通过光化学内化作用在抗原呈递细胞表面上表达抗原的方法

摘要

本发明提供一种在抗原呈递细胞表面表达抗原分子或其一部分的方法,该方法包括通过光化学内化作用将分子导入胞质,其中所述分子或其部分随后呈现在所述细胞的表面。本发明还提供疫苗接种方法,该接种方法包括上述方法,及包含所述细胞的组合物、和包括所述能表达抗原分子的细胞的用途。

说明书

本发明涉及一种疫苗接种的方法，该方法包括使用光动力学处理(PDT)将疫苗组分导入细胞，以实现抗原呈递；本发明还涉及用于本方法的疫苗组合物。

大多数的分子不易于穿过细胞膜。将分子导入活细胞胞质的方法是操纵和研究生物过程的有用工具。现今最常用的方法有显微注射、红血球血影介导的融合和脂质体融合、胞饮体渗透裂解、刮式负荷法(scrape loading)、电穿孔、磷酸钙和病毒介导的转染。这些技术对细胞培养研究有用，虽然在许多情况下它们可能不能实行、费时、低效或者它们可能引起明显的细胞死亡。因而这些技术用于生物学或医学研究或治疗并不是最佳的，因在这些研究中要求细胞保持活力和/或功能。

众所周知卟啉和许多其它的光敏化合物可能引起细胞和组织的细胞毒效应。这些效应基于以下事实，即光敏化合物曝光时可能变成有毒，或者可能释放有毒的物质如单态氧或其它氧自由基，这些物质会损伤细胞物质或生物分子，包括细胞膜和细胞结构，而这些细胞结构或膜的损伤最终会杀死细胞。这些效应已被用于治疗各种异常或疾病，尤其包括肿瘤疾病。这种治疗称为光动力学治疗(PDT)，它包括给予机体受感染部位光敏(光化学治疗)制剂，然后在活化光(photoactivatinglight)下曝光以激活光敏剂，并使其转变成细胞毒形式，从而杀死受感染的细胞或减少它们的增殖潜能。已知应将光敏剂优先或选择性地定位在理想的目标位置如肿瘤或其它病灶。

已知光敏剂的范围包括著名的补骨脂素、卟啉、二氢卟酚和酞菁。这些药物当曝光时变成有毒。

光敏药物通过多种机制直接或间接地发挥它们的作用。因此，如某此光敏剂被光激活时直接变成有毒，而其它的则产生有毒物质，例如氧化剂如单态氧或其它的氧衍生的游离自由基，这些物质对细胞物质和生物分子如脂质、蛋白和核苷酸有极大的破坏性。

卟啉光敏剂通过产生毒性氧物质而间接起作用，并且被认为是用于PDT的最佳候选物。卟啉是血红素合成中自然产生的前体。具体而言，当铁(Fe³⁺)通过亚铁螯合酶的作用掺入到原卟啉IX(Pp)中时产生了血红素。Pp是一种极强的光敏剂，而血红素没有光敏感作用。本领域已知道各种以卟啉为基础的或与卟啉有关的光敏剂，文献中也有描述。

细胞毒作用主要是通过单态氧的形成起作用。这些活性中间物质在细胞中寿命很短(＜0.04μs)，因而，在曝光期间PDT主要在单态氧形成位点非常接近的地方发挥其细胞毒作用：单态氧可氧化蛋白质(组氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、DNA(鸟嘌呤)、不饱和脂肪酸和胆固醇。PDT的一个优点是没有曝光的组织可能不受影响，即可能获得选择性的PDT作用。还有许多文献认为可以用PDT来破坏不想要的细胞群，如肿瘤细胞。专利文献描述了许多光动力化合物，这些化合物可单独或与靶向试剂(如针对肿瘤细胞受体决定簇的免疫球蛋白)偶联使用，使这些复合物更具有细胞特异性。某些光化学化合物(如血卟啉衍生物)天生具有在恶性细胞中定位的能力。这些方法和化合物在挪威专利第173319号、挪威专利申请第900731、176645、176947、180742、176786、301981、300499和891491号中有描述。

