植物中的表达；U.S Pat.No.5,633,440-P119启动子及其应用；U.S Pat.No.5,608,144-2组(Gp2)植物启动子序列；U.S Pat.No.5,608,143-来自玉米、矮牵牛花和烟草几种基因衍生来的核酸启动子片段；U.S Pat.No.5,391,725-豌豆植物，pisum sativum中来自叶绿体GS2谷氨酰胺合成酶核酸基因的，和来自细胞质GS3谷氨酰胺合成酶两个核酸基因的启动子序列；U.SPat.No.5,378,619-来自flagwort花叶病毒(FMV)的全长转录启动子；U.SPat.No.5,689,040-异柠檬酸裂解酶启动子；U.S Pat.No.5,633,438-小苞子特异性调节因素；U.S Pat.No.5,595,896-异质性基因在转基因植物中的表达，和应用植物天门冬酰胺合成酶启动子的植物细胞；U.SPat.No.4,771,002-驱动一个1450碱基TR转录产物，在章鱼肉碱型花冠菌瘿肿瘤中表达的启动子区域；U.S Pat.No.4,962,028-来自1，5二磷酸核酮糖羧化酶小亚单位基因的启动子序列；U.S Pat.No.5,491,288-阿布属组蛋白H4启动子；U.S Pat.No.5,767,363-种子特异性植物启动子；U.S Pat.No.5,023,179-21bp启动子因素，它能将其在根部表达的能力赋予一个通常只在绿色组织中发挥作用的rbcS-3A启动子；U.SPat.No.5,792,925-与植物尤其是根中有关的DNA序列组织优先转录的启动子；U.S Pat.No.5,689,053-Brassica sp.多聚半乳糖醛酸酶启动子；U.S Pat.No.5,824,863-种子皮特异的隐藏的启动子区域；U.SPat.No.5,689,044-自烟草PR-la基因分离的化学合成的核酸启动子片段，它可以应用苯基-1，2，3-硫化二唑，异烟酸复合物或水杨酸复合物诱导合成；U.S Pat.No.5,654,414-自黄瓜壳多糖酶/溶菌酶基因分离的启动子片段，它可以通过应用苯基-1，2，3-硫化二唑诱导合成；U.SPat.No.5,824,872-来自烟草的结构启动子，它至少在卵巢、花、未成熟胚胎、成熟胚胎、种子、茎干、叶子和根组织中有直接表达；U.SPat.No.5,223,419-植物中基因表达的改变；U.S Pat.No.5,290,924-在单子叶植物中基因表达的重组启动子；WO95/21248-应用TMV过度生产肽和蛋白质的方法；WO 98/05199-含有嫩枝分裂组织特异的启动子和调节序列的核酸；EP-B-0122791-菜豆球蛋白启动子和结构基因；U.SPat.No.5,097,025-植物启动子(sub domain of CaMV 35S)；WO94/24294-应用西红柿E8-衍生的启动子表达异质性基因，例如成熟水果中的5-腺苷甲硫氨酸水解酶；U.S Pat.No.5,801,027-应用反式作用蛋白控制转基因植物中基因表达的方法；U.S Pat.No.5,821,398-编码合成的植物启动子和西红柿Adh2酶的DNA分子；WO 97/47756-合成的植物核心启动子和上游调节因子；U.S Pat.No.5,684,239-有双子叶植物外伤诱导启动子的单子叶植物；U.S Pat.No.5,110,732-植物中选择的基因表达；U.S Pat.No.5,106,739-CaMV 35S增强的mannopine合酶启动子和应用合酶的方法；U.S Pat.No.5,420,034-种子特异性的转录调节；U.SPat.No.5,623,067-种子特异性的启动子区；U.S Pat.No.5,139,954-小麦的DNA启动子片段；WO 95/14098-植物中使用的空想调节区和基因盒；WO 90/13658-基因产量达高水平；U.S Pat.No.5,670,349-HMG启动子表达系统和张贴在植物和植物细胞培养中收获的基因产量；U.SPat.No.5,712,112-在植物中含有α淀粉酶基因启动子区的基因表达系统。

一种优选的多聚核苷酸应包括，一个烟草花叶病毒(TMV)的5′转录非翻译区(UTR)(Ω)(Gallie等Nucleic Acids Res 20：4631-4638(1992))，或者一个烟草蚀刻病毒(TEV)的5′转录非翻译区(Carrington等，J.Virol.64：1590-1597(1990))，或者是它们的片段，位于启动子和一种编码免疫原性多肽的多聚核苷酸序列之间。TMV的5′UTR能促进编码序列的翻译。多聚核苷酸可进一步包含有一个TMV的3′UTR或者是它的片段，也能够促进翻译的进行。Zeyenko等FEBSLett.354：271-273(1994)；Leathers等Mol.Cell.Biol.13：5331-5347(1993)；Gallie等Nucl.Acids Res.20：4631-4638(1992)。

更可取的是，表达载体含有一个或多个启动子。本发明中能够应用的一些启动子如下：U.S Pat.No.5,424,200和U.S Pat.No.5,196,525-CaMV35S启动子序列；U.S Pat.No.5,359,142，U.S Pat.No.5,322，938，U.S Pat.No.5,164,316，和U.S Pat.No.5,424,200-衔接复制的CaMV35S启动子；WO 87/07664-TMV的Ω′区；WO 98/14604-PAT1基因的内含子1和/或内含子2；U.S Pat.No.5,593,874-HSP70内含子，存在于植物中的空想基因启动子表达的未翻译前导序列；U.SPat.No.5,710,267，U.S Pat.No.5,573,932，和U.S Pat.No.5,837,849-能够与OCS转录因子结合的植物启动子因素；U.S Pat.No.5,290,924-玉米Adhl内含子；JP 8256777-翻译启动子序列。

本发明中的多聚核苷酸，还可以包括一个在植物宿主中起作用的转录终止序列。典型的终止序列包括，胭脂合酶(nos)(Bevan，Nucleic Acids Res.，12：8711-8721(1984))、植物储存蛋白(vsp)(Mason等Plant Cell.5：241-251(1993))与抑制性蛋白酶-2(pin2)(An等Plant Cell.1：115-122(1989))终止序列。这些序列只能被转录，而不能被翻译。

本发明中的多聚核苷酸，还可以编码—微粒体保留信号序列，例如SEKDEL(丝氨酸-谷氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸)(SEQID NO：4)，或者KDEL(SEQ ID NO：22)，在一个细胞内，是为了增加表达性多肽的保留区。例如HBsAg抗原复合体的浓聚，可以通过带有微粒体保留信号的新生成的多肽来获得，蛋白的这些信号将被在重复应用于内质网(ER)或者其它的细胞器中。微粒体保留信号序列能够可操纵性地连接到免疫原性多肽的3′末端。更为可取的是，该多聚核苷酸缺乏一个位于微粒体保留信号和终止序列之间的非转录区。该信号可以与免疫原性多肽相分离，例如，铰链区。

本发明中的多聚核苷酸进一步可以包含有一个信号肽，该信号肽被可操纵性的连接到免疫原性多肽的5′末端。信号肽包括，如植物贮藏蛋白(VSP)αS信号肽或者VSPαL信号肽。Mason等，Plant Mol.Biol.11：845-856(1988)。按照预先确定的途径，例如，在细胞内的ER或者假定的贮存囊泡中，信号肽可用作选择一种蛋白。因此，在靶位点上，信号肽可以积累和/或进一步加工多肽。通过铰链区，信号肽可以物理性的与一个免疫原性多肽相分离。

一个优选的实施例是，本发明中的多聚核苷酸包含有一种核酸序列，该核酸序列可编码一种免疫原性多肽，例如HBsAg，可操纵性地与一个植物功能性的启动子、一个翻译增强序列和一个终止序列相连接。甚至更优选的是，本发明中的多聚核苷酸，在翻译增强序列和免疫原性多肽编码序列之间，缺乏一个非转录区。即，一种可转录翻译增强序列的RNA聚合酶，不会停止转录，只能连续转录免疫原性多肽编码序列。甚至更优选的是，该多聚核苷酸，在免疫原性多肽序列和终止序列之间，缺乏一个非转录区。

更优选的是，本发明中的多聚核苷酸包含有一个天然病毒源性(或者野生型)的HBsAg-编码核苷酸序列，见SEQ ID NO：1。相应的HBsAg氨基酸序列见SEQ ID NO：2。一个HBsAg编码序列可以通过合成的寡聚体的装配直接加以合成，或者可以来自于cDNA文库，质粒运载序列，或其它的载体，如下文将要论述的那些载体。

另外，本发明中的多聚核苷酸，可以包含有HBsAg编码序列的合成型式，在一种真核细胞表达系统，如一种植物细胞中，它可以结合一个或多个插入、删除或者突变，以提高转化、转录或者翻译的效率。一个这样的编码HBsAg的S蛋白的合成序列，见SEQ ID NO：3(图22)；其相应的氨基酸序列见SEQ ID NO：40(图23)。另一种在植物中被采用的表达序列，可编码前S肽，见图5(SEQ ID NO：5)。

与这些HBsAg序列有着高度同源性的核苷酸序列也被考虑了，优选的是，被编码的氨基酸序列保持着相当大的或者全部没有被改变。尤其是，考虑了至少80％，更好是90％的、与HBsAg多聚核苷酸存在同源的序列。在计算同源性的百分数中，确定了与多聚核苷酸相同的碱基对的百分率，并考虑了在核酸序列中的一些插入、删除或替换。本发明进一步考虑了编码HBsAg多肽的抗原决定簇的多聚核苷酸，其中的HBsAg多肽的抗原决定簇主要是可激发免疫应答。因此，在本发明中，仔细考虑了HBsAg蛋白的C-末端、N-末端或者其它所有的片段。在本发明中的多聚核苷酸中，作为一种单一或者重复序列，这些片段均可以被编码。片段的长度，可以至少有12、15、25、50、75、100、200、300、400、500、750、或1000个核酸。

本发明中，特别优选的多聚核苷酸，包括HB103、HB104、HB105、HB106、HB107、HB111、HB114、HB115、HB116、HB117、HB118、HB119、HB120、HB121、HB122、HB123、HB145、HB165、和HB131、和HB140.3，其中包含有上述结构特征的各种重组体。这些质粒的相应的表达盒，见图1A和1B。最为精选的是HB114，它是用一个35S启动子和一个TEV翻译启动子和一个蛋白酶抑制剂2(pin2)终止序列构筑的。在这种质粒中，抗卡那霉素基因是作为一种选择性标记物使用的。其载体来自根癌土壤杆菌属的一种二元载体，例如pBIN19(Bevan 1984)或者(pGPTV-KAN)(Becker等Plant Mol.Biol.20：1195-1197(1992))。该35S启动子是“结构型”启动子，并有一个双启动子(Mason等1992)。

更为可取地是，本发明中的多聚核苷酸，包含有一种表达盒。即，该多聚核苷酸可操纵性地与一个启动子相连接。另外，翻译增强序列和/或终止多聚核苷酸序列，均能包含在一个表达盒中。其它的多聚核苷酸，例如信号序列，也可以出现在一个表达盒中。

在本发明中的一个优选的表达盒中，编码植物优选化或者野生型的免疫原性多肽的多聚核苷酸，例如HBsAg，可操纵性地与一个植物功能性的启动子相连接，例如CaMV35S或者西红柿E8启动子。此外，表达盒中还可以包括一个烟草蚀刻病毒(TEV)或者烟草花叶病毒(TMV)的Ω翻译启动子，它只能被转录，但不能被翻译。表达盒中还可以包括一个3′转录非翻译区，例如胭脂碱合酶(nos)、植物贮藏蛋白(vsp)或者蛋白酶抑制剂如pin2。一种表达盒可能在翻译增强序列和免疫原性多肽编码序列之间，和/或者在3′转录非翻译区之间，缺乏一个非转录区。(Mason，1992).

本发明中的表达盒，包含有启动子，该启动子在植物的特定部位有直接的多肽表达。例如，包含CaMV35S启动子和本发明中多聚核苷酸的表达盒，在本质上，可用于转化植物，以致于表达有本发明中多聚核苷酸的多肽，可以在植物的叶片中产生。这就需考虑多聚核苷酸表达的快速分析，以及多聚核苷酸产物的生物化学特性。

包含有2S白蛋白启动子和本发明多聚核苷酸的表达盒，可以被用于使种子-特异性的多聚核苷酸表达，进而在种子的组织中合成本发明中多肽的产物，例如，菜籽油(Brassica napus)种子。

由一个patatin启动子或大豆vspB启动子以及发明中的多聚核苷酸组成的表达性基因片段，在块茎组织中，例如马铃薯(块茎茄属植物)，可以被用来诱导块茎特异性的多聚核苷酸的表达和块茎特异性地产生多肽。

由果实成熟特异性启动子和发明中的多聚核苷酸组成的表达性基因片段，可以被用来转化那些在其成熟果实中，例如香蕉(Musaacuminata)产生发明中的多肽的植物。表达载体

如果需要的话，含有本发明中的多聚核苷酸片段的多核苷酸或基因表达片段，可以被克隆到一个表达性载体中，然后被转换到细胞之中，例如细菌、真菌、昆虫、植物或者是哺乳动物的细胞之中。这样，本发明中的多聚核苷酸片段可以在细胞培养中得到表达并被分离出来。多聚核苷酸片段还可以被包含在质粒中，例如PBR322、PUC或者ColE1质粒，也可以被包含在腺病毒载体中，如腺病毒II型载体或者腺病毒V型载体。另外也可以使用其他载体，包括但是并不仅仅局限于如下的载体：Sindbis病毒、猿病毒40、α病毒载体、巨细胞病毒、以及一些逆转录酶病毒载体，如鼠科肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒、，莫罗尼鼠科白血病病毒和劳斯肉瘤病毒。还可以使用细菌性载体，例如沙门氏菌属、小肠结肠耶尔森氏菌属、志贺氏菌属、霍乱弧菌属、BCG分枝杆菌菌株、单细胞基因李斯特菌属和土壤杆菌属等等。另外，也可以使用微小染色体，如MC和MC1、噬菌体、病毒颗粒、病毒样颗粒、cos质粒(插入λ噬菌体cos位点的质粒)以及复制子(一个细胞中可以在自我控制下进行复制的基因片段)作为表达性载体。

优选的是，除了包含有发明中的多聚核苷酸片段外，一个表达性载体还应包括一个可选择的标记物。可选择的标记物的例子包括：卡那霉素基因、β-葡萄糖苷酸酶基因、新霉素转移酶基因、tfdA基因、Pat基因、hyg基因、氨甲蝶呤抵抗性DHFR基因、去卤化酶基因和bar基因。表达载体还可以含有一段大肠杆菌的复制起始端，例如ColE1或者PBR322的复制起始端，以便有助于载体在大肠杆菌中的复制。本发明中的多聚核苷酸片段的表达性载体还可以含有一个根癌土壤杆菌的复制起始端，以便允许载体在那里的复制，例如用于根癌土壤杆菌进行植物转化时。

基因抑制效应可能影响本发明中的多聚核苷酸片段的表达水平。有两种不同形式的基因抑制效应：转录过程基因抑制效应(TGS)和转录后基因抑制效应(TPGS)。Vaucheret等人，Plant J.植物杂志，16：651-9。有一种类型的转录过程基因抑制效应是顺式灭活，在这种情况下，一个被甲基化的DNA位点可以影响与之相连接的DNA片段。在植物中，甲基化作用可以从邻近的基因序列传播到转移基因中，并导致基因抑制效应。Prols和Meyer，Plant J.植物杂志，2：463-75(1992年)。在一段最优化的植物DNA序列中，可能发生甲基化作用的位点的数目减少，甚至没有这杆的位点，因此，如果在转基因蛋白中使用最优化的植物DNA序列，就有可能将这种类型的基因抑制效应减到最少。另一种类型的顺式灭活发生在同一核苷酸序列的多个复制片段整合在同一位点时。同样的是，基因抑制效应的发生机制似乎与甲基化作用有关(Ye和Signer，PNAS，USA，93：10881-6(1996年)。使用不含有潜在的甲基化位点的一段植物最优化序列，可能会避免这种类型的基因抑制效应。

当转基因RNA高水平产生时，就有可能发生转录后基因抑制效应。如果有不止一个的转基因模版在产生RNA，那么产生的RNA就可能积累到一个阈值水平，从而激发转录后基因抑制效应(Vaucheret等人，Plant J.植物杂志，16：651-9(1998年)。一些研究显示，在转录区域只要有60个碱基对的恒定DNA序列，就可以介导这一过程。Depicker和Van Mantagu，细胞生物学的最新观点Curr.Opin CellBiol.，9：373-82(1997年)。在一个转基因植物中联合同一编码序列的不同的模版，可以增加编码同一多聚核苷酸的mRNA水平，但是并不会激发RNA-介导的基因抑制过程。

