可致成人腹泻的新轮状病毒(Rotavirus)及其培养方法

摘要

本发明涉及一种新的轮状病毒(Rotavirus)J19,其培养方法以及在医学中的应用。含新RV的病人粪便标本经高浓度Trypsin(100μg/ml)37℃作用1h,接种于PHEK细胞,37℃吸附1h后,补加无血清含Trypsin(100μg/ml)的DMEM,37℃转鼓培养3d,收获细胞培养液,冻融一次,作为下一代培养的接种物,培养传代。用PAGE、IF、EM和IEM对细胞培养液进行病毒核酸、抗原及形态检查。结果从10份粪便标本中培养分离到一株病毒,定名为J19。该病毒能在PHEK细胞上稳定培养传代,其病毒核酸(dsRNA)电泳图型与初始用于接种细胞的粪便标本中的dsRNA电泳图型完全一致,而与A、B、C组RVdsRNA电泳图型明显不同。J19株不属于A、B、C组RV,而是一种新RV。该轮状病毒(Rotavirus)J19已于2001年10月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.0647。

说明书

技术领域

本发明涉及新颖的轮状病毒(Rotavirus)J19，其培养方法以及在医学中的应用。该轮状病毒(Rotavirus)J19已于2001年10月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.0647。

技术背景

轮状病毒(Rotavirus，RV)是人和动物腹泻重要的病原体(参见文献1)，并根据基因组RNA电泳图型和组特异性蛋白(抗原)，已将其分为七个组(A-G)(参见文献2)，其中A、B、C三组RV能感染人，引起腹泻(参见文献3)。A组RV是婴幼儿重症腹泻最主要的病原体(参见文献4)。B组RV中成人腹泻轮状病毒(Adultdiarrhea rotavirus，ADRV)能引起成人严重的霍乱样的腹泻(参见文献5)。C组RV也能引起儿童重症腹泻，有散发，也有小规模暴发(参见文献6和7)。1987、1988年我国湖南省和福建省分别在两次腹泻调查中从个别腹泻标本发现病毒核酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图型与ADRV dsRNA电泳图型不同的新轮状病毒(参见文献8和9)。该病毒1994年在北京某高校引发一起成人腹泻暴发流行(参见文献10)。1997年河北省一所高校由于水源污染，在千余名学生中发生腹泻流行，检查证明引起此次腹泻流行的病原也是这种与ADRV不同的轮状病毒(参见文献11)。这种新RV引起的成人腹泻从散发到暴发流行表明该病毒已成为人类感染性腹泻另一种病原体。我国一些学者曾对此种病毒进行过初步鉴定，但结论并不一致。有的学者认为该病毒不属于已发现的致人类腹泻的A、B、C组及致动物腹泻的D组RV(参见文献12)。有报告认为新RV与A组RV无血清学交叉反应；而与B组ADRV病毒有交叉反应(参见文献11)。有的学者报告该病毒既不属于A组也不属于B组RV(参见文献13)。由于这种新RV不能在细胞上培养传代，对其生物化学、生物学、分子和抗原特性以及它的复制环不能进行详细研究，因此，该新RV在分类学上的地位至今尚未确定。

发明内容

为进一步研究该病毒，发明人采用高浓度蛋白水解酶处理病毒，然后在原代人胚肾(Primary Human Embryo Kidney，PHEK)细胞上进行转鼓培养的方法，使这种目前只在我国发现的能引起人类腹泻流行的新RV在细胞上培养获得成功，并已在PHEK细胞上连续传代28代。据我们所知，这种新RV在细胞上培养和稳定传代，在国内外，本文是第一次报告。

因此，本发明的目的是提供一种新型轮状病毒J19，CGMCC No.0647，该病毒可在PHEK细胞上进行传代培养；EM下为70nm大小的三层壳完整的病毒颗粒；PAGE电泳图型显示，培养得到的J19株核酸电泳图型与新RV病毒患者粪便标本中dsRNA完全一致，与A组RV和B组RV完全不同；PHEK细胞培养传代的J19病毒抗原与13份新RV腹泻病人恢复期血清呈IF阳性反应，血清滴度在1∶20到1∶40之间，与10份ADRV腹泻病人恢复期血清、兔抗A组RV和ADRV血清均为IF阴性；经IEM证实，经培养得到的J19株和新RV粪便标本的RV与新RV腹泻病人恢复期血清存在免疫学关系。

