寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯,其合成及应用

摘要

本发明涉及具有新的含至少一个核苷间3′－NHP(O)(S－)O－5′连键的糖—磷酸骨架的寡核苷酸,以及合成和使用本发明的寡核苷酸的方法。本发明的硫代氨基磷酸酯(thiophosphoramidate)寡核苷酸能保持亲本寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的高RNA结合亲和性,并呈现高得多的酸稳定性。

说明书

                相关申请的交叉参考

本申请要求1999年9月10日申请的美国申请60/153,201及1999年10月19日申请的美国申请60/160,444的优先权。为在美国申请的目的，该优先权申请以其全文引入本文作参考。

发明领域

本发明涉及具有新的含核苷间3′-NHP(O)(S-)O-5′连键的糖-磷酸骨架的寡核苷酸，更具体地，本发明涉及硫代氨基磷酸酯(thiophosphoramidate)寡核苷酸组合物，其作为诊断剂或治疗剂的用途，及合成硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的方法。

发明背景

核酸聚合物化学在药物、诊断和分析领域、更具体地在反义和反基因治疗学、组合化学、分支DNA信号扩增和基于阵列的DNA诊断学和分析亚领域的许多开发技术中起重要作用(例如：Uhlmannand Peyman，化学综述90：543-584，1990；Milligan等，医学化学杂志36：1923-1937，1993；DeMesmaeker等，结构生物学当前观点5：343-355，1995；Roush，科学276：1192-1193，1997；Thuong等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32：666-690，1993；Brenner等，美国科学院院报89：5381-5383，1992；Gold等，生物化学年度综述64：763-797，1995；Gallop等，医学化学杂志37：1233-1258，1994；Gordon等，医学化学杂志37：1385-1401，1994；Gryaznov，国际申请PCT/US94/07557，Urdea等，美国专利5,124,246；Southern等，基因组13：1008-1017，1992；McGall等，美国专利5,412,087；Fodor等，美国专利5,424,186；Pirrung等，美国专利5,405,783)。

这一化学主要涉及改善天然核酸聚合物如DNA的结合强度，特异性和核酸酶抗性。不幸的是，一个性质如核酸酶抗性的改善通常涉及其它性质如结合强度的牺牲。这种牺牲的例子非常多：肽核酸(PNA)展示良好的核酸酶抗性和结合强度，但是在测试培养物中细胞摄入降低(例如：Hanvey等，科学258：1481-1485，1992)；硫代磷酸展示良好的核酸酶抗性和可溶性，但是典型地是作为P-手性混合物合成并显示若干非序列特异性生物学作用(例如：Stein等，科学261：1004-1012，1993)；甲基膦酸酯展示良好的核酸酶抗性和细胞摄入，但是也是典型地作为手性混合物合成并具有降低的双螺旋稳定性(例如：Mesmaeker等，(如上所述))；等等。

最近，一类新的寡核苷酸类似物被开发出来，其具有所谓的N3′→P5′氨基磷酸酯核苷间连键，其展示有利的结合性质、核酸酶抗性和可溶性(Gryaznov and Letsinger，核酸研究20：3403-3409，1992；Chen等，核酸研究23：2661-2668，1995；Gryaznov等，美国科学院院报92：5798-5802，1995；Gryaznov等，美国化学协会杂志116：3143-3144，1994)。氨基磷酸酯化合物在每个2′-脱氧呋喃糖核苷残基含有3′氨基基团代替3′-氧原子。寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的合成和性质也在Gryanov等，美国专利5,591,607；5,599,922；5,726,297；和Hirschbein等，美国专利5,824,793中有描述。

寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯与互补DNA、特别是RNA链形成非常稳定的双螺旋，与DNA双螺旋形成稳定三螺旋，并且它们还抗核酸酶(Chen等，核酸研究23：2661-2668，1995；Gryaznov等，美国科学院院报92：5798-5802，1995)。另外，寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯在体外和体内均是比硫代磷酸衍生物更强的反义制剂(Skorski等，美国科学院院报94：3966-3971，1997)。同时，相对于天然磷酸二酯相应物，氨基磷酸酯表观上对胞内和胞外蛋白质具有低亲和性，和增加的酸不稳定性(Gryaznov等，核酸研究24：1508-1514，1996)。寡核苷酸氨基磷酸酯的这些特征对于某些应用潜在地负面影响其药物学性质。特别是，考虑到需要使用寡核苷酸制剂作为口服药物，寡核苷酸的酸稳定性更是重要的品质。

为了克服与寡核苷酸类似物相关的上述问题，需要一类新的化合物，其能包括寡核苷酸氨基磷酸酯和硫代磷酸的最佳特征。本发明描述了寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的合成、性质和用途。

发明概述

本发明的组合物和方法涉及具有由亚单位间连键结合的连续核苷亚单位的多核苷酸。在本发明的多核苷酸中，至少两个连续亚单位通过N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚单位间连键而结合，所述连键由式3′-[NH-P(＝O)(-SR)-O-]-5′啶义，其中R选自氢、烷基、芳基及其盐组成的组。在本发明的一个优选的实施方案中，R是氢或其盐。本发明的多核苷酸的组成可以是使得所有亚单位间连键均是N3′→P5′硫代氨基磷酸酯。或者，本发明的多核苷酸可以含有第二类亚单位间连键如磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、p3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯和硫代磷酸酯连键。

一种举例性的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚单位间连键具有下式：其中B是嘌呤或嘧啶或其类似物，Z是OR，SR或甲基，其中R选自氢、烷基、芳基和其盐组成的组；R₁选自由氢、O-R₂、S-R₂和卤素组成的组，而R₂是H，烷基或(CH₂)_nW(CH₂)_mH，其中n在1-10之间，m在0-10之间，W是O，S，或NH，条件是当Z是甲基或OMe时，R₁不是H。组成多核苷酸的核苷亚单位可以选择组成一确定序列：如与单链核酸靶序列互补的碱基序列，或者能使多核苷酸和靶双螺旋之间形成三螺旋结构的序列。由至少一个如上所述N3′→P5 ′硫代氨基磷酸酯亚单位间连键结合的核苷亚单位与具有氨基磷酸酯亚单位间连键的寡核苷酸相比具有优异的酸水解抗性，同时仍保持相同的热稳定性。

本发明还包括合成寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的方法。在这一方法中，将第一个核苷5′-琥珀酰基-3′-氨基三苯甲基-2′，3′-二脱氧核苷附着于固相支持物上。该第一个核苷还另外具有保护3′氨基基团。该保护3′氨基基团随后脱保护以形成游离3′氨基基团，向其加入第二个核苷。第一个核苷的游离3′氨基基团与3′-保护氨基核苷-5′-O-氰乙基-N，N-二异丙基氨基亚磷酰胺单体反应形成核苷间N3′→P5′亚磷酰胺连键。该核苷间N3′→P5′亚磷酰胺基团随后硫化形成第一个和第二个核苷之间的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯核苷间连键。

本发明另一个实施方案中，提供了一种将本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸与DNA或RNA靶杂交的方法。该硫代氨基磷酸酯多核苷酸包含由至少一个下式定义的亚单位连接成的核苷亚单位序列，所述公式为其中B是嘌呤或嘧啶或其类似物，Z是OR，SR或甲基，R₁选自由氢、O-R₂、S-R₂和卤素组成的组，而R₂是H，烷基或(CH₂)_nW(CH₂)_mH，其中n在1-10之间，m在0-10之间，W是O，S，或NH，条件是当Z是甲基或OMe时，R₁不是H。将硫代氨基磷酸酯多核苷酸与RNA靶接触以使该多核苷酸与RNA靶之间形成杂交复合物。

本发明还包括药物组合物和试剂盒，其包括具有至少一个如上所述N3′→P5′硫代氨基磷酸酯连键的多核苷酸。本发明寡核苷酸特别适用于基于杂交作用的口服治疗应用，如反基因和反义应用，包括抑制端粒酶活性。

附图简述

参照下述描述和附图，本发明的上述方面和许多优点将变得更易理解，其中：

图1A示出寡核苷酸硫代磷酸酯的核苷间连键结构。

图1B示出寡核苷酸氨基磷酸酯的核苷间连键结构。

图1C示出举例性的本发明寡核苷酸硫代氨基磷酸酯的核苷间连键结构。

图2示出均匀修饰的寡核苷酸硫代氨基磷酸酯的逐步合成示意图。

图3示出将二核苷酸硫代氨基磷酸酯转变为其氨基磷酸酯相应物的示意图，以及由二核苷酸硫代氨基磷酸酯水解得到的产物。

图4示出用增加量的与端粒酶RNA互补的SEQ ID NO：2的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸，或含有核苷酸错配的SEQ ID NO：4进行的体外端粒酶抑制分析结果。

图5示出用增加量的与端粒酶RNA互补的SEQ ID NO：10的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸进行的体外端粒酶抑制分析结果。

图6示出与端粒酶RNA互补的SEQ ID NOs：2和10以及含有核苷酸错配的SEQ ID NO：4对HME50-5E细胞生长的作用结果。

图7示出硫代氨基磷酸酯寡核苷酸对HME50-5E细胞的端粒长度的作用结果。

图8示出测定的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO：2的IC₅₀值。

详细描述定义

“烷基”是指具有1-20个碳原子的烷基或取代烷基，如甲基、乙基、丙基等。低级烷基典型是指C₁-C₅，中级烷基典型是指C₆-C₁₀。

“芳基”是指具有5-20个碳原子的芳香环基团，如苯基、萘基、蒽基或取代芳基，如烷基或芳基取代如甲苯基、乙基苯基、联苯基等。还包括环中具有一或多个氮、氧或硫原子的杂环芳香环基团。

“寡核苷酸”典型地是指具有约3-50个连续亚单位的核苷亚单位聚合物。核苷亚单位可通过各种亚单位间连键而连接，所述连键包括但不限于图1A-1C中所示的那些。另外，“寡核苷酸”包括本领域熟练技术人员已知的对糖骨架(例如核糖或脱氧核糖亚单位)、糖(例如2′取代)、碱基和3′和5′末端的修饰。本文所用术语“多核苷酸”具有相同含义，因为术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本文可互换地使用。

