一种淤泥趋磁细菌及其分离纯化和制备磁小体的方法

摘要

一种趋磁细菌,该细菌从淤泥土壤样品中分离出来,现已在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号:M202021分类命名为:Magnetotactic bacterium MB－TK。该趋磁细菌MB－TK的特征为:微好氧细菌,菌体形态为杆状或长椭圆形,产生圆形或多角形磁小体,每一菌体产生2～10颗磁小体;磁小体的主要元素组成为铁(Fe)、硅(Si)、铝(Al)、钙(Ca)、碳(C)、氯(Cl)、氧、镁。该趋磁细菌MB－TK具有如下优点:易于培养,可制备具有广泛用途的生物来源的纳米材料－磁小体,磁小体产生量大,具有广泛的开发、应用前景,使纳米科技研究领域的纳米材料来源更丰富,性能更优良,品种多样化。

说明书

技术领域：

本发明涉及细菌，尤其涉及菌体能产生磁小体的趋磁细菌，本发明还涉及趋磁细菌的分离纯化及其制备磁小体的方法。

趋磁细菌(Magnetotactic bacterium，简称MB)MB-YN是从我国印染工厂废水淤泥样品中分离出的，该趋磁细菌MB-YN易于培养、磁小体的产生量大，现已在中国典型培养物保藏中心保藏，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2002年5月10日，保藏编号：M202021，分类命名为：Magnetotactic bacterium MB-YN。

背景技术：

趋磁细菌(Magnetotactic bacteria)是一种能在体内形成纳米级磁性颗粒—磁小体(Magnetosomes)，并在外磁场的作用下作定向运动的细菌。趋磁细菌最早由美国生物学家Blakemore于1975年偶尔发现。此后英、德、日等国的学者不断从淡水池塘、湖泊、海洋等底部的淤泥中和草原土壤样品中分离出了各种形态的趋磁细菌。趋磁细菌体内合成的磁小体颗粒是一种天然磁性纳米材料，其大小在30-120纳米之间，主要成分为Fe₃O₄和Fe₃S₄，可应用于信息存储、生物传感技术、医疗卫生、纳米药物、电子、通信、计算机等高新技术领域。日本学者Matsunaga在1991年就预计趋磁细菌的磁小体在未来的十年将是高新技术应用中的一种新的生物资源。文献：趋磁细菌(Magnetotactic bacteria)，科学(Science，1975，190(4209)：377-379在世界上首次报道了趋磁细菌及其主要特征；淡水中趋磁细菌Magnetic Spirillum在化学鉴定培养基上的分离与纯培养(Isolation and Pure Culture of a Freshwater Magnetic Spirillumin Chemically Defined Medium)，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)，1979，720-729，对趋磁细菌的分离及纯培养方法进行了研究；文献：趋磁细菌磁小体膜的特征(Characterization of theBacterial Magnetosome membrane)，细菌学杂志(J Bacteriology，1988，170：834-841)，研究了趋磁细菌磁小体及其磁小体外膜的特征；细菌趋磁体的应用(Application of Bacteria Magnets)，生物技术趋势(Trends Biotech.1991，9：91-95)、生物磁性纳米粒子的形成与应用(Biomagnetic nanoparticle formation and application)大分子科学(Supramolecular Science，1998，5：391-394)，分析了趋磁细菌形成的纳米粒子-磁小体的应用前景。趋磁细菌在我国有广泛分布，文献：趋磁细菌的分离、纯化及生化特性研究，武汉大学学报，1994，40(148)：115-127，从我国武汉东胡淤泥中分离出了趋磁细菌，并对其生化特性等进行了研究；文献：我国趋磁细菌的分布及其磁小体的研究，科学通报，1996，Vol.41，4：349-352；对我国黄土剖面和淡水湖泊淤泥中的趋磁细菌的形态、培养特征及磁小体的主要成分等进行了研究；文献：中国黄土剖面趋磁细菌的组成特征与生态意义，岩土矿物学杂志，2001，20(4)：428-432；报道了黄土剖面中趋磁细菌的特征及其地学和生态标志意义。文献：好氧趋磁细菌HM-1的分离及生物学特性研究，武汉大学学报，1997，43(6)：775-780；对从我国黄石磁湖淤泥中分离出的好氧趋磁细菌的形态、培养特征及磁小体物质组成等进行了研究。