本发明的另一目的是提供上述新型轮状病毒J19的培养方法，包括将含新RV的病人粪便标本经高浓度Trypsin(胰蛋白酶，例如80-120μg/ml，优选100μg/ml)37℃作用1h，接种于PHEK细胞，37℃吸附1h后，补加无血清含Trypsin(80-120μg/ml，优选100μg/ml)的DMEM，37℃转鼓培养3d，收获细胞培养液，冻融一次，作为下一代培养的接种物，培养传代。用PAGE、IF、EM和IEM对细胞培养液进行病毒核酸、抗原及形态检查。

本发明还一个目的是提供该新型轮状病毒在医学中，尤其在制备疫苗和诊断试剂中的应用。

附图简述

图1是新RVJ19株与A组、B组dsRNA的PAGE电泳图型比较图，其中A：A组RV(长型)；B：A组RV(短型)；C：B组RV(ADRV)；D：新RV J19株感染PHEK细胞第20代的细胞培养液；E：新RV J19株感染MA104细胞第15代的细胞培养液；F：新RV成人腹泻粪便标本。

图2显示J19株(第18代)感染PHEK细胞后24h与新RV腹泻病人恢复期血清(1∶20)作用，用FITC-羊抗人IgG染色(间接IF)，(300×)。

图3是新RV电镜观察结果图，A：新RV J19株在PHEK细胞上传24代的细胞培养液中RV颗粒，B：新RV成人腹泻粪便标本中的RV颗粒。

图4是新RV IEM观察结果图，新RV J19株(A)、新RV腹泻粪便标本(B)与新RV腹泻病人恢复期血清(1∶20)的IEM。

实施例

实施例1    新RV-J19的培养传代和鉴定

                           材料与方法

一、粪便标本：

1.新RV阳性粪便标本：1997年4月河北省石家庄市某高校发生成人急性腹泻暴发流行，共有1055名学生发病。主要临床表现为全身乏力、恶心、腹痛和腹泻，腹泻次数平均2-6次/日，大便性状多数为黄水样便，少数为稀便或软便，病程1-8天。80％以上患者有发热(38℃-40℃)。取流行期住院腹泻病人粪便标本，经检查新RV dsRNA阳性，-20℃保存。

2. ADRV阳性粪便标本，为1986年采自河北省唐山市ADRV腹泻大流行病例(参见文献14)。

二、血清

1.新RV腹泻病人急性期和恢复期血清(病后2-3周)共13份，由河北省卫生防疫站提供(参见文献11)。

2.ADRV腹泻病人恢复期血清10份，采自唐山市ADRV腹泻病人(参见文献14)。

3.兔抗ADRV血清：购自中国预防医学科学院病毒学研究所。

4.兔抗A组RV血清：购自卫生部兰州生物制品研究所。

三、原代人胚肾(Primary Human Embryo Kidney，PHEK)细胞的培养：取人胚肾按常规方法消化肾细胞(参见文献15)，用细胞生长液(DMEM(GIBCO)，加10％小牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml)制成3×10⁵个/ml细胞悬液，加到细胞瓶(10×5×3cm)内，每瓶8ml，37℃培养3-5d，细胞形成单层后，用胰酶消化分散细胞，加细胞生长液，1瓶细胞变2-3瓶，37℃培养传代。

四、新RV粪便的处理：新RV核酸阳性的粪便标本用DMEM含100μg/ml胰蛋白酶(Trypsin DIFCO，1∶250)制成10％悬液，混匀，3000r/min，4℃离心10min，上清液用0.45μm滤膜过滤，然后将滤液置于37℃水浴作用60min，作为细胞接种物。