当寡核苷酸由字母序列如“ATGUCCTG”表示时，应理解核苷酸从左至右是5′→3′顺序。

本文所用术语“核苷”包括天然核苷，如2′-脱氧和2′-羟基形式，例如如Komberg和Baker在《DNA复制》第2版(Freeman，旧金山，1992)所述，及其类似物。核苷“类似物”包括具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷，例如，如Scheit在《核苷酸类似物》(John Wiley，纽约，1980)所述。这种类似物包括设计用于增强结合性质如稳定性、特异性等的合成核苷，如Uhlmann和Peyman(化学综述90：543-584，1990)所揭示的那些。

“碱基”在本文中的定义包括(i)典型的DNA和RNA碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶)和(ii)修饰的碱基或碱基类似物(例如5-甲基胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，或肌苷)。碱基类似物是一种化合物，其分子结构模拟典型DNA或RNA碱基的分子结构。

本文所用“嘧啶”是指在天然核苷中存在的嘧啶，包括胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，及其常见类似物，如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羟基、氨基、硫代、卤代等取代基的类似物。该术语进一步包括附着有常见保护基的嘧啶，如N₄-苯甲酰胞嘧啶。Beaucage和Iyer(Tetrahedron 48：223-2311，1992)公开了其它常见嘧啶保护基。

本文所用“嘌呤”指在天然核苷中存在的嘌呤，包括腺嘌呤、鸟嘌呤和次黄嘌呤，及其常见类似物，如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羟基、氨基、硫代、卤代等取代基的类似物。该术语进一步包括附着有常见保护基的嘌呤，如N₂-苯甲酰鸟嘌呤，N₂-异丁酰鸟嘌呤，N₆-苯甲酰腺嘌呤等。Beaucage和Iyer(Tetrahedron 48：223-2311，1992)公开了其它常见嘌呤保护基。

本文所用的作为化合物名称的组成部分的术语“保护”是指本领域熟知的对于一化合物的特定部分的保护基团，例如核苷的“5′-保护羟基”包括三苯基甲基(即trityl)，对茴香基二苯基甲基(即单甲氧基三苯甲基或MMT)，二-对茴香基二苯基甲基(即二甲氧基三苯甲基或DMT)。本领域熟知的保护基团包括下述参考文献中描述的保护基团：Gait编辑的《寡核苷酸合成：实用途径》(IRL出版社，牛津，1984)；Amarnath and Broom，化学综述77：183-217，1977；Pon等，生物技术6：768-775，1988；Ohtsuka等，核酸研究10：6553-6570，1982；Eckstein编辑的《寡核苷酸和类似物：实用途径》(IRL出版社，牛津，1991)，Greene and Wuts，《有机合成中的保护基团》第2版(John Wiley & Sons，纽约，1991)，Narang编辑的《DNA和RNA合成及应用》(学术出版社，纽约，1987)，Beaucage and Iyer(文献同上)等。

术语“卤素”或“卤代”以其常规含义应用，是指氯、溴、氟或碘取代基。在本文所述及所要求的化合物中，卤素取代基通常是氟、溴或氯，优选是氟或氯。

本发明的化合物可用于抑制或降低端粒酶活性和/或具有端粒酶活性的细胞的增殖。在这些前后关系上，抑制或降低酶活性或细胞增殖是指相对于酶或细胞未用测试化合物处理的对照实验所测活性水平降低。在特定的实施方案中，所测活性的抑制或降低为至少10％降低或抑制。本领域熟练技术人员将会理解所测活性降低或抑制至少20％、50％、75％、90％或100％对于特定应用可能是优选的。

本发明一般地涉及含有至少一个硫代氨基磷酸酯亚单位间连键的寡核苷酸，合成这种多核苷酸的方法，以及使用本发明寡核苷酸作为治疗化合物及用于诊断的方法。

举例性的寡核苷酸具有下式：

其中每个B独立地被选择是嘌呤或嘧啶或其类似物，如尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶和肌苷，

Z₁是O或NH，

Z₂是OR，SR或甲基，其中R选自由氢、烷基、芳基和其盐组成的组，

R₁选自由氢、O-R₂、S-R₂、NHR₂和卤素组成的组，而R₂是H，烷基或(CH₂)_nW(CH₂)_mH，其中n在1-10之间，m在0-10之间，W是O，S，或NH，

R₃和R₄选自由羟基、氨基和氢组成的组，

m₂是1-50之间的整数。

组成本发明的多核苷酸核苷酸的核苷亚单位可以选择组成一确定序列：如能特异地与单链核酸靶序列杂交的碱基序列，或者能使多核苷酸和靶双螺旋之间形成三螺旋结构的序列。优选地，核苷亚单位序列通过至少一个是如下式定义的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的亚单位连接：

其中B是嘌呤或嘧啶或其类似物，

Z是OR，SR或甲基，其中R选自由氢、烷基、芳基和其盐组成的组，

R₁选自由氢、O-R₂、S-R₂、和卤素组成的组，而R₂是H，烷基或(CH₂)_nW(CH₂)_mH，其中n在1-10之间，m在0-10之间，W是O，S，或NH，条件是当Z是甲基或OMe时，R₁不是H。

例如，多核苷酸的所有亚单位间连键均可以是由下式定义的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚单位间连键：

本发明的寡核苷酸可以用于与靶核酸序列如RNA和DNA杂交。如果需要，本发明的寡核苷酸可以用报道基团如放射性标记、生物素标记、荧光标记等标记以促进检测多核苷酸本身，以及其在例如杂交复合物中的存在。

在本发明的另一方面，提供了用于分离或检测样品中的靶RNA的试剂盒，该试剂盒含有一种寡核苷酸，该寡核苷酸具有由至少一个下式定义的亚单位间连键而连接的核苷亚单位确定序列：

其中B是嘌呤或嘧啶或其类似物；Z是OR，SR或甲基；R₁选自由氢、O-R₂、S-R₂、和卤素组成的组，而R₂是H，烷基或(CH₂)_nW(CH₂)_mH，其中n在1-10之间，m在0-10之间，W是O，S，或NH，条件是当Z是甲基或OMe时，R₁不是H，以及

其中该寡核苷酸与靶RNA杂交。

所述寡核苷酸还可配制成在与靶基因的过表达相关的疾病情况中抑制细胞转录或翻译的药物。

优选地，核苷亚单位序列由至少一个是N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的亚单位间连键而连接。或者，多核苷酸的所有亚单位间连键均是由下式定义的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚单位间连键：

在其它方面，本发明涉及用Nelson等(有机化学杂志62：7278-7287，1997)的亚磷酰胺转移方法学的修改技术合成寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的固相方法。该合成策略采用购自Cruachemand JBL Scientific，Inc.(Aston，PA和San Luis Obispo，CA)的3′-NH-三苯甲基保护3′-氨基核苷-5′-O-氰乙基-N，N-二异丙基氨基亚磷酰胺(Nelson等，文献同上)。用下述化学程序进行每一合成循环(见图2)：1)脱三苯甲基化，2)偶联，3)加帽，4)硫化。对于在偶联步骤后形成的核苷间亚磷酰胺基团的逐步硫化，用硫化剂代替碘/水基氧化剂，可以使用元素硫S₈或常用的Beaucage试剂3H-1，2-苯并二硫羟-3-酮(Iyer等，有机化学杂志55：4693-4699，1990)。用在无水乙腈中的1％Beaucage试剂溶液或在CS₂/Et₃N，99/1(vol/vol)中的15％S₈作为硫化剂进行寡核苷酸合成(1μmole合成规模)。

嵌合N3′→P5′氨基磷酸酯-硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的制备可采用偶联步骤后的氧化步骤进行，该步骤导致形成氨基磷酸酯核苷间基团。类似地，磷酸二酯-硫代氨基磷酸酯可通过用5′-亚磷酰胺-3′-O-DMTr保护的核苷酸作为单体构件制备。这些合成途径均是本领域已知的。

用两种硫化剂制备模型氨基磷酸酯胸腺嘧啶二核苷TnpsTn，其具有3′-NHP(O)(S-)O-5′核苷间基团。分析反应混合物并经离子交换(IE)和反相(RP)HPLC以及³¹P NMR证实该化合物的结构。分析揭示用Beaucage试剂对核苷间亚磷酰胺基团的硫化导致形成约10-15％的具有3′-NHP(O)(O-)O-5′氨基磷酸酯连键的氧化二核苷(³¹PNMRδ，ppm7.0于D₂O中)。或者，用分子硫S₈产生所需的含3′-NHP(O)(S-)O-5′核苷间基团的二核苷，用³¹P NMR和IE HPLC分析判断其具有有实际应用价值的产量(³¹P NMRδ，ppm 56.4，59.6于D₂O中，Rp，Sp异构体)。

合成模型寡核苷酸11聚体GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：1)也获得类似的硫化效率结果，其中用Beaucage试剂硫化产生含有约15％氨基磷酸酯连键的全长产物，这是用反应混合物的³¹P NMR分析确定的。主峰的化学位移约为57和60ppm(宽双峰)和7ppm(宽单峰)，其分别相应于硫代氨基磷酸酯和氨基磷酸酯基团。相反，根据³¹P NMR分析，用S₈硫化仅在11聚体产物中产生约2％氨基磷酸酯连键。寡聚物的IE HPLC分析与³¹P NMR谱吻合很好。最终寡核苷酸产物的结构和纯度用MALDI-TOF质谱分析、³¹P NMR及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实。硫代氨基磷酸酯寡聚物GT₂AG₃T₂AG(SEQID NO：1)和TAG₃T₂AGACA₂(SEQ ID NO：2)的分子量分别计算为3577.11和4202.69。经MALDI-TOF质谱分析实验确定的硫代氨基磷酸酯寡聚物GT₂AG₃T₂AG(SEQ ID NO：1)和TAG₃T₂AGACA₂(SEQID NO：2)的分子量分别为3577和4203；在15％PAGE中相对于等序列(isosequential)氨基磷酸酯的迁移率分别为0.95和0.97。

如IE HPLC和³¹P NMR(³¹P NMRδppm7.0)(见图3)所鉴定的，通过用在吡啶/THF/H₂O 1/4/0.1(vol/vol)中的0.1M碘溶液在55°C处理15分钟，模型氨基磷酸酯核苷TnpsTn被定量转变为氨基磷酸酯相应物TnpTn。将TnpsTn二核苷用10％乙酸在55℃处理48小时出人意料地仅导致核苷间氨基磷酸酯连键的部分水解(约10％)。为在这些条件下进行比较，将亲本氨基磷酸酯二聚体TnpTn完全水解。该二核苷硫代磷酸酯中的N-P键的裂解同时伴有脱硫过程(约15％)，随后是所得氨基磷酸酯-NHP(O)(O-)O-基团的快速水解，如IE HPLC和³¹P NMR所揭示(图3)。

