一种细菌、真菌及大肠菌群计数卡及其制备方法

摘要

本发明提供一种细菌、真菌及大肠菌群计数卡及其制备方法,该计数卡由计数卡盒和放置于该计数卡盒底部的计数内卡两部分组成,计数内卡由下框架、上框架和夹在上、下框架之间的计数片构成,由上层材料微孔滤膜和吸附有灭菌液体培养基的下层材料滤纸构成的计数片下凹成浅平底皿状。本计数卡可用于对食品、饮料、矿泉水、饮用纯水、自来水及药品中的细菌总数、真菌总数及大肠菌群数量的快速测定,并大大提高检测灵敏度。

说明书

本发明涉及微生物检测装置及其制备方法。

在食品、饮料、矿泉水、饮用纯水、化妆品、药品和饲料的检验中，细菌总数、真菌总数及大肠菌群数量是十分重要的限量检测指标，较之化学物质，微生物比较活跃，更具有不可控制性和预见性，因而一直引起人们的高度关注，近年来研究开发此类快速检测产品则更是一个生物技术领域中的热门课题。

八十年代初，美国3M公司首先从事这方面的研究，生产出Petrifilm系列细菌、真菌计数板和大肠菌群计数胶片，使用时只需将样品或其稀释液直接涂布在膜上，培养后计数带有颜色的菌落即可，操作非常方便。1997年Kinght MT等报告，美国3M公司的酵母菌和霉菌计数板与传统方法无显著差异。在3M公司之后，日本Y密列泊公司，美国Drew化学公司和芬兰Orion Diagnostica厂等也相继推出各种干片产品。

目前国内已形成专利或产品的微生物检测干片产品有系列水中细菌检验卡、菌落总数检测胶膜、大肠菌群快速检验纸片及霉菌检验纸片等，极大地促进了国内微生物检验技术的发展，并在实际中得到一定程度的应用，而且餐具大肠菌群纸片法还列入了国家标准。

在上述微生物检验制品中，菌落总数检测胶膜虽然检测范围宽，但不少菌在其上扩散性强，不能很好地形成菌落，因此会严重影响结果的可靠性；细菌、霉菌和大肠菌群检验纸片大都是采用滤纸作为载体，由于细菌及霉菌孢子和酵母细胞均较小，因此容易导致它们可在滤纸不同深度生长，而无法计数；另外，一些具鞭毛或运动性强的细菌，可沿着滤纸纤维的孔隙扩散开来，使菌落模糊不清，有时甚至扩散至整块纸片而无法计数；而由微孔滤膜和营养衬垫粘联而成的细菌检验卡，由于检验卡的上下层需用化学粘结剂粘联，制备较为繁琐。上述的各类制品在使用时都需要无菌培养皿来配合，使用不方便，不利于进行快速检验。

本发明的目的在于克服目前微生物干片检测产品中的明显不足，能提供直接检测液体或半固体样品中细菌总数、真菌总数及大肠菌群数量，且准确性与传统方法无显著差异的新型细菌、真菌及大肠菌群计数卡，用于对食品、饮料、矿泉水、饮用纯水、自来水及药品中的细菌总数、真菌总数及大肠菌群数量的快速测定，并大大提高检测灵敏度。

本发明中所提供的细菌、真菌及大肠菌群计数卡，由计数卡盒和放置于该计数卡盒底部的计数内卡两部分组成，所说的计数卡盒的底部平整，底部形状与计数内卡相配，所说的计数内卡由下框架、上框架和夹在上、下框架之间的计数片构成，所说的下框架的内壁沿底部周边具有一阶梯式的突缘，所说的计数片架于所说的下框架的阶梯突缘之上，沿该阶梯突缘的内边缘下凹成浅平底皿状，以使放置其中的待测液体样品不外流为度，上框架将计数片的边缘夹压固定于下框架的突缘上，所说的计数片由上、下两层材料构成，其下层材料为滤纸，滤纸上吸附有灭菌后的液体培养基，上层材料为微孔滤膜。