在WO93/14142中描述了一种药物输送系统，该系统包括连在共聚物载体上的一种抗癌制剂和一种光敏剂(即感光剂)。给药后，该复合物通过胞饮或吞噬进到细胞内，停留在核内体和溶酶体中。在溶酶体中，抗肿瘤制剂与聚合物之间的结合键被水解，前者能被动扩散通过溶酶体膜进入胞液中。因而，此法的用途限于能扩散穿过溶酶体膜的小分子化合物。扩散一段时间后，用适当波长和能量的光源照射，以激活该光敏感化合物。抗癌制剂和光敏剂的联合作用破坏了细胞。

因而，上述PDT方法涉及导致细胞死亡的细胞结构的破坏。

另一方面，WO96/07432提到一种方法，该方法用光动力作用机制将另外的不能透过膜的分子，以不导致普遍的细胞破坏或细胞死亡的方式导入胞质中。在这个方法中，该分子与光敏感制剂共同内化(更具体的说是“胞吞”)细胞的胞内囊(例如溶酶体或核内体)中。然后使细胞暴露于活化光中使光敏剂活化，进而引起囊膜破坏或破裂，囊中的物质(包括分子)释放进入细胞内(即胞质中)。已发现在这个方法中，大多数细胞的功能和活力不会受到有害的影响。因而，已提议用该方法〔称为光化学内化(internalisation)〕来将各种各样不同的分子(包括治疗剂)转运到细胞内即胞质内。

我们现已发现，用这样的方法不仅能有益地将分子转到细胞内，还可以在细胞表面呈现或表达。从而，在某分子转运并释放到胞质之后，该分子就可能被转移到细胞表面，在那儿它可以呈现在细胞的外部即细胞表面。这个方法在疫苗接种领域里有特殊的用途，在此领域中，为了诱导、促进或增强免疫应答，须将疫苗组分即抗原或免疫原导入细胞，以在该细胞表面呈现。

最概括地说，本发明因而提供了一种将抗原分子或其一部分表达于细胞(较佳的是抗原呈递细胞)表面的方法，所述方法包括通过光化学内化作用将分子导入胞质，其中，所述分子或者其一部分后来将呈现在所述细胞的表面。

本文所用的“呈现”或“表达”指分子或某一部分呈现在所述细胞表面，这样该分子至少有一部分暴露和接触于该细胞的周围环境。在“表面”上表达可以通过使待表达的分子与细胞膜和/或细胞组分接触而实现，所述细胞组分可以在膜上呈现或被呈现的。

这种抗原呈递能有利地刺激免疫应答，较佳的是刺激能赋予对含有所述抗原的或其一部分的病原体后续攻击的保护力的免疫应答。因而，本发明的发现作为疫苗接种的方法是特别有用的。

更具体说，本发明在这方面提供了一种在细胞表面表达抗原分子或抗原分子一部分的方法，所述方法包括：

使所述细胞与抗原分子和光敏剂接触，其中，所述分子和所述制剂各自被吸收到所述细胞的胞内受膜限制的区室中；然后

用能有效激活光敏感制剂的波长照射所述细胞，这样，所述胞内区室的膜被破坏，所述分子被释放到胞质中，而不杀伤死细胞；其中，所述释放出来的抗原分子或其一部分随后被提呈在所述细胞的表面上。

本文所用术语“破坏的区室”指该区室膜的完整性被永远地或暂时地破坏，该破坏足以使区室中含有的抗原分子释放出来。

或者，本发明在这方面还提供了用于在细胞表面表达抗原分子或抗其一部分的一种组合物，较佳的是该组合物可刺激免疫应答，所述组合物包括一种抗原分子和一种光敏剂。较佳的是，所述组合物是药学上可接受的，还含有药学上可接受的赋形剂或稀释剂。

