磁性微球的表面包覆和基团功能化修饰方法及所得微球及其应用

摘要

本发明涉及对单分散磁性微球表面进行聚合物包覆及基团功能化修饰的新方法,由此方法制得的磁性微球及其应用。本发明方法可通过一步悬浮聚合法包覆并功能化修饰粒径在5－1000nm范围内的磁球,如此制得的磁性微球的粒度在10nm－2μm。本发明的磁性微球可应用在生物材料的提纯、浓缩、分离、检测中,以及作为在微阵列电磁单元生物芯片中对生物分子定向控制的载体。

说明书

本发明涉及对单分散磁性微球表面进行聚合物包覆及基团功能化修饰的方法，由此方法制得的磁性微球及其应用。本发明方法可通过一步悬浮聚合法包覆及功能化修饰粒径在5-1000nm范围内的磁球，如此制得的微球的粒度在10nm-2μm。本发明的磁性微球可应用在生物材料的提纯、浓缩、分离、检测中，以及作为在微阵列电磁单元生物芯片中对生物分子定向控制的载体。

从样液中分离、提纯与检测各种蛋白质(各种抗体、抗原、酶)、核酸DNA、RNA和细胞等，是生命科学以及临床医学中一个重要的环节。实际样品的分离、纯化在试验的时间和经费上都占相当大的比重，有时甚至可达到90％以上。目前常用的分离方法有沉淀法，离心法，离子交换法，各种色谱法等。但有些方法需要比较昂贵的仪器设备，有些方法尽管简单易操作，分离效果差，有些方法操作复杂和费时，使它们的应用程度受到了很大的限制。现代对样品制备的要求能实现自动化小型化；不使用或尽量少使用有毒试剂；快速、高效；产物适于后续生物化学操作；成本较低。

在最近十几年磁性颗粒被用于生物材料分离，提纯，浓缩。磁性微球作为新型功能高分子材料，在生物医学(临床诊断，免疫分析，酶标，靶向药物)，细胞学(细胞标记，细胞分离)，分子生物学(cDNA文库，基因测序，DNA，mRNA的提取与杂交)及生物工程(酶的固定化)，新兴的生物芯片技术等领域将有广泛的应用前景。相对于上述传统的生物分子分离方法，采用磁性微球分离技术不需要大型贵重仪器，实验方法简单快捷，实验设备简单，而且提取效率高，分离过程比各种色谱方法要快速简单得多。目前国内外，磁球在生物方面的应用相对比较成熟的是在微米粒径的生物磁球，微米级的磁粒主要集中在细胞分离。如含有抗生素蛋白，植物凝结素等配体结合的磁性微球可用于骨髓中T细胞的分离；纳米磁性微球用于生物分子的标记研究的还比较少，而纳米磁性微球的包覆和表面功能化则更鲜见于文献。纳米磁性微球分离技术是一种很好的分离手段，有广阔的应用前景。更由于其具有的软磁性材料性质，可用于靶向药物，通过外磁场的作用到达病变部位，通过磁球上携带的药物达到治疗的作用。

带功能基团的表面包覆聚合物的磁性微球由内部磁性核心和表面聚合物包覆层组成。目前的制备方法有多种，其中一种方法是先制备磁性氧化铁核，再经表面包覆方法制备。但由于磁性氧化铁(Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃)内核极性太强而聚合物包覆层极性低，在磁性微球表面包覆聚合物层较困难；包覆过程中单体可能自身发生聚合反应，而未在磁球表面聚合包覆。也可能在包覆过程中发生纳米颗粒的团聚。目前磁性微球包覆的方法可分为物理方法和化学方法。物理方法主要是包埋法，是将磁性微粒分散于高分子溶液中，通过雾化，絮凝，沉积，蒸发等手段除去溶剂，得到磁性高分子微球。包埋法得到的磁性微球其磁性粒子(磁核)与外层的结合力弱，主要是范德华力(包括氢键)，易于脱落。所得的粒子粒径分布宽，形状不规则，粒径不易控制。如直接将磁粒分散在的氨基葡聚糖(Aminodextron)或聚甲基丙烯酸，或卵磷脂的水溶液中，通过物理吸附使颗粒的表面包被上一层聚合物膜。由于容易发生颗粒团聚，该法无法用于小于10纳米的磁性微球的包覆。化学方法进行包覆主要有悬浮聚合法。包覆是以磁性微球为核心，单体在磁性微球表面发生聚合反应。为使聚合反应在磁性微球表面进行，目前主要采用对微球表面进行硅烷化的方法，但该包覆过程需分步进行，操作复杂；且在处理过程中要产生HCl气体，对微球产生腐蚀作用。由于纳米粒子粒径小而表面能高，易被腐蚀而破坏表面，或改变粒径，表面硅烷化方法难以应用于纳米粒子的包覆。