一个最佳实施例是，一个表达载体应包含有两个表达盒。一个基因表达盒由编码具有免疫原性的多肽(或抗原)的多聚核苷酸组成。另一个基因表达盒由与前者不同的多聚核苷酸组成，但编码同样的免疫原性多肽。例如，第一个基因表达盒由编码乙肝表面抗原(HBsAg)的多聚核苷酸组成，在这里的多聚核苷酸已被植物最优化。见SEQ ID NO：3(图22)。而第二个表达性基因盒则可由编码天然病毒来源的(即野生型)乙肝表面抗原(HBsAg)的多聚核苷酸构成。一个表达载体如果由两个或多个编码同一免疫原性多肽的表达性基因片段组成的话，则可以通过增加复制的数量米增加这种免疫原性多肽的产量。但是，多个模版或同一基因序列的顺序复制可能导致不希望出现的转录后基因抑制效应。DepicherVan和Montagu，细胞生物学最新观点，Curr.Opin.Cell Biol.9：651-9(1998年)。因此，发明中的一个目的就是减少甚至消除转录过程基因抑制效应。例如，将两个或者两个以上编码同一免疫原性多肽、但由不同多聚核苷酸组成的表达性基因片段，引入一个表达性载体之中，从而减少甚至消除RNA介导的转录后基因抑制效应。最佳的是，通过使用不同的启动子、以及5’末端和3’末端被转录而不被翻译的区域，例如翻译增强序列和终止序列，从而进一步减少表达性基因盒的组成序列的同一性。表达盒还可包括不同的多聚核苷酸编码，例如信号多肽。

优选的是，整合到植物表达载体的每一个表达盒，与另一个长度超过90个碱基对的表达盒相比，二者不具有相同的序列。更理想的是，与另一个长度超过60个碱基对的表达盒相比，二者不具有相同的序列。而最理想的情况是，与另一个长度超过30个碱基对的表达性基因片段相比，二者不具有相同的序列。也就是说，当一个表达盒中的每一部分(例如编码启动子或免疫原性多肽的核酸、5′末端和3′末端被转录而不被翻译的区域、以及其他组成部分)与第二个表达盒的相应部分相比时，在两个表达盒中的任何一段长度，没有连续超过90个碱基对(或60个碱基对、或30个碱基对)是完全相同的。

通过构造包括例如两个相同的表达盒组成的一个植物表达载体，而每一个表达盒都由编码一个目标免疫原性多肽的多聚核苷酸组成，利用这种方法可以检测转录过程基因抑制效应的差异。在一个植物细胞中，这种免疫原性多肽表达的数量，可以与一个植物表达载体表达的免疫原性多肽的量相比较，而这个植物表达载体由两个不同的表达盒组成，每个表达盒都编码这种目标多肽。由两个不同的表达盒组成的植物表达载体所表达的免疫原性多肽的数量更多，从而提示在植物细胞中，转录后基因抑制效应被减弱或是没有被激活。理想的是，转录过程基因抑制效应至少被减少10％、25％、50％、75％或者是100％。

进一步而言，一个植物表达载体中的每一个表达盒可以由相同或者不同的启动子、翻译增强序列和终止序列组成。每一个表达性基因片段还可以包含其他的多聚核苷酸序列，例如编码信号序列的多聚核苷酸。优选的是，当在一个植物表达性载体中使用两个或者多个表达盒时，每一个表达盒包括一个不同的免疫原性多肽、一个不同的翻译增强序列和一个不同的终止序列。

在另一种最佳实施例中，单独的、不相同的表达载体，如果它们都有一个表达盒编码同一种多肽(或抗原)，就可以被顺序地用于转化一种植物。进一步而言，如果两个转基因植物含有不同的表达性基因片段，而这些不同的表达盒却编码同一种多肽(或抗原)，则可以将这两个转基因植物进行有性繁殖，这样，在筛选出的后代的基因组中将这两个表达性基因片段整合在一起。相似的情形下，每一个传代植物中都包含有多个不相同的、但编码相同多肽(或抗原)的表达盒，将不同的传代植物进行繁殖，结果是在每一个植物的基因组中不相同的表达盒数量越来越多。因此，在一个表达性载体上不需要存在多个表达盒，但是，基因表达性片段可以通过连续性转化或者有性繁殖的方式，单独地引入植物细胞中。

理想的情况是，发明中的一个植物表达载体至少包括2、3、4、5、10个甚至更多的表达盒。每一个表达盒可以构成同一种多聚核苷酸，或者构成不同的多聚核苷酸。含有多聚核苷酸和表达性载体的植物的转化和重建

本发明的另一方面是，组建的真核细胞或者原核细胞，包括与发明中的多聚核苷酸、或含有发明中的多聚核苷酸的表达性基因片段一起转化。优选的是，该细胞是一个植物细胞，但是，其他类型的细胞，例如昆虫细胞、哺乳动物的细胞、以及细菌的细胞也可以考虑。当使用植物细胞时，理想的情况是，多聚核苷酸被整合到植物细胞核的基因组中，这样可以保证该多聚核苷酸的稳定性，以及可以被顺利地传代下去。本发明的多聚核苷酸在某些情况下，也可以存在于细胞染色体之外，例如存在于线粒体中、叶绿体中、或者是细胞质中。一段多聚核苷酸转移到昆虫细胞中的理想模式是通过病毒进行转移，这样可以在染色体外持续进行复制，或者整合到染色体中进行复制。将多聚核苷酸转移到哺乳动物的细胞或是细菌细胞中的方法，在技术方而已经广为人知。

转化的植物细胞最好来源于这样一种植物，或者可以作为一种粮食被人们消费，或者以一种容易分离的形式表达需要的蛋白质或多肽。代表性的植物包括：烟叶、香蕉、西红柿、马铃薯、胡萝卜、大豆、玉米、大米、小麦、以及向日葵。其中特别理想的马铃薯宿主包括“渴望者”和FL1607(Frito Lay佛莱托-雷1607)的各种品种，它们可以从位于威斯康星的雷因兰德(Rhinelander，WI)的佛莱托-雷(FritoLay)有限公司购得。另一种理想的西红柿品种，TA234，可以从史蒂文·坦史斯雷(Steven Tanksley)处购得，Dept.of Plant Breeding，CornellUniversity，Ithaca，NY 14853。本发明进一步的特点是，通过一个转基因植物的繁殖而获得的转基因植物种子，与发明中的多聚核苷酸一起转化。

将外源性核酸构建物转移到植物中的主要方法中，根癌土壤杆菌转化技术是其中之一。这种方法建立的基础是冠状五倍子的一种致病因子，该致病因子可以影响许多种双子叶植物和裸子植物。当目的植物宿主易于被感染时，这种根癌土壤杆菌转化系统就可以提供很高的转化率和预期的染色体整合模式。

土壤杆菌通常情况下感染植物的受伤部位，这些土壤杆菌带有一个大的染色体外成分，称之为Ti(肿瘤诱导)质粒。肿瘤诱导质粒包含有肿瘤诱导所需要的两个区域。一个区域是T-DNA(被转移的DNA)，这是最终被稳定地转移到植物基因组DNA中的一段DNA序列。另一个区域是vir(毒力)区域，这一区域是被包含在转移机制之中的。虽然vir区域是实现稳定转化所必需的，但是，vir区域的DNA并不转移到被感染的植物中去。通过感染土壤杆菌介导的植物细胞的转化，以及随后的T-DNA转移，都已经得到充分的证明。Bevan等人，Int.Rev.Genet.16：357页(1982)。土壤杆菌系统的技术已经相当成熟，可以允许常规性地将DNA转移到多种植物组织的基因组中。例如，烟叶、西红柿、向日葵、棉花、油菜籽、马铃薯、白杨和大豆等都可以通过土壤杆菌系统进行转化。

优选的是，当根癌土壤杆菌介导含有本发明中的多聚核苷酸的植物进行转化时，同时也提供了根癌土壤杆菌侧面的T-DNA边沿区域。T-DNA边沿区域是23-25个碱基对的直接重复序列，与T-DNA转移到植物基因组中有关。侧面的T-DNA边沿区域将T-DNA和将被转移和整合到植物基因组中的信号多聚核苷酸括在一起。首选的是，本发明中的多聚核苷酸或者表达载体至少含有一个T-DNA边沿区域，尤其是右侧的T-DNA边沿区域。另外，被输送到一个植物基因组的多聚核苷酸是夹在T-DNA的左右边界之间，这些边沿区域可以来自于任何的Ti质粒或Ri质粒(见下文)，这些区域还可以通过任何常规的手段连接到一个表达载体或者多聚核苷酸上。

典型的情况下，含有将被转移的多聚核苷酸的载体首先是在大肠杆菌中构建和复制。这个载体至少含有一个右侧的T-DNA边界区域，并且最好有一个左侧和右侧的边界区域，分别位于所需多聚核苷酸的侧面。同时还可以存在一个选择性标记物(例如编码抗生素耐药性的基因，如卡那霉素)，以便容易筛选已转化的细胞。然后，大肠杆菌载体被转移到土壤杆菌，这一过程可以通过结合配对系统或者直接摄取的途径来实现。一旦进入到土壤杆菌之中，含有多聚核苷酸的载体可以与土壤杆菌中的Ti质粒进行同源性的重组，将T-DNA合并到Ti质粒之中。Ti质粒还含有一套可诱导的vir基因，在将T-DNA转移到植物细胞中时发挥作用。

另外，含有多聚核苷酸的载体可以以反式的形式隶属于Ti质粒的vii基因。在一优选的方面，特定细胞株系的Ti质粒被“解除武装”，也就足说T-DNA的致癌基因被消除或受到抑制，从而避免了在转化的植物中形成肿瘤，但是，反式结构的vir基因仍然作用于T-DNA向植物宿主中的转移。见Hood，Trangenic Res.，2：208-218(1993年)；Simpson，Plant Mol.Biol.，6：403-415页(1986)。例如，在一个二元的载体系统中，大肠杆菌质粒载体被构建起来，其中含有侧面与T-DNA边沿区域相连接的目标多聚核苷酸，以及一个选择性标记物。这个质粒载体被转移到大肠杆菌之中，然后，被转化的大肠杆菌通过结合作用与土壤杆菌配对。这个作为受者的土壤杆菌含有一个第二Ti质粒(辅助性Ti质粒)，而该质粒中含有vir基因，但是已经被修饰过，切除了其中的T-DNA片段。辅助性Ti质粒将为植物细胞的感染提供必要的蛋白质，但是只有大肠杆菌修饰的T-DNA质粒将被转移到植物细胞中去。

根癌土壤杆菌系统允许许多种植物组织进行常规的转化。见Chilton，Scientific American，248-50(1983)；Gelvin，PlantPhysiol，92：281-285(1990)；Hooykaas，Plant Mol Biol.，13：327-336(1992)；Rogers等，Science，227：1229-1231(1985)。表1列出了利用这种系统被转化的代表性植物和代表性的参考文献。其他有可食部分的植物，或者可以通过加工提取单独的蛋白质的植物，也可以利用同样的方法或相关的常规修饰进行转化。

                       表1植物                          参考文献烟叶    Barton，K.等，    (1983)Cell，32，1033西红柿  Fillatti，J.等，  (1987)Bio/Technology，5，726-730马铃薯  Hoekema，A.等，   (1989)Bio/Technology，7，273-278  茄子       Filipponee，E.等，(1989)Plant Cell Rep.8，370-373Pepino      Atkinson，R.等，(1991)Plant Cell Rep.10，208-212山药       Shafer，W.等，(1987)Nature，327，529-532大豆       Delzer，B.等，(1990)Corp.Sci.，30：320-322豌豆       Hobbs，S.等，(1989)，Plant Cell Rep.8：274-277糖用甜菜     Kallerhoff，J.等，(1990)，Plant Cell Rep.9，224-228莴苣       Michelmore，R.等，(1987)， Plant Cell Rep.6：439-442钟形胡椒     Liu，W.等，(1990)，Plant Cell Rep.9：360-364芹菜       Liu，C-N等，(1992)，Plant Mol，Biol.1071-1087胡萝卜       Liu，C-N等，(1992)，Plant Mol，Biol.1071-1087芦笋       Delbriel，B等，(1993)，Plant Cell Rep.12：129-132洋葱       Donnusse，E.等，(1990)，Plant Sci.69：249-257葡萄藤       Baribault，T.等，(1989)，Plant Cell Rep.8：137-140香瓜       Fang，G.等，(1990)，Plant Cell Rep.9：160-164草莓       Nehra，N.等，(1990)，Plant Cell Rep.9，10-13大米       Raineri，D.等，(1990)，8：33-38向日葵       Schrammeijer，B.等，(1990)，Plant Cell Rep.9：55-60油菜籽       Pua，E.等，(1987)，Bio/Technology，5：815小麦       Mooney，P.等，(1991)，Plant Cell Tiss.Organ Cult.25：

         209-218燕麦         Donson，P.等，(1988)，Virology，162：，248-250玉米         Gould，J.等，(1990)，Plant Physiol.95：426-434紫花苜蓿     Chabaud，M.等，(1988)，Plant Cell Rep.7：512-516

柿花     Umbeck，P.等，(1987)，Bio/Technology.5：263-266

胡桃     McGranahan，G.等，(1990)，Plant Cell Rep.8：512-516云杉/针叶树  Ellis，D.等，(1989)，Plant Cell Rep.8：16-20

白杨     Pythoud，F.等，(1987)，Bio/Technology.5：1323

苹果     James，D.等，(1989)，Plant Cell Rep.7：658-661

其他土壤杆菌菌株，例如毛根土壤杆菌，也可以当作载体用于植物的转化。生根菌促进许多种类的双子叶植物根毛的形成，其中含有一个大的染色体外成分，称之为Ri(毛根诱导)质粒，Ri质粒的作用方式与根癌土壤杆菌中的Ti质粒相似。采用与利用根癌土壤杆菌进行转化相似的方法，发展了利用毛根土壤杆菌进行的转化，并且这种转化已被成功地使用，例如，用来转化紫花苜蓿和白杨，Sukhapinda等，Plant Mol.Biol.8：209(1987)。

根据植物的不同种类和土壤杆菌的传递系统，植物组织接种的方式有多种多样。一种简便的方法是叶盘程序，这种方法可以用任何的组织外植体来进行，只要这个外植体为整个植物分化的启动提供良好的来源。在特定的情况下可能还需要添加培育组织。接下来进行其他程序，例如含有根癌土壤杆菌的再生原生质体的体外转化，以获得转化的植物细胞。

在不使用土壤杆菌质粒的情况下，可以利用基因直接转移程序来转化植物和植物组织。Potrykus，Bio/Technology，8：535-542(1990)；Smith等人，Crop.Sci.，35：01-309(1995)。直接转化包括将外源性遗传物质摄入到植物细胞或者原生质中。通过使用化学试剂或者是电场，可以加强这种摄取作用。例如，本发明中的多聚核苷酸可以被转移到一种植物的原生质中，方法是用在原生质面前使用电穿孔术，用一个电刺激处理原生质。为了实现电穿孔，原生质被分离并悬浮在甘露醇溶液中。含有发明中的多聚核苷酸的超螺旋或环状的质粒DNA被加入其中。将溶液混合均匀，在室温条件下将其置于大约400伏/厘米的脉冲中10-100毫秒。这时细胞膜会发生可逆性的、自然的裂解，从而外源性的遗传物质便被转移到原生质中。然后，外源性的遗传物质被整合到细胞核中的基因组中。一些单子叶植物的原生质也是通过这一途径而被转化的，其中包括大米和玉米。

在植物细胞的转化中，脂质体的融合也是一种有效的办法。在这种方法中，原生质被聚集在一起，而其中的脂质体则带有发明中的多聚核苷酸。当原生质的细胞膜融合时，外源性的遗传物质便被转移到原生质中。Dehayes等人，EMBO J.4：2731页(1985)。同样的，在烟叶(一种双子叶植物)和繁叶Lolium(一种单叶植物)中都实现了直接基因转移，利用的是聚乙烯乙二醇(PEG)介导的转化作用。Mg²⁺和聚乙烯乙二醇(PEG)之间的协同作用会影响直接基因转移，Ca²⁺也可能在其中发挥作用。Negrutiu等人，Pant Mol.Biol.，8：363(1997)。另一种选择是，利用一个精细制作的玻璃针，将含有发明中的多聚核苷酸的质粒DNA溶液以微注射的方式直接注射入细胞之中，这样，外源性的DNA就被引入到细胞或原生质中。

也可以用“基因枪”法(或称为微粒加速过程)来实现直接的基因转移，包括用携带有发明中的多聚核苷酸来微小炮弹来轰击植物细胞。Klein等，Nature，327：70(1987)；Sanford，Physiol.Plant.，79：206-209(1990)。在该过程中，用发明中的多聚核苷酸包裹具有化学惰性的金属颗粒，例如钨或者金，并将之加速射向目的植物细胞。于是这些颗粒携带着发明中的多聚核苷酸穿入细胞内。研究显示，“基因枪”法既可以使悬浮在培养液中的细胞、原生质和植物的未成熟萌芽(这些植物包括洋葱、玉米、大豆及烟草)出现暂时的基因表达，也可以使之出现稳定的基因表达。McCabe等，Bio/Technology，6：923(1988)。