另一方面，本发明还提供了在药物制造中抗原分子和光敏剂的用途，所制造的药物用于在细胞表面表达所述抗原分子或其一部分，以刺激免疫应答。

另一方面，本发明提供了一种产品，该产品包括抗原分子和光敏剂，它作为混合的制品在细胞表面表达所述抗原分子或其一部分中同时、分开或顺次使用，以刺激免疫应答。

另一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒用于在细胞表面表达抗原分子或其一部分，所述试剂盒包括：含有所述抗原分子的第一容器和含有光敏剂的第二容器。

本发明中的抗原分子可以是任何的分子，其中，当以适当的方式将该分子或其一部分呈递给免疫系统时，它们能刺激免疫应答。优点是，该抗原分子因此可以是一种疫苗抗原或疫苗组分，如一种包含多肽的实体。

本领域已知许多这样的抗原或抗原性疫苗组分，包括所有细菌的或病毒的抗原或真正的抗原(indeed antigen)或任何致病物种(包括原生动物或高等生物)的抗原组分。同时，在文献中已广泛地研究和报道，传统上疫苗抗原组分包括整个生物体(不管是活的、死的或减毒的)即全细胞疫苗，以及亚单位疫苗即基于生物的具体抗原性组分(如蛋白或肽)，或者甚至是碳水化合物。任何亚单位疫苗组分在本发明中均可用作抗原性分子。然而，本发明在肽疫苗领域有特殊的应用。因而，本发明一个较佳的抗原分子是肽(在本文，肽定义为包括短的和长的肽，即肽、寡肽或多肽，还包括蛋白分子或它们的片段，如含5-500，10-250；含15-75、8-25氨基酸的肽)。宜提呈或表达的抗原分子部分较佳地包括细胞内抗原加工机制所产生的部分。然而这些部分可以由其它方法产生，如通过合理的抗原设计(如pH敏感条带)或通过其它的细胞加工方法而实现。足够大小的这些部分能方便地产生免疫应答，如五个以上或者10或20个氨基酸以上的肽。

文献中已提出了许多的候选肽疫苗物，例如，在病毒性疾病和传染病如AIDS/HIV感染或流行性感冒、犬细小病毒、牛白血病病毒、肝炎等的治疗中(参见Phanuphak等人，Asian Pac.J.Allergy.Immunol.1997，15(1)，41-8；Naruse，Hokkaido Igaku Zasshi 1994，69(4)，811-20；Casal等人，J.Virol.，1995，69(11)，7274-7；Belyakov等人，Proc.Natl.Acad.Aci.USA，1998，95(4)，1709-14；Naruse等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91(20)，9588-92；Kabeya等人，Vaccine 1996，14(12)，1118-22；Itoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83(23)，9174-8)。与可采用细菌肽相类似，肽抗原实际上可以从其它生物体或物种中得到。

除了从致病生物得到抗原外，已提出将肽作为抗癌症或其它疾病如多发性硬化的疫苗。例如，致癌基因突变肽很有希望成为癌疫苗，在细胞毒T淋巴细胞的刺激中用作抗原(Schirrmacher，癌症研究和临床肿瘤学杂志，1995，121，443-451；柯斯蒂癌化疗和生物反应调节剂，1997，17，316-327)。也评价了一种合成肽疫苗在转移性黑色素瘤治疗中的效果(Rosenberg等人，Nat.Med.1998，4(3)，321-7)。Wilson等人〔J.Neuroimmunol，1997，76(1-2)，15-28〕描述了用T细胞受体肽疫苗来治疗多样性硬化。任何这些肽疫苗组分可以用作本发明的抗原性分子，正如在文献中描述或提议的任何一种肽均可作为肽疫苗。这种肽可以合成或从生物体中分离得到。

