抗白血病和肿瘤耐药性的bc1－2基因反义核酸药

摘要

本发明公开了一种抗白血病和肿瘤耐药性的bc1－2基因反义核酸,其核苷酸序列为:5’－ATCCTCCCCCAGTTCACC－3’,18个经全硫代修饰,它能特异性地抑制bc1－2基因的表达,促进白血病和肿瘤细胞的凋亡,提高药物敏感性,克服耐药性,对正常组织几乎无毒副作用,可作为药物应用于临床。该反义核酸与三氧化二砷联合作用,可协同下调bc1－2蛋白的表达,促进诱导细胞凋亡,提高对三氧化二砷的敏感性,减少砷剂的用量,减少毒副作用的发生,克服白血病和肿瘤细胞的耐药性。

说明书

本发明涉及抗白血病和肿瘤耐药性的bcl-2基因的反义核酸药物。

砷剂作为凋亡诱导剂用于白血病的治疗已引起人们关注，我国学者在三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病的临床和基础研究方面取得的进展令人瞩目。但由于砷剂的毒副反应大，进入人体的砷约有80％停留在肝、肾、胃肠壁、脾、肺等全身组织，主要经肾脏和胃肠道排泄，易对人体的肝、肾等产生严重的毒副作用。而且通过与含巯基结构蛋白的结合，易在头发、指甲、骨骼中蓄积：并且使得含巯基的酶失活，如丙酮酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、脱氧核糖核酸聚合酶等，严重干扰机体的代谢，细胞的氧化过程，易致癌、致突变。砷剂的毒副作用与剂量成正相关，若能找到协同作用的药物，联合使用，既能提高和加强其疗效，同时又能控制砷剂的用量在一定范围内，将使砷剂的使用更加安全。

肿瘤耐药是成功治疗白血病的主要障碍之一。目前有大量研究表明：大部分的抗肿瘤化疗药物引起细胞死亡的机理是通过引起细胞凋亡实现的。细胞凋亡基因的过度表达引起肿瘤细胞对大多数抗肿瘤药物产生抗药性。

白血病癌基因(bcl-2)是迄今为止功能研究得最明确的细胞凋亡的拮抗基因。本发明人等在1998年第14(6)期《中国病理生理杂志》591～594页《bcl-2基因反义核苷酸对HL-60和K562细胞的影响》一文中报道，应用互补于bcl-2基因mRNA的翻译起始部位设计的全硫代的反义寡核苷酸体外作用于K562和HL-60细胞可下调bcl-2蛋白的表达，增加细胞对化疗药物阿糖胞苷的敏感性。反义技术的引入，给由于bcl-2基因过度表达引起的白血病细胞的耐药的逆转带来希望。

本发明的目的就是提供一种抗白血病和肿瘤耐药性的bcl-2基因反义核酸，根据反义技术原理，针对bcl-2基因的mRNA蛋白编码区对反义核酸较敏感位点设计bcl-2基因反义寡核苷酸。

本发明的另一个目的是提供一种能增加白血病和肿瘤细胞对三氧化二砷敏感性，提高其治疗效果，降低三氧化二砷用量和毒副作用的反义药物，与三氧化二砷联合作用，共同下调bcl-2基因的表达，提高细胞对砷剂的敏感性，相应减少砷剂的用量，从而具有抗白血病和肿瘤耐药性的药，使之安全高效地应用于临床治疗。

上述的发明目的是通过分别由如下技术方案实现的：

根据反义技术原理，设计出具有药用价值的bcl-2基因反义寡脱氧核糖核苷酸(ASODN)，其序列为5’-ATCCTCCCCCAGTTCACC-3’。18个经全硫代修饰，使其具有抗核酸酶作用。

能增加自血病和肿瘤细胞对三氧化二砷敏感性，提高其治疗效果，降低三氧化二砷用量和毒副作用的反义药物，由10～40μmol/L上述的bcl-2的基因反义寡核苷酸、0.25～2.0μmol/L三氧化二砷和钠离子、氯离子、水组成。

发明人选用急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4和慢性髓系白血病急变细胞株K562作靶细胞，通过本发明设计的bcl-2基因反义寡核苷酸、三氧化二砷、及两者联合应用诱导细胞凋亡的实验，实验证明该bcl-2基因反义寡核苷酸有较强的下调bcl-2基因的表达，抑制白血病细胞的生长的作用，bcl-2基因反义寡核苷酸与三氧化二砷联合作用可共同下调bcl-2基因的表达，提高细胞对砷剂的敏感性和砷剂的疗效，相应减少砷剂的用量，使之安全高效地应用于临床。

实验用流式细胞仪碘化丙啶(PI)染色法测定细胞DNA含量，低于合成前期(G1期)DNA含量的细胞为凋亡细胞，从而可测定凋亡细胞数量。用免疫荧光测定bcl-2蛋白的表达。

实验结果见表1～2和附图1～13：

表一、As₂O₃与ASODN联合诱导NB4和K562细胞凋亡百分率(％)。(取指数生长期的细胞，接种于24孔板，置于5％CO₂培养箱中，ASODN浓度10μmol/L，SODN(正义寡脱氧核糖核苷酸)浓度10μmol/L，空白对照组加入等量RPMI-1640培养液，作用96小时，对K562细胞，As₂O₃浓度为2.0μmol/L，对NB4细胞，As₂O₃浓度为0.25μmol/L，)