除此之外，DNA病毒也可以用来作用植物中的基因载体。例如，携带有经修饰过的、细菌氨甲蝶呤耐药基因的花椰菜镶嵌病毒曾被用于感染一种植物。外源性基因系统性地分布于整个植物。Brisson等，Nature，310：511(1984)。该系统的优点包括容易感染，在整个植物中系统地分布，每个细胞中都有基因的多个拷贝。

一旦植物细胞被转化后，有多种方法可用于植物的再生。特定的再生方法的选择，取决于启始的植物组织类型和需要再生的特定的植物品种。许多植物可以由来源于植物外植体的瘢痕组织再生，其中包括玉米、大米、燕麦、小麦、黑麦、向日葵、大豆、棉花、油菜籽和西红柿，但不仅仅局限于这些植物。利用根癌土壤杆菌转化植物组织，并在此基础上再生植物，这在多种植物中得到了证实，例如向日葵、西红柿、白色三叶草、油菜籽、棉花、西红柿、土豆、玉米、大米和多种蔬菜作物，但不仅仅局限于这些植物。从原生质体进行植物再生是特别有用的一项技术，该技术在许多植物中得到了证实，例如烟草、土豆、白杨、玉米和大豆，但不仅仅局限于这些植物。Evans等人，Handbook of Plant Cell Culture 1，124(1983)。

通过使用一个报告基因测量指定结构的表达效能，可以用来探查关于植物转化项目的初步研究以及其他一些类似的研究。典型的报告基因主要编码β-葡萄糖苷酸酶(GUS)、氯霉素乙酰基转移酶、β-牛乳糖、绿色荧光蛋白和荧光素酶。由一个报告基因或本发明中的多聚核苷酸转化的植物细胞，可以用多种方法分析其表达水平。例如，标准的Southern或Northern印迹杂交、多聚酶链反应(PCR)、以及免疫分析技术，都可使用于所选择的植物组织。表达发明中的免疫原性多肽的植物

本发明包括整个植物、植物细胞、植物器官、植物组织、植物种子、原生质体、瘢痕、细胞培养以及任何一组形成结构和/或功能单位的植物细胞，至少能够表达一种发明中的多聚核苷酸。理想的情况是，整个植株、植物细胞、植物器官、植物组织、植物种子、原生质体、愈合组织、细胞培养以及任何一个植物细胞组，能够在总的可溶植物材料中，每克至少产生0.001、0.01、1、5、10、25、50、100、500或1000微克发明中的多肽。最佳的是，根据发明所使用的植物，摄取的每克植物材料至少应该含有5微克的、理想的是含有7微克至15微克的乙肝表面抗原(HBsAg)。对于动物，例如一个人，通常情况下会摄入足量的植物性食物，这样为身体的每公斤体重提供大约2克至5克的植物物质。本发明进一步还包括将发明中的免疫原性多肽，如乙肝表面抗原，从产生这些多肽的植物细胞或者植物组织中分离、纯化或部分纯化。

可以采用ELASA方法分析植物组织的提取物中免疫原性多肽的表达程度。简而言之，可以使用各种技术，例如聚苯乙烯ELASA盘，使缓冲液中免疫性多肽的中和性抗体被包被上。在室温下经过的约一个小时的孵化，将缓冲液洗掉，例如使用PBS冲洗，而被阻碍用于非特异性结合的小孔则用含有5％牛奶的PBS冲洗。将待分析的植物提取样本加入这些小孔中。为了得到免疫原性多肽的标准定量曲线，不同稀释浓度的、细菌来源的免疫原性多肽被加入同一个盘中。在室温下孵化一个小时后，用缓冲液冲洗该盘。抗血清，例如针对免疫原性多肽的牛抗血清或免抗血清，用缓冲液和BSA稀释，在室温条件下于小孔中孵化1小时。用缓冲液清洗四次后，检测孔中的物质，例如，可用稀释于缓冲液和BSA中的、对抗与碱性磷酸酶结合的山羊IgG的兔抗血清来进行检测。用缓冲液清洗后，小孔在二氨基乙醇缓冲液中与对硝基酚磷酸盐底物一起孵化。经过10-30分钟的孵化，通过加入氢氧化钠终止反应，并在410纳米处读取吸收剂量。

通过比较产生发明中的多肽的植物与不产生发明中的多肽的植物的生长情况，可以用来检测本发明中的多肽对产生多肽的植物的毒性作用。最佳的是，产生发明中的多肽的植物，与不产生本发明的多肽的植物有着同样或相似的生长速率。发明中的免疫原性多肽的构成成分

本发明可以在整个植物、植物细胞、植物器官、植物组织、植物种子、原生质体、瘢痕、细胞培养、以及任何一组植物细胞(该组植物细胞形成结构和/或功能单位，至少能够表达一种发明中的多聚核苷酸)中提供含有免疫原性的多肽化合物，例如乙肝表面抗原(HBsAg)。本发明包括的植物材料，如叶、果实、块茎，最好能被人或动物食用。本发明还进一步包括发明中的免疫原性多肽，这些多肽已经从由产生它们的植物细胞或植物组织中分离、加工、提纯或部分提纯。例如，植物材料可以进行提取、研磨、粉碎、干燥、匀化等等，产生最终产品，其形式可能是提取物、汁、液体、粉末或者片剂。在对婴儿进行某些疾病的预防时，它有特别的优势，因为可以生产出含有疫苗的果汁，如西红柿汁、大豆汁和胡萝卜汁，或者是含有疫苗的牛奶，从而使服用变得容易。植物成分还可以通过另一种方法进行处理，即加入各种味道，使其变得更加美味。还可以通过加工，使植物中的抗原成分得到浓缩或纯化，从而增强这些成分的免疫原性。虽然通常并不给予优先的考虑，但是植物中的提取物也可以进行获取、灭菌和重新生成注射液，这样如果需要的话，可以通过肠外途径使用。

理想的是，任何对植物材料进行浓缩或使之达到条件的加工过程，都应该避免使免疫原性多肽，如HBsAg颗粒，发生明显的变性，这样多肽的抗原性不会丢失。合成物可能的免疫原性可以在体外用抗HBsAg的抗体进行筛检。本发明还可以提供含有发明中的多聚核苷酸的合成物。

本发明的合成物还可以含有制药上可以接受的载体。这一载体自身不应诱导对宿主有害的抗体产生。制药上可以接受的载体，在制药界中是人所熟知的。这些的载体包括大的缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖(例如具有乳胶功能的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、纤维素珠和类似物)、多聚乳糖酸、多聚乙醇酸、氨基酸聚合物(例如多聚谷氨酸、多聚赖氨酸及类似物)、氨基酸共聚物、拟肽、拟脂质和无活性的病毒颗粒等等，但是载体并不仅仅局限于上述这些物质。

制药中可接受的盐也可在发明中的化合物中使用，例如，象盐酸、溴化氢、磷酸盐或硫酸盐这样的无机盐，以及象醋酸盐、proprionate、苹果乳酸盐和安息香酸盐这样的有机盐。特别有用的蛋白底物有血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白、破伤风类毒素、以及制药界中人所熟知的其它蛋白。发明中的合成物还可以包含液体或赋形剂，例如水、盐水、甘油、右旋糖、丙二酸糊精、乙醇及类似物，它们可以单独地，也可以联合的形式加入化合物中。发明中的合成物中还可以包含如湿润剂、乳化剂或pH缓冲因子这样的物质。脂质体也可以被用作发明中的化合物的载体。

如果需要，发明中的化合物中也可以包含协同刺激分子，这种分子可以促进免疫原向淋巴细胞的呈递，例如B7-1或B7-2，以及白介素-2、白介素-12这样的细胞因子。在某些条件下，佐剂也可以包含在发明中的化合物之中。这些可以使用的佐剂包括但不局限于MF59-0、氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酸-L-苏氨酸-D-同型谷氨酸盐(thr-MDP)、N-乙酰基-(-)-胞壁酸-L-丙氨酰基-D-同型谷氨酸盐(CGP 11637，被称为nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酸-L-丙氨酰基-D-同型谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-双甘油棕榈酰基-sn-丙三醇-3-羟基磷酰基)-乙胺(CGP 19835A，被称为MTP-PE)、细菌的质粒DNA、抗HB抗体、含有免疫刺激性CpG的寡脱氧核糖核酸酶、亲脂性的胞壁酸二肽衍生物(MDP-lys(L18))、磷酸铝或者硫酸铝、丙肝病毒核心蛋白和RIBI(它含有从细菌中提取的三种成分)、单磷酰基脂质a、海藻糖和2％鲨烯/80乳剂中的细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。

理想的佐剂包括霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、抗独特型抗原2F10、集落因子、志贺氏细菌性痢疾样毒素、内素、单磷酰基脂质a、OPTIVAX(U.S.Patent No.5622649)，外表面蛋白a(OspA)、氟化钠、聚氨基葡萄糖、以及其中的亚单位、其中的突变体。(Clements等人，Vaccine，6：269-277(1988年)；deHaan等人，Vaccine，14：260-266(1996)；De Magistris，“作为粘膜辅助物的热变性毒素的非毒性衍生物，”粘膜免疫：遗传学方法与佐剂。IBC生物医学图书馆，Southborough，MA，PP.1.8.1-1.8.12，1996年(根据1995年10月16-18日IBC会议上Rockville的发言)；Dickinson等人，Infect.Immun.，63：1617-1623(1995)；Di Tommaso等人，Infect.Immun.，64：974-979(1996)；Fontana等人，Infect.Immun.，63：2356-2360(1995)；Holmgren等人，Vaccine，11：1179-1184(1993)；Nedrud等人，Reg.Immunol，3：217-222(1991)；Pride等人，J.Exp.Med.，177：127-134(1993)；以及Thanavala等人的美国专利等。

佐剂可以与免疫原性化合物同时提供，也可以或者是在其前面，或者是在其之后。佐剂也可以整合到免疫原性化合物中而被提供，如转基因植物的共同表达产物；佐剂还可以单独地以一种方便的形式被提供，如液体形式，与产物一起获得。理想的是，佐剂最好是一种免疫学上可以接受的物质，可以促进一种免疫反应而没有严重的毒性作用。

发明中的化合物可以包含持续释放制剂、肠制剂、片剂、咀嚼片剂、胶囊、溶剂、肠外溶剂、鼻内喷雾剂或粉末、药片、栓剂、透皮贴片和悬浮剂。通常情况下，根据需要的剂量和使用的化合物的类型，化合物中至少含有0.01、0.1、1、3、5、10、20、30、40、50、60、70、或者80％的发明中的多肽或多聚核苷酸。激发免疫反应的方法

发明中的免疫原性多肽可以用于在许多动物中引起免疫反应，例如牛、猪、鼠、豚鼠、兔、禽类(如鸡、鸭、鹅)、黑猩猩、狒狒、短尾猿以及人类。理想的是，发明中的免疫原性多肽引起IgG和/或IgA抗体产生(见例21和23)，和/或细胞介导的免疫反应(见例24)。

首选的是，发明中的一种免疫原性多肽最好是粘膜免疫原，例如乙肝表面抗原HBsAg。为了达到发明中的目的，粘膜免疫原应具有特异性地激发粘膜免疫系统的功能。更好的实施例是，发明中的粘膜免疫原以一种剂量依赖性的形式，激发粘膜免疫系统和/或刺激体液免疫反应，而不会导致系统性耐受，也不需要过量的抗原。这里系统性耐受指的是，当某种抗原反复地给予哺乳动物后，导致随后特异性的抗体-抗原反应减弱的现象。

目前认为，发明中的免疫原的粘膜反应包括免疫原刺激粘膜免疫系统时产生的任何反应。典型的情况下，通过给被研究的哺乳动物口服免疫原，就可以激活消化道相关性的淋巴组织(GALT)。通过这种将免疫原引入粘膜表面的途径，就可以提供接近小肠M细胞的途径，M细胞覆盖着集合淋巴结和消化道相关性的淋巴组织(GALT)的其它淋巴丛。然而，这里膜的定义特异性地包括可能与发明中的免疫原接触的所有粘膜。(例如通过吸入途径可接触的气道粘膜，通过栓剂可接触的直肠粘膜，等等)。

可以通过发明中的免疫原性多肽激发抗体产生，并与其他物质一起，提供模型系统以优化抗体对抗原的反应，例如抗-HBsAg抗体对乙型肝炎病毒(HBV)的反应，还可以提供针对乙型肝炎病毒(HBV)、其它细菌、病毒或原生动物的预防性或治疗性处理。例如，在给予HBsAg多肽后，通过检测和/或定量抗-HBsAg抗体的滴度，可以确认HBsAg的抗原决定部位，该部位对增加抗-HBsAg抗体的滴度尤其有效。通过分析针对不同长度的HBsAg多肽产生的HBsAg抗体，可以确认HBsAg抗原决定部位针对乙型肝炎病毒(HBV)能够产生很强的抗体反应。还可以通过使用抗-HBV ELISA分析方法，检测激发抗-HBsAg抗体产生的特定的HBsAg多肽的抗原决定部位，接下来可以确定哪一条多肽含有最有效的、激发强烈免疫反应的抗原决定部位。然后就可以构建HBsAg多肽或者融合蛋白，其中含有抗原决定部位，或者含有编码这些抗原决定部位的多聚核苷酸，并可以将其用于激发强烈的HBsAg抗体反应。

可以通过给予动物或人免疫原性多肽，以在动物或者人体内引起免疫反应。最好的选择是是口服免疫原性多肽。可以采用在业界熟知的给予多肽的各种方法，包括口服、肌肉注射、皮内注射、腹膜腔内注射、或者是皮下注射，另外还包括用生物飞弹(“基因枪”)注射。也可以采用经鼻的途径给药内。理想的是，免疫原性多肽最好同时伴随有一个蛋白载体，这样以便于口服。还可以使用联合给予的方法，用来激发抗-HBsAg的免疫反应。例如，可以通过一种途径，如口服，给予一个剂量的免疫原性合成物，同时可以通过另外的途径再给予一个支持剂量，例如通过经皮、皮下、静脉内、肌肉内、鼻内或直肠内的途径。

含有免疫原性多肽的发明中的化合物，或者是它的一个联合体，其给予方式应与其中使用的特定成分相一致，其使用的剂量应有效地激发针对免疫原性多肽的免疫反应，例如，由ELASA方法测定的抗-HBsAg抗体的滴度。

发明中的抗原性化合物的剂量取决于许多因素，其中包括物种、年龄、使用该化合物的人或动物的一般情况、以及化合物的给予方式，但不仅仅局限于这些。单纯采用常规的实验方法，就可以很容易地确定发明中的化合物的有效剂量。这里所述的体外模型或体内模型，就可以用于确定合适的剂量。一般情况下，对于大型的哺乳动物，如狒狒、黑猩猩或者是人，至少需要给予0.001、0.001、0.1、1.0、1.5、2.0、5、10毫克/公斤的抗原。最好是给予10-100微克/公斤。如果需要的话，协同刺激分子或佐剂可以与抗原性化合物同时使用，也可以在使用化合物之前、或者之后使用。发明中的免疫原性多肽既可以用于治疗，也可以用于预防方面。通常地，我们希望植物或植物中被食用部分的数量足以提供足够的免疫原性多肽，例如HBsAg，在动物或人消耗的食物中，免疫原性多肽至少占到0.1，、1、2、5、10、50、100、500微克/克食物。进一步而言，植物的提取物可以进行制备和/或浓缩，以提高每克制备和/或浓缩的食物中多肽的含量，也可以服用这种经制备和/或浓缩的食物。

在人或动物体内，通过给予发明中的化合物激发的免疫反应，包括激发IgG和/或IgA抗体的产生，和/或细胞介导的免疫反应，都可以通过改变剂量、改变给药途径、以及强化配方来加强。发明中的化合物的给予可以采用单一剂量的时间表，或首选多剂量的时间表，这时疫苗接种的基本过程包括1-10种不同的剂量，在随后一定的时间间隔给予其它剂量，以保持和/或加强免疫反应，例如，在1-4月给予一个次要剂量，并且如果需要的话，几月后再给予一次或多次随后剂量。理想的情况是，其中至少有一次是通过口服的途径给药，这样既可以激发粘膜的免疫反应，而且还有费用较低、服用方便等优点。口服途径是指直接食用转基因植物或发明中的植物部分。最好对植物材料进行多次摄取，如三次、四次、五次、十次甚至更多，每次摄取之间至少应该间隔3天，最好是至少间隔7到14天。