2′-R₃N3′→P5′硫代氨基磷酸酯可如上所述从相应的氨基磷酸酯获得。2′-R₃N3′→P5′氨基磷酸酯是通过设计用于合成寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的亚磷酰胺转移方法学获得。2-O-烷基N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的合成作为这一方法学的举例而详细描述。

根据下述方案1-3所示的一系列化学转化制备合适保护的2′-O-烷基-3′氨基核苷-5′-亚磷酰胺构件4，6，11和15。制备这些化合物的一创造性步骤是在嘧啶的亚氨基官能性或嘌呤的N-7原子存在下对2′-羟基选择性甲基化。两个嘧啶基单体得自己知的3-叠氮-2′-O-乙酰基-5′-O-甲苯酰基-3′-脱氧-β-D-核糖呋喃糖基尿嘧啶1。典型地，1的N-3/O-4亚氨基氮首先用保护基团保护，如通过在二甲基氨基吡啶存在下甲基propyolate的反应而进行(方案1)。粗反应产物随后选择性地2′-O-去乙酰化，然后得到的游离2′-羟基被烷基化，如通过用碘甲烷和氧化银进行甲基化。N-3保护基团被除去，3′-叠氮基被还原成胺，随后其被立即保护，如与4-单甲氧基三苯甲基氯反应，得到前体3。随后用碱性溶液裂解5′-甲苯酰基酯，接着用已知方案进行phosphitylation，得到所需的2′-O-甲基尿苷亚磷酰胺单体4。通过将尿苷中间体3转化为3′-氨基胞苷类似物5而获得2′-O-甲基胞嘧啶亚磷酰胺。

2′-O-烷基腺苷类似物的合成需要使用大保护基团，主要用于环外氨基以防止在2′-羟基甲基化期间N-7的烷基化(方案2)。3′-叠氮-2′-O-乙酰基-5′-O-N⁶-苯甲酰-3′-脱氧腺苷7首先被脱保护，如与NH3/MeOH(1/1，v/v)反应，以提供3′-叠氮-3′-脱氧腺苷。然后，用大保护基团如叔丁基二苯基甲硅烷基或4-单甲氧基三苯甲基对5′-羟基和N-6部分选择性再保护。在5′-O和N-6位置的两个大取代基的组合立体封闭N-7，由此使得在2′-位置选择性导入甲基，以产生中间体8。然后如通过用在有机溶剂如二氯甲烷中的3％三氯乙酸处理除去N-6 4-单甲氧基三苯甲基基团，接着进行N-6的再保护。使用苯甲酰氯再保护N-6获得两个苯甲酰基团的加成。第二个苯甲酰基团随后通过碱处理除去，产生中间体9。然后还原叠氮基团，并用4-单甲氧基三苯甲基保护所得3′-氨基而形成10。最后，裂解5′-甲硅烷基保护基团，phosphitylation得到2′-O-甲基亚磷酰胺单体11。方案2

鸟苷基2′-O-烷基亚磷酰胺15的合成如方案3所示。用碱处理使3′-叠氮基-2′-O-乙酰基-5′-O-甲苯酰基-N²-异丁酰基-O⁶-二苯基氨甲酰基-3′-脱氧鸟苷12去封闭。通过与叔丁基二苯基甲硅烷基氯反应再保护5′O-和O-6。该双甲硅烷基化中间体随后被2′-O-烷基化。O-6甲硅烷基被选择性脱保护，得到化合物13。N-2基团被再保护，3′-叠氮基团被还原，得到的3′-氨基基团被保护以产生核苷14。最后，通过除去5′-保护基团，随后将暴露的5′-羟基phosphitylation而得到2′-O-烷基鸟苷亚磷酰胺单体15。方案3

在本发明的另一实施方案中，寡核苷酸的酸稳定性通过将由N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚单位间连键连接的亚单位置于寡核苷酸中而增强。相对于具有磷酸二酯或氨基磷酸酯亚单位间连键的互补DNA或RNA链，评价硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的杂交性质。从氨基磷酸酯寡核苷酸和磷酸二酯寡聚物产生的双螺旋的热稳定性数据总结于表1中(实施例3)。

硫代氨基磷酸酯寡核苷酸与互补核酸的杂交是序列特异性的并由合适的Watson-Crick碱基配对决定。由具有一单碱基错配的氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO：3与端粒酶的RNA靶成分形成的双螺旋(实施例6，表2，实验2)的稳定性比由完全互补于端粒酶RNA成分的寡核苷酸SEQ ID NO：1形成的双螺旋差许多(实施例6，表2，实验1)。含有核苷间3′-NHP(O)(S-)O-5′硫代氨基磷酸酯连键的寡核苷酸的应用

合成寡核苷酸SEQ ID NO：2 3′-NHP(O)(S-)O-5′硫代氨基磷酸酯，这一化合物令人惊奇地具有酸稳定性并与互补RNA靶形成稳定的复合物。本发明的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯多核苷酸具有反义和反基因诊断/治疗应用的巨大潜力。在本发明的一个优选实施方案中，所述寡核苷酸是寡脱氧核糖核苷酸。A.端粒酶抑制应用

最近出现了对正常细胞达到衰老状态的机制的了解，该状态即细胞在正常经历细胞老化过程中的增殖能力的丧失。真核生物染色体末端或称端粒处的DNA通常由串联重复的简单序列组成。科学家长久以来已知道端粒在保持染色体结构和功能方面有重要的生物学作用。近来科学家推测在重复细胞分裂中端粒DNA的累积丧失可能引发细胞衰老和老化，而参与保持端粒长度的酶即端粒酶的调节可能具有重要的生物学应用。参见Harley，1991，突变研究256：271-282。Bodnar等的实验已证实端粒和端粒酶在控制培养的正常人细胞的复制寿命中的重要性，参见Bodnar等，1998，科学279：349-352。

端粒酶是一种核糖核蛋白酶，其合成端粒DNA的一条链以用作该酶的RNA成分中所含的序列的模板。参见Blackburn，1992，生物化学年度综述61：113-129。人端粒酶的RNA成分已被测序，其长度为460个核苷酸并含有一系列11个碱基的序列重复，该序列重复互补于端粒重复。人端粒酶活性可被各种互补于端粒酶的RNA成分的寡核苷酸抑制。参见Norton等，自然生物技术14：615，1996；Pitts等，美国科学院院报95：11549-11554，1998；Glukhov等，生物化学生物物理研究通讯248：368-371，1999。本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸与端粒酶RNA的10-50个核苷酸互补。优选地，本发明的端粒酶抑制剂硫代氨基磷酸酯寡核苷酸具有与端粒酶RNA互补的10-20个连续碱基序列。

已经描述了用于检测端粒酶活性以及鉴别调节或影响端粒酶活性的化合物的方法，还描述了通过控制端粒长度和端粒酶活性而治疗或诊断细胞衰老和永生化的方法。见Feng等，1995，科学269：1236-1241；Kim等，1994，科学266：2011-2014；PCT专利出版物93/23572，1993年11月25日公开；美国专利5,656,638，5,760,062，5,767,278，5,770,613和5,863,936。

抑制端粒酶活性的化合物的鉴别对治疗人类疾病的努力提供了重要有利之处。抑制端粒酶活性的化合物可用于治疗端粒酶介导的疾病如癌症，因为癌症细胞表达端粒酶活性，而正常人体细胞不具备生物学相关水平(即足以在许多次细胞分裂中保持端粒长度的水平)的端粒酶活性。不幸的是，仅鉴别和鉴定的非常少的这种化合物，特别是具有高效力或活性的化合物，以及在口服投药后具有生物利用性的化合物。因此，目前仍有需要获得具有相对高效力或活性并且是口服可生物利用的作为端粒酶抑制剂的化合物，以及治疗癌症和异常存在端粒酶活性的其它疾病的组合物和方法。

本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸化合物是酸稳定的，因此作为有害的端粒酶活性的抑制剂有许多有价值的用途，如治疗人类癌症。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的药物组合物可用于治疗方案中，以体内抑制癌细胞，或者可用于来自体内(ex vivo)癌细胞。因此，本发明提供了治疗癌症的治疗化合物和组合物，以及治疗哺乳动物(例如牛、马、绵羊、小公牛、猪和兽医动物如猫及狗)的癌症。另外，本发明的氨基磷酸酯寡核苷酸也可用于治疗其它端粒酶介导的状态或疾病，如其它过度增生或自身免疫疾病。

如上所述，细胞的永生化特别涉及端粒酶的活化。更具体地，端粒酶活性与许多肿瘤细胞系保持永生的能力之间的联系已通过端粒酶活性分析被证实(Kim等，文献同上)。这一分析，连同表明端粒长度的缩短在正常细胞中可提供复制衰老信号的数据(见PCT申请93/23572)证实抑制端粒酶活性可以是有效的抗癌疗法。因此，端粒酶活性可通过防止端粒长度的正常缩短以及在许多次细胞分裂后在正常体细胞中发生的细胞复制的同时停止而防止正常复制衰老的开始。在癌细胞中，当恶性表型是由于细胞周期的丧失或生长控制或其它遗传损伤所致时，端粒酶活性的缺失使得细胞分裂期间端粒DNA丧失，导致染色体重排和异常，由此最终导致细胞死亡。但是，在具有端粒酶活性的癌细胞中，在细胞分裂期间端粒DNA不丧失，由此使癌细胞变得永生化，导致患者预后不良。能抑制肿瘤细胞中的端粒酶活性的制剂对于各种癌症和其中具有端粒酶活性的永生细胞是疾病进程的因素或者其中端粒酶活性的抑制是治疗目的所需的其它病症(如真菌感染)提供了治疗益处。本发明的端粒酶抑制剂也可用于在种系细胞中抑制端粒酶活性，其可用作避孕目的。