因此，本发明的一个目的是克服现有技术中的不足，提供一种新的包覆和基团功能化修饰磁性微球的方法。

本发明的再一目的在于提供由本发明方法获得的表面包覆和基团功能化修饰的磁性微球。

本发明的又一目的在于提供所得磁性微球在生物材料的提纯、浓缩、分离、检测中的应用，以及作为在微阵列电磁单元生物芯片中对生物分子定向控制的载体的应用。

根据本发明的一个方面，本发明涉及一种一步法实现纳米或微米磁性微球表面包覆及功能化的方法，该方法中表面包覆及功能化采用悬浮聚合法，该方法包括如下步骤：

(1)将粒径范围在5-1000nm的某一粒径的单分散的磁性微球在强烈超声及搅拌下，分散于含有表面活性剂的有机溶剂介质中；

(2)向上述含分散有磁性微球的有机溶剂中加入包覆单体、功能化试剂、引发剂、偶联剂和交联剂；

(3)反应开始时先强烈搅拌30分钟，促使单体充分分散并分配于磁性微球表面，之后通氮气除氧，降低搅拌速度至30rpm，升温至80℃恒温，在氮气气氛下反应12小时；

(4)待聚合反应结束后，将反应物在磁搅拌器上搅拌，待磁性树脂沉积后，倾去上层清液；

(5)将磁性树脂真空抽滤，用去离子水、无水乙醇和丙酮多次洗涤，得到带功能基团的表面包覆聚合物的磁性微球。

本发明方法中，聚合时各种试剂的用量可视使用要求而改变。参与聚合反应的总有机单体(包括包覆单体、功能化试剂、偶联剂和交联剂的总和)与磁性微粒的质量比为1∶400～1∶1的范围内。各种组分在总有机单体中的含量为：偶联剂为1～10％(体积)；包覆单体为0～80％(体积)；交联剂为10～80％(体积)；功能化试剂为5～40％(体积)；引发剂为1～5％(重量)。另外，表面活性剂在有机溶剂中的体积分数为0.1～5％。

本发明方法中适合形成聚合物包覆层的包覆单体包括但不限于：丙烯酸，甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸-2-羟乙酯，乙二醇单(含或不含甲基)丙烯酸酯，二乙二醇单(含或不含甲基)丙烯酸酯，三乙二醇(含或不含甲基)丙烯酸酯，乙二醇二环氧单(含或不含甲基)丙烯酸酯，三羟甲基丙烷单(含或不含甲基)丙烯酸酯，季戊四醇单(含或不含甲基)丙烯酸酯，苯乙烯等。这些单体可以单独使用，也可以混合使用，最好与交联剂配合使用。

本发明方法中适合形成聚合物包覆层的交联剂包括但不限于：乙二醇双(含或不含甲基)丙烯酸酯，二乙二醇双(含或不含甲基)丙烯酸酯，三乙二醇双(含或不含甲基)丙烯酸酯，乙二醇双环氧双(含或不含甲基)丙烯酸酯，三羟甲基丙烷三(含或不含甲基)丙烯酸酯，季戊四醇二(含或不含甲基)丙烯酸酯，二乙烯苯。这些交联剂与单体配合使用，可取得很好的包覆效果。