用于本发明方法和用途等的细胞可以是任何能在其表面表达或提呈分子的细胞，该分子是通过给药或转运进入胞质的。

由于本发明主要的应用是抗原呈递或疫苗接种，所以，细胞通常是免疫效应细胞，即参加免疫应答的细胞。但是，其它细胞也可能提呈抗原给免疫系统，这些也在本发明的范围之内。本发明的细胞宜是抗原呈递细胞。抗原呈递细胞可以涉及免疫反应的任何方面或“分枝”，包括体液和细胞介导免疫力，例如，刺激抗体产生，或者刺激细胞毒或杀伤细胞，这些细胞能识别和破坏(或消除)表面表达外来抗原的细胞。术语“刺激免疫应答”，包括所有类型的免疫应答和激发它们的机制。

对细胞毒细胞或产生抗体的细胞的刺激，需要被呈递给被刺激细胞的抗原由抗原呈递细胞这种特殊方式递呈，例如通过MHC-I类分子的呈递(如CD8^-细胞毒T细胞的激活需要MHC-I抗原呈递)。

抗原呈递细胞在本领域中是周知的，在文献中有所描述，这些细胞包括如淋巴细胞(T细胞和B细胞)、树突细胞、巨噬细胞等。其它的包括如癌细胞(如黑色素瘤细胞)。

对于抗原呈递细胞向细胞毒T细胞(CTL)的抗原呈递，抗原分子需要进入抗原呈递细胞的胞质内(Germain，Cell，1994，76，287-299)。本发明提供一种将抗原分子送到胞质的有效的方法。

通过光化学内化作用，抗原分子一旦被释放到胞质中，即可通过细胞的抗原加工机制而被加工，并以适当的方式(如以MHC-I的方式)呈递到细胞的表面。这个加工可能包括抗原降解，如，蛋白或多肽抗原降解成肽，这些肽随后与MHC分子形成复合物而呈递。因而，本发明表达或呈递在细胞表面的抗原分子可以是被内化(胞吞)抗原的一部分或片段。

抗原可以被抗原呈递细胞通过胞吞所摄取，并在胞吞的囊内降解成肽。这些肽可能在核内体中与MHC-II类分子结合，并被转移到细胞表面，在那里肽-MHC-II类复合物可被CD4+T辅助细胞识别并引起免疫应答。或者，胞质中的蛋白质可能被降解(如被蛋白酶体降解)，然后通过TAP(与抗原呈递相关的运载蛋白)转运到内质网中，在那儿肽可与MHC-I类分子结合并如图1所述转运到细胞表面(Yewdell和Bennink，1992，Adv.Immunol.52：1-123)。如果肽是外来的抗原，那么此肽-MHC-I类复合物将被CD8+细胞毒T细胞(CTLs)识别。CTLs将与该肽-MHC-I类复合物结合，从而被激活，开始增殖并形成CTLs克隆。靶细胞和其它表面具有相同的肽-MHC-I类复合物的靶细胞可被该CTL克隆所杀死。如果能在胞质中能导入足量的抗原，就可能建立对外来抗原的免疫力(Yewdell和Bennink，1992，同上；Rock，1996，Immunology Today，17：131-137)。这尤其是癌症疫苗开发的基础。一个最大的实际问题是将足量的抗原(或抗原的部分)导入胞质。这可用本发明的PCI解决。原理在图1中阐述，该图显示了怎样用PCI来刺激CTLs。将一条肽或一个蛋白(P)在胞外给予抗原呈递细胞。P通过PCI被胞吞和释放到胞质中。该肽或蛋白随后将被蛋白酶体部分降解，与MHC(HLA)-I类分子形成复合物，并被转运到细胞表面，在那儿，该复合物被CTLs识别。