另外，应理解的是治疗癌症的治疗益处可通过将本发明的端粒酶抑制剂与其它抗癌剂结合而实现，所述其它抗癌剂包括端粒酶的其它抑制剂，如美国专利5,656,638，5,760,062，5,767,278，5,770,613和5,863,936所述。这种结合的选择基于各种因素，包括但不限于疾病类型、患者年龄和总的健康状况、疾病进程的攻击性、待治疗的疾病细胞的TRF长度和端粒酶活性以及患者对包含该结合的制剂的耐受能力。例如，如果肿瘤进程已到达高度状态，推荐将本发明的端粒酶抑制化合物与有效降低肿瘤大小的其它制剂和治疗方案(例如放射、手术、化疗和/或激素治疗)结合。另外，在某些情况下推荐将本发明的端粒酶抑制剂与一或多种治疗疾病的副作用的制剂如止痛剂结合，或者与有效刺激患者自身免疫应答的制剂(例如集落刺激因子)结合。

如下所述，本发明的化合物证实具有体内针对端粒酶活性的抑制活性。本发明的体外活性已用本文所述方法证实。本文所用术语“体外”是指用组织培养的活细胞进行的试验。这种程序也已知为“来自体内(ex vivo)”。

本部分描述的寡核苷酸端粒酶抑制剂典型地包括与端粒酶RNA成分互补的序列。人端粒酶RNA成分的序列见美国专利5,776,679。其它物种的端粒酶RNA成分也可使用，这取决于意欲治疗的个体。

通常，寡核苷酸包括10-100个特异于端粒酶的核苷酸(即它们与端粒酶RNA成分在低浓度或更高严格性条件下杂交，所述更高严格条件是相对于其与其它RNA酶成分或预计在靶细胞或治疗旁观者细胞中存在并有功能活性的其它RNA分子的杂交条件而言)。所述寡核苷酸包括约10-25个核苷酸，实施例中举例示出了12-15个核苷酸的寡核苷酸。在许多情况下，寡核苷酸应精确与端粒酶RNA中相同长度的连续序列互补。但是，应理解的是即使当寡核苷酸中有错配残基或间隙或添加时，特别是当RNA中的相应互补序列长度超过15个核苷酸时，杂交仍可以是特异性的。

用于鉴别具有抑制端粒酶活性的特异序列的本发明的硫代氨基磷酸酯多核苷酸的一种方法涉及将细胞、组织或优选地含有端粒酶的细胞提取物或其它制备物与几种已知浓度的与端粒酶的RNA成分互补的硫代磷酸酯寡核苷酸在端粒酶活性相容的缓冲液中接触，测定每一浓度的硫代氨基磷酸酯多核苷酸的端粒酶活性。在给予端粒酶抑制剂之前或之后，可用标准试剂和方法确定端粒酶活性。例如，培养细胞中的端粒酶活性可用TRAP活性分析测定(Kim等，科学266：2011，1997；Weinrich等，自然遗传学17：498，1997)。下述分析试剂盒可商购用于研究目的：TRAPezeXK端粒酶检测试剂盒(目录s7707；Intergen公司，NY)；TeloTAGGG端粒酶PCR ELISAplus(目录2，013，89；Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)。

所述多核苷酸的IC₅₀(即样品制备物的观察活性降低至其原始或对照值的一半时的多核苷酸浓度)用标准技术确定。基于本文所述内容，本领域技术人员显而易见的是可以采用确定本发明的化合物针对端粒酶的抑制浓度的其它方法。

使用上述方法，测定本发明的几种硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的IC₅₀值，发现其低于10nM(见表2，实施例6)。

预计用互补于端粒酶的RNA成分的硫代氨基磷酸酯多核苷酸治疗恶性疾病能诱导端粒酶阳性细胞系发生转变。用硫代磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO：2处理自发永生化的HME50-5E人乳腺上皮细胞导致对端粒酶活性的抑制，如通过端粒长度降低所证实(见实施例6和图4)。用互补于端粒酶的RNA序列成分的本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸处理其它端粒酶阳性细胞系如HEK-293和HeLa细胞也预计诱导处理的细胞中端粒长度的降低。

本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸也预计在人肿瘤细胞系如卵巢肿瘤细胞系OVCAR-5和SK-OV-3中在细胞分裂期间诱导端粒缩短。但是重要的是，在用作对照的正常人细胞如成纤维细胞来源的BJ细胞中，观察到的端粒长度的降低预期与用对照物质例如与互补端粒酶RNA靶有至少一个单碱基错配的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸处理的细胞没有不同。本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸还预期能证实在低于20μM浓度在正常细胞中没有明显的细胞毒性作用。

另外，本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸对端粒酶RNA的特异性可通过进行杂交试验并将其针对端粒酶和其它已知具有重要RNA成分的酶如ribonucleoase P的活性(IC₅₀)进行比较。具有与所筛选的其它酶的IC₅₀值相比较低的针对端粒酶的IC₅₀值的化合物据认为具有对端粒酶的特异性。

也可用小鼠异种移植模型例如将OVCAR-5肿瘤细胞移植至裸鼠上的模型进行体内测试，其中用本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸治疗的小鼠预期具有的肿瘤质量在起始剂量后的一段时间平均会增加，但随着持续治疗质量会开始下降。相反，用对照(例如与互补端粒酶RNA靶具有至少一个单碱基错配的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸)治疗的小鼠预期其肿瘤质量持续增加。

本领域熟练技术人员从上述描述应理解本发明还提供了选择涉及给予本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的治疗方案的方法。对于这种目的，可能有利的是进行一末端限制片段(TRF)分析，该分析中通过用特异于非端粒(T₂AG₃)_N序列的序列的限制酶消化而分析来自肿瘤细胞的DNA。消化DNA后，进行凝胶电泳以根据大小分离限制片段。随后用特异于端粒序列的核酸探针探查分离的片段，以确定含有样品细胞的端粒DNA的末端片段的长度。通过测量端粒DNA的长度，可以估计端粒酶抑制剂应给予多长时间，以及是否还应该采用其它治疗方法(例如手术、化疗和/或放疗)。另外，在治疗期间，可以测试细胞以确定是否随着渐进细胞分裂发生端粒长度降低，以证实治疗效果。

因此，在一个方面，本发明提供了可作为抗癌斗争中重要武器以抗表达端粒酶的恶性，肿瘤如皮肤、结缔组织、脂肪、乳腺、肺、胃、胰腺、卵巢、宫颈、子宫、肾、睾丸、结肠、前列腺、中枢神经系统(CNS)、视网膜和循环系统肿瘤(如白血病和淋巴癌)的化合物。特别是，本发明的硫代氨基磷酸酯多核苷酸可提供治疗许多(如果不是大多数)恶性的高度通用方法，如用具有端粒酶活性的高变人肿瘤细胞系和肿瘤所证实的那样。更重要地，本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可提供高度有效区分恶性和正常细胞的疗法，从而避免大多数目前通用的化疗方案所存在的危害性副作用，目前通用的化疗方案基于无区别性杀死分裂细胞的药剂。B.其它反义应用

反义治疗涉及给予结合位于细胞内的靶核酸(典型地为RNA分子)的外源寡核苷酸。用反义这一术语是因为所述寡核苷酸典型地于编码细胞产物的mRNA分子(“有义链“)互补。

本文所述硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用于反义抑制基因表达(Matsukura等，美国科学院院报86：4244-4248，1989；Agrawal等，美国科学院院报86：7790-7794，1989；Zamecnik等，美国科学院院报83：4143-4146，1986；Rittner and Sczakiel，核酸研究19：1421-1426，1991；Stein and Cheng，科学261：1004-1012，1993)。含有N3′→P5′硫代氨基磷酸酯连键的寡核苷酸对于大量医学显著的靶均有治疗应用，包括但不限于抑制癌细胞增殖和干扰传染性病毒。N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用于兽医和人的应用。本发明的寡核苷酸的高度酸稳定性及其在低浓度有效作为反义分子的能力(见下述)使得这些寡核苷酸作为治疗反义剂是高度希望的。

反义剂典型地需要持续结合所有靶RNA从而失活这些靶RNA分子或者提供内源性核糖核酸酶H(Rnase H)活性的底物。由本发明方法产生的RNA/寡核苷酸复合物对Rnase H消化的敏感性可通过标准方法评价(Donia等，生物化学杂志268：14514-14522，1993；Kawasaki等，医用化学杂志36：831-841，1993)。

本发明的化合物和方法相对于更传统的反义剂有若干优点。首先，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸与相应磷酸二酯寡核苷酸能更强地结合RNA靶。第二，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸抗酸性条件的降解的能力更强。第三，在化合物的细胞摄入中，不带电的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸骨架比带电的寡核苷酸能更有效地使氨基磷酸酯寡核苷酸进入细胞。

另外，当RNA由双螺旋靶序列的大部分为嘌呤的链编码时，靶向该双螺旋的氨基磷酸酯类似物寡核苷酸还具有失活DNA的潜力，即失活单链和双链形式的病原体的能力(见下述反基因治疗的讨论)。

序列特异性硫代氨基磷酸酯寡核苷酸分子对于以某种方式涉及RNA的几乎任何疾病或症状均是潜在的强治疗剂。这种序列可被靶向而进行治疗应用的举例模式包括：

a)靶向表达参与感染因子如细菌、病毒、酵母和其它真菌的繁

  殖和/或保持的产物的RNA序列，例如由感染因子编码的

  特异mRNA；

b)形成双螺旋分子，从而诱导RNA的裂解(例如，RNA/DNA

  杂合双螺旋分子的Rnase H裂解)；

c)阻断蛋白质与RNA序列的相互作用(例如，TAT和TAR的

  相互作用，见下述)；和

d)靶向导致细胞基因的不适当表达或增殖的序列：例如，与细

  胞周期调节；炎性过程；平滑肌细胞(SMC)增殖、迁移和

  基质形成(Liu等，循环79：1374-1387，1989)；某些遗传病

  和癌症相关的基因(原癌基因)。

在一个实施方案中，不适当表达的细胞基因的翻译或RNA加工被阻断。举例性的潜在靶序列是原癌基因，例如包括但不限于下述基因：c-myc，c-myb，c-fos，c-kit，ras，和BCR/ABL(例如，Wickstrom编辑的《癌症和AIDS的反义核酸治疗的前景》，Wiley-Liss，纽约，1991；Zalewski等，循环研究，88：1190-1195，1993；Calabretta等，癌症生物学研讨会3：391-398，1992；Calabretta等，癌症治疗综述19：169-179，1993)，原癌基因(例如，p53，Bayever等，反义研究和发育3：383-390，1993)和病毒基因(例如，乳多空病毒，Cowsert等，Antimicrob.Agents and Chemo 37：171-177，1993；单纯疱疹病毒，Kulka等，抗病毒研究20：115-130，1993)。增生反义治疗的另一种合适靶是端粒酶的蛋白质成分(见WO99/50279)，其是端粒酶表达中的限制成分。人端粒酶逆转录酶的序列在美国专利6,093,809，WO98/14592和pGRN121(ATCC登录号209016)中提供。进一步的举例是，可被本发明方法靶向的HIV-1蛋白的两个RNA区是REV-蛋白应答元件(RRE)和TAT-蛋白反式激活应答元件(TAR)。REV活性需要存在位于HIV包膜基因中的REV应答元件(RRE)(Malim等，自然338：254-257，1989；Malim等，细胞58：205-214，1989)。