    细胞系  对照组  As₂O₃  ASODN  As₂O₃+  SODN  As₂O₃+  ASODN    K562  (As₂O₃2.0μmol/L)2.54±0.50  14.61±3.2 10.66±3.5  11.33±5.5 38.45±6.2*    NB4  (As₂O₃0.25μmol/L)3.85±1.2  5.22±1.8 15.68±4.2  7.10±3.1 34.67±4.4*

表一所示，As₂O₃(2.0μmol/L)+ASODN(10μmol/L)联合作用于K562细胞96小时流式细胞仪测定凋亡百分率为38.45％，与单用As₂O₃(2.0μmol/L)、ASODN(10μmol/L)凋亡百分率相比，单因素方差分析有显著差异(p＜0.01)，而As₂O₃(2.0μmol/L)+SODN(10μmol/L)凋亡百分率为11.33％，与单用As₂O₃(2.0μmol/L)相比无显著性差异(p＞0.05)。As₂O₃(0.25μmol/L)+ASODN(10μmol/L)联合作用于NB4细胞96小时，凋亡百分率为34.67％，与单用As₂O₃、ASODN相比，单因素方差分析有显著差异(p＜0.01)，而联用SDON组与单用As₂O₃相比无差异。

表二、流式细胞仪检测K562和NB4细胞bcl-2阳性率(％)，作用96小时。

    细胞系对照组  As₂O₃  ASODN  As₂O₃+  SODN As₂O₃+ ASODN    K562  (As₂O₃2.0μmol/L)71.70±11.2 55.53±14.5  54.96±13.8  48.76±10.6 20.65±5.68*    NB4  (As₂O₃0.25μmol/L)72.08±8.9 65.53±15.6  48.78±10.6  59.76±7.9 26.94±3.92*

表二所示为As₂O₃与bcl-2ASODN对K562及NB4细胞联合作用96小时，流式细胞仪测定bcl-2阳性细胞数百分率，单因素方差分析示As₂O₃+ASODN组与As₂O₃组及ASODN组相比有显著性差异(p＜0.01)，As₂O₃+SODN与As₂O₃组相比无显著性差异(p＞0.05)。

图1是K562及NB4细胞的生长曲线。细胸生长的起始密度为2×10⁴/mL，置37℃，饱和湿度，5％二氧化碳培养箱中。

图2是不同浓度的As₂O₃对K562细胞生长的抑制作用曲线图。取指数生长期的细胞，细胞起始密度为2×10⁵/mL，置37℃，饱和湿度，5％二氧化碳培养箱中。

图3是不同浓度的As₂O₃对NB4细胞生长的抑制作用曲线图。

图4是不同浓度As₂O₃诱导K562细胞凋亡的百分率图。

图5是不同浓度As₂O₃诱导NB4细胞凋亡的百分率图。

图6是不同浓度bcl-2 ASODN对K562细胞的抑制作用曲线图。

图7是不同浓度bcl-2 ASODN对NB4细胞的抑制作用曲线图。

图8是不同浓度bcl-2 ASODN诱导K562细胞凋亡的百分率图96小时。

图9是不同浓度bcl-2 ASODN诱导NB4细胞凋亡的百分率图。

图10是bcl-2 ASODN与1.0μmol/L As₂O₃联合对K562细胞生长的抑制效应曲线图。

图11是bcl-2 ASODN与2.0μmol/L As₂O₃联合对K562细胞生长的抑制效应曲线图。

图12是bcl-2 ASODN与0.25μmol/L As₂O₃联合对NB4细胞生长的抑制效应曲线图。

图13是bcl-2 ASODN与0.5μmol/L As₂O₃联合对NB4细胞生长的抑制效应曲线图。

图14是经全硫代修饰的反义寡核苷酸化学结构图。

我们可得出结论：根据bcl-2基因的特定部位设计出特定的反义核酸，它能特异性地抑制bcl-2基因的表达，促进白血病和肿瘤细胞的凋亡，提高药物敏感性，克服耐药性，对正常组织几乎无毒副作用，可作为药物应用于临床。bcl-2反义核酸与三氧化二砷联合作用，可协同下调bcl-2蛋白的表达，促进诱导细胞凋亡，相对提高对三氧化二砷的敏感性，从而减少砷剂的用量，减少毒副作用的发生，克服肿瘤细胞的耐药性。

实施例1：合成bcl-2-ASODN的原料A.T.G.C.可从国外进口，依序列5’-ATCCTCCCCCAGTTCACC-3’，用核酸合成仪自动合成，18个经全硫代修饰。使用前加生理盐水配制所需浓度，可采用静脉点滴的方式发药。

实施例2：称取三氧化二砷干粉0.1978克，用1mmol/L的NaOH滴定至完全溶解，加入三蒸水，用1mmol/L的HCl调整pH为7.2，定容至1000mL，配制成1mmol/L三氧化二砷储存液，使用前加生理盐水配制成所需浓度。另bcl-2-ASODN加生理盐水配制成所需浓度。两者可分别采用静脉点滴的方式给药，协同发挥作用。