本发明方法中有机溶剂可选用甲苯，二甲苯，四氢呋喃，乙醇和水的体系等。

本发明方法中，聚合时引发剂可选用过氧化苯甲酰(BPO)、偶氮二异丁腈等。

本发明方法中为使磁性微球在有机溶剂中充分分散，选用非离子表面活性剂或阴离子表面活性剂，例如但不限于烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10，OP-15)，十二烷基硫酸钠，十二烷基苯磺酸钠等。在反应开始前须对体系强烈搅拌并用超声进行分散，以免纳米颗粒在聚合过程中发生团聚。但聚合开始后，应降低搅拌速度，以减少颗粒相互碰撞的机会。

为使包覆后的纳米或微米磁性微球与生物分子有效地连接，微球表面需经功能化，使不同的功能化基团连接于微球的表面，这些功能化基团可选择氨基，羧基，羟基，醛基和环氧基，以及巯基等。通过这些功能化基团，磁性微球可与生物分子通过一定条件下的反应相连，这种连接方式是共价键连接，比较稳固，不易断裂。本发明方法中，选用既含有功能化基团，又含有双键的单体作为功能化试剂，在包覆过程中加入了带有功能化基团的单体，聚合完成后，包覆和功能化过程同时完成。

本发明中用的功能化试剂为带有功能化基团的单体，例如但不限于：丙烯酸，甲基丙烯酸，乙二醇双环氧单丙烯酸酯，丙烯酸-2-羟乙酯，季戊四醇二丙烯酸酯，甲基丙烯醛等。

因为磁性纳米粒子的表面极性强，而聚合物的极性较弱，为使聚合物完全包覆于微粒表面，本发明方法的一个关键特征是加入偶联剂，本发明方法所用的偶联剂选自磷酸双-(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)，磷酸双-(三羟甲基丙烷二丙烯酸酯)，磷酸双-(季戊四醇三丙烯酸酯)等。这些偶联剂的共同特点是一端含有强极性的磷酰氧键，与无机物(铁的氧化物)具有强的络合作用，而另一端是与其它单体亲和力强的侧链、并含可与之共聚的双键。这样，单体可完全吸附于微粒表面再发生聚合，并通过交联剂使其形成空间网状结构，结果可以在纳米磁球表面形成分布均匀的聚合物包覆层，而纯单体基本上不形成新的聚合物颗粒。这样，包覆与功能化反应就可以简单地一次完成。

根据本发明的另一方面，本发明涉及根据本发明方法制备的磁性微球。本发明制得的带功能基团的表面包覆聚合物的纳米或微米磁性微球为无机物和有机物关联的高分子复合材料，由金属氧化物(如铁，钴，镍等氧化物，在生物应用中性能最好的是Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃)组成核，高分子或生物高分子材料组成包覆层，外表层含有事先设定的功能化基团。包覆及修饰过程不应导致磁响应特性的显著下降。该纳米磁性微球为软磁性，即磁粒只有在外磁场作用下才表现出强的磁性，而当外磁场撤去后，则不再有磁性，其饱和磁化强度高，剩磁和矫顽力小。一般近似球形，粒度大小可根据需要的不同在10nm-2μm范围内选择，制得的纳米或微米磁性微球粒径比较均匀，粒度分布范围比较窄，在±10％之内。纳米磁性微球可较好地分散于水溶液中，不易沉淀与相互絮凝，可耐受生物样品环境的侵蚀，使用寿命长。

带功能基团的表面包覆聚合物的磁性微球包覆层的厚度可以根据要求进行调节。包覆是以纳米或微米磁性微球为核心，发生单体的聚合和交联反应。参与聚合反应的有机单体(这里参与聚合反应的有机单体包括前述的包覆单体、功能化试剂、偶联剂和交联剂的总和)的量不同时，包覆在磁性微球表面的聚合物的量是不同的，这样得到的包覆磁性微球的粒径和平均密度不同，因此通过控制加入包覆有机物的量，达到控制粒径和平均密度的目的。对5-1000nm的纳米磁性微晶，通过改变单体的量，可制备10nm-2μm范围内的任一粒径的包覆磁性微球。