RRE已被定位于一个据信形成4个茎-环结构和1个分支茎环结构的234个核苷酸的区域(Malim等，自然338：254-257，1989)。得自足迹研究的数据(Holland等，病毒学杂志64：5966-5975，1990；Kjems等，美国科学院院报88：683-687，1991)提示REV与RRE的一个茎结构中的6个碱基对结合，并与一相邻茎环结构的3个核苷酸结合。茎-环II中的约40个核苷酸的最小REV结合区已由Cook等鉴别(核酸研究，19：1577-1583)。这一结合区可以是根据本发明方法使用一或多个硫代氨基磷酸酯寡核苷酸而产生RNA/DNA双螺旋的靶(例如，Li等，病毒学杂志67：6882-6888，1993)。

HIV-1 TAT对于病毒复制是重要的，并且是长末端重复(LTR)介导的病毒基因表达的强反式激活物(Dayton等，细胞44：941-947，1986；Fisher等，自然320：367-371，1986)。由TAT蛋白诱导的反式激活需要存在TAR元件(见美国专利5,837,835)，该元件位于病毒mRNA元件的非翻译5′末端。

TAR元件能形成稳定的茎-环结构(Muesing等，细胞48：691-701，1987)。TAR茎上的茎和3核苷酸(nt)凸起的完整性已被证实是TAT蛋白与TAR元件的特异和高亲和性结合所需的(Roy等，基因发育4：1365-1373，1990；Cordingley等，美国科学院院报87：8985-8989，1990；Dingwall等，美国科学院院报86：6925-6929，1989；Weeks等，科学249：1281-1285，1990)。这一区域可以根据本发明方法而被靶向进行反义治疗。

除了导向REV，RRE和TAT蛋白的RNA结合位点，REV和TAT蛋白本身的RNA编码序列可以被靶向以阻断蛋白质的表达。

指导结合潜在反义靶位点的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的起始筛选典型地包括测试所得RNA/DNA双螺旋的热稳定性。当鉴别了结合选定的RNA靶序列的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸时，进一步测试该寡核苷酸在体外对RNA功能的抑制。使用细胞培养分析系统进行这种体外分析(例如，单纯疱疹病毒，Kulka等，抗病毒研究20：115-130，1993；HIV-1，Li等，病毒学杂志67：6882-6888，1993，Vickers等，核酸研究19：3359-3368，1991；在再狭窄中的冠状平滑肌细胞增殖，Zalewski等，核酸研究15：1699-1715，1987；IL-2R，Grigoriev等，美国科学院院报90：3501-3505，1993；c-myb，Baer等，血液79：1319-1326，1992；c-fos，Cutry等，生物化学杂志264：19700-19705，1989；BCR/ABL，Szczylik等，科学253：562-565，1991)。C.反基因应用

以前已证实经三螺旋形成对基因表达的抑制(Cooney等，科学241：456-459，1989；Orson等，核酸研究19：3435-3441，1991；Postel等，美国科学院院报88：8227-8231，1991)。当采用第三条链硫代氨基磷酸酯类似物寡核苷酸时形成的三螺旋结构的稳定性增加提供了反基因应用如兽医和人类治疗应用的更强的工具。

靶区域的选择基于已知序列用三螺旋形成的基本规则进行选择(Helene和Toulme，生物化学生物物理学报1049：99-125，1990)。典型地，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸序列定向于双链基因序列，其中一条链主要含有嘌呤，另一条链主要含有嘧啶。

用条带移位分析测试本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸与选定的双螺旋靶序列形成三螺旋形成的能力(例如参见美国专利5,726,297，实施例4)。典型地，用高百分比聚丙烯酰胺凝胶进行条带移位分析，并将变性条件的水平(Ausubel等，分子生物学当前方案，John Wileyand Sons，Inc.，Media Pa.；Sauer等编辑，酶学方法：蛋白质/DNA相互作用，学术出版社，1991；Sambrook等，分子克隆实验手册，冷泉港出版社，第2卷，1989)被调节以降低任何非特异背景结合。

双螺旋靶被标记(例如，用放射性核苷酸标记)并与第三条链寡核苷酸混合，以测试该寡核苷酸与靶双螺旋形成三螺旋结构的能力。标记的双螺旋寡核苷酸迁移率的移位指示该寡核苷酸形成三螺旋结构的能力。

在条带移位分析中三螺旋形成以标记的三螺旋结构相对于标记的双螺旋结构在凝胶中的降低的迁移率指示。

通过这一方法可评价许多潜在靶位点，包括选自长度和复杂性变化的全范围DNA序列的靶位点。序列特异性硫代氨基磷酸酯类似物结合分子是用于以某种方式涉及DNA的几乎任何疾病或症状的潜在强治疗剂。这种治疗剂的举例性靶序列包括：a)参与感染因子如细菌、病毒、酵母和其它真菌的繁殖和/或保持的DNA序列，例如，破坏感染因子的代谢；和b)导致细胞基因如癌基因的不合适表达或增殖的序列，例如阻断或降低不合适表达的细胞基因(如与某些遗传病相关的基因)的转录。

基因表达或复制可以通过在所需的调控蛋白(或分子)已知结合的区域产生三螺旋结构而被阻断(例如，HIV转录相关因子如启动子起始位点和SP1结合位点，McShan等，生物化学杂志267：5712-5721，1992)。或者，基因(如癌基因)的蛋白质编码区内的特异序列也可以被靶向。

当通过上述凝胶条带移位迁移率分析鉴别与选定的双螺旋靶序列测试结合的硫代氨基磷酸酯类似物寡核苷酸时，进一步测试该类似物体外形成稳定三螺旋结构的能力。使用如美国专利5,631,135所述的细胞培养和体内分析系统。

靶位点可以在基因的控制区，例如在转录起始位点或调控蛋白的结合区中选择(Helene and Toulme，1990；Birg等，1990；Postel等，1991；Cooney等，1988)。另外，可以选择靶位点以使靶也存在于mRNA序列(即转录的序列)中，使得针对该位点的寡核苷酸也作为反义介导物起作用(见上述)。

另外，硫代氨基磷酸酯修饰的DNA分子可以用于与第三条链靶(即单链核酸)产生三螺旋分子。例如，具有能与选定的第三条链靶分子形成三螺旋结构的两个区域的DNA分子可以被合成。典型地这两个区域通过柔性区连接，该柔性区使得这两个区域与第三条链结合形成三螺旋。

绞链区可包括任何柔性连键以保持两个三螺旋形成区在一起并使得它们与第三条链结合形成三螺旋。第三条链靶选择具有合适的嘌呤/嘧啶含量以使得三螺旋分子形成。

柔性连键可以根据靶的碱基序列以任何选定的方向连接两个三螺旋形成区(典型地，互补DNA链)。例如，两个三螺旋形成区每个均具有5′和3′末端，这些末端可通过柔性绞链区以下述方向连接：5′-3′，3′-5′，3′-3′，5′-5′。

另外，在每条链含有至少一个硫代氨基磷酸酯连键的双螺旋DNA分子可用作转录因子或DNA结合蛋白(例如，c-myb)的引诱分子。

单链DNA也可用作本发明的寡核苷酸的靶核酸，使用例如含硫代氨基磷酸酯亚单位间连键的发夹结构。两个硫代氨基磷酸酯类似物寡核苷酸可选择用于单链DNA靶介导结合。两个氨基磷酸酯类似物链与单链DNA靶的结合导致形成三螺旋。D.药物组合物

本发明包括用于反义和反基因治疗的药物组合物。该组合物包括有效量的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸与药物可接受载体的组合。一或多个N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸(具有不同的碱基序列或连键)可包括在任何给定的配方中。

N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸当用于治疗应用时，可以单独配制或添加药物载体而配制。药物载体可以是固体或液体。随后该配方以治疗有效剂量给予需要其的个体。

液体载体可用于制备溶液、乳液、悬液和加压组合物。N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸溶解或悬浮于药物可接受液体赋形剂中。用于肠道外给予N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸制剂的合适的液体载体的例子包括水(部分含有添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)及其衍生物，和油(例如分级分离的椰子油和花生油)。液体载体可以含有其它合适的药物添加剂，包括但不限于下述：加溶剂、悬浮剂、乳化剂、缓冲剂、增稠剂、色素、粘度调节剂、防腐剂、稳定剂和渗透压调节剂。

为了N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的肠道外给药，载体可以是油状酯如油酸乙酯和豆蔻酸异丙酯。无菌载体可用于无菌液体形式肠道外给药组合物。

无菌液体药物组合物、溶液或悬液可通过例如腹膜内注射、皮下注射、静脉内或局部而应用。例如，抗视网膜巨细胞病毒感染的反义寡核苷酸可通过眼药水局部给药。N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸也可以血管内给予或者例如，在气囊导管插入术期间通过用霉酚酸浸渍的血管stent给药以在损伤后立即提供局部抗再狭窄作用。

用于加压组合物的液体载体可以是卤代烃或其它药物可接受推进剂。这种加压组合物也可以压缩为液体以经吸入输送。对于鼻内或支气管内吸入或吹入给药，N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可被配制成水溶液或部分水溶液，然后可以气雾剂形式使用，例如用于治疗肺部感染如Pneumocystis carnii。

N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可以作为与含有活性化合物的药物可接受载体配制成的溶液、膏剂或洗剂而局部给药。例如，用于治疗生殖器疣。