如同将在下面实施例中所作的更详细描述那样，已证明根据本发明，可以有效地用光化学内化进行癌特异性肽的胞质中传送。

使用靶定向试剂如靶特异性传送或运载系统或载体分子，可将抗原分子和/或光敏剂导向特异性细胞或组织。这样，例如可将抗原分子和/或光敏剂通过载体或载体系统(如重建的LDL颗粒)传送给细胞。载体分子可与抗原分子、光敏剂或这两者结合或偶联，可采用相同的或不同的载体分子。抗原分子和/或光敏剂还可偶连于一位点靶向配体(site-targeting ligand)，例如对具体细胞类型或具体细胞结构具有特异性的配体，如抗体，该抗体能识别表达在某些类型细胞表面上的抗原如肿瘤特异性抗原。这些机制可通过受体介导的内吞作用增加光敏剂和/或抗原分子的摄取。还可以用这些靶定向分子载体和载体来引导抗原分子和/或光敏剂进入细胞内的区室中。

胞内受膜限制的区室可以是存在在细胞内的任何区室，较佳的该区室是膜性囊，尤其是核内体或溶酶体。但是，该胞内区室还可以包括高尔基体或内质网。所有的这些要求是抗原分子和光敏剂定位在同一胞内区室中。

在WO96/07432中较详细地描述了光化学内化方法(本文引用该文的内容作为参考)。现在在文献中也广泛地描述了PDT方法。

本发明使用的光敏剂可以是能定位于胞内区室，尤其是内涵体或溶酶体任何试剂。这些光敏剂的范围是本领域周知的，在文献中有所描述，包括WO96/07432。这方面可能会提及的有双-和四磺酸铝酞菁、磺酸四苯基卟吩(TPPSn)、耐尔蓝、二氢卟酚e₆衍生物、尿卟啉I、叶赤素、血卟啉和亚甲基蓝，这些都显示定位在培养细胞的核内体和溶酶体中。这种情况最多是由于内吞活动。

可能提及的合适的光敏剂类型包括卟啉、酞菁、红紫素、二氢卟酚、二苯卟啉酞菁、阳离子染料、四环素和亲溶酶体弱碱(lysomotropic weak base)或者它们的衍生物(Berg等人，Photochemistry and Photobiology，1997，65，403-409)。

较佳的是，光敏剂包括TPPS₄(Zabner等人，J.Biol.Chem.1995，270，18997-19007)TPPS_2a和AlPcS_2a。

本发明的光化学内化作用可用PDT方法进行，该方法是本领域周知的和标准的，对这些技术做适当的修改在本方法中是有效的。因而，可根据PDT领域周知方法和手段的应用(application)或引入将抗原分子和光敏剂传送到细胞中。可用本发明方法体内或体外，原位处理或活体外处理细胞，然后将处理的细胞给予病人。

从而，本发明另一方面提供了在其表面表达有抗原分子或其一部分的抗原呈递细胞，该细胞通过前述方法获得(或已获得)。本发明另一方面提供了这种细胞的种群或培养物，特别是这种细胞的活的和具有完整功能的种群或培养物，本发明还提供了这种细胞(或这种细胞的种群或培养物)在治疗中的应用，具体是用来刺激免疫应答，尤其是刺激CTLs应答。

本发明还提供了这种细胞(或这种细胞的种群或培养物)的应用，即用来制备刺激免疫应答尤其是CTLs免疫应答的药物(如疫苗组分)。

可以采用本领域普通或标准的任何体内给药方式进行体内和体外表面给药，如注射、输灌、局部给药等。对于在体内使用，本发明可用于任何相关的含有靶细胞的组织，包括局部体液，以及固体组织。只要光敏剂能被靶细胞摄取并且光能正确地传送，可用其处理所有的组织。

从而，本发明的组合物可以根据制药技术领域周知的技术和工艺以任何方便的方式配制，如采用一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。此组合物和载体或赋形剂材料的性质、剂量等可以根据选择和所需的给药途径、接种目的等以常规方式选择。剂量同样地可以常规方式确定，可能依赖于抗原分子的性质、接种目的、病人年龄、给药方式等，还要考虑到光敏剂照射时破坏膜的力量/能力。