五、新RV在PHEK细胞上的培养和传代

1.在试管内培养传代：取1ml细胞悬液加到试管(1.0×10cm)内，37℃静止培养2-3d，细胞形成单层，使用前1h去掉生长液，用细胞洗液(无小牛血清DMEM，加青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml)洗2次，每次1ml/管，然后再加洗液1ml/管备用。接种标本前，将细胞管内的洗液去掉，接种制备好的细胞接种物，每管200μl，每份接种物接种2管，然后将接种标本的细胞置37℃温箱作用1h，每隔15min振动一次，使接种物与单层细胞充分接触。37℃作用1h后，每管加含100μg/ml Trypsin无血清DMEM 0.8ml，放37℃转鼓培养3d，收获细胞培养液(Cell Culture fluids，CCF)，-20℃冻融一次，作为下一代病毒传代的接种物，每管接种200μl。以后的连续传代均以同样方法进行。

2.在细胞瓶内培养传代：当CCF用PAGE检查有11条核酸带存在而且核酸电泳图型与粪便标本中新RV核酸电泳图型一致以后，细胞培养物改用细胞瓶培养传代。PHEK细胞形成单层后，用洗液洗3次，每次2-3ml/瓶，接种上一代CCF0.5ml/瓶，37℃吸附1h，每隔15min振动一次，吸附以后加含100μg Trypsin无血清DMEM 8ml/瓶，37℃转鼓培养3d，-20℃冻融一次。以后的传代以同样的方法进行。

六、检查方法

1.病毒dsRNA PAGE分析：粪便标本及CCF用酚-氯仿提取病毒dsRNA，乙醇沉淀。提取的dsRNA用10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳4h，凝胶用硝酸银染色，具体方法见文献16、17。

2.免疫荧光(Immunofluorecence，IF)：PHEK细胞在试管或培养瓶内生长成单层以后，接种上一代CCF，37℃转鼓培养，20-24h或不同时间取出1.0mlCCF，2000r/min离心5min，弃上清液，加1.0ml 0.01mol/L PBS，pH7.2重悬细胞沉淀，同法再离心一次，弃上清液，用少量PBS再重悬细胞沉淀并滴在载玻片上，吹干，冷丙酮固定10min，制成抗原片。抗原片与不同稀释度的新RV腹泻病人双份血清、ADRV腹泻病人恢复期血清和兔抗A组RV、ADRV血清37℃作用45min，用PBS洗二次，蒸馏水洗一次后，吹干，用羊抗人IgG(或羊抗兔IgG)-异硫氰酸荧光素结合物(上海生物制品研究所生产)染色，37℃45min，PBS洗二次，蒸馏水洗一次，吹干，镜检。

3.电镜(EM)和免疫电镜(IEM)

(1)EM：J19株在PHEK细胞上传24代，37℃转鼓培养24h的CCF和10％新RV粪便标本分别与等体积的三氯三氟乙烷混合，振荡10min，4000rpm，4℃离心10min，取水相，90000×g，4℃离心90min，弃上清，沉淀悬于1/100体积蒸馏水。取少许浓缩的CCF或粪便标本，加到碳包被的铜网上，2％磷钨酸水溶液负染，用TEOL，JEM-1010电镜检查。

(2)IEM：取100倍浓缩的J19株第24代CCF和新RV粪便标本各20μl分别与20μl新RV腹泻病人恢复期血清(1∶10)混合，37℃作用2h后，90000×g，4℃离心90min，沉淀悬于20μl蒸馏水，滴在铜网上，负染，镜检。

                           结  果

一、新RV在PHEK细胞上的培养和传代

1.新RV阳性粪便标本经高浓度Trypsin处理，接种于PHEK单层细胞后，37℃转鼓培养3天，连续传代6代，从10份粪便标本接种的PHEK细胞中，分离培养出一株病毒，用PAGE检查该株病毒CCF，dsRNA阳性，核酸电泳图型与粪便标本中dsRNA电泳图型完全一致。我们将此分离物定名为J19。J19株在试管内生长的PHEK细胞上传9代后，改在细胞瓶内生长的细胞上转鼓培养，连续传28代，dsRNA仍然阳性，而且电泳图型不变(图1)。此结果表明新RV J19株在PHEK细胞上培养和稳定地传代已经获得成功。

