公开/公告号CN1335889A
专利类型发明专利
公开/公告日2002-02-13
原文格式PDF
申请/专利权人 C·B·F·莱蒂股份有限公司;
申请/专利号CN99816306.6
发明设计人 卡洛斯·贝达特·阿隆索;
申请日1999-12-23
分类号C12N15/30;C12N15/62;C07K14/44;C07K16/20;A61K31/70;A61K38/16;A61K39/395;A61P33/02;
代理机构永新专利商标代理有限公司;
代理人林晓红
地址 西班牙特雷斯坎图斯
入库时间 2023-12-17 14:06:51
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-01-17
专利权有效期届满 IPC(主分类):C12N15/30 授权公告日:20040721 申请日:19991223
专利权的终止
2004-07-21
授权
授权
2002-03-20
实质审查的生效
实质审查的生效
2002-02-13
公开
公开
发明目的
本说明书涉及一项发明专利申请，本发明涉及由编码L.INFANTUM四种蛋白质的抗原决定簇的DNA序列组成的嵌合基因，以及由此基因编码的可以用于预防和治疗利什曼病，尤其是犬科动物利什曼病的蛋白。本发明最明显的用途就是利用基因序列或得自嵌合基因的蛋白质制备药物组合物以用于预防或治疗利什曼病，尤其是犬科动物利什曼病，所述药物组合物可以通过例如疫苗或单克隆抗体制剂的形式作用于患者。在这里，患者并不仅仅限于犬类，还可以是那些具有免疫抑制现象的人类。为了实现上述目的，产生一种嵌合基因，其编码由“dd hoc”构建的嵌合基因的“体外”合成产生的嵌合产物组成的称为PQ的蛋白质，该蛋白质包含四种不同蛋白的5个抗原决定簇。该产物按照设计，应该具有高度的灵敏度和特异性，可以刺激机体产生针对犬科动物利什曼病的保护性免疫应答，或可以用于制备针对犬科动物利什曼病的抗体。
发明领域
本发明一般地用于药物制品的工业生产。
发明背景
利什曼病是一类在世界范围内广泛存在的疾病，其特征为可以引发多种临床症状。它是由利什曼属的寄生型原生动物引起的。
在自然界中，利什曼病主要是作为一种动物传染病，研究表明，人类是第二宿主。
L.Infantum，利什曼属中的一种，主要分布在地中海地区，会导致人类和犬类患内脏型利什曼病(Visceral Leishmaniosis：LV)。
实际上，被L.Infantum感染的犬类是这种寄生虫在动物中最主要的宿主，由于这类疾病具有较长的潜伏期，尤其是那些还没有产生可观察的临床症状的犬类更是潜在的传播源。
流行病学数据显示，犬科动物利什曼病的流行与这类寄生虫向人类的传播之间存在直接的联系。所以，为了防止这类疾病的蔓延，关键在于能否在感染或疾病发生的早期进行有效的诊断。
这种寄生虫在脊椎动物宿主身上的传播方式是通过白蛉亚科(Phlebotominae)的蝇类的叮咬实现的。通过这种方式，寄生虫进入单核吞噬细胞，在吞噬溶酶体结构中分化并产生鞭毛虫。
被感染的细胞会在特定的组织中聚集，例如脾、肝和淋巴结中。据估算，世界上大约有15,000,000人被感染患有利什曼病，并且以每年500,000人的速度递增，主要发生于不发达国家和发展中国家。
近来的流行病学数据表明，在欧洲西南部的国家，上文提及的由L.Infantum引发的内脏型利什曼病(Visceral Leishmaniosis：VL)已经日趋严重。
在意大利有些地区VL的发病率界于14.4％于37％之间。
在葡萄牙，尤其是里斯本附近区域，血清阳性率已达8.4％；在法国阿尔卑斯山附近的沿海地区，发病率从3.2％至17.1％不等。
在西班牙的加泰罗尼亚地区，平均感染率为9.3％，在某些地区，感染率甚至达到18％。
在马略卡岛，发病率为14％；木尔西亚为2.4％；格拉纳达为8.8％；萨拉曼卡为10％-15％；马德里省为5.25％；卡赛雷斯为14％。
虽然在人类中由L.Infantum引发的VL的病例相对较少，但是在犬科动物利什曼病高发地区，大量的感染利什曼病的人出现了免疫力消退的症状。
事实上，在欧洲南部，50％的利什曼病患者同时也是HIV病毒的携带者。另一方面，根据利什曼病-HIV共感染的数据，由于存在大量的尚不足以被检测的感染症状，估计被寄生虫感染的水平比现有的数据高一至两个数量级。