在动物或人体中给予免疫原性多肽，可以引起抗体滴度的增加和/或激发细胞免疫反应，并且至少可以持续1周、2周、1月、2月、3月、4月、6月、1年甚至更长。可以选择在初次给药后的1月、2月、3月、4月、5月、6月、1年或更长时间后，给予一次或者多次的免疫原性多肽的加强注射，用以保持动物或人体内的免疫反应。还可以选择在首次注射引起免疫反应的化合物后，以植物或食物的形式服用发明中的多肽，用来加强免疫反应。理想的免疫接种方法包括使用当前抗原性复合体的一个或多个强化剂量，来增强受体的免疫反应。相应地考虑到，即可以将方便的转基因植物作为主要的免疫原，也可以将其作为同种免疫原或其它免疫原的一个“强化剂”。例如，食用含有CT佐剂的转基因西红柿片，在随后的7到16周腹腔内或皮下给予酵母菌来源的重组rHBSAg(商品)，最后的的结果见图4A-E。相似地，也可以用重组HBSAg进行首次免疫接种，而将转基因西红柿和CT佐剂作为强化剂给予，保持抗体滴度的增加。最初的是，对于首次经肠外途径给予目前常用疫苗的个体，使用口服增强疫苗的效果得到了证实。更好的是，一种口服疫苗可以单独地用于免疫接种计划，并且能够达到有效的保护作用。使用复合体的频率和剂量不应太大，否则会激发抗原的免疫耐受，这种情况可以通过常规的实验方法加以确以。

为了确定发明中的、由植物产生的免疫原性多肽在口服时的免疫原性，可以将表达发明中的免疫原性多肽的植物的提取物、或植物组织喂给动物，例如鼠或人。例如，可以将表达发明中的多肽的植物的提取物或植物组织喂给一组小鼠。而另一组小鼠则给予从表达相同抗原的大肠杆菌中提纯的重组多肽，这里的相同抗原来源于一个重组质粒。可以用ELISA方法测定血清和粘膜中的抗体反应。

现在已知，人体内HBsAg抗体的滴度达到10mIU/mL时就有保护作用。目前推荐的疫苗产生的抗体滴度至少可以达到100mIU/mL，以允许抗体滴度随着时间的推移而下降。理想的是，经过四次或更少次数的喂养后，由发明中的HBsAg免疫原性多肽引起的首次免疫反应，可以使血清中抗-HBsAg抗体的水平超过50mIU/mL。当发明中的化合物作为免疫增强剂时，理想的情况是经过四次或更少次数的喂养后，血清中抗-HBsAg抗体水平能够至少增加四倍，或者超过500mIU/mL。

在口服HBsAg免疫接种的研究中，霍乱毒素(CT，10微克/支)或者LT被用作了佐剂。例如，在表达乙肝表面抗原(HBsAg)的马铃薯块茎切片上放置霍乱毒素(CT)，然后与抗原一起被动物食用。CT在增强与HBsAg相关的免疫反应方面非常有效。前期数据表明，作为HBsAg的口服佐剂，CT较大肠杆菌热不稳定毒素LT_R192G的变异体更为有效，该变异体由土伦大学的John Clements发明。有意义的是，在喂养重组块茎后可以检测到分泌型的IgA抗体，而肠外给予HBsAg则不会产生这种抗体。

在阐明本发明中的例证中，是用5克表面覆盖了10微克CT的重组马铃薯，以每周三次的间隔喂养小鼠。该方案中抗体滴度的峰值达到70-110mIU/mL，通过从重组酵母菌(Merck)中提纯的、单一的亚免疫原的腹腔内剂量的HBsAg的增强作用，抗体滴度可达1700-3400mIU/mL。测量得到的真实滴度与马铃薯中HBsAg的表达水平相关。该剂量反应水平是剂量相关性的，表现在携带1.1μg/g HBsAg的马铃薯与携带8.3μg/g HBsAg的马铃薯相比，前者所致的免疫反应较低，持续时间较短。上述同样的喂养方案可以增强从重组酵母菌(MERCK)中提纯的、单一的皮下注射剂量的HBsAg刺激机体产生的免疫反应，使抗体滴度的峰值达到1000mIU/mL。沸煮后(5分钟，100℃)的块茎不产生可检测到的免疫反应，但在如果随后给予从重组酵母菌(MERCK)中提纯的、单一的腹腔内剂量的HBsAg，就可以见到显著的增强作用。

以下文字仅供说明目的，而不是要将先前所述及的本发明中的广泛应用加以范围限制。在本文中所引用的所有参考文献被列于此，以供参考。

                        例证例1.HB101和HB102载体的合成

pHB101：将来自pMT-SA(由中国科学院李和国(翻译名)友情提供)Pst I/HindIII切割片段的HBsAg编码区域，亚克隆入pBluescriptKS(分层基因)形成pKS-HBS。通过BstBI使pKS-HBS的HBsAg基因在含终止密码子的3’端打开116个碱基对，通过加入Klenow酶和dCTP/dGTP使其所产生的末端钝化，然后，用BamHI酶在Pst I位点上游16bp的位置将整个编码区域切断。将pBI121(Clontech实验室，Palo Alto，CA)用Sac I消化，末端用绿豆核酶钝化，然后用BamHI释放GUS编码区域使载体分离。将HBsAg编码片段与缺乏GUS的pBI121连接而产生pHB101，由pBI121衍生而来的菜花花叶病毒(CaMV)启动子可以驱动其表达。

pHB102(图1A)：菜花花叶病毒35S启动子的重复启动子与烟草蚀刻病毒(TEV)5’端非翻译引导序列相连，其作为翻译启动子(Carrington等，J Virol.，64：1590-1597，(1990))，通过以下方式从pRTL2-GUS(Carrington等，Plant Cell 3：953-962，(1991))切割得到：用NcoI酶将pRTL2-GUS进行消化，末端用绿豆核酶钝化，通过HindIII的消化将启动子-引导片段释放出来。用HindIII和SmaI消化pHB101以释放35S启动子片段，载体得到纯化。随后，启动子-引导片段与经HindIII/Sma I消化过的pHB101连接，产生pHB102。在二种构建中，HBsAg编码区域均位于nopaline合成酶终止子的上游。通过土壤杆菌tumefaciens介导的转化作用整合入植物基因组DNA的DNA界限是由质粒所含有的左侧和右侧区域指示的，质粒还含有新霉素磷酸转移酶基因，可以通过卡那霉素进行选择。例2.HBsAg cDNA本地的5’与 3’端非翻译区域的HB102发生的缺失

pHB103(图1A)：Mason H.，等(1992)以及前文均描述了质粒HB102的构建。经过观察发现，病毒非翻译序列的选择性缺失可以改善植物中重组蛋白的聚集。因此，除了非编码病毒序列的缺失外，HB103和HB102的构建是一致的，非编码病毒序列的缺失可以降低转录率或翻译效率。来自质粒pKS-HBS(Mason等1992)的HBsAg编码区域通过加入寡HBNco(5’CATGCCATGGAGAACACAACATCAGG3′)(序列号7)与HBSac(5’GCC GGA GCT CAA ATG TAT ACC CAA AGA CA3′)(序列号8)经PCR方法得到放大。这使编码区域在启始密码子中引入NcoI位点，终止密码子中引入SacI位点。利用NcoI和SacI位点将PCR片段克隆入中间载体指定的pIBT201.1(Haq等Science 268：714-716(1995))，形成质粒pIBT201.1HBsC#10。

来自pIBT201.1HBsC#10的XhoI到SacI片段被亚克隆入pBluescript SK+以产生中间性pBSSKHBsC#6。未修饰的XhoI到SacI片段被亚克隆入pIBT211.1以建立中间性pIBT211.1HBsC#9。pBI101(Clontech，Jefferson等EMBO J.13：3901-3907，(1987))与SacI、EcoRI消化得到的Nos终止子片段连接到pIBT210.1的相同位点，并除去VSP终止子，可以获得载体pIBT211.1。来自pIBT211.1HBsC#9的HindIII/EcoRI片段被亚克隆入植物转移载体pBI101以产生pHB103，该质粒的HindIII与EcoRI位点之间含有35S启动子和重复性启动子、TEV先导序列、HBsAg编码区域和Nos终止序列，图1A和图2A分别表示了HB103的表达盒子和限制性内切酶位点图。例3.对HB103的修饰

下列构造都是对HB103的修饰，其中，一35S启动子被人为地与天然病毒来源(野生型)的HBsAg cDNA连接，图1A显示了相关的盒子。

35S-TEV-HBsAg-SEKDEL-NOS构建：

pHB105(图1A)包含了HBsAg编码序列C末端Ile密码子的一个缺失，以及编码C末端延伸SEKDEL的一个插入(序列号4)。中间性克隆的构建是通过三个片段的连接，包括pIBT201.1HBsC#10的XhoI到AccI片段，寡核苷(aSEKDELs-F：5′ATACTCTGAGAAAGATGAGCTATGAGAGCT3′(序列号9)和aSEKDELs-R：5′CTCATA GCTCATCTTTCTCAGAGT3′(序列号10))与pBluescript SK+的XhoI到SacI片段退火后得到的AccI到SacI片段。其产生的质粒pBSSKHBsCK#3被亚克隆形成pHB105，如同前面在pHB103中所描述的将XhoI/SacI片段亚克隆入pIBT211.1，再将HindIII/EcoRI片段亚克隆入pBI101。35S-TEV-VSPαS-HB sAg-NOS的构建：

pHB106(图1A)包含一个编码大豆VSP“αS”信号肽(Mason等1988)的插入，造成HBsAg编码序列N末端延长21个氨基酸，其编码序列为：CCATGGCAATGAAGGTCCTTGTTTTCTTCGTTGCTACAATTTTGGTAGCATGGCAATGCCATACC(序列号11)。pBSSKHBsC#6用NcoI消化，与来自pVSP-αSig-GUS的67bp的NcoI片段连接(DeWald，Ph.D.论文，德克萨斯州A&M大学生物化学与生物物理教研室1992)。产生的质粒pSKHBsC-αS#90被亚克隆形成pHB106，如同前面在pHB103中所描述的将XhoI/SacI片段亚克隆入pIBT211.1，再将HindIII/EcoRI片段亚克隆入pBI101。35S-TEV-VSPαL-HBsAg-NOS的构建：

pHB107(图1A)包含一个编码大豆VSP“αL”信号肽(Mason等1988)的插入，造成HBsAg编码序列N末端延长34个氨基酸，其编码序列为：CCATGGCAATGAAGGTCCTTGTTTTCTTCGTTGCTACAATTTTGGTAGCATGGCAATGCCATGCGTACGATATGTTCCCTCTCCGAATGAACACTGGCTATGGTGCC(序列号12)。pBSSKHBsC#6用NcoI消化，与来自pVSP-α前导-GUS(DeWald 1992)的106bp的NcoI片段连接。产生的质粒pSKHBsCαl#L1被亚克隆形成pHB107，如同前面在pHB103中所描述的将XhoI/SacI片段亚克隆入pIBT211.1，再将HindIII/EcoRI片段亚克隆入pBI101。

35S-TEV-VSPαS-HBsAg-SEKDEL-NOS的构建：

pHB108包含一个编码大豆VSP“αS”信号肽(Mason等1988)的对pHB105的插入，造成HBsAg编码序列N末端延长21个氨基酸，其编码序列为：CCATGGCAATGAAGGTCCTTGTTTTCTTCGTTGCTACAATTTTGGTAGCATGGCAATGCCATACC(序列号13)。pBSSKHBsCK#3用NcoI消化，与来自pVSP-α-Sig-GUS(De Wald 1992)的67bp的NcoI片段连接。产生的质粒pSKHBsCKS#23被亚克隆形成pHB108，如同前面在pHB103中所描述的将XhoI/SacI片段业克隆入pIBT211.1，再将HindIII/EcoRI片段亚克隆入pBI101。35S-TEV-VSPαL-HBsAg-SEKDEL-NOS的构建：

pHB109包含一个编码大豆VSP“αL”信号肽(Mason等1988)的对pHB105的插入，造成HBsAg编码序列N末端延长34个氨基酸，其编码序列为：CCATGGCAATGAAGGTCCTTGTTTTCTTCGTTGCTACAATTTTGGTAGCATGGCAATGCCATGCGTACGATATGTTCCCTCTCCGAATGAACACTGGCTATGGTGCC(序列号14)。pBSSKHBsCK#3用NcoI消化，与来自pVSP-α-Leader-GUS(De Wald 1992)的106bp的NcoI片段连接。产生的质粒pSKHBsKalphaL#29被亚克隆形成pHB109，如同前面在pHB103中所描述的将XhoI/SacI片段亚克隆入pIBT211.1，再将HindIII/EcoRI片段亚克隆入pBI101。35S-TEV-TPSS-HBsAg-NOS的构建：

pHB110(图1A)包含一对pHB103的插入，该插入编码来自豌豆rbcS N末端d中间肽和部分成熟肽(Nawrath等，“在高等植物中的多羟丁酸产物的酶的质粒靶位”“生物降解的塑料和多聚物”Doi Y，Fukuda K，Elsevier，Amsterdam，pp.136-149(1994))，造成HBsAg编码序列N末端延长82个氨基酸，其编码序列为：CCATGGCTTCTATGATATCTTCTTCCGCTGTGACAACAGTCAGCCGTGCCTCTAGGGGGCAATCCGCCGCAATGGCTCCATTCGGCGGCCTCAAATCCATGACTGGATTCCCAGTGAAGAAGGTCAACACTTGACATTACTTCCATTACAAGCAATGGTGGAAGAGTAAAGTGCATGCAGGTGTGGCCTCCAATTGGAAAGAAGAAGTTTGAGACTCTTTCCTATTTGCCACCATTGACCAGAGATTCCATGG(序列号15)。

PUC-TPSS(Nawrath等1994)加入引物5′TPSS(5′GGATCCATGGCTTCTATGATATCTT-3′序列号16)与3′TPSS(5′GGATCC ATGGAATCTCTGGTCAATGGTGG-3′序列号17)，行PCR扩增，用于在rbscS序列的两端加入NcoI位点。pBSSKHBsC#6用NcoI消化后，与含TPSS编码区域的经NcoI消化的PCR产物连接，产生的质粒pHB211.1TPSS#23被亚克隆形成pHB110，如同前面在pHB103中所描述的那样将XhoI/SacI片段亚克隆入pIBT211.1，再将HindIII/EcoRI片段亚克隆入pGPTV-Kan(Becker等1992)。例4.不同的终止序列影响蛋白的聚集

例3中讨论的构建包含烟草蚀刻病毒(TEV)非翻译引导序列和nos 3′末端。载体pHB104(图1A)和pHB114(图1A)分别含有vsp和pin23′终止端而不是nos 3′末端。这些载体的每个mRNA聚集的蛋白质水平比HB103高。通过将pIBT210.1HBsC#10的SacI到EcoRI片段亚克隆入pHB103，使Nos终止子被VSP终止子替代，从而获得pHB104。图1显示了其表达盒子。

pHB114包含400bp的土豆pin2终止子(An等，1989)。用BamHI和EcoRI消化pDP687(Pioneer Hi-Bred International，Johnsoncity，IA)，400bp的pin2终止子被亚克隆入pBluescriptKS，形成的pBlueKS-pin2用SacI和EcoRI消化获得pin2终止子片段，将其与pHB103连接SacI和EcoRI消化，形成pHB114。例5用烟草镶嵌病毒Ω(TMV)引导区构建

pHB111(图1A)包含有烟草镶嵌病毒Ω非编码区(Gallie等1992)而不是烟草侵蚀病毒的非编码区。来自质粒pBSG660(BiosourceTechnologies，Inc，Vacaville，CA)的，一个包含35S启动子3′末端和Ω非编码区的EcoRV/XhoI片段，被亚克隆入pIBT211.1HBsC#9的EcoI/XolI位点，产生中间性质粒pHB211Ω-5′。为了删除烟草侵蚀病毒(TEV)引导序列，将pHB211Ω-5′用XhoI和NcoI消化，然后用绿豆核酶钝化残端，形成的质粒pHB211用HindIII到EcoI片段消化，其表达盒子被克隆入pGPTVKAN(Becker等，1992)以产生pHB111。例6.替代的启动子序列