二、PHEK细胞感染J19株后的变化：接种病毒，37℃吸附1小时后，细胞单层变成网状。置37℃转鼓培养后，细胞仍以网状粘附在管(瓶)壁上。8-20h大部分细胞成片状，少量细胞成单个细胞，悬浮在细胞培养液中或粘附在管(瓶)壁上，细胞完整光滑。24h大部分细胞成片状，表面光滑，部分细胞破碎成梭状、大小不等的颗粒。36h细胞表面粗糙，片状细胞失去光滑变暗或破碎。48h大部分细胞破碎，片状细胞变暗、粗糙成菜花样，有成片细胞残骸粘附在管(瓶)壁上，只有少数小片状细胞团透明完整。72h细胞全部破碎，无片状细胞存在。

正常的PHEK细胞在同样条件(DMEM含100μg/ml Trypsin)培养，37℃作用1h后，单层细胞变成网状，24-36h绝大部分细胞成片状粘在管(瓶)壁上或悬浮在培养液中，细胞透明，边缘清楚，48h片状细胞透明边缘清楚，少数细胞破碎，72h破碎细胞增多，少部分成片的细胞失去光泽、变暗，但大部分成片细胞仍透明，细胞界限清楚。接种新RV J19株的PHEK细胞与未接种病毒的正常PHEK细胞相比，有明显差别：J19株感染的细胞变暗、粗糙、破碎，出现的早(24h)，进展的快，72h细胞全部破碎。

三、感染细胞中新RV抗原的检查：用J19株第18代CCF感染PHEK细胞后，不同时间用新RV腹泻病人恢复期血清进行IF试验，检查J19株病毒抗原，结果如表1。

J19株感染PHEK细胞后，37℃转鼓培养，10h即可在少数细胞浆内检查到病毒抗原，12h 20％左右，14h 50-60％细胞浆内能检测到抗原，16-24h大部分细胞均抗原阳性(图2)。结果表明细胞感染J19株后16-24h用IF法检查病毒抗原最为适宜，因为在这段时间内，感染的细胞大部分是完整的而且病毒在PHEK细胞浆内形成的抗原量大。此后，大多数感染的细胞破碎，无法进行感染细胞的检查。

           表1 J19株感染PHEK细胞后不同时间

                  新RV抗原的检查  感染PHEK细胞后     病人恢复期血清号(血清稀释度)

 的时间(h)           5(1∶20)     11(1∶20)

   10                    +            +

   12                   ++           ++

   14                  +++          +++

   16-24                 #            #

注：+＝1-10％细胞IF阳性，++＝10-40％细胞IF阳性，

+++＝40-80％细胞IF阳性，#＝80-100％细胞IF阳性

四、J19株病毒抗原与腹泻病人血清、兔抗A组RV和兔抗ADRV血清的反应：(1)与新RV腹泻病人双份血清的反应：13份恢复期血清均与J19株病毒抗原呈IF阳性反应，血清滴度在1∶20至1∶40之间；13份急性期血清均IF阴性。(2)与10份ADRV腹泻病人恢复期血清、兔抗A组RV和ADRV血清均为IF阴性。

从结果可以看出，石家庄市新RV腹泻病人恢复期血清与J19株病毒抗原反应的滴度比急性期血清高20-40倍，表明PHEK细胞培养传代的J19株病毒是新RV腹泻病原体，与A组RV及B组的ADRV无血清学交叉反应。

五、J19株对PHEK细胞的感染性：J19株在PHEK细胞传18代后，将CCF进行10倍系列稀释(10^-1-10^-5)，然后接种PHEK细胞，0.2ml/管，37℃吸附1h，37℃转鼓培养24h，进行IF检查，结果见表2。

结果表明J19株，在PHEK细胞上传18代，CCF经10^-5稀释对PHEK细胞仍具有感染性。

            表2 J19株病毒对PHEK细胞的感染性

    病毒稀释度                     IF阳性细胞百分率

    10^-1                            80-90

    10^-2                            40-60

    10^-3                            30-40

    10^-4                            20-35

    10^-5                            10-15

六、EM和IEM

1.EM：J19株在PHEK细胞上培养24代，37℃转鼓培养24h的CCF，经高速离心浓缩后，负染，电镜检查可见70nm左右的三层壳完整的RV病毒颗粒(图3)，未见其他病毒颗粒。培养3d收获的CCF在镜下所见到的病毒大部分为单、双层颗粒，很难见到三层壳颗粒，这可能是由于CCF中Trypsin浓度高致使病毒外壳、中壳脱落造成的。