N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可以在脂质体载体中给予。例如在美国专利4,897,355和美国专利4,394,448中描述了使用脂质体促进细胞吸收。许多出版物描述了脂质体配方和制剂。

用N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸进行治疗的剂量要求根据所采用的特定组合物、给药途径、表现的症状的严重性、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的形式以及待治疗的特定个体而变化。

为用作药物制剂中的活性成分，本发明的寡核苷酸通常从制备其的混合物中存在的其它反应性或潜在免疫原性成分中纯化出来。典型地，每种活性成分以至少约90％均质性、更优选95％或99％均质性提供，所述均质性百分比通过功能分析、色谱或凝胶电泳测定。随后活性成分根据制备药物制剂通用程序复合成药。

本发明的药物组合物可以作为配方以有效实现任何临床所需结果的量给予个体。对于治疗癌症，所需结果包括降低肿瘤质量(如通过触诊或成象，例如通过放射照相、CAT扫描或MRI)，降低肿瘤生长速率、降低转移形成速率(例如通过生物活检标本的组织化学分析)，降低生化标记(包括一般标记如ESR和肿瘤特异标记如血清PSA)，以及改善生活质量(如通过临床评价确定，例如Kamofsky评分)。对于治疗病毒感染，所需结果包括降低或消除感染、感染性颗粒形成或疾病相关症状的解除。

实现这些效果所需的每剂寡核苷酸量和剂量数可用体外测试和动物模型而实验确定(见实施例9)。用于测试的合适范围可以从用分离的端粒酶或培养细胞确定的50％抑制浓度估算。分离的端粒酶的制备物可通过美国专利5,968,506获得。典型地，对于与酶特异性靶RNA序列100％相同的12-15个核苷酸的稳定寡核苷酸而言，配方和给药途径将在疾病部位提供1μM-lnM之间的局部浓度。确定给药方案的最终责任取决于主管临床医生。

总之，N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸以提供有效结果同时不导致任何有害副作用的浓度(例如有效量)给药。这种浓度可通过给予单一单位剂量或给予分成方便的亚单位的剂量在每日合适间隔而施用。E.诊断应用

本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸也可用于诊断分析中以检测具有给定靶序列的RNA或DNA。在一种一般应用中，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸被标记(例如同位素或其它可检测报道基团)并用作结合于固体支持物(例如尼龙膜)的DNA或RNA样品的探针。

或者，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可与固体支持物(例如磁珠)结合，样品中的同源RNA或DNA分子与样品中的其它成分基于其与固定化氨基磷酸酯类似物的杂交而分离。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸与固体支持物的结合可通过常规方法进行。结合的RNA和DNA的存在可通过标准方法检测，例如用第二种标记的报道分子或聚合酶链反应(见美国专利4,683,195和4,683,202)。

诊断分析可以根据标准程序进行，需调整杂交条件以使硫代氨基磷酸酯寡核苷酸与靶区域杂交。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸在升高的温度结合的能力也有助于使硫代氨基磷酸酯寡核苷酸探针和诊断样品中存在的任何相应单链磷酸二酯寡核苷酸对靶序列的结合的竞争最小化。

设计用于杂交分析和本文描述的其它方案中的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可以包装成试剂盒形式。所述寡核苷酸提供在容器中，其典型地在适合长期贮存的缓冲液中存在，并任选地与用于进行反应的其它试剂、标准或对照一起提供。典型地，试剂盒也可包括将寡核苷酸用于杂交反应或诊断分析的说明书，其或者包装在产品中，或者在配送或出售试剂盒时提供文字材料。F.其它应用

在一个方面，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用于促进从样品中分离RNA或DNA的方法中。例如，如上所述，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可固定于固体支持物上并用于分离互补核酸序列，例如，从聚A级分纯化特异mRNA(Goldberg等，酶学方法68：206，1979)。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸在这类应用中是有利的，因为它们可与RNA和双螺旋DNA形成比标准磷酸二酯寡核苷酸所形成的更稳定的相互作用。

报道分子标记的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可在分子生物学中有大量应用，特别是用于检测样品中的RNA。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用放射性报道分子(³H，¹⁴C，³²P或³⁵S核苷)、生物素或荧光标记而标记(Gryaznov等，核酸研究20：3403-3409，1992)。标记的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用作例如RNA杂交反应的有效探针(Ausubel等，分子生物学当前方案，John Wiley and Sons，Inc.，Media，PA；Sambrook等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，第2卷，1989)。

另外，每一链含有至少一个硫代氨基磷酸酯连键的双链DNA分子可用于分离DNA-双螺旋结合蛋白。在这一实施方案中，含有硫代氨基磷酸酯亚单位间连键的双螺旋典型地固定于固体支持物上，随后将含有怀疑的结合蛋白的样品在促进蛋白质与其DNA靶结合的缓冲条件下通过该支持物。蛋白质典型地通过改变缓冲条件从柱中洗脱。

上述含有硫代氨基磷酸酯修饰的连键的三螺旋形成DNA分子还可用作诊断试剂，以例如检测样品中DNA分子的存在。

另外，含有具有N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚单位间连键的寡核苷酸的复合物可用于筛选有用的小分子或结合蛋白：例如，具有双螺旋DNA的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸复合物可用于筛选能进一步稳定三螺旋结构的小分子。用与单链DNA和RNA分子形成的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸复合物可进行类似筛选。G.改变

本发明方法所用硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的改变包括修饰以促进细胞对寡核苷酸的吸收(例如，添加胆固醇基元(Letsinger，美国专利4,958,013))；用亚单位间连键产生嵌合寡核苷酸(Goodchild，生物缀合物化学1：165-187，1990)；用嵌入剂修饰(例如，稳定三螺旋的嵌入剂，Wilson等，生物化学32：10614-10621，1993)；和使用核糖亚单位代替脱氧核糖亚单位。

进一步的修饰包括寡核苷酸5′和3′末端修饰(例如，--OH，--OR，--NHR，--NH₂和胆固醇)。另外，核糖2′位置可以是许多修饰的位点，包括但不限于卤代(例如，--F)。

N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸还可以通过与被特异细胞吸收的一多肽缀合而修饰。这种有用的多肽包括肽激素、抗原和抗体，例如多肽可以选自被癌细胞特异吸收的多肽，导致N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸被特异输送至该类型细胞。所述多肽和寡核苷酸可通过本领域已知方式偶联(参见例如PCT国际申请出版物PCT/US89/02363，WO8912110，1989年12月14日公开，Ramachandr，K.等人)。

当用于本发明方法时，这种修饰的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的性质可通过本文所述方法确定。

实施例1  一般方法

³¹P NMR谱在Varian 400Mhz分光计上获得。将³¹P NMR谱与85％磷酸水溶液进行校准。用Dionex DX 500色谱系统使用PharmaciaBiotech Mono Q HR 5/5或10/16离子交换柱进行阴离子交换HPLC。质谱分析由Mass Consortium，San Diego，CA进行。寡核苷酸的MALDI-TOF分析用具有延迟提取的PerSpective Biosystems VoyagerElite质谱仪获得。热解离实验在Cary Bio 100 UV-Vis分光计上进行。

除非另有说明，所有反应均在微波炉干燥的玻璃器皿中于氮气氛下进行。市售DNA合成试剂购自Glen Research(Sterling，VA)。无水吡啶、甲苯、二氯甲烷、二异丙基乙胺、三乙胺、乙酐、1，2-二氯乙烷和二恶烷购自Aldrich(Milwaukee，WI)。

所有非硫代氨基磷酸酯寡核苷酸用基于亚磷酰胺的偶联途径标准方案(Caruthers，Acc.Chem.Res.，24：278-284，1991)在ABI 392或394 DNA合成仪合成。寡核苷酸氨基磷酸酯合成的链组装循环如下：(i)脱三苯甲基化，3％三氯乙酸于二氯甲烷中，1分钟；(ii)偶联，0.1M亚磷酰胺和0.45M四唑于乙腈中，10分钟；(iii)加帽，0.5M异丁酐于THF/二甲基吡啶中，1/1，v/v，15秒；和(iv)氧化，0.1M碘于THF/吡啶/水中，10/10/1，v/v/v，30秒。

该循环的化学步骤之后进行乙腈洗涤，并用干态氩冲洗0.2-0.4分钟。从支持物上裂解、除去碱及氨基磷酸酯保护基团通过用氨水/EtOH，3/1，v/v，在55℃处理6个小时而实现。将寡核苷酸真空干燥浓缩，之后通过用1M TBAF于THF中在25℃处理4-16小时而除去2′-叔丁基二甲基甲硅烷基团。用水稀释反应混合物，并通过0.45尼龙acrodisc(购自Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)过滤。然后经IE HPLC分析和纯化寡核苷酸，并在Pharmacia NAP-5或NAP-25柱上用凝胶过滤最终脱盐。IE HPLC的梯度条件为：溶剂A(10mM NaOH)，溶剂B(10mM NaOH和1.5M NaCl)；溶剂A 3分钟，然后线性梯度0-80％溶剂B 50分钟。实施例2  阿拉伯糖-氟寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的合成

寡聚-2′-阿拉伯糖-氟核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的固相合成基于亚磷酰胺转移反应，采用单体构件3′-MMT-保护的-3′-氨基-2′-阿拉伯糖-氟核苷酸的5′-(O-氰乙基-N，N′-二异丙基氨基)-亚磷酰胺。所述核苷单体的制备见方案4。

糖前体1(来自Pfanstiehl)转化成保留糖C-1构象的α-1-溴中间体2。化合物2随后不经分离而使用，与甲硅烷化尿嘧啶和胸腺嘧啶碱基一起进行S_N2型糖基化反应，产生核苷3。糖基化反应的立体选择性非常高，超过90％形成的核苷3具有希望的β-端基异构构象，这是由反应混合物的¹H NMR分析判断的。核苷3的纯β-异构体通过从乙醇结晶而分离。随后，3的5′-和3′-O-苯甲酰保护基团通过用甲醇化氨水处理而以近定量产量除去。得到的含有5′-，3′-羟基基团的核苷产物随后在Mitsunobu反应条件下转化成2，3′-无水核苷4。用叠氮化锂处理2，3′-无水核苷得到关键的3′-叠氮基前体5。这一化合物通过将3′-叠氮基氢化还原成3′-氨基，随后经3′-三苯甲基化，5′-O-脱保护和5′-O-亚磷酰基化而转化成亚磷酰胺7t，u。胞苷亚磷酰胺7c用尿嘧啶至胞嘧啶转化方法得自所述3′-叠氮基前体。基于起始糖前体1，亚磷酰胺7c，t，u的总产量在8-12％范围内。单体的结构经¹H，³¹P，¹⁹F NMR和质谱分析证实。使用2′-阿拉伯糖-氟核苷酸单体的寡核苷酸合成随后如下所述在自动化DNA/RNA ABI 394合成仪上进行。实施例3  寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的合成

