抑制血管内皮细胞及内皮干细胞生长及迁移的多肽及其制备方法和用途

摘要

本发明属于生物技术制药中的基因工程生产多肽药物及化学合成多肽药物的技术领域,其目的是利用(1)化学合成HSIFTPETNPRAGLEK多肽,(2)化学合成该多肽的基因,并实现在大肠杆菌中的高效表达,经分离纯化,创造出具有较高抑制血管内皮细胞及内皮干细胞生长及迁移的多肽药物,用于肿瘤等内皮细胞生长相关疾病的治疗。

说明书

本发明涉及一种抑制血管内皮细胞及内皮干细胞生长及迁移的多肽及其制备方法和用途。

1972年，Judah Folkman提出了“肿瘤生长依赖于血管生成作用”的假说，随着一些刺激血管生成与阻遏分子的发现，特别是一些与肿瘤发生密切相关的生长因子(如VEGF，FGF，HGF，TGFβ等)对血管发生的影响及其机制的探讨，为上述假说提供了有力的证据。如果能抑制肿瘤周围的血管生成，就可有效地防止肿瘤扩散，并且迫使肿瘤因无法生成新的细胞而不断减小。

1994年，O`Reily等人在患Lewies Lung Carcinomas小鼠的血清及尿液中提取到一种血管生成阻遏物质，命名为angiostatin，其分子量为38KD，与纤溶酶原前四个kringle结构域同源性度高达98％。体外及体内实验表明该蛋白可特异性抑制内皮细胞的分裂生长，而对上皮细胞及表皮细胞没有作用。通过体外注射angiostatin，可抑制原发瘤及转移瘤组织内的血管生成，从而抑制肿瘤的生长。Yihai Cao等人发现纤溶酶原(kringle1-3)结构域具有比kringle1-4结构域(angiostatin)更强的抑制内皮细胞生成的作用，他们达到最大抑制作用一半时的浓度(ED50)分别为70nM，135nM。1997年，他们又报导了纤溶酶原kringle5具有更强的抑制bFGF激发的毛细管内皮细胞生成的功能，其ED50为50nM。

随后，人们先后报导了纤溶酶原不同的kringle或多或少地具有内皮细胞生长抑制作用，其活性顺序为kringle1-5＞kringle5＞kringle1-3＞kringle1-4＞kringle3＞kringle2。

Angiostatin，kringle5等已在美国申请专利，其中angiostatin已被用于临床实验，但结果并不令人满意。因为它必须使用高剂量时才有效。其疗效与endostatin合用时具有协同性。因此，对于肿瘤治疗，急待开发出较angiostatin及kringle5具有更强血管生成抑制作用的新型制剂。

本发明的目的在于根据我们已有的plasminogen Kringle5酶解片段的实验结果，提出一种抑制血管内皮细胞及内皮干细胞生长及迁移的多肽及其制备方法和用途。

本发明的技术内容包括：

1)利用化学合成法及反向HPLC纯化方法制备具有能抑制血管内皮细胞及内皮细胞干细胞生长及迁移的十六肽，其序列为HSIFTPETNPRAGLEK。

2)用化学合成法制备上述肽段的基因，将其克隆至大肠杆菌表达载体，进行融合表达，经纯化及酶切后获得目标多肽。

3)用化学合成法制备上述肽段的基因。其编码链及互补链3′端分别增加ATG及CAT，经连接后获得该肽段的串联基因，将其克隆至pET31b，以BLR(DE3)LysS为表达宿主菌，表达产物经溴化腈裂解，获得十六肽单体。

4)利用Bovine capillary endothelial cells(BCE)、Calf pulmonaryarterial endothelial cells(CPAE)、Human Umbilical Vein EndothelialCells(HUVEC)、Endothelial progenitor cells(EPC)等细胞等细胞及小鼠移植肿瘤动物模型测定生物活性。

本发明解决了Angiostatin等用量大的缺点，临床上用于治疗内皮细胞生长相关的疾病，包括实体瘤、肥胖症、糖尿病、粥状动脉硬化等及在化疗、放疗中的联合或辅助治疗，效果十分理想。

本发明的实施例：

1、抑制内皮细胞及内皮干细胞生长及转移多肽的合成：

化学合成法制备HSIFTPETNPRAGLEK肽段，合成产物经C₄柱HPLC反向层析纯化，其HPLC纯度大于95％，质谱测定其分子量为1800道尔顿。

2、抑制内皮细胞及内皮干细胞生长及转移多肽串联基因的构建：

化学合成十六肽基因的两条互补链，其序列分别为5′CAC TCCATC TTC ACT CCg gAA ACT AAC CCg CgT gCT ggT CTg gAA AAAATg 3′5′TTT TTC CAg ACC AgC ACg Cgg gTT AgT TTC Cgg AgT gAA gAT ggA gTgCAT 3′

上述两条链经磷酸化、退火后得到编码十六肽的基因，加入T₄DNA连接酶，连接产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分别得到不同大小的十六肽串联基因。

将十六肽串联基因与经AlwNI酶切的pET31b(+)连接，连接产物转入NovaBlue，经NdeI及XhoI酶切筛选得阳性克隆。

3、抑制内皮细胞及内皮干细胞生长及转移多肽串联基因的表达及包涵体制备：

将上述含串联重复基因的重组质粒转入表达宿主菌BLR(DE3)lysS，挑取单克隆于LB(含100μg/ml Amp)中，37℃摇振培养过夜，取过夜菌以2％比例接入新鲜LB培养基中，250rpm，37℃培养至OD₆₀₀ 0.3～0.5，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续培养3-6小时，OD₆₀₀达2.0左右。离心、收集菌体，按10ml/g菌体比例加入1×结合缓冲液(5mM咪唑，40mMTris·HCl pH7.9,500mM NaCl)，超声破菌至菌液不再粘绸，12000g，4℃离心10min，收集沉淀。