来自菜花花叶病毒的35S启动子，是一种几乎在所有植物组织中均表达的强的基本启动子。其他试验的启动子有patatin启动子，一种土豆中主要的储存蛋白，以及颗粒限制性淀粉合酶(GBSS)启动子。两种启动子在块茎中引起强烈的表达。这些结构被确定为HB145和HB165(图1A)，显示在图1中。由于叶组织不能用这些结构分析，所以必须引入微小块茎来检测表达水平。A.Patatin-TEV-HBsAg-SEKDEL-NOS构建

pHB145在pHB105的CaMV35S启动子的位置含有土豆块茎特异的patatin基因启动子。将来自pPS20-GUS(Wenzler等Plant Mol Biol12：41-50，1989)的HindIII/BamHI patatin片段亚克隆入pIBT210.1的HindIII/XhoI位点，得到pIBT210.1。来自pBSSKHBsCK#3的NcoI/SacI片段与用NcoI和SacI消化的pIBT240.1连接，形成的质粒其HindIII到EcoRI片段亚克隆入pBI101得到pHB145。B.GBSS-TEV-HBsAg-SEKDEL-NOS构建

pHB165在pHB105的CaMV 35S启动子的位置含有土豆块茎特异的颗粒限制性淀粉合酶(GBSS)基因启动子(Visser等，Plant Mol.Biol.，17：691-699(1991))。pPGB1(Visser等1991)用SalI和SacI消化并与pBSSKHBsCK#3的XhoI到SacI片段得到pHB165。C.Pin2-TEVΩ-HBsAg-pin2构建

pHB131包含天然的HBsAg编码序列，与烟草镶嵌病毒(TMV)Ω5′非编码区域融合的土豆pin2启动子可以驱动该序列，由土豆pin23′元素使其终止。Pin2启动子可由创伤诱导，可能使块茎中的HBsAg有控制地表达。其构建包括一个中间步骤以便在SacI-EcoR1片段上获得pin2-3′元素，pRT38的SacI-PstI片段被亚克隆入pBluescriptKS形成pKS-RT38。Pin2启动子(Palm等proc.Natl.Acad Sci USA 87：603-607，1990)来自pRT24(Robert Thornburg，爱荷华州立大学生物化学和生物物理系，Ames，IA 50011)，pRT24(1kb)的HindIII-BamHI片段和pkS-ΩHB/BamHI-SacI(750bp)片段，与用HindIII/SacI消化的pUC-V(含有大豆vspB终止子)相连得到pHB231，然后得到来自pSK-RT38的含有pin2-3′终止子的SacI-EcoRI片段(Robert Thornburg，爱荷华州立大学生物化学和生物物理系，Ames，IA 50011)，并与含有pin2-TMVΩ启动子引导元素的pHB231/HindIII-NcoI、含有HBsAg编码序列的pHB103/NcoI-SacI片段以及pGPTV-Kan/HindIII-EcoRI相连接，得到pHB131，D.Patatin-TMVΩ-HBsAg-vspB构建

pHB140.3含有天然的HBsAg编码序列，与烟草镶嵌病毒(TMV)Ω5′非编码区域融合的土豆块茎特异的patatin基因启动子可以驱动该序列，由大豆vspB3′元素使其终止。用诱突变引物“Omega-Bam”(5′-GATCGGATCCTTACAACAATTACCAAC-3′序列号18)。使用pHB211作为烟草镶嵌病毒(TMV)Ω5′非编码区域的源，使用诱突变引物“Omega-Barn”和下流引物，“NOS”(5′-CGGCAACAGGATTCAATC-3′序列号19)，约800bp的PCR片段被克隆入带T尾的pBluescriptKS形成pKS-ΩHB。pPS20/HindIII-BamH1片段(2.35kb patatin启动子)与pKS-ΩHB/BamHI-SacI(750bp)、pUC19/HindIII-SacI(2.7kb)连接，形成pPS-ΩHB。最后，含大豆vspB终止子的pUC-V/SacI-EcoR1片段被接入pPS-ΩHB形成pHB240.3，它包含与烟草镶嵌病毒(TMV)Ω5′非编码区域融合的patatin启动子，由大豆vspB3′元素使其终止。用HindIII和EcoRI消化pHB240.3可以得到表达盒子，接入pGPTV-Kan得到pHB140.3。例7.HBsAg的植物优选化密码子

在植物和动物中，密码子的使用是有差别的，DNA序列中的许多信号并不保守(Ausubel，F.等，eds，1994，Current Protocols in MolecularBiology，vol 3，pp.A.1C.3)。例如，一种合成酶基因的表达在植物中要比在天然细菌性序列中要增加10-20倍。

对天然HBsAg基因的分析显示，9.7％的密码子在单子叶中是不利的，8.8％的密码子在双子叶中是不利的(例如土豆)，尤其是在29CnG三聚体和16CG二聚体基因的开始部分附近有一个RNAPolII终止序列，这些信号将影响转录的延伸和稳定性，从而降低HBsAg蛋白。因此，可以在保留相同或相似的天然氨基酸的同时改变不适宜的密码子、不需要的信号序列、切割位点和甲基化位点。对于HBsAg，可以改变681个碱基中的160个碱基，而保留蛋白的天然氨基酸顺序，参见序列3(图22)和序列5(图5)。其AT成分占52.42％，不利的信号被改变了。载体被提供了上述的VSP3′终止信号，其中一个载体被提供了一个αL信号肽。这些载体是经过设计的HB115-HB117.(图1A和21)A.35S-TEV-sHBsAg-VSP构建

pHB115(图1A和21)包含一个编码HBsAg蛋白的植物优化合成序列。为了使用密码子，并发现有潜在问题的序列，对天然的HBsAg序列进行浏览，包括假的mRNA加工信号，如多聚核苷酸序列、剪切位点、转录终止信号、“ATTTA”等不稳定mRNA序列(Ohme-Takagi等，Proc.Nacl.Acad.Sci.USA 90：11811-11815 1993)、“DST”序列(Newman等，Plant Cell 5：701-714，1993)以及胞嘧啶甲基化图形“CCGG”。

利用植物优选的密码子和缺乏潜在问题的序列设计植物优化基因，然后采用Stemmer等1992描述的方法从重叠寡核苷中聚集该基因，最终产物用NcoI和SacI消化，克隆入pGem5Zf+。克隆#7和#3各有一个错误，所以将#7的5′与#3的3′结合，从#7中分离出HincII/SacI片段，从#3中分离出NcoI/BbsI片段，将这些片段用BfaI切割，与用NcoI和SacI切割的pGEM5Zf+载体连接，形成的克隆#8进行测序，命名为psHB312，并在NcoI和SacI位点被亚克隆入pIBT210.1(微小#1 8)，然后在HindIII和EcoRI位点再亚克隆入pGPTV-Kan形成pHB115。后来发现这个克隆的HB编码区域含有一个核苷错误(nt595位置不是“T”而是“G”，这导致单个氨基酸的替代，即色氨酸替代了甘氨酸)，这促使了改正的pHB117的产生(见下)。

pHB117(图6和图21)对HBsAg基因的核苷错误进行修正，这与pHB115是一样的。通过定点突变，psHB312中的错误核苷(595位的“G”)被修正为“T”(Axia Genetics plc，英国剑桥)，被命名为pHBV10。NcoI到SacI片段被亚克隆入pIBT210.1，形成pIBT210.1HBV，然后HindIII/EcoRI片段被亚克隆入pGPTV-Kan产生pHB117。B.35S-TEV-VSPαL-sHBsAg-VSP构建

pHB116(图1A和21)含有大豆VSP“αL”序列，该序列被插入pHB115的HBsAg合成基因的5′端。来自pSKHBsC-αL#29的NcoI片段与NcoI和SacI消化的psHB312以及载体pIBT210.1的NcoI到SacI片段连接(微小#4αL)，然后在HindIII和EcoRI位点亚克隆入pGPTV-Kan(Becker，D等1992)。C.35S-TEV-αS-sHBsAg-VSP构建

pHB118(图7和21)含有大豆“αS”序列，该序列被插入pHB117的HBsAg合成基因的5′端。含有来自pIBT210.1HBsCKaS(pHB308)的“αS”序列的NcoI片段与psHB317连接形成psHB318，然后HindIII到EcoRI片段与pGPTV-Kan连接形成pHB118。D.35S-TEV-αL-sHBsAg-VSP构建

pHB119(图8和21)含有大豆“αL”序列，该序列被插入pHB117的HBsAg合成基因的5′端。含有来自pIBT210.1HBsCKaL(pHB309)的“αL”序列的NcoI片段与psHB317连接形成psHB319，然后HindIII到EcoRI片段与pGPTV-Kan连接形成pHB119。E.E8-sHBsAg-pin2构建

pHB120(图9和21)含有E8启动子，该启动子通过pin23′末端与sHBsAg连接。含有psHBV10的sHBsAg基因的NcoI到SacI片段与经EcoRI和SacI消化的pBluescript II SK+和EcoRI到NcoI E8启动子，形成psHB520。来自psHB520的HindIII到SacI片段与含有pin2终止子的经HindIII和SacI消化的HB131连接，形成pHB120。F.35S-TEV-sHBsAg-SEKDEL-pin2

pHB121(图10和21)含有内质保留信号，该信号插入在sHBsAg基因的3′端。将寡核苷5′ATCTCTGAGAAGGATGAGCTTTAA3′(序列号20)和3′GACTCTTCCTACTCGAAATTTAGA 5′(序列号21)与BbsI消化的psHBV10杂交，并连接产生psHB521。来自psHB521的NcoI到SacI片段与来自HB131的HindIII到SacI片段(包括含pin2终止子的pGPTV-Kan载体)以及来自含35S启动子的pIBT210.1的HindIII到NcoI片段连接，形成pHB121。G.35S-TEV-αS-sHBsAg-SEKDEL-pin2

pHB122(图11和21)将sHBsAg上的αS信号与KDEL(序列号22)信号结合，来自pHB121的BstXI片段含有带SEKDEL(序列号4)和pin2终止子的sHBsAg3′末端，将它接入pHB118代替sHBsAg基因的3′端和vsp终止子，形成pHB122。H.35S-TEV-αL-sHBsAg-SEKDEL-pin2

pHB123(图12和21)将sHBsAg上的αL信号与KDEL(序列号22)信号结合，来自pHB121的BstXI片段含有带SEKDEL(序列号4)和pin2终止子的sHBsAg3′末端，将它接入pHB119代替sHBsAg基因的3′端和vsp终止子，形成pHB123。例8.土豆植株的转化

通过无污染的叶盘的共同培养使土豆获得稳定的转化(SolanumtuBerosum″Frito-Lay 1607″)。Haq，T.等(1995)；Wenzler，H等(1989)。其总结步骤如下：切割外植体，将离轴的一面朝上放在LCI盘上三到四天，将外植体放置于土壤稀释液中十分钟(用手晃动)，然后在消毒纸巾上进行印迹转移，将外植体离轴的一面反向朝上放在LCI盘上三到四天，经共同培养后，将外植体放在含有卡那霉素和羧卞青霉素的LClCK盘上五到七天，直到产生硬结，将已产生良好硬结的外植体放在LC2CK盒内二周，二周后将外植体放在新鲜的LC2CK介质上使根形成，在em介质中加入羧卞青霉素以防止细菌过度生长。

生长土壤杆菌-LB干系：在有卡那霉素存在的情况下对一克隆进行一夜的培养；YM干系：在卡那霉素存在的情况下对一个克隆进行36到48小时的培养。

由于位点的插入随机性，在独立的转化事件中存在一些表达的变异是意料之中的事，因此，可以通过编码区域特异的探针进行Northern杂交来筛查独立的转基因系。当使用35S启动子的时候，筛查的是来自叶片的所有的RNA；当使用patatin启动子的时候，得到在无污染培养物中产生的微小块茎的RNA。筛查patatin启动子的构造是从微小块茎开始的，微小块茎是从新生的转化芽中切下的茎干节点在含高浓度蔗糖的培养基中进行亚培养形成的。把最有希望的转化系通过节点的无污染培养进行繁殖，生根的小植株被转种到土壤中，在温室中成长。

为了得到块茎，植株生长经过二个阶段：其一，在头一个半月到二个月内，或在足够的植物生长发生之前，采用长光照(16小时)，如果在冬季则用灯光补充照射，其二，在此后的一个半月到二个月，采用短光照(12小时)。经过这样三到四个月的培育方案，每个三加仑的罐中可以得到六百到八百克的块茎。第一次收获得到的块茎在经过一个月的休眠期后可以用来启动新的植株。例9.植物细胞HBsAg的聚集增加

通过改善植物表达载体，增加外来蛋白的转录和翻译，可以增加植物细胞中HBsAg的表达水平。转录、mRNA合成和聚集、转化、转化后合成与聚集可以受表达载体成分的影响。早期的研究证实，存在一个临界的细胞阈值浓度，在该浓度下，由HBsAg亚单位组成的VLPs的聚集加速，VLPs比未聚集的亚单位更稳定；当HBsAg mRNA(通过Northern杂交信号密度测定)与rHBsAg蛋白(通过ELISA测定)进行印迹杂交时，它与结构HB103和HB107成线形关系。这一结果的可能解释是：如果HBsAg能有效的指向ER，那么它对植物胞浆蛋白酶就会更稳定或更有抵抗力。例10

转化的土豆植株在暖房的罐里栽培，表达HBsAg的转基因植株尽管产生块茎，但表现出生长习惯的改变，并将限制植物中表达抗原的绝对水平。表2显示了图1中转化不同结构的土豆叶组织和块茎组织HBsAg蛋白分析的结果，每一个结构的HBsAg水平用相对于表达最高的转化个体的总可溶性蛋白的百分比表示。转化pHB114的系中HBsAg的表达水平有相当大的变异，每个块茎从0.2到16ug不等。HBsAg蛋白形成微粒，并可能被糖基化，抗原上出现三个潜在的N糖基化序列，同时有许多O连接糖基化的可能位点。认为在哺乳动物系统仅有一个N连接的位点被糖基化，而且只能达到40-50％。早期对转基因烟草的研究数据表明，植物可以将HBsAg装配入病毒样微粒(VLPs)，后者与来自重组酵母和感染个体的树液的VLPs体积相似(虽然其体积大小有差异性)。尽管认为皮下层的蛋白水平最高，但块茎中抗原的具体位置并不清楚。在提取缓冲液中加入β巯基乙醇可以增加纯化或提取HBsAg的量。

                  表2

                           最佳个体中HBsAg的表达

结构    mRNA/蛋白的斜率  叶组织(％)     块茎组织(ug/g)

HB102   0.001            0.016          0.18

HB103   0.001            0.023          0.33

HB105   0.004            0.048          1.25

HB106   0.004            0.035          0.8

HB107   0.005            0.11           2.4

HB110   ND               0              ND

HB104   0.004            0.19           6.5

HB114   0.005            0.22           16

HB145   ND               0.063          1.1

HB165    ND    0.021       --

HB111    ND    0.041       0.33

HB115    ND    0.13        2

HB116    ND    0.176       2例11.转基因土豆系HB114-16的块茎特点

这个例子描述的试验表现了土豆“FL1607”系HB114-16块茎产生的重组HBsAg的特性，HB114-16是从pHB114转化来的。这些数据表明，这些块茎产生的HBsAg的结构是一种有希望的免疫疫苗蛋白，可以比得上用于商业疫苗的酵母重组HBsAg。特别是，组装的HBsAg病毒样微粒(VLP)的形式比未经组装的亚单位更加稳定，免疫原性更强，被认为是疫苗抗原至关重要的特性。

通过蔗糖梯度沉降了解病毒样颗粒的成分。为了了解HBsAg的沉降是否与烟草表达中描述的病毒样颗粒一样，我们通过蔗糖梯度沉降，检测了HB114-16块茎和非转基因块茎对照的提取物(Mason等1992)。将块茎在液氮搅拌器中磨成粉末，得到块茎的粗提物，然后加入两倍重量的1X PBS(pH7.2)，0.1％Triton X-100，10mM EDTA，将混有冷冻粉末的缓冲液冷冻，然后在冰上缓慢解冻，再次悬浮的提取物在4℃14000xg转速下离心5分钟，0.5毫升的表层悬浮物分层在线形蔗糖梯度的5-30％之上(10mM磷酸盐，pH7.0，0.15M NaCl)，为了比较，同时对含2μg纯化酵母衍生的重组HBsAg(rHBsAg)微粒(1XPBS(pH7.2)，0.1％Triton X-100，10Mm EDTA，含或不含FL1607土豆提取物)进行了试验，在Beckman SW41离心仪中4℃33000rpm转速下梯度离心5小时，在梯度片段进行HBsAg的ELISA(Auszyme单克隆，Abbott试验室)，ELISA的吸光度对％蔗糖作图。图13显示，所有的HBsAg样本的高峰都分布在约8％到22％蔗糖的范围内。块茎物质整体向高密度区轻微移动，但在所有的样本中HBsAg沉积物最多是位于10％到15％之间。加入非转基因FL1607块茎的酵母rHBsAg显示出和纯化酵母rHBsAg相似的面貌，但ELISA信号要弱一些。非转基因FL1607块茎在梯度中没有显示ELISA信号。这些数据表明，块茎来源的HBsAg与酵母来源的HBsAg共同沉降，提示块茎来源的HBsAg象病毒样颗粒那样聚集。