在ABI 394合成仪上经亚酰胺(amidite)转移反应制备寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯。完全保护的单体构件是3′-氨基三苯甲基核苷-5′-(2-氰乙基-N，N′-二异丙基)亚磷酰胺，其中核苷是3′-脱氧胸苷，2′，3′-二脱氧-N²-isobutyryl鸟苷，2′，3′-二脱氧-N⁶-苯甲酰腺苷或2′，3′-二脱氧-N⁴-苯甲酰胞苷。5′-琥珀酰基-3′-氨基三苯甲基-2′，3′-二脱氧核苷与含有氨基的长链可控孔径玻璃(LCAA-CPG)偶联并用作固体支持物。合成以5′至3′方向进行。使用下述方案组装寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯：(i)去三苯甲基化，3％三氯乙酸于二氯甲烷中；(ii)偶联，0.1M亚磷酰胺和0.45M四唑于乙腈中，25秒；(iii)加帽，异丁酐/2，6-/二甲基吡啶/THF 1/1/8 v/v/v作为帽A，和标准帽B溶液；和(iv)硫化，15％ S₈于含有1％三乙胺的二硫化碳中，1分钟。在硫化步骤之前和之后，用纯二硫化碳洗柱以防止元素硫沉淀。寡核苷酸硫代氨基磷酸酯用浓氨水从固体支持物上裂解并脱保护。经HPLC分析和纯化化合物。用pH12(10mM NaOH)的DIONEXDANPac^TM离子交换柱使用10mM NaOH于1.5M NaCl中1％/分钟线性梯度和1ml/min流速进行离子交换(IE)HPLC。产物在SephadexNAP-5凝胶过滤柱(Pharmacia)上脱盐并真空冻干。³¹P NMR实验在氧化氘中进行以分析硫化分析程度(³¹P NMRδ，ppm 58，60宽信号Rp，Sp异构体)。

寡核苷酸硫代氨基磷酸酯5′-GTTAGGGTTAG-3′(SEQ IDNO：1)以下述方式合成：用3′-三苯甲基氨基-2′，3′-二脱氧-N⁶-苯甲酰腺苷(N²-isobutyryl鸟苷和胸苷)5′-(2-氰乙基-N，N-二异丙基)亚磷酰胺的0.1M溶液起始ABI 394型合成仪。用纯二硫化碳填充10号工作站的试剂瓶，并用在含1％三乙胺的二硫化碳中的15％S₈溶液填充15号试剂瓶。用市售的在乙腈中的0.45M四唑溶液作为活化剂。帽A溶液(11号工作站)用四氢呋喃/异丁酐/2，6-二甲基吡啶8/1/1 v/v/v溶液替换，帽B也是市售试剂。创建一新功能以将二硫化碳从10号工作站输送至柱中。默认的硫合成循环以下述方式修改：硫化时间设为1分钟，在硫化之前和之后将二硫化碳送至柱20秒。合成柱用1μmole固体支持物N²-isobutyryl-3′-(三苯甲基)氨基-2′，3′-二脱氧鸟苷-5′-琥珀酰加载的CPG(可控孔径玻璃)填充。化合物的序列计划为GATTGGGATTG(5′→3′)(SEQ ID NO：11)。在合成结束时除去三苯甲基基团并用二硫化碳和乙腈手工洗柱。从柱中取出固体支持物并在一密封玻璃瓶中用1ml浓氨水在55℃处理6小时。过滤后，蒸发掉大部分氨水，并用Sephadex NAP-5凝胶过滤柱(Pharmacia)脱盐并真空冻干。如上所述分析和纯化产物。表2中列出的所有其它硫代氨基磷酸酯寡核苷酸(SEQ ID NO：2-4)用上述方法合成。实施例4  寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的酸稳定性和双螺旋形成性质

寡核苷酸硫代氨基磷酸酯令人意外地证实相对于氨基磷酸酯相应物具有增加的酸稳定性。人们可能预期用硫取代核苷酸间连锁基团的非桥氧应导致氨基磷酸酯的酸稳定性下降，因为硫对氧的电子给体性质的差异应使得3′-NH的质子化更容易。但是，与这一预期相反，发现硫代氨基磷酸酯核苷酸间连键比其氧-氨基磷酸酯对应物更加对酸稳定。

根据IE HPLC分析(见表1)，硫代氨基磷酸酯TAG₃T₂AGACA₂(SEQ ID NO：2)及其氨基磷酸酯对应物在40％乙酸水溶液中于室温的半寿期分别约为6小时和0.5小时。另外，硫代氨基磷酸酯和其氨基磷酸酯对应物之间水解产物的组成是不同的。硫代氨基磷酸酯的酸水解似乎最初导致脱硫化，而非在氨基磷酸酯中发生的核苷间N-P基团的裂解。这些结果表明硫代氨基磷酸酯对酸性条件的抗性比氨基磷酸酯寡核苷酸高许多，因此说明这一类新硫代氨基磷酸酯寡核苷酸与其它氨基磷酸酯寡核苷酸相比具有开发口服寡核苷酸治疗剂的增加的潜力。

                      表1实验  寡聚物         类型² Tm，℃^b -Tm，℃^c 酸稳定性^d1     GTTAGGGTTAG    po     44.2        -

  SEQ ID NO：12     TAGGGTTAGACAA  po     45.2        -

  SEQ ID NO：23     同实验1        np     72.1       27.94     同实验2        np     71.7       26.5      0.5hr5     同实验1        nps    71.5       27.36     同实验2        nps    70.0       24.8      6hr^apo，np，nps分别相应于磷酸二酯、N3′→P5′氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯基团；^b在150mM NaCl，10mM磷酸钠缓冲液pH7.4中与互补天然RNA寡聚物形成的双螺旋的熔解温度Tm(±0.5℃)；^c相对于天然磷酸二酯对应物的Tm的增加；^d寡核苷酸在40％乙酸水溶液中于室温的半寿期。

寡核苷酸氨基磷酸酯与互补RNA链形成双螺旋的性质用热解离实验评价，结果见表1。数据示出寡核苷酸硫代氨基磷酸酯形成比等序列天然磷酸二酯寡聚物明显更稳定的复合物，其中每个寡聚物Tm差异在约25-27℃。另外，双螺旋热稳定性的增加与在氨基磷酸酯寡聚物中观察到的类似。这表明用硫原子取代在核苷间氨基磷酸酯基团中的非桥氧不会明显改变这些化合物的RNA结合性质，这是用3′-氨基核苷的N-型糖折叠及糖-磷酸骨架水合增加而确定的。实施例5  具有端粒酶活性的亲和纯化的提取物的制备

用于筛选端粒酶抑制剂的提取物从过表达端粒酶蛋白催化亚基(hTERT)的293细胞常规制备。发现这些细胞具有比亲代293细胞多2-5倍的端粒酶活性。将200ml收集细胞(从100升培养物收获)悬浮在等体积低渗缓冲液(10mM Hepes pH7.9，1mM MgCl₂，1mMDTT，20mM KCl，1mM PMSF)中并用dounce匀浆器裂解。将甘油浓度调整至10％并缓慢加入NaCl使终浓度为0.3M。搅拌裂解的细胞30分钟，然后在100000xg沉淀1小时。向S100上清中加入固体硫酸铵直至42％饱和度。离心该物质；将沉淀重悬于1/5原始体积中并对含有50mM NaCl的缓冲液A透析。透析后，在25000xg离心提取物30分钟。在亲和层析之前，加入Triton X-100^TM(0.5％)，KCl(0.3M)和tRNA(50μg/ml)。向提取物中加入亲和寡聚物(5′生物素TEG-生物素TEG-生物素TEG-GTA GAC CTG TTA CCA guuagg guu ag 3′[SEQ ID NO：5]；小写字母表示2′O-甲基核糖核苷酸，大写字母表示脱氧核苷酸)(每10ml提取物加入1nmol)。在30℃保温10分钟后，加入Neutravidin珠(Pierce；250μl 50％悬液)并将混合物在4℃旋转过夜。沉淀珠并用含0.3M KCl的缓冲液B洗3次，用含有0.6M KCl的缓冲液B洗2次，用含有0.3M KCl的缓冲液B再洗2次。在含有0.3M KCl，0.15％ Triton X-100^TM和2.5摩尔过量的置换寡聚物(每125μl收集的Neutravidin珠用0.5ml 5′-CTAACC CTA ACT GGT AAC AGG TCT AC-3′[SEQ ID NO：6])的缓冲液B中在室温洗脱端粒酶30分钟。进行第二次洗脱并与第一次合并。纯化的提取物典型的比活为10fmol掺入的核苷酸/min/μl提取物，或200个核苷酸min/mg总蛋白。

 缓冲液A 缓冲液A 20mM Hepes pH7.9 20mM Hepes pH7.9 1mM MgCl₂ 1mM EDTA 1mM DTT 1mM DTT1mM EGTA10％甘油10％甘油0.5Triton X-100^TM实施例6  寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯对端粒酶的抑制