本发明中优选由Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃组成核进行包覆，由于Fe₃O₄和γ-Fe₂O₃的密度比较大，都大于4kg/m³，为使纳米或微米磁性微球长时间悬浮在溶液中，同时磁性微球不被所使用的溶液腐蚀或溶解，用有机聚合物包覆，其平均密度可减小，再加上双电层效应，应用胶体的一些特性，可使磁性微球在溶液中长时间悬浮。

根据本发明的又一方面，本发明涉及所得磁性微球在生物材料的提纯、浓缩、分离、检测中的应用，以及作为在微阵列电磁单元生物芯片中对生物分子定向控制的载体的应用。

具体地，根据本发明方法获得的表面包覆及功能化修饰的磁性微球可作为生物物质分离，电磁定向控制的载体和生物分子磁标记的磁性微球探针，可用来对生物分子如DNA、RNA、多肽、蛋白质(酶、抗体、抗原等)、细胞等进行标记。该磁性微球探针可广泛用于生命科学研究中的多种生物分子的标记，提纯，浓缩和分离，如临床诊断中的免疫分析，cDNA文库的创建，以及在微阵列电磁单元生物芯片中作为生物分子定向控制的载体。对生物分子如DNA，蛋白质进行磁修饰后，使在电磁生物芯片上可通过单点选通的磁极对磁修饰的生物分子进行定向控制，使其定向移动，实现微量反应物浓缩，富集和检测的目的，为建立芯片试验室提供条件。

本发明制备的带功能基团的表面包覆聚合物的磁性微球探针与生物分子连接的方法可分为直接法和间接法。磁性微球在使用前需进行灭菌处理，在4℃，pH4-10，不冷冻时可稳定长期保存。

直接法是将磁性微球探针分散在磷酸盐溶液中，加入待标记的生物分子(如DNA，多肽，蛋白质等)，当功能化基团为环氧基时，与生物分子连接时反应溶液应控制在碱性；当功能化基团为羧基时，加入活化试剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺；醛基与生物分子连接时，反应后生成的西夫碱不够稳定，需加入硼氰化钠反应生成稳定的仲胺；氨基与生物分子连接时，先加入戊二醛使氨基转变成醛基，再与生物分子连接。所有反应缓慢搅拌数小时，用磁性分离架将纳米或微米磁球固定，用磷酸盐缓冲溶液(PBS-T，PBS中含0.05％ Tween20)洗涤三次，得到纳米或微米磁性微球探针标记的生物分子。这些标记的生物分子，可用于和其具有特异反应的生物分子结合，从而进行生物分子的分离，提取与检测。如将某种抗体固定在纳米或微米磁球的表面，该抗体可和与其具有特异反应的抗原结合。而从样品中将这种特异抗原分离出来。

间接法是采用例如生物素(biotin)和亲和素(avidin)或链亲和素(striptavidin)的特异亲和体系，利用生物大分子两者的高度特异亲和力，通过纳米或微米磁性微球表面的功能化基团将亲和素或链酶菌亲和素包覆在纳米或微米磁性微球的表面，将靶生物分子在溶液中与生物素结合，成为生物素修饰的靶生物分子，依靠生物素-亲和素的结合反应，使靶生物分子得到高效快速的分离。通过外磁场在与母液分离后，可通过洗脱液将靶生物分子与生物素分离。该分离技术可用于多种生命科学研究，临床疾病检测，DNA芯片，蛋白质芯片等研究领域。

本发明方法的优点是将粒径在5-1000nm范围内的任一粒径的单分散磁性微球在有机溶剂中用悬浮聚合法进行聚合物表面包覆，并在聚合过程中加入带功能基的单体，使表面连接功能化基团。这样可改变其密度和亲-疏水特性，保护表面不受环境侵蚀。包覆过程对磁性影响不大，不会形成新的聚合物核，也不会使纳米磁性微球发生团聚。通过控制包覆单体的量可制备粒径10nm-2μm范围内的任一粒径的表面基团功能化修饰的包覆磁性微球。磁球粒度分布窄，单分散性好，可较长时间悬浮在水溶液中。如将生物分子，如特异的抗体、抗原、DNA、RNA、蛋白质、酶或细胞等，通过功能化基团反应固定在该磁性微球的表面，偶联的生物分子仍然保持生物活性，可用作生物材料的提纯、浓缩、分离、检测，以及在微阵列电磁单元生物芯片中对生物分子定向控制的载体。