激活光敏剂的光照射步骤同样地可根据本领域熟知的技术和程序进行。例如，光的波长和强度可根据所用的光敏剂选择。合适的光源在本领域中是熟知的。

如前面所提到的，以及在WO96/07432中提到的，已发现这种方式的光化学内化作用对细胞的活力和功能没有有害的影响。具体而言，已发现当按照本发明处理全部或大多数细胞时，大多数细胞没有被杀死，而是活着，主要功能完整。

本文所用的术语“没有杀死细胞”是想定义这样的一种情况。换句话说，全部或多数细胞，实际上是所有的细胞或绝大多数细胞(如至少75％的细胞，较佳的是至少80％、85％、90％或95％的细胞)没有被杀死。

显然，当用光照射全部或多数细胞时，某些细胞群或某些区域的组织可得到更多的光，或者以某些其它方式比其它细胞群或组织区域受到更大的PCI影响。因而，在整个受照射细胞群中生存细胞的百分比不一定一致，该百分比指受照射细胞群中仍能存活的细胞的百分比，要求仅是有足够比例的受照射细胞存活。另外，照射导致细胞死亡要一些时间，例如几个小时。在这种情况下可能看到最终死亡的细胞也可能在其表面表达抗原分子，这与本发明的方法一致，因而包括在本发明的方法、使用等之中。因而，细胞死亡百分比是指在照射的数小时时间内(如照射后达到4小时)仍能存活的细胞百分比，较佳的是指照射后4小时或以上的存活细胞百分比。

本发明方法可以作修改，这样，可通过选择与光敏剂浓度相应的光剂量而调节存活细胞组分或比例。这些技术在本领域也是熟知的。

本发明提供了一种有效的方法来传送各种各样的抗原分子。本发明有许多特征，使得本发明特别适合作为疫苗传送工具，这些特征包括：1)只要待输送的分子能被靶细胞胞吞，其分子的大小没有限制；2)它不依赖于细胞增殖；3)它是位点特异性，只有曝光的区域才受到影响；4)它不致瘤。另外，光化学内化作用可以和其它机制联合作用，以产生位点或组织特异性药物作用，如通过使用细胞表面结构的特异性配体来靶向，使用有组织特异性的调节基因元件或使用疾病特异性药物，从而开创了获得对靶细胞的药物特异性的充分协同作用的可能性。

现在，本发明将参考下列附图更详细地描述以下非限制性例子，其中：

图1显示了可用PCI如何刺激CTLs的示意图。在抗原呈递细胞的胞外加入一条肽或一个蛋白(P)。P被胞舌并通过PCI释放到胞质中。该肽或蛋白随后将被蛋白酶体部分降解，与MHC(HLA)-I类形成复合物，然后被转移到该细胞的表面，在那儿该复合物被CTLs识别。

图2显示了某肽的光化学诱导的主定域。将BL2-G-E6细胞与荧光素标记的p21^ras衍生的5-21Val^1A肽和AlPcS_2a共同培育。用荧光显微镜定域方法检测细胞的荧光肽和AlPcS_2a开始前(上图)和30分钟后(下图)，红光曝光4分钟。其标尺刻度为20μm。

图3显示了MART-1肽经PCI后CD8+T淋巴细胞克隆抗FM3黑色素瘤细胞的细胞毒性。

图4显示了PCI将HRP转运到胞质的能力。用3.2μg/ml的TPPS_2a和1mg/ml的HRP处理NHIK 3025细胞18小时。然后在用所示光剂量曝光前用没有药物的培养基换掉原培养基。用电渗透(electropermeabilisation)和密度离心技术测量完整细胞(○)、和与没有胞质的死细胞()分开的胞质(●)中的HRP活性。

图5显示了GFP的光化学诱导表达。图a.GFP在THX细胞中的表达，该细胞在没有AlPcS_2a和光、或者存在AlPcS_2a下用pEGFP-N1-pLys复合物处理，随后用图中所示的光剂量曝光。用流式细胞术分析细胞，画线右边的细胞是GFP表达阳性细胞。图b.THX细胞中的GFP表达，该细胞用光敏剂(20μg/ml的AlPcS_2a或0.25μg/ml的3-THPP)处理18小时接着用pEGF-N1-pLys复合物转染6小时并曝光，灭活了50％的细胞。用如图a.所述的流式细胞术分析分析GFP表达。