Western印迹杂交：为了观察与抗体发生反应的HB114-16块茎中的HBsAg多肽，我们进行了Western印迹杂交实验。样品在减弱的SDS-PAGE样品缓冲液(100mM DTT，2％SDS)中煮沸5分钟进行降解，经过电泳，在PVDF膜上印迹并用抗HBsAg兔多克隆抗血清标记探针，图14显示了Western杂交实验以及同时行库马西染色的双重凝胶电泳。染色的凝胶表明，无论是HB114-16(laneHB)还是非转基因FL1607(lan-)样品，上面装载的块茎总蛋白的数量相似。在Western印迹杂交中，10ng酵母来源的rHBsAg(lan+)产生预料中的一个约25kDa的单体以及在Mr产生一个约40kDa的二聚体(在带的左侧用Y标记)。块茎来源的物质(laneHB)包含一个约28kDa的单体以及一个可能代表二聚体的宽带(在带的左侧用P标记)。块茎来源的单体可能是糖基化的，因此体积比酵母来源的单体大。非转基因块茎(lane-)中有一些微弱的非特异条带，但与单体和二聚体的区域并无重叠反应。有趣的是，二聚体与单体的相对比例在块茎物质中要远远高于酵母rHBsAg。尽管这个分析是在减弱的条件下进行的，块茎物质中二聚体的高比例表明，它于硫酸氢盐的交叉连接更高更稳定，因此潜在地对降解更耐受，尤其是口服时。

对从土豆系HB114-16块茎制备的总RNA进行Northern印迹杂交实验，如Mason所述(Mason等1996)。作为阴性对照，非转基因土豆系FL1607块茎的RNA同时检测。每个样品取5ug在MOPS/醋酸/EDTA缓冲液中用甲醛在65℃下变性十五分钟，在1％的琼脂糖凝胶上电泳，通过毛细印迹转移到Zeta探针膜上(BioRad)，将膜在Stratalinker(Stratagene)上用紫外线固定，然后用亚甲基蓝染色以证实RNA的完整性和负荷密度。通过随机性接触抗原标记用NcoI和SacI消化pHB114得到的700bpDNA片段(包括HBsAg编码序列)，完成探针的准备，在65℃，0.25M磷酸盐，pH7.2，7％SDS，1mM EDTA条件下将印迹与探针杂交16小时，膜用清洗缓冲液1(40mM磷酸盐，ph7.2，1mM EDTA，5％SDS)清洗两遍，每次在65℃下各三十分钟，然后将膜用塑料包埋，用磷酸盐图象仪(Molecular Dynamics)对其进行量化。

图15显示了得到的结果。含有相同数量的每种RNA样品走双重条带；印迹杂交后一组条带是经亚甲基蓝染色的。右侧的照片显示一半胶的亚甲基蓝染色印迹，它表示来自叶组织样品的总RNA要高于来自块茎样品的总的RNA。通过核糖体RNA条带的完整性判断RNA的质量的好的。左侧的照片显示获得的杂交类型，HB114-16RNA在约1kb处有一条主要条带，在块茎和叶组织中都如此，代表了HBsAg的全程转录，1kb条带下面的斑点代表降解的RNA，叶组织RNA样品中大约在3kb位置的微弱条带可能代表了有一个异常插入造成的HBsAg单位的转录通读，非转基因FL1607块茎和叶组织RNA均没有显示杂交信号。

对从HB114-16叶组织分离的基因组DNA进行PCR分析。图16显示了通过引物TEV(5’-GCA TTCTACTTCTATTGCAGC序列号23)和PIN2获得的一条主要的单带，两种引物分别是HBsAg基因的5′和3′侧区。这条条带的面积与从质粒pHB114扩增的条带相同，在对照组FL1607基因组DNA中则看不到这条条带。从胶上切下PCR片段，测序，以证实从pHB114序列没有突变，序列是完全一致的。这表明转移HB114-16系的HBsAg基因没有发生突变或改变。

用与PCR分析中同样的基因组DNA样品进行Southern印迹杂交。每种DNA样品取15μg，10ng pHB114载体在0.8％琼脂糖凝胶分馏前用各种限制性内切酶消化或不消化，用盐酸处理进行去纯化，中和，通过毛细印迹法转移到Zeta探针膜上(BioRad)，将膜在Stratalinker(Stratagene)上用紫外线固定。通过随机性接触抗原标记HindIII和SacI消化pHB203得到的2kbDNA片段(包括S35启动子、TEV 5-URT和HBsAg编码序列)，完成探针的准备，在65℃0.25M磷酸盐，ph7.2，7％SDS，1mM EDTA的条件下将印迹与探针杂交16小时，膜用清洗缓冲液1(40mM磷酸盐，ph7.2，1mM EDTA，5％SDS)清洗两遍，每次在65℃下各三十分钟，然后将膜用塑料包埋，用磷酸盐图象仪(Molecular Dynamics)对其进行量化。图17显示了杂交后形成的类型、凝胶在转移到Zata探针前的溴化二氨乙苯啡啶染色、T-DNA盒子的图谱和作为探针的DNA部分。NcoI和HindIII消化形成二个片段，一是在T-DNA内侧，和探针(INT)杂交，另一个片段在T-DNA的插入位点延伸。在用NcoI或HincII消化的HB114-16系，除了内带外至少可以数出四条带(见条带Nco右侧的数字和条带HincII左侧的数字)。对这些数据最可能的解释是；至少有四个T-DNA拷贝含有HBsAg表达盒，该表达盒整合在HB114-16细胞核基因组DNA的不同位点(见条带上的数字)。含有FL1067DNA的条带和探针不杂交。EcoRI消化表现出意外的结果，可能是由于存在部分消化或星活性，从而被忽略。保存九个月的块茎的HBsAg的稳定性。一些HB114-16块茎系是在1998年5月收获的，每一个株系用纸包分别包裹并储藏在4℃的环境中。自11个株系各取出一个块茎，在二周的收获时间内用ELISA法分析HBsAg(Auszyme单克隆，Abbott试验室)。九个月后，分析同样11个株系的二个块茎。图18的柱形图显示：黑色柱表示的是1998年5月测定的HBsAg的量，白色柱显示的是1999年2月的量，块茎在经过九个月的老化之后，相同新鲜重量的块茎明显产生更多的HBsAg。其可能的原因是，块茎的部分脱水使它在储存后重量较刚刚收获时低；另一种解释是，刚收获时一些HBsAg是不适当折叠的单体亚单位，在储存过程种，这些单体正确折叠，并聚集形成病毒样微粒，从而使更多的HBsAg被检测出来；最后，在储存过程中可能发生单体的进一步合成，它们进一步聚集形成ELISA能检测的形式。(已知，土豆块茎细胞在4℃是有生理性活动，淀粉和糖的变化以及最终发芽证实了这一点)。这些数据表明，转基因块茎产生的HBsAg在4℃储存条件下至少九个月内是稳定的。例12.烟草细胞中经修饰的HBsAg的表达和脱硫交叉连接的分析

这个例子描述了转基因烟草NT1细胞对合成型植物优化HBsAg基因的稳定表达，该基因在亚细胞靶位通过不同方法被修饰。这些研究显示：某些修饰使单体通过双硫桥交叉连接的程度显著增强，由于HBsAg交叉连接增多，其潜在的免疫原性更稳定，交叉连接的增强可以形成更好的疫苗抗原。另外，由于酵母来源的重组HBsAg(rHBsAg)只有在提取出来并用化学制剂促进双硫桥形成后才有高度的交叉连接(Wampler D.，Lehman E.，Boger，J.，McAleer，W.&Scolnick，Multiplechemical forms of the hepatitis B surface antigen produced in yeast.ProcNat Acad of Sci，USA 1985；82，6830-6834)，当口服时，不经过纯化和/或化学处理的植物来源的HBsAg代表了一种潜在免疫原性更强的物质。

我们用质粒pHB117，pHB118，pHB119，pHB121，pHB122和pHB123通过土壤杆菌介导的DNA传输创造了转基因烟草NT1细胞系。这些结构在例7中有详细的介绍，但我们还是在表3中简单描述了其修饰情况，它们都包含有例7中所描述的合成性植物优化HBsAg基因，这儿的修饰是通过N末端或/和C末端的延伸。我们的基本原则提示：N末端的植物信号肽将使ER更有效地指向新生的HBsAg肽，允许更有效的单体折叠和交叉连接的病毒样微粒的聚集。αS信号肽包含二十一个氨基酸，αL信号肽含有来自同一个大豆vspA基因的一个额外的14残基，该基因包含一个潜在的空泡定位信号(Mason等1988)。此外，C末端ER保留信号“SEKDEL”(序列号4)可以通过对内膜内容物的下降进行补救从而在ER中聚集亚单位，粗经单体更加有效的关联和交叉连接。

表3本例中使用的质粒

名称    N-末端延伸          C末端延伸pHB117      无                  无pHB118      vspAαS信号肽       无pHB119      vspAαL信号肽       无pHB121      无                  SEKDELpHB122      vspAαS信号肽       SEKDELpHB123      vspAαL信号肽       SEKDEL

我们用这些质粒转化烟草NT1细胞(Newman TC，Ohme-TakagiM，Taylor CB，Green PJ.DST sequences，highly conserved among plantSAUR genes，target reporter transcripts for rapid decay in tobacco.PlantCell 1993；5：701-714)。对选择性地在300mg/L卡那霉素上生长的细胞群落进行HBsAg表达的分析。每克细胞用2毫升缓冲液(PBS，pH7.2，50mM抗坏血酸盐，10mM EDTA，0.2mM PMSF，0.1％Triton-X-100)进行提取，提取物在4℃16000xg转速下进行离心提纯，对上层液用Bradford分析法进行总的可溶性蛋白(TSB)检测，并用Auszyme单克隆ELISA法检测HBsAg(Abbott试验室)。不同系株间的表达差别很大，但每一结构中表达最高的系进一步进行繁殖以做进一步的研究。下面的表4显示了一个代表实验的表达数据，此处，每个结构中挑选的系得到了检测，所有的系表达的可溶性蛋白水平相似，在HB117-9系，所有的修饰形式比未修饰者表达的HBsAg都高，在HB118-3系表达最高。我们在解释这些数据时必须十分谨慎，因为我们没有对RNA水平进行定量，而这将有些不同。但是，在每一个转化实验中，这些系在二十个随机事件中被选择作为最好的系，如此看来修饰形式至少和未修饰HBsAg表现的一样好。

表4转基因NT1细胞株的HBsAg和总蛋白水平

细胞系      总可溶性蛋白(mg/ml)   HBsAg(ng/mgTSP)

HB117-9             4.78                 67

HB118-3             4.28                 261

HB119-5             3.88                 121

HB121-11            3.40                 118

HB122-8             4.80                 133

HB123-1             4.46                 155

NT1对照             3.12                 0免疫沉淀法和交联的分析

在部分条件减弱的情况下，我们在免疫沉淀分层后，用Western印迹杂交法检测了NT1细胞提取物的HBsAg多聚体形式，提取细胞，用前述方法检测了TSP和HBsAg。含有1毫克的样品用含1％Triton-x100，0.5％抗坏血酸盐，0.1％SDS的PBS稀释十倍，然后与1微克山羊抗HBsAg(Fitzgerald Industries，Concord，MA)混合，在23℃下孵育一小时进行反应，然后与15微升的蛋白G Plus-琼脂糖(Calbiochem)混合，在旋转搅拌器中4℃下孵育16小时。根据供应商的建议，琼脂糖基质在25微升含80mM DTT的1.5X SDS-PAGE样品缓冲液中悬浮之前，先对其进行pellet和清洗。酵母rHBsAg样品用同样的方法进行免疫沉降。

在实验一，对来自HB117-9系、HB118-3系和HB121-11系的样品进行检测。SDS-PAGE样品缓冲液中免疫沉淀后的样品在50℃下加热五分钟(部分条件减弱)16000xg下离心两分钟，10微升悬浮物在4-20％的梯度微胶(BioRad)上负荷，剩下的物质重新悬浮，在100℃下加热20分钟(严格降低条件)，16000xg下离心两分钟，10微升悬浮物在第二胶上负荷。样品进行电泳，电印迹在PVDF膜上，用于IP中同样的山羊抗HBsAg血清标记探针。图19显示了获得的Weston印迹杂交。A道是暴露于部分条件降低(50℃五分钟)下的样品，B道是严格条件下的样品(100℃20分钟)。道1中的酵母rHBsAg显示了在部分条件降低的情况下多聚体的梯度，它明显没有严格条件下的显著。用IP纯化的酵母rHBsAg(道2)可以见到相似的图形，尽管恢复量没有想象的大。注意到所有道均含有约50kDa的信号，代表了山羊IgG的重链，既可以用作IP钩，又可以作为Weston印迹杂交的探针，并包含在对照组道7中，HBsAg二聚体和三聚体信号在该信号的两边，并与之截然分开。样品HB117-9(未修饰的HBsAg)的HBsAg单体与酵母rHBsAg单体共同迁徙。在部分降低的条件下表现有二聚体和微弱的多聚体信号，这表明HBsAg在植物细胞表达中容易交叉连结成多聚体。甚至在严格条件下，样品HB117-9也有一个强的二聚体信号。样品HB117-9中有一对微弱的低M_r信号，而在酵母来源的物质中则没有，这提示存在一个单切割导致了两个HBsAg片段。为了了解这种切割是在活细胞中发生还是提取物的结果，需要进行进一步的研究。非转基因NT1细胞样品(道6)显示了一个微弱的非特异信号，它在HBsAg单体和二聚体之间迁徙，并与两条带截然分开。

道4包含NT1细胞样品HB118-3，其HBsAg的N末端有“αS”植物信号肽的延伸修饰。该样品的单体信号迁徙位置较M_r略高，提示在这些NT1细胞中植物信号肽没有被切割。最有意思的是，在条件部分降低的样品HB118-3中二聚体信号比单体信号强，多聚体(可到十聚体)可以被区分，其上的污迹表明有更高的多聚体存在，甚至在严格条件下，也容易辨认出三聚体和四聚体信号，表明单体间的双硫交叉连接非常稳定，可以耐受HB118-3细胞的减少。与HB117-9样品一样，两个微弱的M_r下信号提示有部分蛋白溶解性裂解。

实验1中的道5含有来自NT1细胞株HB 121-11的样品，其HBsAg C末端“SEKDEL”的延伸修饰(序列号4)。部分降低条件的样品显示了一个迁徙位置较M_r略高的单体，这与C末端的延伸修饰是一致的。此外，多聚体直至十聚体很容易被观察到，表明其交叉连接的程度比HB117-3细胞明显增加。严格条件下使大多数多聚体成为单体，但仍然存在强的二聚体信号。象HB117和HB118株一样，两个微弱的M_r下信号提示HB121样品有部分蛋白溶解性裂解。

实验2中，检测了来自所有六个转基因株的样品。在这种情况下，在部分降低条件(50℃，5分钟)下和严格条件下(100℃，20分钟)进行独立的IP反应，目的是为了获得更加量化的结果。图20显示了其结果，A道样品是部分降低条件，B道样品是严格条件。样品HB117-9、HB118-3、HB121-11的结果与实验1是一致的，尽管在部分降低条件时高倍的多聚体的界限不足十分清楚。B道中的HB118-3样品(严格条件)的四聚体十分清楚，M_r以上的印迹显示更高的多聚体存在，再次表现出高度稳定的交叉连接。

实验2中的道4包含NT1样品HB118-3，其HBsAg的N末端有“αL”植物信号肽的延伸修饰。在A道中，信号肽加工的单体显示出与可能代表未加工形式的较大信号大致相同的摩尔数比。同时显示的有多聚体，在严格降低条件下它大部分转化成单体和二聚体。

第6和第7道分别包含了样品HB122-8和HB123-1，其HBsAg的N末端和C末端都有延长。在这些样品中(B道)，四聚体甚至在严格条件下也很明显。HB123-1株携带了αL植物信号肽延伸和C末端的SEKDEL延伸(序列号4)，与单独携带αL植物信号肽的HB119-5一样，它显示出明显的信号肽的部分性加工。由此看来，在这些NT1细胞中，长的αL信号肽的加工比短的αS信号肽的加工更有效。

总之，培养烟草NT1细胞的HBsAg表达容易形成双硫交叉连接多聚体。当大豆vspA信号肽的αS或αL与植物优化的HBsAg基因的N末端融合，将使交叉连接得到极大的加强。这些数据表明，植物产生的HBsAg，特别是当它与植物信号肽融合时，在天然或未加工宿主物质经口传播中是出色的疫苗抗原。例13.土豆中口服佐剂的表达

土豆块茎切成薄片直接喂养小鼠时，其中的大肠杆菌LTB亚单位可以表达为一种具有免疫原性的形式，氨基酸序列SEKDEL(序列号4)的表达增加(Taq，T.等1995)。在这里强调，LT-B蛋白可以用作疫苗载体。通过使用编码该蛋白序列的植物优化密码子，还可以进一步增加LT-B蛋白的表达。表5显示了不同的表达水平。

                    表5LT-B，ng/mg编码区域(质粒)             修饰               总的可溶性蛋白天然LT-B(pLTB110)      优化翻译启始位点            70LTB-SEKDEL(pLTK110)    C末端SEDKEL延伸             190合成的LT-B^*(pTH110)   植物优化密码子，除          4640

                   去假的多聚腺苷酸和

                   剪接信号^*pTH110的构建见Mason，H.等(1998)，Vaccine，16：1336-1343例14.块茎中共同表达HBsAg和粘膜佐剂大肠杆菌突变株LT的转基因土豆植物