以下参照附图和实施例详细描述本发明，其中

图1为实施例1中包覆后的纳米磁性微球的磁滞回线。

图2为如实施例1所述包覆的纳米磁性微球的红外光谱图。

图3为应用实施例1所述的电磁生物芯片电磁单元通电对磁性微球吸引富集在显微镜下放大图。

图4为如应用实施例3所述不同条件下DNA提取液琼脂糖凝胶电泳图，图中各泳道的处理条件为：泳道1：NaI 100μl+异丙醇100μl；泳道2：NaI 50μl+异丙醇150μl；泳道3：NaI 150μl+异丙醇50μl；泳道4：NaI 100μl+乙醇100μl；泳道5：NaCl 100μl+乙醇100μl；泳道6：NaI+PEG 200μl；泳道7：NaI+PEG 100μl+乙醇100μl；泳道8：NaCl 100μl+异丙醇100μl；泳道9：NaI 100μl+甲醇100μl；泳道10：NaI+脲100μl+异丙醇100μl；泳道11：SDS 100μl+乙醇100μl；泳道12：SDS 100μl+甲醇100μl；泳道13：NaI+脲100μl+乙醇100μl；泳道14：NaI+urea 100μl+甲醇100μl；泳道M：λDNA(HindIII单切)分标记。

图5为如应用实施例4所述用不同方法、不同磁性微球分离大肠杆菌基因组DNA提取液琼脂糖凝胶电泳图，图中各泳道条件为：泳道1：未包覆磁球；泳道2：未包覆磁球；泳道3：聚苯乙烯包覆磁球；泳道4：甲基丙烯酸羟乙酯包覆磁球；泳道5：氨基葡聚糖包覆磁球；泳道6：甲基丙烯酸包覆磁球；泳道L：苯酚-氯仿法提取的DNA；泳道M：λ-DNA(HindIII单切)标记。

实施例1

甲基丙烯酸羟乙酯对10nm的Fe₃O₄纳米磁性微球包覆及环氧功能化

于装有回流冷凝管、搅拌器、温度控制器的三口烧瓶中，将3.274gFe₃O₄纳米磁性微球加入500ml甲苯中，再加入0.816g十二烷基苯磺酸钠，超声分散0.5小时，通过强烈搅拌使纳米磁性微球分散于甲苯中。然后将过氧化苯甲酰0.242g，甲基丙烯酸-2-羟乙酯2.5ml、三乙二醇双丙烯酸酯1.5ml、磷酸双-(甲基丙烯酸2-羟乙酯)0.6ml、乙二醇双环氧单丙烯酸酯1.2ml加入三口烧瓶中，先用搅拌桨强烈搅拌30min，并通氮气除氧，降低搅拌速度至30rpm。油浴升温至80℃恒温，氮气气氛下反应12小时。在聚合反应结束后，将反应物转至烧杯。置磁搅拌器上搅拌，待磁性树脂沉积后，倾去上层清液。将磁性树酯进行真空抽滤洗涤，用去离子水洗去剩余的十二烷基苯磺酸钠等，再用丙酮洗去未反应的有机物及吸附在磁性树脂上的杂质，洗涤完毕后将包覆纳米磁性微球分散到10ml磷酸缓冲溶液中，4℃保存。该磁球亲水性较好，能悬浮于水中，表面带有环氧基团。可直接与带氨基的生物分子连接(包覆后的纳米磁性微球的磁滞回线见图1)。通过对包覆与未包覆纳米磁性微球的红外光谱图(附图2)比较，除3390cm^-1的羟基特征吸收峰和576cm^-1的Fe₃O₄的特征吸收峰外，在包覆纳米磁性微球的红外谱图上还出现以下吸收峰：2933cm^-1为-CH₂-吸收峰；1560cm^-1为-C＝C-吸收峰；2885cm^-1为-CH-吸收峰；1255cm^-1为环氧基团吸收峰；1728cm^-1为羰基吸收峰；1057cm^-1为-P＝O基团吸收峰。这些有机官能团的存在有力的证明了包覆及功能化的成功。