4、抑制内皮细胞及内皮干细胞生长及转移串联多肽的纯化及CNBr裂解。

用含有6M盐酸胍的结合缓冲液重新悬浮包涵体，12000rpm4℃离心10min去除不溶物，取上清上Ni-NTA柱，依次用结合缓冲液(含6M盐酸胍)，洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.9，0.5MNaCl，16mMimidazole，6M盐酸胍)各8个床体积洗涤。最后用洗脱缓冲液(20mMTris-HCl，pH7.9，0.5MnaCl，300mM咪唑，6M盐酸胍)洗脱，收集洗脱峰。对水透析过夜，2000g4℃离心10min，收集沉淀。

用6ml 80％formic acid溶解上述沉淀。转入50ml圆底烧瓶，加入0.2gCNBr，氮气饱和，密封，搅拌18-22hr，用旋转蒸发液28℃蒸干，用尽量小体积的40％ CH₃CN/60％ H₂O/0.1％TFA搅拌1小时以溶解沉淀，12000g 4℃离心10min，取上清，用0.22μM滤膜过滤，用RP-HPLC签定多肽纯度。

5、抑制内皮细胞及内皮干细胞生长及转移多肽的克隆、表达及表达产物的纯化：

化学合成编码十六肽的基因，其5′及3′端分别增加NcoI及EcoRI位点，将其克隆至pET30a中，以BL21(DE3)为宿主菌，经0.5mM IPTG诱导表达后，收集菌体，按10ml/g菌体比例加入1×结合缓冲液(5mM咪唑，40mMTris·HCl pH7.9，500mM NaCl)，超声破菌至菌液不再粘绸，12000g，4℃离心10min，取上清上Ni-NTA柱，依次用结合缓冲液，洗涤缓冲液(20mMTris-HCl，pH7.9，0.5MNaCl，16mM imidazole，)各8个床体积洗涤。最后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.9，0.5MnaCl，300mM咪唑，)洗脱，收集洗脱峰。对水透析过夜，肠激酶酶切，反向层析纯化目标多肽。

6、抑制内皮细胞及内皮干细胞生长及转移多肽生物活性的测定：

①Bovine capillary endothelial cells(BCE)测定法：取生长良好的BCE细胞，经PBS洗涤，胰酶消化，用含DMEM+1％GPS培养液配成25,000个/ml的悬液，加入24孔板，每孔0.5mL，37℃，10％CO₂条件下培养24小时，细胞贴壁后弃上清液，加入0.5mL DMEM+5％小牛血清+10％GPS及待测样品，37℃培养20分钟后，加入bFGF至终浓度1ng/ml或VEGF至终浓度25ng/ml。72小时后，XTT法测活细胞数。

②Calf pulmonary arterial endothelial cells(CPAE)测定法：方法同上。

③Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVEC)测定法：将在EBM+2％小牛血清培养基中生长的细胞加至96孔板，每孔0.1mL(50,000Cells)，37℃，10％CO₂条件下培养24小时，细胞贴壁后弃上清液，加入0.1mL EBM+2％小牛血清+4ng/mL bFGF或100ng/mL VEGF，继续培养48小时，弃上清，加入0.1mL EBM+2％小牛血清及待测样品，37℃培养20分钟后，补加0.1ml培养基(EBM+2％小牛血清+2ng/mL bFGF或50ng/mL VEGF)，24小时后，XTT法测活细胞数。

以上三种方法的测定结果表明十六肽对三种细胞的抑制作用均优于Angiostatin。

④Endothelial progenitor cells(EPC)体外测定法：取Balb’c小鼠，皮下注射B16细胞1×10⁶，10天左右可观察到约1cm的肿硬块。取其骨髓细胞，用含VEGF、IGF、BFGF的1640培养液培养，12天后，收获细胞，PBS洗涤，计数。加入抗小鼠FLK-1的抗体(1μg/mL)，4℃放置1小时，离心，PBS洗涤去除游离抗体。用protein G的慈性Beads 1μL分离FLK-1+细胞并计数。结果表明对照组及加入1.2μM Angiostatin、1.2μM十六肽的骨髓细胞中，FLK-1+的比例分别为9.6％，2.7％，及1.3％。

⑤Endothelial progenitor cells(EPC)体内测定法：取Balb’c小鼠，皮下注射B16细胞1×10⁶，尾静脉注射待测样品，连续5天。麻醉小鼠，从眼眶取外周血，用红细胞裂解液处理15分钟，离心，PBS洗涤两次，计数。加入荧光标记的抗小鼠FLK-1、CD45的抗体，4℃放置1小时，离心，PBS洗涤去除游离抗体。加终止液，Facs测定FLK-1+/CD45+的细胞数。结果表明：正常鼠外周血中0.4％为FLK-1+/CD45+细胞，肿瘤鼠及静脉注射Angiostatin、十六肽后，外周血中FLK-1+/CD45+的比例分别为1.0％，0.3％及0.35％。

⑥小鼠实体瘤测定法：取Balb’c小鼠，皮下植入B16细胞1×10⁶，尾静脉注射待测样品，连续三周，观察肿瘤生长情况。