人骨髓和脐带血间充质干细胞体外分离扩增和向神经细胞定向诱导的方法

摘要

本发明利用比重1.073的percoll和比重1.077的淋巴细胞分离液分别分离骨髓和脐带血中的单个核细胞,用MesencultTM(Stem Cell Co.)培养基纯化扩增间充质干细胞,利用适当浓度的强抗氧化剂体外诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化。

说明书

本发明涉及人骨髓和脐带血间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的体外分离扩增和向神经细胞的定向诱导分化。

随着组织工程和基因工程的兴起和发展，干细胞的研究成为21世纪的热点之一。在人和动物的个体发生发育过程中，在胚胎和成年组织中均存在着具有高度更新能力和多向分化潜能的干细胞。干细胞可体外分离、扩增和冷冻保存，而且在适当的条件下可被诱导分化为多种细胞和组织，这为探讨人和动物胚胎发生、组织细胞分化、基因表达调控等发育生物学问题提供了理想的模型系统，同时也为临床组织缺陷性疾病和遗传性疾病的细胞替代治疗和基因治疗(目的基因导入干细胞)开拓了新途径。目前，干细胞初步分为胚胎干细胞和组织干细胞两大类。虽然胚胎干细胞更具有全能性，但对人的胚胎干细胞研究由于受到伦理和取材困难等因素的限制，研究较少。而组织干细胞存在于胎儿和成人各种组织器官中，来源相对广泛，而且组织干细胞的深入研究不涉及伦理问题，而且取自病人的组织干细胞定向诱导分化以后输注给病人，不存在免疫排斥。因此，组织干细胞是干细胞工程的一类主要研究对象。

MSCs是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞。体外培养的骨髓MSCs已被广泛应用于研究领域。最近报道，脐带血中也存在MSCs。脐带血MSCs和骨髓MSCs类似，表达多种表面标志如SH3、SH4、CD29、CD90等；但不表达造血干细胞系的表面标志，如脂多糖受体CD14、CD34以及白细胞表面抗原CD45等。这群细胞特性稳定，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。实验表明，在体外特定的诱导条件下，骨髓MSCs可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉等多种细胞；脐带血MSCs也具有向骨和脂肪细胞分化的能力。这为组织工程进行细胞治疗提供了新的种子细胞，有很大的临床应用前景。

本发明的目的是探索骨髓和脐带血MSCs的体外分离、纯化、扩增以及定向分化为神经细胞的条件，为骨髓和脐带血MSCs用于临床治疗损伤性和遗传性神经疾病提供更充足的理论依据和技术方法。

下而用实施例对本发明进行进一步详细说明。

实施例1.骨髓MSCs的分离、纯化和扩增培养

一、材料和方法

无菌条件下采集非血液系统疾病的人骨髓，用含15％胎牛血清(Hyclone)的α-MEM培养液5倍稀释，400g离心5min，弃上清及脂肪层，加入5mL含15％胎牛血清的α-MEM培养液，制成细胞悬液，轻轻叠加到比重为1.073的Percoll分离液上，400g离心20min，取界面层，加入5ml PBS制成单细胞悬液，离心洗涤.以2.0×10⁵/cm²(T-25培养瓶)的密度接种于Mesencult培养液(StemCell Co.)中，置于37℃，5％CO₂和饱和湿度的孵箱内培养.培养3d后，更换培养基，弃掉未贴壁细胞。以后每3d换液一次.细胞长到80％融合时用1∶1的0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化传代(在显微镜下控制消化时间)，以8.0×10³/cm²的密度接种于传代培养瓶(T-25)中进行扩增培养。

二、结果

MSCs呈较均一的长梭形，三周左右细胞生长达80％～90％融合，每个克隆约数百至数千个细胞。将这些细胞传代培养，传代后的MSCs一周左右达融合，每瓶单层融合的MSCs消化后平均获得(5.5±0.17)×10⁵个细胞。5.0×10⁵个原代成人骨髓MSCs在体外扩增15代后获得7.5×10¹²个细胞，扩增约1.36×10⁷倍。

实施例2.脐带血MSCs的分离、纯化和扩增培养

一、材料和方法

无菌条件下采集肝素抗凝的非血液系统疾病的人脐带血50-100mL，与0.01M PH7.4的PBS按1∶1混匀，再按4∶1与0.5％的甲基纤维素混匀，静置30min沉降红细胞。吸上清离心，弃上清，用PBS制成单细胞悬液，叠加到比重1.077的淋巴细胞分离液上，400g离心20min，取界面层，加PBS制成单细胞悬液，离心洗涤，以1.0×10⁶/cm2(T-25培养瓶)的密度接种于Mesencult培养液(Stem Cell Co.)中，置于37℃，5％CO₂和饱和湿度的孵箱内培养。一周后，更换培养基，弃掉未贴壁细胞.以后每3-4d换液一次。细胞长到80％融合时用1∶1的0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化传代(在显微镜下控制消化时间)，以8.0×10³/cm²的密度接种于传代培养瓶(T-25)中进行扩增培养。