实施例2

聚苯乙烯包覆50nm的γ-Fe₂O₃纳米磁性微球及表面羧基功能化

单体苯乙烯在聚合反应前先除其所含阻聚剂。取单体苯乙烯5ml，用4mol.L^-1的NaOH溶液反复洗涤除去其中的阻聚剂，再用去离子水洗到中性。采用与实施例1相同的包覆方法。50纳米2.974gγ-Fe₂O₃磁性微球加入500ml甲苯中，再加入十二烷基硫酸钠0.813g，超声分散0.5小时。然后将过氧化苯甲酰0.208g，磷酸双-(三羟甲基丙烷二丙烯酸酯)0.5ml，甲基丙烯酸1.5ml，苯乙烯5ml，二乙烯苯3ml加入三口烧瓶中，先用搅拌桨强烈搅拌30min，并通氮气除氧，降低搅拌速度至30rpm。油浴升温至80℃恒温，氮气气氛下反应12小时。在聚合反应结束后，将反应物转至烧杯。置磁搅拌器上搅拌，待磁性树脂沉积后，倾去上层清液。将磁性树酯进行真空抽滤洗涤，用去离子水洗去残余的十二烷基硫酸钠等，再用乙醇洗去未反应的有机物及吸附在磁性树脂上的杂质，洗涤完毕后将包覆纳米磁性微球分散到10ml磷酸缓冲溶液中，4℃保存。该磁球亲水性较好，能悬浮于水中，磁性微球表面带有羧基。

实施例3

甲基丙烯酸甲酯对200nm的Fe₃O₄磁性微球包覆及醛基功能化

于装有回流冷凝管、搅拌器、温度控制器的三口烧瓶中，将5.584gFe₃O₄磁性微球加入500ml中，再加入0.614g烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)，超声分散0.5小时，强烈搅拌使磁性微球分散于二甲苯中。然后将偶氮二异丁腈0.235g，甲基丙烯酸甲酯2.5ml，季戊四醇二甲基丙烯酸酯2.0ml、磷酸双-(甲基丙烯酸2-羟乙酯)0.4ml、甲基丙稀醛1.5ml加入三口烧瓶中，先用搅拌桨强烈搅拌30min，并通氮气除氧，降低搅拌速度至30rpm。油浴升温至80℃恒温，氮气气氛下反应12小时。在聚合反应结束后，将反应物转至烧杯。置磁搅拌器上搅拌，待磁性树脂沉积后，倾去上层清液。将磁性树酯进行真空抽滤洗涤，用去离子水洗去剩余的烷基酚聚氧乙烯醚等，再用丙酮洗去未反应的有机物及吸附在磁性树脂上的杂质，洗涤完毕后将包覆纳米磁性微球分散到10ml磷酸缓冲溶液中，4℃保存。磁性微球表面带有醛基。

实施例4甲基丙烯酸羟乙酯对100nm的γ-Fe₂O₃磁性微球包覆及羟基功能化

于装有回流冷凝管、搅拌器、温度控制器的三口烧瓶中，将2.934gFe₃O₄磁性微球加入500ml乙醇和水比例为4∶1的介质中，再加入0.593g烷基酚聚氧乙烯醚，超声分散0.5小时，强烈搅拌使磁性微球分散于乙醇和水的混合溶液中。然后将过氧化苯甲酰0.247g，甲基丙烯酸-2-羟乙酯2.0ml、季戊四醇三丙烯酸酯3.5ml、磷酸双-(季戊四醇三丙烯酸酯)0.5ml、加入三口烧瓶中，先用搅拌桨强烈搅拌30min，并通氮气除氧，降低搅拌速度至30rpm。油浴升温至76℃恒温，氮气气氛下反应12小时。在聚合反应结束后，将反应物转至烧杯。置磁搅拌器上搅拌，待磁性树脂沉积后，倾去上层清液。将磁性树酯进行真空抽滤洗涤，用去离子水洗去剩余的烷基酚聚氧乙烯醚等，再用乙醇洗去未反应的有机物及吸附在磁性树脂上的杂质，洗涤完毕后将包覆磁性微球分散到10ml磷酸缓冲溶液中，4℃保存。磁性微球表面带有羟基。