2.IEM：J19株第24代CCF和新RV腹泻粪便标本经100倍浓缩与新RV腹泻病人恢复期血清作用后，在电镜下两者均观察到集聚的轮状病毒-抗体复合物(图4)，表明J19株和新RV粪便标本的RV与新RV腹泻病人恢复期血清存在免疫学关系。

实施例2  新RV-J19在医学中的应用

一、新RV诊断试剂

1、用培养的新RV-J19按本领域已知的方法，制备单克隆和多克隆抗体，组装酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒。

2、用胶体金标本抗体制备快速检测新RV抗原的试剂条。

3、用所培养的J19感染的细胞制备抗原片进行免疫荧光试验(IFA)检测人和动物机体新RV抗体水平的调查。

二、新RV疫苗的研制

1、按常规方法，用培养的J19经β-丙内酯或甲醛灭活后制成灭活疫苗，用于人群免疫。

2、用培养的J19细胞在细胞上进行长期传代，使J19毒力减弱后，制成减毒活疫苗。

3、制备重配疫苗，以J19株为亲本，用基因重配技术，使非可培养的与新RV同组的RV的基因重配在J19基因组上，然后将基因重配体在细胞上培养可产生大量的重配基因，制备基因重配疫苗。

三、新RV的基因分析及应用

1、从培养的新RV-J19提取病毒dsRNA按分子克隆技术进行各基因的克隆和核酸序列分析。

2、用克隆的J19各基因与原核或真核细胞表达载体重组构建表达系统研究新RV-19的各基因的功能及基因工程疫苗。

3、用克隆的J19基因的互补DNA(cDNA)制备核酸探针进行J19的基因诊断和相关轮状病毒亲缘关系的研究。

文献记载七个组轮状病毒中，只有A、B、C组中一些病毒株能引起人类腹泻流行(参见文献3)。目前为止，引起人类腹泻的A组RV的一些毒株在Trypsin存在条件下能在原代或传代细胞(MA104，CV1)培养传代，C组RV能在Caco-2培养传代，人B组RV(ADRV)尚不能在细胞上培养传代(参见文献18)。Sato报告，蛋白水解酶(Protelytic enzymes)能提高RV的生长，胰酶(Pancreatin)处理有助于非A组RV在细胞上适应传代(参见文献19)。Oseto等用此法成功地使人C组RV适应于结肠癌传代细胞(Caco-2)并传代(参见文献20)。Sanikata等报告用高浓度pancreatin处理病毒标本，使猪B组RV在猪肾细胞分离成功(参见文献18)。

我们用高浓度Trypsin(100μg/ml)处理病毒，首次成功地使引起成人腹泻的新RV在人胚肾细胞上培养传代。这个成功不仅非常有助于该病毒基因组结构、功能、蛋白组成、抗原特性、繁殖(复制环)、形态发生以及其分类学地位的研究，而且将有助于致人类腹泻的肠道病毒病原体包括非A组RV的体外分离培养。用100μg/ml Trypsin处理病毒并在细胞生长液中加同样浓度的Trypsin虽然能使细胞从培养管(瓶)壁脱落，但不影响病毒的复制，因为J19株对PHEK细胞的感染滴度能达10^-5以上。关于J19株致细胞病变作用(Cytopathiceffects，CPE)，尽管由于Trypsin浓度高，细胞从管(瓶)壁脱落，无法在单层细胞上观察病毒的CPE，但在脱落悬浮于培养液或粘附在管(瓶)壁上的细胞片或细胞团上可见到病毒感染的细胞从失去光泽、粗糙，直到破碎的变化过程。

J19株感染细胞后10-12h即可查出病毒抗原。18-24h抗原量最大，是进行IF检查的最适时期。J19株感染PHEK细胞CCF的dsRNA电泳图型与新RV粪便中的dsRNA电泳图型完全相同，证明J19株即为新RV的PHEK细胞适应株。IF结果表明J19株只与新RV病人恢复期血清反应，比急性期血清反应滴度高20倍以上，而与A组RV和ADRV无免疫学关系。从上述结果可以看出，新RV既不属于A组RV也不属于B组、C组RV，而是一种引起人类腹泻的新病原体。

我们实验证明，经高浓度Trypsin处理的J19株，在PHEK细胞上37℃静止培养也能生长、复制、传代；而且在同样条件下，J19株也能在猴肾传代细胞MA104细胞上培养传代。

                        参考文献

1、Estes，M.K.，and J.Cohen..Rotavirus gene structure and function.Microbiol.Rev.1989，53：410-499.