所说的计数片上可印制计数格，以便于对生长的菌落计数。

所说的计数片的上层材料可采用孔径为0.2～1.0um的微孔滤膜。

所说的计数卡的下框架的高度一般为3～8mm，该下框架的阶梯突缘高度为1～5mm。

所说的计数卡盒以及计数卡的上框架和下框架可由透明塑料制成。

所说的计数卡盒可根据需要设计成各种形状，最好为圆形或方形。

上述所提及的被吸附于计数片的滤纸上的液体培养基，既可采用一般的液体培养基，也可采用具有抵抗防腐剂、消毒剂或臭氧干扰性能的液体培养基，例如由广东省微生物研究所属下广东环凯微生物科技公司生产并已公开销售的具有抵抗防腐剂、消毒剂或臭氧干扰性能的抗干扰液体培养基制品，如表1所列的十二个配方，这些液体培养基分别具有抵抗防腐剂、消毒剂或臭氧干扰的性能，在检测含有抗防腐剂、消毒剂或臭氧等干扰物质的样品时，与普通计数卡相比，可大大提高检测的灵敏度。表1为以广东环凯微生物科技公司生产的十二个不同配方液体培养基和用量及所制成的计数卡：

                  表1  各种计数卡的培养基及用量

    计数卡名称    使用的培养基    用    量    (g/L)    细菌计数卡    营养肉汤培养基   22-24    抗防腐剂型细菌计数卡    抗防腐剂型细菌液体大样检测培养基   22-28    抗消毒剂型细菌计数卡    抗消毒剂型细菌液体大样检测培养基   20-24    抗臭氧型细菌计数卡    抗臭氧型细菌液体大样检测培养基   19-23  真菌计数卡    霉菌液体培养基   14-18  抗防腐剂型真菌计数卡    抗防腐剂型真菌液体大样检测培养基   21-25  抗消毒剂型真菌计数卡    抗消毒剂型真菌液体大样检测培养基   17-21  抗臭氧型真菌计数卡    抗臭氧型真菌液体大样检测培养基   16-20  大肠菌群计数卡    乳糖胆盐发酵培养基   32-40  抗防腐剂型大肠菌群计数卡    抗防腐剂型大肠菌群检测液体培养基   36-44    抗消毒剂型大肠菌群计数卡    抗消毒剂型大肠菌群检测液体培养基   33-41  抗臭氧型大肠菌群计数卡    抗臭氧型大肠菌群检测液体培养基   32-40

下面为本发明的细菌、真菌和大肠菌群计数卡的具体制备工艺步骤：

(1)、按设计尺寸制备计数卡盒以及计数内卡的上框架和下框架，将构成记数片的微孔滤膜和滤纸裁切成与下框架相配的尺寸；

(2)、灭菌处理：

a、用钴-60或环氧乙烷将计数卡盒以及计数内卡的上框架和下框架进行灭菌处理；

b、用钴-60或高温蒸汽对滤纸片和微孔滤膜进行灭菌处理；

c、用高温蒸汽或膜过滤对液体培养基进行灭菌；

(3)、按灭菌滤纸所能吸附液体量的1-5倍量，把灭菌的滤纸加入到灭菌后的培养基中进行吸附，或把灭菌后的培养基加入到灭菌的滤纸中；

(4)、取出已充分吸附培养基的滤纸，置于下框架的阶梯突缘上，再在滤纸上贴附上灭菌的微孔滤膜形成计数片，然后压装上框架把计数片固定在下框架的阶梯突缘上，再将计数片沿所说的下框架的阶梯突缘的内边缘下压成浅平底皿状，即成计数内卡；

(5)、把计数内卡置35-100℃的烘箱内干燥0.5-3.0小时；

(6)、把干燥的计数内卡置于计数卡盒的底部，盖上塑料盒盖，即得本发明产品。

本发明较好地解决了国内外现有细菌、真菌及大肠菌群检验干片产品存在的主要问题，计数卡均采用底部四周有一定凹度的塑盒一体化装置，不必与无菌培养皿配合，可方便加样并进行快速检测，使细菌和大肠菌群减少菌落扩散程度，并使真菌生长良好，便于计数。此外，可制成抗防腐剂型、抗消毒剂型及抗臭氧型计数卡以分别消除防腐剂山梨酸及山梨酸钾、苯甲酸及苯甲酸钠，消毒剂二氧化氯、过氧乙酸、次氯酸钠及过氧化氢和臭氧及余氯的干扰(表2)，在检测含有干扰物质的样品时，与普通计数卡相比，可大大提高检测的灵敏度。