实施例

材料和方法

照射

用两种不同的光源处理细胞，每种光源都有4个荧光管。使受TPPS₄、TPPS_2a和3-THPP(卟啉产品，Logan，UT)处理的细胞在蓝光(3026型；Appl.Photophysics，Lodon，UK)中曝光，其光强度达到1.5mW/cm²细胞，而用AlPcS_2a(卟啉产品，Logan，UT)处理的细胞在红光(Philips TL 20W/09)中曝光，该光用Cinemoid 35型滤波器过滤，光强度为1.35mW/cm²细胞。

荧光显微镜检查

将Berg.K.等人(Biochem.Biophys.Acta.，1370：317-324，1998)描述用荧光显微镜分析了细胞。为分析荧光标记分子，该显微镜装备有一个450-490nm激发滤光片、一个510nm二向色光束分路器和一个510-540nm的波段通过发射过滤片。

质粒-pLys复合物的制备和细胞的处理

用含5μg质粒(pEGFP-N1；Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)的75微升HBS与含5.3μg pLys(MW20700；Sigma，St.Louis，MO)的75微升HBS轻轻混合制备了质粒-pLys复合物(电荷比为1.7)。该溶液在室温下培育30分钟，然后用培养基稀释，并加到细胞中。

将THX细胞在37℃下与20μg/ml的A1PcS_2a培育18小时，洗涤并在与质粒-pLys复合物培育2小时之前与没有光敏剂的培养基培育3小时。将经pEGFP-N1/pLys处理过的THX细胞洗涤一次，然后在曝光前在没有添加物的培养基中培育2小时。37℃培育该细胞2天，传代培养并在进行流式细胞术分析GFP表达前进一步培育5天。

用20μg/ml的AlPcS_2a培育HCT-116细胞18小时，洗涤然后在曝光前在没有质粒的培养基中用质粒-pLys复合物转染6小时。37℃培育40小时后，用显微镜研究其GFP表达。

流式细胞术分析

用胰蛋白酶处理细胞，离心后重悬于400μl的培养基中，然后用50μm的尼龙网过滤器过滤。然后用FACStar与流式细胞术(Becton Dickinson)分析该细胞。用调到488nm的氩激光(200mW)激发之后，通过510-530nm滤光片测量了绿荧光蛋白(GFP)。用调到351-356nm的氪激光(50mW)激发之后，通过650nm长通路滤光片测量了AlPcS_2a。通过门控GFP荧光信号的脉冲宽度将双染色细胞与单染色细胞相区分。该数据用PC Lysys II软件(BectonDickinson)分析。

荧光肽的制备和细胞的处理

荧光标记的Val^1A-p21^ras-肽(残基5-21)由Alan Cuthbertson NycomedAmersham合成和提供。将BL2-G-E6与30μg/ml的荧光标记p21^ras衍生肽一起培育18小时，随后与20μg/ml的AlPcS_2a培育18小时，并在红光中曝光前在没有药物的培养基中培育1小时。

实施例1

光化学内化(PCI)作用能用来使肽进入到细胞的胞质中

为了评估PCI对癌特异性肽的胞质中传送，采用了荧光标记的含残基5-21的p21^ras肽和含Val¹²突变(G12V)的肽(Gjertsen，M.K.等人，Int.J.Cancer，72：784-790，1997)。ras肽和AlPcS_2a共定域于BL2-6-E6小鼠纤维母细胞中，这表明该肽被胞吞摄入(图2)。曝光4分钟后，发现荧光标记的ras肽和AlPcS_2a扩散到细胞质中。仅暴露于荧光标记的ras肽和光中的细胞没有观察到类似的作用(没有给出数据)。