二、结果

培养的脐带血单个核细胞，一周后全量换液，去除未贴壁细胞，有的脐带血样单个核细胞培养后出现破骨样细胞，有的脐带血样单个核细胞培养后出现间充质干细胞。破骨样细胞胞体较大，呈圆形，多个核。间充质干细胞胞体呈梭形，最初散在存在，两周后形成几十到几百个细胞的克隆，随着细胞的迅速增殖，三周后细胞生长达80％～90％融合，每个克隆约几百至几千个细胞，此时的MSCs呈较均一的长梭形，形态类似于骨髓MSCs，但较骨髓MSCs稍小。每瓶单层融合的脐带血MSCs消化后平均获得(8.25±0.49)×10⁵个MSCs，将这些细胞传代培养，6.6×10⁵个脐带血原代MSCs在体外扩增10代后获得9.9×10⁸个细胞，扩增约1.5×10³倍。

实施例3.骨髓和脐带血MSCs的表面抗原特性

一、方法

分别取扩增一代的骨髓和脐带血MSCs，去掉培养液，PBS洗两遍，用1∶1的0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化，用含2％BSA的PBS洗涤后分别制成浓度为1.0×10⁶/mL的单细胞悬液。骨髓MSCs单细胞悬液分别加入3个Eppendof管，每个Eppendof管加500μl，1号管为阴性对照，加入抗鼠的5μlIgG1-FITC和5μl IgG1-PE单克隆抗体；2号管加入抗人的5μlCDlla-FITC和5μl CD29-PE单克隆抗体；3号管加入抗人的5μl CD71-FITC和5μl CD34-PE单克隆抗体。脐带血MSCs单细胞悬液分别加入6个Eppendof管，1号和2号管为阴性对照，分别加入抗鼠的5μlIgG1-FITC和5μl IgG1-PE单克隆抗体；其余四管分别加入抗人的5μl CD71-FITC、5μl CD34-PE、5μlCD11a-FITC、5μl CD29-PE单克隆抗体。室温孵育20min，流式细胞仪检测。

二、结果

经流式细胞仪检测发现，扩增一代的骨髓和脐带血MSCs不表达CD34、CD11a，强表达CD29，弱表达CD71。CD34是造血干细胞的特异性表面标志，CD11a(LFA-1αchain)是淋巴细胞标志，CD29是整合素家族的成员，CD71是转铁蛋白受体。这表明MSCs是骨髓和脐带血中区别于造血细胞的一群处于未分化状态的非定向干/祖细胞。

实施例4.骨髓和脐带血MSCs的向神经细胞的诱导分化和鉴定

一、方法

分别取体外扩增2、6、10代后的骨髓MSCs和2、5、8代后的脐带血MSCs，以8.0×10³/cm²浓度接种于放置有消毒盖玻片的六孔板内，制备细胞爬片，每孔加2ml Mesencult培养液，达到60-70％融合时，换成含20％胎牛血清(Hyclone)和3μmol/Lβ-巯基乙醇的DMEM培养液预诱导24h，PBS(PH7.4)洗涤，而后换成含2％DMSO和200μmol/L丁化羟基苯甲醚(BHA)的DMEM培养液进行诱导。半小时后开始在显微镜下观察，以后每隔半小时观察一次，直到细胞形态无明显变化。

对于骨髓和脐带血MSCs，分别取诱导2h、4h、6h、12h后的细胞爬片，参照Hi stostain^TM-SP(链酶卵白素-过氧化物酶)试剂盒(北京中山生物技术公司)操作方法进免疫组织化学实验，检测神经丝蛋白(neurofilament，NF)和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)。同时分别取诱导后6h、8h的细胞爬片，用甲苯胺蓝染色，观察尼氏体。

二、结果

在预诱导后12h已发现原来大而扁平的MSCs胞体发生收缩，细胞边缘变的不规整，有许多细的指状突起。预诱导结束时，一部分细胞胞体已变成近似圆形。正式诱导后的3h内细胞发生明显的形态学变化，细胞胞体进一步收缩，形成圆形，不规整的锥形、三角形，有的细胞有多个突起，而且发出分支，终末端有类似神经元细胞的终结；有的突起逐渐伸长，形成圆锥状终末端，类似于Golgi I型神经元的长轴突。5h后细胞形态基本不再发生明显变化，观察发现：骨髓MSCs有80％以上呈现典型的神经元样表型，脐带血MSCs有70％左右呈现典型的神经元样表型。

免疫组化结果表明，骨髓和脐带血MSCs诱导后不同时间均有NSE和NF表达，见表1。阳性细胞呈棕褐色。NSE阳性细胞表现为弥漫性胞浆着色，NF在核周和突起均有表达。

表1骨髓和脐带血MSCs诱导后不同时间的NSE和NF表达

   2h    4h    6h    12hNSE    ++    ++    ++    ++NF     ++    +++   +++   +++++为染色强阳性(深棕褐色)，++为染色阳性(棕色)

甲苯胺蓝染色发现，诱导6h和8h后的神经元样细胞的胞质中存在着深蓝色的块状或颗粒状的尼氏体。

这表明骨髓和脐带血MSCs均具有向神经细胞分化的潜能。