在混合与稳定含有疫苗抗原和佐剂的准备物时，为了避免后勤中出现问题，如果提供的可食用物质所含的抗原和佐剂成分无须作准备，将是很方便的。至此，可以制造转基因土豆植物，它们的块茎共同表达并聚集HBsAg和大肠杆菌突变株LT。

植物中可以共同表达大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)及其突变株的A、B亚单位的质粒载体已被构建。这些也是同时待审的美国专利申请的主题，申请号为No.60/113507。为了在土豆植物中共同表达HBsAg和LT，将质粒作为转化双载体的宿主，该载体中含有一个HBsAg表达盒并有抗菌素耐药性，用该质粒对土豆植物进行转化。以往质粒的一个例子是pSLT102，它表达聚集的LT-K63(LT-A的S62到K63突变)，并载有卡那霉素耐药基因NPT-II。用于准备含有抗菌素耐药的载体的合适的质粒有pGPTV-HYG(潮霉素)和pGPTV-BAR(三磷化氢)(Becker，D.等1992)。用HindIII和EcoI消化pHB117得到HBsAg盒，并与用同样方法消化的Pgptv-HYG和pGPTV-BAR连接，构建出所希望的质粒，然后用产生的双载体，在含20mg/L潮霉素或1mg/L三磷化氢的介质上转化表达LT-K63的宿主土豆株。例15.用土豆块茎中表达的HBsAg口服免疫小鼠

用表达HBsAg的土豆片(每个动物每次投食5克土豆)喂养BALB/c小鼠，如图3和4A-E中显示，小鼠产生了HBsAg特异性IgM和IgG血清免疫反应，而喂养未转化土豆的一组对照动物没有产生抗体。在这些实验中，霍乱毒素(Sigma，St.Louis，MO)被用作口服佐剂，十微克的佐剂放在土豆片上与抗原一起被动物摄取。该实验重复了两遍，实验组和对照组总共有十只小鼠。这些实验中的土豆块茎仅表达1.1微克的HBsAg/毫克土豆，因此，每只小鼠每次喂食仅摄入5.5微克HBsAg，这或许直接反应了中等程度的初始反应。尽管如此，两组小鼠在第60天用亚免疫剂量的酵母来源的rHBsAg刺激，仅有那些喂养转基因土豆的小鼠产生继发性抗HBsAg反应，证实其建立了记忆细胞反应。当分析免疫反应的免疫球蛋白的种类和亚类时，在所有的亚类中都观察到在IgG反应之后出现IgM反应，血清中没有测到IgA反应。例16番茄植株的转化

番茄植物的转化可以根据Frary/Fillati等(Biotechnology 5：726-730，1987)的方案，并如此修饰：

将消毒种子(100种子～380毫克)(Tanksley TA234TM2R)浸在20％的CHLOROX漂白液中20分钟，在消毒的milli-Q水中仔细清洗(清洗两次或两次以上)，播种在含有1/2 MSO的Magenta盒中(每个盒子约30颗种子)。在切割子叶前一天，将2毫升已培养一周的NT-1悬浮培养液吸到KCMS介质盘上(NT-1细胞在KCMS液体介质中每周传代培养)，悬浮液上覆盖消毒的滤光器，在黑暗中培养一夜，播种八天后割下子叶，种子放在经消毒水弄湿的消毒纸巾上，在叶柄处切下子叶，切除末梢，如果子叶大于一厘米则将它一切为二，外植体放在饲养盘上，近轴面向下，25℃条件下，经16小时光照期和一夜的培养。

为了转化，在转化前1周，将土壤杆菌划线培养于LB选择性培养板上，并在30℃下孵育。在划线培养的培养板上，选取单个的菌落接种于液体选择性培养基中，并接种在有150微克硫酸卡那霉素的3毫升YM培养基中孵育。30℃强烈振荡培养48小时。将1毫升的培养液接种于49毫升加有2.5毫克硫酸卡那霉素的YM培养基中，并在一250毫升的培养瓶中，30℃强烈振荡培养24小时。在600纳米下测量其光密度，最佳的光密度值应在0.5-0.6之间。

土壤杆菌培养液8000rpm离心(Sorvall离心机，ss34转)十分钟，倒去YM培养基，将小球在2％MS-O中再次悬浮，最后的吸光度应该在0.5和0.6之间。将25毫升土壤杆菌培养液吸入消毒的Magenta盒子中，将二至三个盘子中的外植体转移到Magenta盒子的接种体中，孵育五分钟，并偶尔摇动。将外植体转移到消毒的纸巾上，回到饲养盘，近轴面朝下，饲养盘用Nesco膜封上，将外植体在25℃下共同培养24小时，其中有16小时的光照期，然后近轴面朝上转移到选择性介质(2Z)，盘子用微孔带密封，回到25℃，度过16小时的光照期。

每三周将外植体转移到新的IZ选择培养基板上。当开始出现嫩枝时，将它们转移到IZ的Magenta盒中。例17.转基因西红柿的再生

在4-6周内，应该出现第一批嫩枝。当嫩枝有至少2厘米长，并且包括至少1个结节时，自外植体切下嫩枝，将它们放在Magenta盒中，每盒放4个，Magenta盒内含有选择反应素的西红柿根培养基。根应该在大约2周内开始出现。标准的温室生长条件为：一天16小时；平均温度24.5℃；每次加水施肥：100ppm的EXCELL(15-5-15)，具有额外的钙和镁；马铃薯生长在METRO-MIX360中；西红柿生长在Cornell Mix+OSMO中；尽可能提高全部的植物质量，以用于生物对照。例18.ELISA方法测定血清抗-HBsAg的特异性抗体

应用市场上可以买到的AUSAB酶联免疫测定(EIA)诊断试剂盒(Abbott Diagnostics，Chicago，IL)，来评价小鼠血清中抗-HBsAg-特异性抗体，其它文章中描述过这种方法的应用(Pride，M.等，1998)。AUSAB定量板的应用，使得吸收值换算到毫国际单位/毫升(mIU/mL)。例19.抗-HBsAg应答的同型分布

应用鼠型亚一同型试剂盒(Bio-Rad；Richmond，CA)，测定抗-HBsAg应答的同型分布，在HBsAg-包被的珠子上孵育血清、唾液和粪便的提取物，并且应用鼠抗-粘膜亚类-特异型抗血清(Bio-Rad，enzymeimmunoassay(EIA)grade Mouse Typer panel)发现结合的抗体。例20.应用ELISA发现CT(LT)特异性抗体的产生

这种测定可作阳性对照应用。已经证明，在口服CT/LT后，可获得全身的抗体应答，并且如果应答是可以比较的就准许评价。正如Mason等1992，1998所描述的可测定CT-B。例21.测定粘膜分泌物中的抗体应答

为测定粘膜分泌物中的抗体水平，应按如下方法收集粪便和唾液标本：

粪便：自个体的动物搜集新鲜排空的粪便球，并将其贮存在Eppendorf管中，放于-70℃。在测定之前，用PBS(每个粪球用50微升)悬浮粪球，然后，将管置在室温中15分钟，并且随后剧烈振荡，20℃孵育15分钟。然后，再振荡样本，从1000xg离心5分钟。收集上清液并且立即用于ELISA测定。如deVos或Dick.J.Immunol.Method.141：285-288(1991)所描述的。

唾液：在给小鼠腹腔注射0.1ml的1mg/ml毛果芸香硷溶液后，搜集唾液于毛细管中，小心搜集所有病例中的第一次唾液。将样品转移到Eppendorf管中，放于-70℃保存直至测定。例22.制备单细胞悬液

应用一个无菌的不锈钢筛，轻轻挑开脾脏组织，从中获取单细胞悬液。从小肠壁中，切下派氏集合淋巴结，分离派氏淋巴结中的淋巴细胞。在Joklik′s改良的培养基中分离细胞(GIBCO，GrandIsland，NY)，这种改良的培养基中含有每ml或0.5mg/ml胶原酶中，有1.5mg的中性蛋白酶Dispase(Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)，就同以前所描述的(Kiyono，H.等PNAS USA79：596-600(1982))。例23.B细胞ELISPOT

如上面所描述的，用脾脏和派氏集合淋巴结中分离的细胞进行这种测定，脾脏和派氏集合淋巴结，用于全身(脾脏)和粘膜诱导(派氏集合淋巴结)免疫应答的比较。抗原特性和所有IgM，IgA和IgG点式细胞(SFC)在细胞悬浊液中应用别处描述的(见，如Current Protocolsin Immunology)抗原特异的ELISPOT计数。例24.在口服摄取转基因马铃薯后，分析鼠全身的肠相关组织中的Th1和Th2细胞

作为给小鼠喂食表达HBsAg或任何免疫原性多肽的转基因植物的结果，能够检查产生的T-细胞应答反应的本质和动力学特征。用合成的和微胶囊密封的肽，口服免疫那些富含T细胞的脾脏和派氏集合淋巴结，来激发抗原-特异性T细胞的增殖反应。在喂转基因马铃薯的小鼠中，也能够进行类似的研究。

也进行分析转基因HBsAg表达植物喂养小鼠的全身和粘膜相关组织中Th1和Th2型细胞的频率。诸如派氏集合淋巴结等粘膜组织中，Th1和Th2细胞的频率，可能影响同种特异应答的发生。能够应用的三种方法为：(i)细胞因子特异性单细胞测定，定量分泌特殊细胞因子的抗原特异性细胞的数量，(ii)应用特异的ELISA测定方法，测定分泌的细胞因子，和(iii)细胞因子特异性的PCR分析。前两种方法允许测定多种细胞因子合成和分泌的水平，而第三种方法将要判定mRNA产物中是否伴随这些变化。联合这些方法，将能允许判定是否一种特殊细胞因子的增加，是细胞因子mRNA表达增加的一个直接结果。

脾脏和派氏集合淋巴结中，T细胞的体外增殖。在第三次喂食动物的一周后，将动物杀死，依照前面描述的方法，搜集脾脏、转化细胞(Pride，M等1993)。依照上述的方法，收集派氏集合淋巴结和细胞。在96-孔平底板中，铺上T细胞(每孔2.5×10⁵个细胞)，同时加入5×10⁵个光照射的同源脾细胞，以作为抗原提呈细胞。在加入抗原后，按照所描述的方法培养细胞120小时。应用[³H]胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法，通过液体闪光分光镜检查判定增殖的情况。用三份相同的孔中[³H]-TdR掺入的平均cpm来表达结果。

计数T细胞产生的细胞因子：应用ELISPOT方法，采用配对抗-细胞因子的单克隆抗体，来确定在体外培养的、再次受刺激的抗原-特异性T细胞中，T细胞产生的细胞因子数量。

细胞因子特异性的ELISA测定。采用ELISA(Current Protocols inImmunology)应用与在ELISPOT测定中所用的相同的抗-细胞因子mAbs，来测定脾细胞和派氏集合淋巴结T细胞的培养上清中的细胞因子的量。

细胞因子-特异性的PCR分析。为探查在CD4+T细胞(脾细胞和派氏集合淋巴结)中的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-6特异性mRNA，执行并修改了此前所描述的(Kiyono，H等1982)标准RT-PCR扩增方案。为了RNA的分离，应用了硫氰酸胍/酚/氯仿抽提方法程序(Chomczynski & Sacchi，Anal.Biochem.162：156(1987))。RNA被抽提，然后应用2.5U/μl的Superscript II逆转录酶(Life Technologies)进行细因子特异性的RT-PCR。PCR产物通过在2％的琼脂凝胶的电泳分离，由溴乙啶(0.5微克/毫升)染色，并在UV(紫外)光下观察。

IFN-γ、IL-4特异性mRNA的定量，应用重组的mRNA(rcRNA)作为内参照，进行RT-PCR。根据其它地方所描述的方法(Wang，等，PNAS USA 86：9717-9721(1989))，构建IFN-γ、IL-4和β-肌动蛋白的衔接rcRNA。所进行的PCR反应，包括了50微升的PCR缓冲液，3亳摩尔浓度的氯化镁，0.2毫摩尔浓度的dNTP，30pmol的IFN-γ、IL-4和β-肌动蛋白的mRNA上游和下游引物，200纳克的基因组DNA(间隔基因)以及2.5单位的Taq多聚酶(Perkin-Elmer Cetus，FosterCity，CA)85℃。其相应的引物列于表6。在加热至94℃3分钟，样本经30个循环，即每一次热循环(Perkin-Elmer Cetus)包括-30秒的变性(94℃)、一秒的退火(59℃)和一个45秒的扩增(72℃)。在反应过程的最后进行一次5分钟的扩增(72℃)。PCR产物应用WizardPCR Preps DNA纯化系统(Promega Corp.，Madison，WI)进行纯化。在这种包含有IFN-γ、IL-4和β-肌动蛋白的合成基因构建完成以后，将PCR的产物插入到含有T7多聚酶启动子(Promega)的pGEM-T载体中。应用埃希氏大肠杆菌JM109进行转化。为获得rcRNA，纯化的合成基因需应用Spel(Promega)线性切开。为获得纯化的rcRNA，转录需经RQIDN酶(Promega)处理，并且进一步应用Oligotex-dT乳胶颗粒(Oligotex-dT mRNA试剂盒，Qiagen，Chatsworth，CA)加以纯化。

                     表6特异性PCR细胞因子的引物列表β-肌动蛋白      5′引物5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′          序列号24(349bp)          3′引物5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′          序列号25INF-γ           5′引物5′-TGAACGCTACACACTGCATCTTGG-3′           序列号26(460bp)          3′引物5′-CGACTCCTTTTCCGCTTCCTGAG-3′            序列号27IL-2(502bp)      5′引物5′-ATGTACAGCATGCAGCTCGCATC-3′            序列号28

             3′引物5′-GGCTGGTTGAGATGATGCTTTGTCA-3′          序列号29IL-4(399bp)      5′引物5′-ATGGGTCTCAACCCCCAGGAAGTC-3′           序列号30

             3′引物5′-GCTCTTTAGGCTTTCCAGGAAGTC-3′           序列号31IL-5(243bp)      5′引物5′-ATGACTGTGCCTCTGTGCCTGGAGC-3′          序列号32

             3′引物5′-CTGTTTTTCCTGGAGTAAACTGGGG-3′          序列号33IL-6(155bp)      5′引物5′-CTGTTTTTCCTGGAGTAAACTGGGG-3′          序列号34

             3′引物5′-5′-TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC-3′      序列号35IL-10(237bp)     5′引物5′-ACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGC-3′          序列号36

             3′引物5′-CTATGCAGTTGAAGATGTCAAA-3′             序列号37TNFα            5′引物5′-TTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC-3′   序列号38(354bp)          3′引物5′-GTATGAGATAGCAAATCGGCTGACGGTGTGCC-3′   序列号39

采用竞争RT-PCR，作为一种竞争性的模板，总RNA和细胞因子-特异性的rcRNA一起进行反应。小份的总RNA(8-630纳克的IFN-γ，11-900纳克的IL-4和0.19-15微微克β-肌动蛋白)，采用一系列的稀释的mRNA内标准进行测试。然后进行标准的RT-PCR(见表7)。通过添加到PCR反应混合物中5微居里的[³²P]dCTP(Amersham，Arlington Heights，IL)，进行定量测定。Duchmann等，DNA and CellBiol.12：217.1993。最后，如同上面所描述的方法，进行PCR产物的电泳。在IFN-γ、IL-4和β-肌动蛋白的特异性键中的[³²P]dCTP的含量，可通过液体闪烁计数器加以确定。

                      表7RT情况                    PCR情况

42℃15分钟      95℃2分钟             1循环

99℃5分钟       95℃1分钟60℃1分钟    35循环

5℃5分钟        60℃7分钟             1循环

                4℃浸泡例25.去垢剂浓度对从植物中提取HBsAg的影响

从植物病毒载体为基础的马铃薯病毒X(PVX)株DX，被用来表达植物中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。把寡核苷酸引物置入具有限制性内切酶ClaI和XhoI的位点中，使用这种引物，对在例证7中所描述的、在pHB115下的质粒psHB312，进行多聚酶连反应、扩增，优先在植物中表达的合成的HBsAg基因。用这些酶消化这些扩增产物，将含有HBsAg基因的消化产物，连接到用同样的酶消化的9kb的质粒pDX10a片段上。质粒pDX10a是PUC19的一种衍生物，具有ClaI/XhoI限制性内切酶位点，可包括PVX基因组衣壳蛋白的编码序列。这就产生了一种质粒，pDX10a-HBV6，含有PVX株DX全长感染的cDNA克隆，它在T7启动子的控制下，在那里，HBsAg的mRNA的基因取代了PVX的衣壳蛋白基因。设计这种构造，以便通过编码HBsAg的mRNA的产物，来启动HBsAg的表达。编码HBsAg的mRNA，来自亚基因组启动子，它自然地指导PVX衣壳蛋白的亚基因组mRNA的产生。