实施例5

季戊四醇三甲基丙烯酸酯对1000nm的Fe₃O₄磁性微球包覆及环氧基功能化

于装有回流冷凝管、搅拌器、温度控制器的三口烧瓶中，将2.836gFe₃O₄磁性微球加入500ml甲苯中，再加入0.583g十二烷基苯磺酸钠，超声分散0.5小时，强烈搅拌使磁性微球分散于甲苯中。然后将偶氮二异丁腈0.227g，季戊四醇三甲基丙烯酸酯2.2ml、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯1.5ml、磷酸双-(甲基丙烯酸2-羟乙酯)0.4ml、乙二醇双环氧单丙烯酸酯1.8ml加入三口烧瓶中，先用搅拌桨强烈搅拌30min，并通氮气除氧，降低搅拌速度至30rpm。油浴升温至80℃恒温，氮气气氛下反应12小时。在聚合反应结束后，将反应物转至烧杯。置磁搅拌器上搅拌，待磁性树脂沉积后，倾去上层清液。将磁性树酯进行真空抽滤洗涤，用去离子水洗去剩余的十二烷基苯磺酸钠等，再用丙酮洗去未反应的有机物及吸附在磁性树脂上的杂质，洗涤完毕后将包覆纳米磁性微球分散到10ml磷酸缓冲溶液中，4℃保存。磁性微球表面带有环氧基。应用实施例1

用于微阵列电磁单元生物芯片中对生物分子定向控制

将实施例3获得的磁性微球与被测DNA靶样连接。在主动式电磁生物芯片中，通过选通微阵列中电磁单元，可使DNA靶样迅速聚集于被选通的单元，实现对DNA分子的定向控制。采用本发明人自行开发设计的微阵列电磁单元生物芯片，该生物芯片中心有16个可单点选通的电磁极，通过对每个磁极外加电流的有无，控制该磁极是否产生电磁场，在电磁生物芯片上用紫外胶作一个反应容器池，在反应池的下方是16个可单点选通的电磁极，当某个电磁极通电后，在其周围空间产生磁场，对溶液中悬浮的磁球产生引力，使磁球在被选通的单元富集，通过对各个磁极电流的通断，可实现对磁球的定向控制，同时也实现了对和磁球偶联固定的生物分子的定向控制。电磁生物芯片磁极对磁球的富集，在显微镜下观察效果很明显，磁球被吸附于通电磁极附近(见图3)。应用实施例2

用于免疫检测和分析

免疫反应采用传统的夹心式反应。免疫分析实验步骤如下所示。

由于eppendorf管内表面也可以吸附少量的蛋白质，为防止蛋白质的损失，先用1％的牛血清蛋白溶液装满0.5ml的eppendorf管，进行封闭，4℃过夜。在此管中加入50μl的20μg/μl的实施例5制得的带环氧功能基磁性微球悬液，再加入200μl的1.2mg/ml羊抗人免疫球蛋白IgG碳酸钠缓冲液(pH9.6)，在37℃温育摇床下反应2小时，然后用磁性分离架将磁球固定，将上清液除去，用磷酸盐洗涤液(PBS-T，含0.05％ Tween20)洗涤磁球，每次洗涤5分钟，洗涤三次。再用1％牛血清白蛋白溶液对磁球表面进行封闭，37℃温育摇床下反应1小时，此步骤对消除抗原在磁球表面的非特异性吸附是很有必要的。将200μl的待测抗原人免疫球蛋白IgG溶液加入封闭完的eppendorf管中，37℃温育摇床下反应1小时。用PBS-T洗涤三次，每次5分钟。将200μl荧光素FITC标记的兔抗人免疫球蛋白IgG加入反应的200μl eppendorf管，37℃下反应2小时后，用PBS-T洗涤二次，再用去离子水洗涤一次，用50μl PBS溶液稀释磁球。