          表2  抗干扰计数卡可以消除的干扰物质及其浓度

    计数卡名称  可以消除的干    扰物质  可以消除的干扰物    质的浓度    抗防腐剂型计数卡  苯甲酸、苯甲    酸钠  山梨酸、山梨    酸钾    2.0g/L(kg)    抗消毒剂型计数卡    二氧化氯    过氧乙酸    次氯酸钠    过氧化氢    150mg/L    400mg/L    700mg/L    180mg/L    抗臭氧剂型计数卡      臭氧      余氯    10.0mg/L

图1为本发明一实施例的正视图；

图2为图1的侧视图；

图3为图1的A-A向剖视图；

图4为图1中的计数内卡的正视图；

图5为图4的B-B向剖视图。

以下结合附图对本发明实施方式作进一步的详细说明：

实施例一

本细菌、真菌及大肠菌群抗干扰计数卡由计数卡盒1和放置于该计数卡盒底部的计数内卡2两部分组成，计数卡盒1由盒体11和盒盖12构成，一个计数卡盒1内装两个相同的方形计数内卡2，计数内卡2包括一方形的下框架22和一方形的上框架23，形成浅平底皿状的计数片21夹在上、下框架之间，上框(23将计数片21的边缘夹压固定于下框架22的阶梯突缘上，计数片21由上、下两层材料构成，其下层材料为滤纸，滤纸上吸附有灭菌后的液体培养基，上层材料为孔径微孔滤膜，其上印制有计数方格。

本计数卡的制备方法如下：

1、选用聚苯乙烯作为计数卡盒1和计数卡2上、下框架材料，计数卡盒的尺

   寸大小为88×44×15 mm，该计数卡盒的壁厚为2mm，分成左右两隔，计数

   内卡的下框架22和上框架23的尺寸大小分别为40×40×5mm与35×35

   ×2mm，下框架的阶梯突缘高度为2mm，上框架可套夹于下框架的内框壁中，

   据此设计模具制作塑料计数卡盒和计数内卡塑料框架；

2、把按计数内卡下框架大小裁好的滤纸片及微孔滤膜与塑料计数卡盒和塑料

   框架采用钴-60进行杀菌。

3、把不含氯化三苯甲基四氮唑(TTC)的各类液体培养基置于121℃，0.1MPa

   下灭菌15-20分钟；TTC溶液则采用0.2μm微孔滤膜过滤灭菌，待培养基

   冷却后，使用前加入其中即可。

4、在无菌条件下，按灭菌滤纸所能吸附液体量的3倍吸取上述灭菌后的液体

   培养基，然后把灭菌滤纸置于其中，吸附10分钟后，置于已打开的计数内

   卡塑料框下框上后，在滤纸上面放置滤膜，并合上上框。

5、置计数片于70℃的烘箱内干燥2.0小时后，取出干燥的计数片置于灭菌塑

   料盒的底部，合上塑料盖。

6、将包装好的计数卡套上热收缩膜后进行热收缩，然后装入外包装纸盒。

   采用上述计数卡进行细菌、真菌及大肠菌群的计数方法如下：

1、把固体样品加入灭菌生理盐水中溶解或制成半固体样品，液体样品可直接

   进行检测，无需对样品进行处理。

2、在超净工作台上打开实施例一生产的计数卡后，吸取1mL样品，加入到计

   数卡膜的中央，然后合上塑料盒盖，5分钟后待膜上的液体全部被下层的

   滤纸吸干，倒置计数卡。

3、把细菌及大肠菌群计数卡置35-37℃培养24-36小时，真菌计数卡置30-32

   ℃培养36-48小时后，观察计数。

4、在细菌及大肠菌群计数卡上显红色并有明显突起的数量分别为细菌及大肠

   菌群数。真菌计数卡上有霉点或丝状的数量则为霉菌数，有类似细菌的突

   起菌落数则为酵母菌数。

5、计数卡适合的计数菌数小于200cfu/mL，如超过则需采用无菌生理盐水稀

   释后再计数。