用下述缓冲溶液建立3个独立的100μl端粒酶分析：50mM Tris乙酸，pH8.2，1mM DTT，1mM EGTA，1mM MgCl₂，100mM乙酸钾，500μM dATP，500μM TTP，10μM[³²P]dGTP(25Ci/mmol)和100nMd(TTAGGG)₃[SEQ ID NO：7]。向各个反应中加入2.5、5或10微升亲和纯化的端粒酶(见实施例4)并将反应在37℃保温。在45和90分钟，从每个反应中取40微升样品并加入160微升终止缓冲液(100mM NaCl，10mM焦磷酸钠，0.2％SDS，2mM EDTA，100μg/mltRNA)。加入10微升三氯乙酸(TCA)(100％)，并将样品在冰上保温30分钟。样品在微离心机中沉淀(12000xg离心力)15分钟，沉淀用1ml 95％乙醇洗并在微离心机(12000xg离心力)中再次沉淀5分钟。将沉淀重悬于50微升蒸馏水中并转移至含有2.5ml 5％TCA和10mM焦磷酸钠的冰冷溶液的12×75玻璃试管中。将样品在冰上保温30分钟。将样品在真空过滤歧管上经2.5cm湿(蒸馏水)GFC膜(S&S)过滤。在真空下用5ml冰冷1％TCA洗滤膜3次并用5ml 95％乙醇洗1次。干燥滤膜并用闪烁液在闪烁计数器中计数。掺入的fmol核苷酸是用放射性追踪剂的比活确定的。基于掺入的dNTP计算提取物的活性并表示为fmol dNTP/min/μl提取物。

                 端粒酶活性分析Bio-Tel FlashPlate分析

提供了一种检测和/或测量端粒酶活性的分析法，其是通过测定由端粒酶催化的反应即TTAGGG端粒重复添加至生物素化端粒酶底物引物上而进行。生物素化产物在链亲和素包被微滴板中捕获。用³³P标记的互补于3.5个端粒重复的寡核苷酸探针被用于测量端粒酶产物，如下所述。通过洗涤除去未结合的探针并用闪烁计数确定与捕获的端粒酶产物退火的量。方法：I.硫代氨基磷酸酯寡核苷酸作为浓缩原料贮存并在PBS中溶解。II.为进行测试，在PBS中将硫代氨基磷酸酯寡核苷酸稀释成15X工作原液，并将2微升分配于96孔微滴皿的两个孔中(双份分析)。III.在端粒酶稀释缓冲液中将端粒酶提取物稀释至比活为0.04-0.09fmol掺入的dNTP/min/μl，将18微升加至每一样品孔中以与化合物在室温预保温30分钟。IV.通过向含有端粒酶提取物和待测寡核苷酸化合物的孔中加入10微升Master Mix而起始端粒酶反应，将板密封并在37℃保温90分钟。V.通过加入10微升HCS终止反应。VI.将25微升反应混合物转移至96孔链亲和素包被的FlashPlate^TM(NEN)中，并温和振荡于室温保温2小时。VII.用180微升2×SSC不经保温洗孔3次。VIII.在闪烁计数器中检测与生物素化端粒酶产物退火的探针量。缓冲液端粒酶稀释缓冲液

50mM Tris-乙酸，pH8.2

1mM DTT

1mM EGTA

1mM MgCl₂

830nM BSAMaster Mix(MM)

50mM Tris-乙酸，pH8.2

1mM DTT

1mM EGTA

1mM MgCl₂

150mM乙酸钾

10μM dATP

20μM dGTP

120μM dTTP

100nM生物素化引物(5′-生物素-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)[SEQ ID NO：8]

5.4nM标记的探针[5′-CCCTAACCCTAACCCTAACC-(³³P)A_1-50-3′][SEQ ID NO：9]；比活约为10⁹cpm/μg或更高杂交捕获溶液(HCS)

12×SSC(1×＝150mM NaCl/30mM柠檬酸三钠)

40mM EDTA

40mM Tris-HCl，pH7.0

用上述分析，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2代表的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸示出具有低于1.0nM的端粒酶IC₅₀值(见表2，实验1和3)。

                            表2

       寡聚物作为端粒酶抑制剂与氨基磷酸酯的比较评价

实验    寡核苷酸IC₅₀(nM)氨基磷酸酯  IC₅₀(nM)硫代氨基磷酸酯    1234 5′-GTTAGGGTTAG-3′SEQ ID NO：15′-GTTGAGTGTAG-3′SEQ ID NO：35′-TAGGGTTAGACAA-3′SEQ ID NO：25′-TAGGTGTAAGCAA-3′SEQ ID NO：4    1.910001.641000    0.89177.40.4179.3

寡核苷酸序列2(SEQ ID NO：3)是实验1所用寡核苷酸(SEQ IDNO：1)的错配对照。类似地，寡核苷酸序列4(SEQ ID NO：4)是实验3所用寡核苷酸(SEQ ID NO：2)的错配对照。

表2中的端粒酶抑制数据示出本发明的硫代氨基磷酸酯多核苷酸相对于对应的氨基磷酸酯寡核苷酸其抑制端粒酶活性高约2-3倍。因此，本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸不仅在端粒酶抑制分析中比其氨基磷酸酯对应物更有活性，而且比其具有更高的抗酸性。这些特征的组合使本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸比氨基磷酸酯多核苷酸具有重要的优越性。实施例7  硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的抗肿瘤活性来自体内(exvivo)研究

a.在肿瘤细胞中降低端粒长度

用标准方法和材料制备人乳腺上皮细胞的集落(自发永生化)。通过以每皿约10⁶个细胞接种15厘米培养皿而制备集落，将培养皿保温以使细胞集落生长至约80％铺满，此时将每个集落分成2组。在分组后铺板，之后一组与亚急性剂量的预定浓度(例如约100nM-20μM之间)的硫代氨基磷酸酯多核苷酸SEQ ID NO：2接触，第二组类似地与错配对照寡核苷酸SEQ ID NO：4接触。

使每组细胞继续分裂，各组再次平均分割(接近铺满)。接种相同数目的细胞以继续生长。每四天将测试硫代氨基磷酸酯寡核苷酸或对照寡核苷酸以最初输送的相同浓度加至样品。在一个实验中，细胞另外根据厂商指导用FuGENE6^TM(Boehringer-Mannheim)处理。FuGENE6^TM促进细胞对寡核苷酸的吸收。

通过用特异于非人端粒重复T2AG3序列的序列的限制酶消化细胞样品的DNA而确定端粒长度(TRF分析)用凝胶电泳标准技术经大小分离消化的DNA以确定端粒重复的长度，其在用端粒DNA探针探查后在凝胶上呈高分子量DNA(约2Kb-15Kb)扩散条带。图4和图5示出这种实验的样品。

图4的结果示出硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO：2是端粒酶活性的强体外抑制剂。在不存在FuGENE6^TM时，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO：2在1-20μM范围与HME50-5E细胞保温时诱导端粒长度大大降低。当细胞与FuGENE6和硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO：2共保温时，甚至在最低的测试浓度(100nM)端粒大小与对照细胞相比也降低。

图5结果示出具有序列CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：10)的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸是端粒酶活性的强体外抑制剂。当细胞与硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO：10共保温时，甚至在最低的测试浓度(1nM)端粒大小与对照细胞相比也降低。因此，本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸是永生化人乳腺上皮细胞中端粒酶活性的强体外抑制剂。

在另一实验中，HME50-5E细胞与SEQ ID NO：2和10的硫代氨基磷酸酯多核苷酸之一保温。错配寡核苷酸SEQ ID NO：4用作对照。所有多核苷酸采用上述方案以约0.1μM-20μM浓度使用。图6所示对细胞生长的数据表明在给予所测试的本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸后约100天，细胞进入衰老(即细胞功能停止)。

另外，用标准方法学进行的细胞的TRF分析(图7)示出所测试的本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可有效降低端粒长度。HME50-5E细胞与SEQ ID NO：2和10的硫代氨基磷酸酯多核苷酸之一保温。错配寡核苷酸SEQ ID NO：4用作对照。所有多核苷酸采用上述方案以约0.5μM浓度使用。在10、20、40和80天测量端粒长度。使用对照错配寡核苷酸的细胞的端粒长度在第90天测量，这一数据点作为终点。除了上述HME50-5E细胞外，这一分析可使用任何端粒酶阳性细胞系如HeLa细胞或HEK-293细胞进行。

b.特异性

通过用标准技术进行杂交试验或酶抑制分析筛选本发明的硫代氨基磷酸酯多核苷酸抗端粒酶和其它具有RNA成分的酶的活性(IC₅₀)。针对端粒酶的IC₅₀值低于针对所筛选的其它酶的IC₅₀值的寡核苷酸被认为具有端粒酶特异性。

c.胞毒性

用HME50-5E、Caki-1、A431、ACHN和A549细胞类型进行胞毒性细胞死亡(XTT)分析。分析中所用的细胞系在存在和不存在脂类的条件下与约1μM-100μM浓度的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO：2接触72小时。在这一期间，在540nm测定样品的光密度(OD)。针对各种细胞类型(如图8所示)的IC₅₀值通常低于1μM。因此，预计在低于约100μM浓度不能观察到明显胞毒性作用。应理解的是，除了对照细胞系如正常人BJ细胞外，其它肿瘤细胞系如卵巢肿瘤细胞系OVCAR-5和SK-OV-3也可用于确定胞毒性。胞毒性的其它分析法如MTT分析(参见Berridge等，生物化学4：14-19，1996)和alamarBlue^TM(美国专利5,501,959)也可使用。

优选地，为观察任何端粒酶抑制作用，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸应以低于胞毒性的浓度投药。但是，由于许多癌症化疗药的有效性衍生自其胞毒性作用，因此，本发明的范围包括本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸以观察到化疗作用的任何剂量投药。体内动物研究

用标准技术和材料构建人肿瘤异种移植物模型，该模型中OVCAR-5肿瘤细胞被移植到裸鼠中。将小鼠分成两组，一组用本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸经腹膜内途径处理，另一组用对照处理，该对照包括磷酸缓冲溶液(PBS)和与端粒酶RNA互补但与端粒酶RNA的序列有至少一个碱基错配的寡核苷酸的混合物。异种移植后用标准方法和材料定期测定每组小鼠平均肿瘤质量。

在用本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸处理的组中，预计在初次处理后平均肿瘤质量增加一段时间，之后预计肿瘤质量保持稳定，随后开始降低。对照组肿瘤质量预计在整个研究期间增加。因此，本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸预计显著减慢肿瘤生长速率，并最终诱导肿瘤大小的降低和肿瘤的消除。

因此，本发明提供了用于抑制端粒酶活性和治疗其中端粒酶活性有有害作用的疾病状态特别是癌症的新的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸和方法。本发明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸提供了对需要端粒酶活性以保持永生化的恶性细胞的高度选择性和有效的治疗法，同时不影响非恶性细胞。

尽管已描述了本发明的优选实施方案，但应理解的是可做出各种改变而不偏离本发明的实质和范围。