检测使用Scanner Array 4000玻璃片荧光扫描系统。首先清洗玻璃片，将玻璃片(25mm×75mm)在铬酸洗液中浸泡2小时，用大量去离子水冲洗后N₂吹干。接着将它们再依次放入正己烷、丙酮和无水乙醇中各超声15分钟后，放在80℃的烘箱中烘5分钟后，立即使用微机械手将反应得到的纳米磁球悬液在玻璃片点成阵列形状，每个斑点大约皮升量级，大小为300μm，点与点之间的距离为800μm，最后在氮气流下吹干。然后用Scanner Array 4000荧光成像。532nm的He-Ne激光器为激发光源，Scanner Array 4000扫描玻璃片得到的玻璃表面的荧光图像，其荧光强度是经Array 4000软件处理过的，是一个相对强度。应用实施例3

纳米磁性微球吸附DNA片段

本发明方法制备的纳米磁性微球可用于从各种生物样品中提取、分离与纯化DNA，改变分离体系的盐和有机溶剂的种类、浓度，pH值，可改变DNA从样品中的回收率。本例中方法步骤如下：在高温消毒的eppendorf管中加入15mg/ml的纳米磁性微球(实施例2制得)悬浮液40μl，0.4μg/μl的双链λ-DNA marker(HindIII单切)15μl，在漩涡振荡器上轻微振荡15s，再加入4mol.L^-1的NaI溶液80μl，轻微振荡30s，然后静置3分钟，再加入100μl异丙醇，轻微振荡5s，然后静置2分钟，用磁性分离架将磁球固定，将上清液除去，用100μl异丙醇洗涤吸附DNA的纳米磁球2次，加入50μl TE溶液(pH8.0，10mmol.L^-1 Tris.Cl，1mmol.L^-1 EDTA)，在水浴中62℃恒温12分钟将DNA从磁球上洗脱下来，然后将磁球与TE溶液分离，将得到的TE溶液用琼脂糖水平凝胶电泳检测分离的DNA片段，试验指出，在不同盐溶液，不同pH值环境中，分子量差异较大的DNA片段回收率不同；整个操作只需要15min。不同条件下DNA提取液琼脂糖凝胶电泳图见图4。应用实施例4

用纳米磁性微球分离大肠杆菌的基因组DNA

样品为培养过夜的不含质粒的Ecoli菌株，试验步骤为：取收获的细胞培养液1ml离心3000rpm×30s，弃上清。再加入500μl SDS细胞裂解液，摇匀、室温静置10min；然后加入50μl实施例1制得的纳米磁性微球，同时加入300μl丙酮；在漩涡振荡器上轻微振荡30s，室温静置5min；用磁性分离架将磁球固定，弃上清后，再用70％乙醇洗磁性微球2次。然后加100μl TE溶液(pH8.0)，水浴恒温65℃，10min。再用磁性分离架将磁球固定，收集洗脱液，进行紫外分析和琼脂糖凝胶电泳。用不同方法、不同纳米磁性微球分离大肠杆菌基因组DNA提取液琼脂糖凝胶电泳图见图5。采用紫外分光光度计测量提取的大肠杆菌基因组DNA的A值，提取液在稀释50倍后260nm和280nm的比值都在1.8以上。DNA产量约为30μlg/ml，与传统的SDS加蛋白酶K破胞，酚-氯仿抽提法相比，产量及纯度相当。本方法的优点在于：①本方法简便、快速，仅需20min即可完成操作。②本法易于实现自动化操作。③在一支eppendorf管中即可完成操作，不需离心。④在室温条件下本操作在任何一步停顿下来，在24小时内可以接着继续操作，无需重新开始。