趋磁细菌是生物磁学和仿生学研究领域一种良好的模式材料，其产生的磁小体颗粒小而均匀，外有生物膜包被，颗粒间不聚集，是一种生物来源的良好纳米材料。趋磁细菌及其磁小体具有广泛的用途，如：(1)趋磁细菌用于制作磁化细胞；(2)用于废水处理；(3)磁小体作为酶、药物、核酸等的载体，用于生物传感器、医疗卫生等领域(4)用于信息存储，磁小体可用于制作容量大、高清晰度、高保真水平的记录材料；(5)趋磁细菌的磁小体合成基因克隆到发酵工业中的生产菌株，可大大改善发酵工艺。

发明内容：

本发明的目的是，提供一种新的趋磁细菌MB-YN，该趋磁细菌MB-YN的菌体能产生磁小体。本发明的另一目的是，提供趋磁细菌MB-YN的分离纯化和制备磁小体的方法。

本发明的趋磁细菌MB-YN已在中国典型培养物保藏中心保藏，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2002年5月10日，保藏编号：M202021，分类命名为：Magnetotactic bacterium MB-YN。其特征为：微好氧细菌，菌体形态为长杆状或园形、肾形、瓶状等，产生圆形磁小体，每一菌体含3-20的磁小体，生长周期为25天-30天；磁小体的主要元素组成为铁(Fe)、钙(Ca)、磷(P)、氧、镁。

趋磁细菌MB-YN的分离纯化方法按下列步骤顺序进行：

(1)对趋磁细菌进行富集培养：

①、取含趋磁细菌MB-YN淤泥土壤样品，加入仅趋磁细菌能生长的选择性富集培养基的瓶中，将瓶口密封；

②、在22℃-30℃室温下避光培养25～30天；

③、用滴管吸取菌体及部分培养液，用5000～7000转/分钟离心8～12分钟，去掉上清液；

④、收集菌体即离心后的沉淀物，悬浮于无菌水中；

(2)对趋磁细菌MB-YN进行纯化培养：

⑤、先在培养皿中加入经富集培养获得的趋磁细菌水悬液，再倒入半固体生长培养基，冷却凝固；

⑥、在22-30℃下培养3天，挑选趋磁细菌MB-YN的单菌落，即为纯化的趋磁细菌MB-YN。

上述的半固体生长培养基为：在生长培养基中加入0.7％的琼脂，113℃灭菌20分钟。

上述的选择性富集培养基每升的组份为：丁二酸钠1克，硝酸钠0.1克，醋酸钠0.2克，巯基乙酸钠0.05克，维生素混合液10ml，矿物质混合液10ml，0.01M奎宁酸铁1ml，余者为水。再用NaOH调pH值为6.7，113℃灭菌20分钟。

上述的维生素混合液每升的组份为：生物素2.0毫克/升，叶酸2.0毫克/升，维生素B₆10.0毫克/升，维生素B₂5.0毫克/升，维生素B₁5.0毫克/升，维生素B₅5.0毫克/升，维生素B₃5.0毫克/升，维生素B₁₂0.1毫克/升，硫辛酸5.0毫克/升，ρ-aminobenzoic acid 5.0毫克/升，余者为水。

上述的矿物质混合液每升的组份为：nitrolotriacetic acid1.5克/升，硫酸镁3克/升，硫酸锰0.5克/升，氯化钠1克/升，硫酸铁0.1克/升，氯化钙0.1克/升，氯化钴0.1克/升，硫酸锌0.1克/升，硫酸铜0.01克/升，硫酸钾铝0.01克/升，硼酸0.01克/升，钼酸钠0.01克/升，余者为水。

趋磁细菌MB-YN制备磁小体的方法按下列步骤顺序进行：

(1)对趋磁细菌MB-YN进行扩大培养：

a、在瓶中装入生长培养基，113℃灭菌20分钟，静置12-20小时，接入纯化的趋磁细菌MB-YN；

b、在22℃-30℃室温下，避光培养20～25天；

c、再用5000转/分离心10～12分钟，去上清液，收集菌体；

d、将菌体悬浮于无菌水中成菌体悬浮液；

(2)对趋磁细菌MB-YN进行生长培养：

e、在瓶中装入生长培养基，113℃灭菌20分钟，静置12-20小时，接入菌体悬浮液；

f、在22℃-30℃室温下，避光培养25～60天；

g、再用5000转/分离心10～12分钟，去上清液，收集沉淀物；

h、将沉淀物悬浮于无菌水中成悬浮液；

(3)将悬浮液，用孔径45um的滤纸初过虑，再用孔径20um的滤纸过虑以除去细胞碎片；

(4)再用5000转/分离心10～12分钟，去上清液，收集磁小体沉淀、真空干燥、密封保存，即制成趋磁细菌MB-YN来源的纳米材料-磁小体。

上述的生长培养基为：每1000ml的组份为：维生素混合液10ml，矿物质混合液10ml，KH₂PO₄ 50mM，奎宁酸铁250uM，丁二酸钠1g，无水醋酸钠0.2g，硝酸钠0.1g，巯基乙酸钠0.05g，加水至1000ml。再用NaOH调至pH值为6.7，113℃灭菌20分钟。