应用限制性内切酶SpeI线性切开pDX10a-HBV6的DNA，参照说明书，应用Ambion T7 mMessage mMachine试剂盒，用T7多聚酶，在体外转录线性切开的DNA。将转录产物人工接种在表达PVX衣壳蛋白的转基因烟草属的植物中，在转基因补充丢失的病毒基因，衣壳蛋白时，改良的病毒形式对植物产生整体的感染。对受感染植物的提取物进行SDS-PAGE电泳和Western杂交分析，结果表明有两种蛋白的表达，这两种蛋白对HBsAg特异性抗血清，是有免疫反应的；这两种蛋白很可能代表了病毒表达的HBsAg蛋白的糖基化和非糖基化形式。

采用Mason等(1992)根据其特征所描述的改良的操作方法，在Planta中，尝试表达HBsAg蛋白的纯化。应用一个研棒和研钵，在4倍体积的提取物缓冲液中搅匀全被感染的叶片组织。以1000xg离心组织的匀浆5分钟，以27000xg离心上清液15分钟，以100000xg过夜离心经27000xg离心的上清液，1小时。等分粗制的匀浆组织和每次离心的上清液，进行SDS-PAGE电泳和Western杂交，分析HBsAg特异性抗血清。肉眼观察Western杂交的结果表明，在第一步低速离心期间，没有描写的HBsAg沉淀，但是在第二步离心期间，则有了明显的表达蛋白的丢失，并且绝大多数残基的可溶性HBsAg，在第三步高速离心期间沉淀。还观察到，在中速离心期间，有大量的HBsAg丢失，这表明所用的缓冲液，不能有效地提取蛋白质，很可能是由于众所周知的膜相关特征。因此，为测试是否能够增加蛋白质的提取物，可考虑应用含有不同水平的去垢剂的缓冲液，进行提取。

应用研棒和研钵，在0.1M的磷酸钠(PH值7.0)和0.1M的抗坏血酸的两倍体积的缓冲液中，搅匀全被感染的叶片组织。用相同体积的缓冲液，在研棒和研钵中，采用等分量的5毫升粗制匀浆组织，再搅匀2分钟，用0.2％、1％、2％、5％或10％的Triton X-100，作为无离子去垢剂的替代物，来补充至缓冲液体积相同。组织匀浆被冰浴1小时，随后以27000xg离心15分钟。采取等量的粗制匀浆组织和五步提取过程中的每一次上清液，进行SDS-PAGE电泳和Western杂交，分析HBsAg特异性抗血清。肉眼观察Western杂交结果表明，在无去垢剂的情况下，离心的上清液中，发现HBsAg的效力很低，但是用1％或更高的Triton X-100终浓度的提取物，可导致效力的恢复。这样以来，增加去垢剂的水平直至1％，可导致更有效地提取所需要的蛋白质。

然而，HBsAg作为一种免疫原，其功效依赖它的聚集状态，颗粒型比游离蛋白更具有免疫原性。因此，通过区带离心，进一步分析用0.1％、0.5％和1.0％终浓度的TritonX-100提取的HBsAg，即在10mM的磷酸钠(PH值7.0)和0.15M的氯化钠中制成不连续的32毫升的蔗糖梯度(即5％、13.3％、21.6％和30％的蔗糖，每种8毫升)，并使其在4℃慢慢混合过夜。取2毫升经27000xg离心的上清液加载于梯度蔗糖上，并在5℃下在一个Sorval AH629离心机中以29000rpm离心6小时。从三种不同的梯度中收集2毫升，并且等分样品采用SDS-PAGE和Western杂交进行分析。用1％Triton X-100提取的原料上样密度梯度中的Western杂交部分，观察的结果表明，自顶端梯度的四个部分存在实际上全部的HBsAg相关蛋白，这提示用这种水平的去垢剂已经可以完全溶解HBsAg脂蛋白复合物。相反，用0.1％Triton X-100提取的原料上样密度梯度中的Western杂交部分，结果表明在中间段梯度的部分中有一个宽峰值，这提示提取的HBsAg是以一种想要的颗粒形式存在。观察第三种蔗糖梯度中的Western杂交部分，表明绝大多数HBsAg可以用这种水平的去垢剂提取物所完全溶解，如同1％Triton X-100的情况一样。

因此，尽管通过增加去垢剂的水平至Mason等用过的0.1％以上，可以提高HBsAg提取物的水平，但是，应用0.5％或更高浓度的TritonX-100可导致HBsAg颗粒形式的破坏，而用作疫苗的最有效部分可能就是HBsAg的这些颗粒形式。这样，如果不是故意重新组成颗粒或需要完全可溶性的蛋白，那么用于抗原纯化的去垢剂水平就应在0.5％以下。总之，Triton X-100的水平高于或等于0.1％但决不超过0.5％，显然对提取planta中表达的颗粒形式的HBsAg是最理想的。例26

当乙型肝炎表面抗原(HBsAg)在植物中表达时，可以得到对它的一个免疫应答，并且当动物对HBsAg有免疫接纳性时，给它喂食这种植物原料。通过用含HBsAg的植物原料与一种合适的佐剂喂食一种动物，有可能使该动物产生对HBsAg的免疫接纳性。由于以前的免疫接种，该动物也可能是免疫接纳性的，例如，在初次免疫接种的动物中，给动物喂食含有HBsAg的植物原料，可以在动物体内激发对HBsAg的免疫应答。

与例证27-30一致，挑选来使用的表达HBsAg的马铃薯细胞系是由马铃薯L.c.v.Frito-Lay 1607HB-7转化来的。FL-1607 HB-7和HB114-16是指定的转化细胞系。为得到这些细胞系，将从中国adr隔离的HBV的PMT-SA克隆中获得的HBsAg，插入转化质粒载体(pHB-7和pHB114)内，再将这些载体移入根癌土壤杆菌(LBA4404)中，然后用来转化马铃薯L.c.v.“Frito-Lay 1607”。用来构建这些例证中使用的马铃薯细胞系pHB-7和pHB114-16的质粒载体，都含有新霉素磷酸转移酶基因(NPTHII，也就是通常所说的APH(3′)II)。这种基因也可以整合入马铃薯基因组，并且在马铃薯细胞中表达。已经表明埃希氏大肠杆菌衍生的NPTII在生物化学上等同于植物表达的NPTII。埃希氏大肠杆菌衍生的NPTII在模拟哺乳动物消化的条件下能快速降解，并且已经表明当给小鼠喂食高达每公斤体重5克的纯化蛋白时，不会产生有害作用。根癌土壤杆菌处理转化的FL-1607，并无性繁殖，挑选能够表达高水平HBsAg的FL-1607 HB-7和HB114-16细胞系。通过ELISA技术测试FL-1607转化细胞系提取物中的HBsAg浓度。HB-7平均为每克重量的块茎有1100纳克的HBsAg，和HB114-16平均为每克重量的块茎有8500纳克±2100纳克的HBsAg。

提取的HBsAg自然地形成病毒样颗粒(VLP)，与酵母衍生的HBsAg VLPs以同样的密度沉降。电泳迁移率和western杂交分析显示表达抗原的块茎与酵母衍生的抗原难以区别。

细胞系被无性繁殖以增加植物的数量，并且把它装在罐里的土壤中，产生例证中使用的块茎。通过体外无性繁殖来维持转化的细胞系。

通过无性繁殖来维持未转化的亲本马铃薯细胞系，FL-1607，并且将它装在罐里，以产生用作安慰对照组的块茎。这些块茎中的组织并不表达对检测HBsAg的试剂起反应的任何蛋白质。例27

给BALB/c小鼠喂食去皮的HB-7马铃薯片做为实验组或者喂食没有转基因的马铃薯做为对照组。在0天、7天和14天给每组小鼠喂食三次5克的马铃薯，用霍乱毒素(CT)B亚单位作为口服佐剂。将10微克的佐剂放在马铃薯片(对照组和实验组)中与抗原一起喂食动物。喂食HB-7的动物，每次喂食因此而得到了平均5.5微克的HBsAg，或者说，三次喂食一共有平均16.5微克的HBsAg。

喂食HB-7的小鼠出现特异性针对HBsAg的血清IgM和IgG抗体应答，而喂食对照的非转化的马铃薯的对照组动物，则没有产生任何的抗体。在第三次喂食后，观察到免疫应答的峰值在70mIU/ml左右。在单纯的腹膜内注射了一次0.5微克的酵母源性的、在硫酸铝中重组的HBsAg(rHBsAg)以后(为一正常的亚免疫原性剂量)，出现了一次强烈的二次应答，其峰值在1700mIU/ml左右。这次应答中主要的抗体为IgG。在喂食非转基因马铃薯和CT的对照鼠中，没有见到初次和二次免疫应答。没有口服佐剂的，也没有出现明显的针对HBsAg的免疫应答。例证28

在Frito-Lay 1607 HB114-16细胞系，35S启动子驱动表达，在用于这些实验的部分中，平均的块茎表达是每克鲜重块茎有8.37微克HBsAg。

用HB114-16或以对照的没有转基因的马铃薯，喂养BALB/c小鼠组(每组5个)。在两组中，都给马铃薯添加10微克CT。一周和两周后再重复喂养一次。在整个的三周期间，给予每一只小鼠的转基因马铃薯中HBsAg的总平均剂量为125.55微克。然后，在第一次喂食的70天后，或者在出现的初次免疫应答已回复到基线水平后的3-6周时，给予一次rHBsAg(酵母源性)的亚-免疫原性剂量(0.5微克)，并加以铝佐剂，通过皮下(s.c.)注射免疫小鼠。

在这些剂量水平上，在第二次喂食后，马上即可见到一次初次免疫应答。该免疫原性持续上升，并且在6周左右的峰值为100mIU/ml。而在人体，在第三次注射目前所允许注射的乙型肝炎疫苗的剂量后，抗体的滴度仅仅达到10mIU/ml，便认为是已成功地免疫了。在13周时，免疫应答回复至基线水平，并在16周再给动物注射高剂量的HBsAg。这会导致曲线的一次骤升，其抗体的滴度可达大于3000mIU/ml，而在实验(共40周)的剩余时间内，滴度仍保持在1000mIU/ml以上。这是由于初次免疫中产生的，具有抗原特异性的免疫记忆细胞所致，这些记忆细胞的快速、强烈的对抗原回忆应答，导致了二次应答的迅速上升。

本实验中的对照组动物，给予了没有转基因的马铃薯和CT，它们没有出现明显的针对HBsAg的免疫应答，并且用上述方法第二次注射亚免疫原性剂量后，也没有见到二次应答，因而确定了HBsAg结果的特异性。给予转基因马铃薯但未加CT的对照组动物，仅仅出现了一次低水平的初次应答，如10mIU/ml滴度，在仅一周内便回复至基线水平。另外，用上述方法第二次注射亚免疫原性剂量后，也仅出现了一次50 mIU/ml滴度的二次应答，并且在两周内回复到仅仅有10mIU/ml的滴度。例29

在小鼠中已经应用转基因马铃薯，激发一种已存在的亚免疫原剂量的rHBsAg。在这个实验中，BALB/c小鼠组(每组5个)，用亚免疫原剂量的rHBsAg(Merck)进行免疫，rHBsAg在明矾中经皮下途径传输，5周后，用HB114-16或用对照的没有转基因的马铃薯喂养每个小鼠。在两组中，都给马铃薯添加10微克CT。一周和两周后再重复喂养一次。三周的时间内，每只小鼠的总的平均剂量为125.55微克。

在第三次喂养时已经开始出现发生的继发应答，而且在下降之前在初级免疫作用后的11周，升高到大约1000mIU/ml。在对照组，在喂养没有转基因的马铃薯时没发生免疫应答。例30

在一个随机双盲的研究中，给以前接种过一种商业上的乙肝疫苗、且经过一段延长时间后抗-HBsAg滴度在115mIU/ml以下、且没有人体免疫缺陷病毒者42人，吃含有HBsAg的马铃薯或不含HBsAg的马铃薯对照。当打破代码时，接受三种剂量的100克没有转基因的马铃薯FL-1607的对照组称为组1。组2接受两种剂量的、每一种为100克的转基因马铃薯FL-1607 HB114-16和一种剂量的没有转基因的FL-1607马铃薯。组3接受三种剂量的每一种为100克的转基因马铃薯FL-1607 HB114-16。

可利用的前期临床资料显示：(1)以体重方式，小鼠自由地食用其25％体重的马铃薯，该马铃薯没有毒性的证据；和(2)5克马铃薯中含50微克剂量的HBsAg，可作为具有口服佐剂的一系列初级的免疫原。可利用的其它马铃薯疫苗的临床资料表明：(1)吃掉100克的生马铃薯一般是可以很好耐受的，和(2)以体重方式，70公斤的人吃掉100克的马铃薯，将代表0.14％的体重。这个量大约比在小鼠的临床前实验中根据体重消耗掉的量低178倍。

这样，在人类的实例中，志愿者吃每一剂量的100-110克马铃薯。在这项研究中计划使用的临床批量为每克马铃薯含8.5±2.1微克的HBsAg。在28天的疗程后，接受两个100克剂量的转基因马铃薯的研究对象，所接受的HBsAg的总剂量为1,280-2,120微克，而接受三次剂量者所接受的HBsAg的总剂量为1,920-3,180微克。

在每天的定量(第0，14和28天)上，药房全体人员用清洁的技术将供给每组(安慰剂和对照组)的适当数量的马铃薯分别除去并且加工到个人的100-110克的剂量中。简单地，清洗、去皮挑选的马铃薯，把它们切成丁，放进冰冷的水中冲洗。马铃薯去皮就是除去含有植物碱基茄碱的皮。这种植物碱能够引起腹部不适或恶心，并且可以引起一种苦味。在去皮和切成丁后，根据每组的分配和研究对象识别数目(SID)，为每个研究组称出100-110克剂量的马铃薯。搜集皮和任何没有用的马铃薯部分，将其毁坏。每组研究对象的那份的马铃薯均在水下保存，以防止在马铃薯切成丁后到被研究对象吃完的这期间，因氧化而发生褐色变。每组在每次吃加工过的马铃薯时，留取适当的马铃薯进行冷冻，以便进一步加工来证实抗原的含量。

在表8，9，10列出的天数时，测定研究对象的抗-HBsAg的滴度。结果清楚地表明，作为摄取转化的马铃薯的结果，HBsAg抗原被服用时免疫应答增加。接受三次剂量都含有HBsAg的马铃薯的研究象中，有60％以上的人表明在免疫应答上有明显的增加。表中清楚地表明，在多数情况下，摄取含有遗传表达的HBsAg的植物物质能够为主要乙肝疫苗的一种有效的激发剂。在全部的观察期间，接受三次剂量都没有转基因的对照马铃薯的对照组研究对象，在抗体滴度上没有任何变化。

                      表8

            组1(接受3剂量的非转基因马铃薯块茎)

                   滴度(Im/ml)志愿者  0天   7天   14天  21天  28天  35天  42天  56天1     72    64    73    74    78    78    63    572     17    14    12    12    2     5     10    *3     63    51    56    67    69    74    88    894     66    78    52    62    54    74    67    695     0     0     0     1     0     0     *     76     12    9     12    18    18    16    17    197     34    28    24    32    33    29    34    338     9     11    12    11    8     7     9     9

9    104    99    83    110    120    100    99    92^*未提出样本

                     表9

组2(接受2剂量的转基因和1剂量的非转基因马铃薯块茎)

                 滴度(mIU/ml)志愿者   0天   7天   14天   21天   28天   35天   42天   56天

1    29    29    29     29     29     29     47     93

2    8     15    27     49     41     40     73     79

3    170   161   158    144    130    144    *      132

4    32    32    31     34     33     23     *      42

5    13    15    15     14     11     11     17     17

6    43    37    46     77     69     85     85     78

7    67    37    47     57     80     89     77     73

8    11    7     114    114    136    176    191    200

9    104   126   262    269    318    313    357    390

10   33    26    22     21     21     25     25     29

11   107   92    96     89     93     83     95     90

12   21    22    55     112    120    219    395    458

13   65    68    66     63     89     103    137    258

14   20    24    18     15     12     12     15     20

15   0     0     0      0      0      0      0      0

16   97    93    112    109    128    294    454    432

17   26    34    197    330    353    360    707    863^*未取出样本

                   表10

     组3(接受3剂量的转基因马铃薯块茎)

                   滴度(mIU/ml)志愿者  0天    7天   14天   21天    28天    35天    42天    56天1     17     20    70     140     269     428     401     4632     94     87    100    99      88      79      87      883     33     34    32     33      27      34      31      324     0      0     0      0       0       0       0       05     9      9     53     74      74      85      65      616     20     41    57     84      452     475     897     6527     85     76    496    1212    3058    3572    4152    45268     13     19    19     15      28      14      20      219     120    236   282    390     605     667     1583    171710    9      11    14     13      13      18      11      1511    0      0     0      0       0       0       0       012    72     77    137    270     349     523     1098    122613    85     76    84     74      111     215     175     16314    40     35    39     71      119     122     330     43015    56     51    59     85      252     407     520     74516    115    213   511    1054    1964    3069    2966    3449