2、Saif，I.J.Non group A rotaviruses.1990，p73-95.In I.J.Saif andK.W.Theilc(ed).Varal diarrhea of man and animals.CRC press，Boca Raton.Fla..

3、Gouvea，V.，J.R.Allen，.I.Grass，et al.Detection of group B andC rotaviruses by polymerase chain eaction.J.Chin.Microbiol.1991，29：519-523.

4、Kapikian，A.Z.and.M.Chanock.1985.Rotaviruses，p863-906.InB.N.Fields，D.N.Knipe，et al.Virology.Raven press，New York.

5、Hung，T.Rotavirus and adult diarrhea.Adv.VirusRes.1988，35：193-218.

6、Brown，D.W.，L.Campbell，and J.Briger.A school outbreak ofgastroentertis due to an atypical rotavirus.Abstr.VIIIth Intcongr.Virol.1990，p71-011，p434.

7、Ccaul，E.O.，C.K.Asheley，et al.Group C rotavirus associated withfatal enteritis in a family outbreak.J.Med.Virol.1990，30：201-205.

8、胡超文，黄发利，周乐松，等.515例急性腹泻患者病原学调查研究。中华流行病学杂志编辑部，腹泻病专辑，1987.8.

9、陈锦生，邓涤夷，陈霞，等.福建省首次检查的成人轮状病毒。中国人兽共患病杂志，1988，4(4)：23。

10、钱渊，张又，刘军，等.在北京爆发流行的成人腹泻粪便中发现非A组轮状病毒。中华实验和临床病毒学杂志，1994，(增刊)：75。

11、陈淑芬，孟宗达，张志珍，等.新型B组轮状病毒引起腹泻爆发流行的初步报告。中华流行病学杂志，1998，19(特刊载)：95-97。

12、王长安，胡超文，黄发利，等.在我国患急性腹泻的成人中发现一种新轮状病毒。病毒学报，1987，3：321。

13、杨红彦，陈淑芬，纪绍忠，等.一株新轮状病毒引起河北省石家庄市成人腹泻爆发流行。中华流行病学杂志，1998，19(6)：336-338。

14、纪绍忠，张新生，杨凤蓉，等.唐山赵各庄煤矿成人轮状病毒腹泻爆发流行的病原学研究，中华流行病学杂志，1988，9(特刊4)：10-14。

15、纪绍忠.病毒分离培养技术，见：尚德秋，张树波，纪绍忠等编写的防疫检验。北京：中国科学技术出版社。1991，233-239。

16、Kalica，A.R.，C.F.Garon，R.G.Wyatt.，et al..Differentiation ofhuman and calf reovirus-Like agents associated with diarrhea usingpolyacylamide gel electrophoresis of RNA.Virology，1976，74：86-92。

17、Rodger，S.M.，and I.H.Holmes.Comparison of the genomes ofsimian，Bovine，and human rotaviruses by gel electrophoresis and detectionof genomic Variation among bovine isolates.J.Virol.1979，30：839-846。

18、Sanekata，T.，Kuwamoto，Y.，et al.Isotalion of group B porcinerotavirus in cell culture.J.Clin.Microbiol.1996，34：759-761。

19、Sato，K.，Y.Inaba.，T.Shinoraki.，et al.Effect of enzymes on the growthof human and amimal rotaviruses.J.Vet.Med.Sci.1995，57：569-570.

20、Oseto，M.，Y.Yamashita.，et al.Serial propagation of human group Crotavirus in a continous cell line(CaCo-2).Igakunoayumi，1994，168：177-178.In Japanese)。