上述维生素混合液的组份与选择性富集培养基中的维生素混合液的组份相同。

上述矿物质混合液的组份与选择性富集培养基中矿物质混合液的组份相同。

本发明具有如下优点：其趋磁细菌MB-YN易于培养，可制备具有广泛用途的生物来源的纳米材料-磁小体，磁小体产生量大，具有广泛的开发、应用前景，使纳米科技研究领域的纳米材料来源更丰富，性能更优良，品种多样化。

具体实施方式：

趋磁细菌MB-YN用如下方法进行富集培养：取10克含趋磁细菌MB-YN淤泥土壤样品，加入到装有250ml仅趋磁细菌能生长的选择性富集培养基的瓶中，将瓶口密封，在22℃-30℃室温下避光培养25～30天，利用趋磁细菌成团并偏向于培养瓶一边生长的特点，用滴管吸取菌体及部分培养液，用5000～7000转/分钟离心8～12分钟，去掉上清液，收集菌体即离心后的沉淀物，悬浮于无菌水中。

上述选择性富集培养基每升的组份为：丁二酸钠1克，硝酸钠0.1克，醋酸钠0.2克，巯基乙酸钠0.05克，维生素混合液10ml，矿物质混合液10ml，0.01M奎宁酸铁1ml，余者为水。再用NaOH调至pH值为6.7，113℃灭菌20分钟。

上述维生素混合液每升的组份为：生物素2.0毫克/升，叶酸2.0毫克/升，维生素B₆10.0毫克/升，维生素B₂5.0毫克/升，维生素B₁5.0毫克/升，维生素B₅5.0毫克/升，维生素B₃5.0毫克/升，维生素B₁₂0.1毫克/升，硫辛酸5.0毫克/升，ρ-aminobenzoic acid 5.0毫克/升，余者为水。

上述矿物质混合液每升的组份为：nitrolotriacetic acid 1.5克/升，硫酸镁3克/升，硫酸锰0.5克/升，氯化钠1克/升，硫酸铁0.1克/升，氯化钙0.1克/升，氯化钴0.1克/升，硫酸锌0.1克/升，硫酸铜0.01克/升，硫酸钾铝0.01克/升，硼酸0.01克/升，钼酸钠0.01克/升，余者为水。

趋磁细菌MB-YN可用如下方法进行纯化：先在培养皿中加入经富集培养获得的趋磁细菌水悬液，再倒入半固体生长培养基，冷却凝固；在22-30℃下培养3天，挑选趋磁细菌MB-YN的单菌落；该单菌落即为纯化的趋磁细菌MB-YN。

再在250ml瓶中，装入200ml生长培养基，静置12～20小时，接入纯化的趋磁细菌MB-YN的单菌落，在22℃～30℃室温下，避光培养20～25天。

趋磁细菌MB-YN用如下方法进行生长培养：在500ml瓶中装入400ml生长培养基，静置12～20小时，接入趋磁细菌MB-YN水悬浮液，在22℃-30℃室温下，避光培养25～60天。

再用5000转/分离心10～12分钟，去上清液，收集沉淀物将沉淀物悬浮于无菌水中成悬浮液。

将悬浮液，用孔径45um的滤纸初过虑，再用孔径20um的滤纸过虑以除去细胞碎片；再用5000转/分离心10～12分钟，去上清液，收集磁小体沉淀，真空干燥，密封保存，即制成趋磁细菌MB-YN来源的纳米材料-磁小体。

上述半固体生长培养基为，在生长培养基中加入0.7％的琼脂，113℃灭菌20分钟。

上述生长培养基每1000ml的组份为：维生素混合液10ml，矿物质混合液10ml，KH₂PO₄ 50mM，奎宁酸铁250uM，丁二酸钠1g，无水醋酸钠0.2g，硝酸钠0.1g，巯基乙酸钠0.05g，加水至1000ml。用NaOH调至pH值为6.7，113℃灭菌20分钟。

上述维生素混合液的组份与选择性富集培养基中的维生素混合液的组份相同。

上述矿物质混合液的组份与选择性富集培养基中矿物质混合液的组份相同。