实施例2

用PCI诱导抗原呈递和CD8+T淋巴细胞介导的细胞杀伤

将培养在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基不表达MART-1的FM3黑色素瘤细胞(在6孔板中，2×10⁵/孔)以10μg/ml的光敏剂AlPcS_2a处理18小时。然后用含EDTA(0.1M)的Dulbecco公司的磷酸缓冲溶液(PBS)从培养基中释放出该细胞，将⁵¹Cr(60μCi/ml Na₂CrO₄)的100％FCS加到该细胞中，并在溶液中保持1小时，然后与含5μg/ml MART-1肽的PPMI 1640的10％FCS溶液培育5小时，同时细胞仍保持在溶液中。MART-1肽的序列是：TAEEAAGIGILTVILG。然后用含10％FCS的RPMI 1640培养基洗涤该细胞两次，并接种在96孔平板(在100μl的RPMI 1640/10％FCS培养基中，2000/孔)中。然后以图3所示的时间曝光该细胞(Philips TL 20W/09)，该光用Cinemoid 35滤光片过滤过，其光强度达到1.35mW/cm²细胞(Rodal等人，1998，J.Photochem.Photobiol.B：Biol.45：150-9)。曝光18小时后，去除原培养基，并加入含MART-1/HLA-A2特异性细胞毒T淋巴细胞的培养基(加入CTLs-40000/孔在100μl中)。培育4小时后，将FM3细胞与培养基相分离，计数释放在培养基中(作为溶解细胞的指示剂)的⁵¹Cr，同时如以前所述计算自发释放和最大释放(Fossum等人，1995，Cancer Immunol.Immunother.40：165-172)。特异性铬释放百分比根据下式计算：(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)×100。从图3所示的结果可以看出，上述MART-1肽PCI之后的FM3细胞，对CD8+T淋巴细胞细胞毒性具有轻微的依赖易感性(dependent susceptibility)。

实施例3

PCI诱导胞吞的分子大组分的释放

这通过PCI诱导的辣根过氧化物酶(HRP)内化/胞吞所显示。

通过使用HRP证明(见图4)，PCI诱导胞吞的HRP大组分(60％)释放并进入到胞质中。

在这个实验中，用光敏剂TPPS_2a(3.2μg/ml)和1mg/ml的HRP处理NHIK3025细胞(人子宫颈原位癌细胞)18小时。然后在以图4所示的曝光剂量曝光之前用没有药物的培养基替换原培养基。按照Steinman等人(J.Cell Biol.，68：665-687，1976)描述的方法测量了HRP的活性。用电渗透和密度离心技术(Berg等人，Int.J.Cancer 59：814-822，1994)将胞质与无胞质的死细胞相分离。

实施例4

可用PCI来增加功能基因的递送

为证明这一点，用编码绿荧光蛋白(GFP)的质粒(pEGFP-N1)的pLys复合物转染了TXH细胞。用流式细胞术(图5a和b)和荧光显微镜(未给数据)分析了GFP表达。从图5a可以看出，用AlPcS_2a和光处理导致表达GFP的细胞的百分比强烈地增加。该报告分子阳性的细胞组分从没有光处理时的1％，到曝光5分钟后增加到50％。在不用光敏剂时用pEGFP-pLys处理的细胞中，光不增强GFP的表达。当用AlPcS_2a和光联合处理时，不相关的质粒(编码血红素加氧酶)与pLys的复合物不诱导绿荧光(未给出数据)。因而，以光定向的方式，PCI能充分地增加功能基因转染到THX细胞中的效率。用TPPS_2a作为光敏剂和BHK-21、HCT-116作为靶细胞得到了相似的结果(未给出数据)。基本上是非溶酶体定域的光敏剂3-THPP只诱导了GFP表达的微小增加(图5b)。不与pLys形成复合物的pEGFP-N1的PCI不导致GFP表达(未给出数据)。