不同类型的利什曼感染的共同特征是它们都会引起宿主很强的体液应答反应。因此，基于血清学技术的检测方法是目前使用最广的检测方法。
无论是自然感染还是人为感染的情况，疾病的临床症状还未出现之前，抗体就可以被检测到。
这些检测的方法的灵敏度和特异性和使用的抗原的种类、来源和纯度相关。现在的商业化的免疫学方法，使用的是完整的鞭毛属生物或来源于鞭毛属生物的抗原。这种方法通常会和来源于麻疯病、肺结核、非洲tripanosomiasis、南美锥虫病(查格斯氏病)、疟疾和其它寄生虫病患者的血清发生交叉反应。
血清学方法检测的灵敏度和特异性和使用的抗原的种类、来源和纯度相关。在刚刚过去的几年中，许多利什曼病相关的抗原被确定和研究。其中有些还是特异针对这类寄生虫的蛋白。
在这些特异针对这类寄生虫的蛋白中，表面蛋白酶GP63、表面糖蛋白gp46和KMP-11蛋白值得一提。
另外一组利什曼病相关抗原由保守的蛋白质组成，，例如热激蛋白、微管蛋白和肌动蛋白等等。
为了研究犬科动物利什曼病的特异的血清学诊断系统的一部分，需要确定L.Infantum的抗原。采用的方法是，从患有犬科动物内脏利什曼病的狗血清中通过免疫检测的方法确定L.Infantum的基因表达库。
通过比较发现，用这种方法分离出的抗原都属于进化过程中的保守的蛋白家族。通过队这些抗原的表位B的研究发现，在所有的情况中，这些抗原决定簇都位于非极端保守的区域。
特别值得一提的是，在80％的VL患者血清样本中都发现有酸性核糖体蛋白LiP2a和LiP2b。
酸性核糖体蛋白LiP2a和LiP2b中应该包含利什曼病的特异的抗原决定簇。去除天然蛋白中的某些片段，可以得到重组的酸性核糖体蛋白LiP2a和LiP2b，它们可用于区别利什曼病和南美锥虫病(查格斯氏病)。
同时研究还表明L.Infantum的PO核糖体蛋白，一种在进化过程中高度保守的蛋白，在许多患有VL的狗的血清样本中都有发现。但是，它的抗原决定簇主要位于C端，即位于进化过程中该蛋白不保守的区域。
在78％的患有VL的狗的血清之中，都存在有抗H2A蛋白的抗体。并且抗体是由利什曼蛋白H2A上特异的抗原决定簇引发的，而不是由真核生物的H2A蛋白的共有序列引发的。
在患有VL的狗的血清中发现的抗原决定簇位于H2A蛋白的两端。
这样，一种明显的解决方案就是构建一个嵌合基因，它包含有编码蛋白LiP2a、LiP2b、LiPO和H2A的抗原决定簇的DNA序列，从而可以产生富含上述抗原决定簇的蛋白。
构建嵌合基因，它包含有编码所需的抗原决定簇的DNA序列，从而可以产生富含抗原决定簇的蛋白的这一目标，至少到现在为止，还没有实现。
发明描述
首先，本发明涉及一种嵌合基因，它由编码L.infantum的四种蛋白质的抗原决定簇的DNA序列组成，可以用于预防或治疗犬科动物利什曼病。
本发明涉及一种由上述嵌合基因编码的蛋白质。该蛋白包含一个或多个由上述嵌合基因编码的L.infantum的四种蛋白的抗原决定簇。
本发明还涉及一种预防或治疗人类和动物患犬科动物利什曼病的方法，在这一治疗方法中可以使用本发明的嵌合基因或由该基因编码的蛋白。也可以使用抗本发明的嵌合基因编码的蛋白或其抗原决定簇部分例如表位的抗体。
另一方面，本发明涉及可以用于预防和/或治疗人类或动物的利什曼病的药物组合物，其中的活性成分来源于或针对本发明的嵌合基因和/或其编码的蛋白。这种活性物质优选可以用于治疗和/或预防利什曼病的药物组合物。
特别地，这种药物组合物可以制成疫苗的形式，其包含本发明所述的嵌合基因编码的蛋白或蛋白的一个或多个部分，所述部分包含一个或多个本发明所述的嵌合基因编码的蛋白的抗原决定簇。
因此，在另一方面，本发明涉及一种用于预防和治疗人类或动物的利什曼病的药物组合物，它
a)由给予个体(人类或动物)的嵌合蛋白Q，或该嵌合蛋白Q的含有保守氨基酸修饰或取代的变体组成；或
b)由分离形式的蛋白Q，或与腹膜内、皮下或肌肉内途径给药的任何生理学佐剂联合的蛋白Q组成。
本发明还涉及一种能刺激产生可以识别利什曼寄生虫的抗体的疫苗，它：
a)由给予个体(人类或动物)的嵌合蛋白Q，或该嵌合蛋白Q的变体组成，所述变体与蛋白Q在保守氨基酸上不同；或
b)由分离形式的蛋白Q，或与腹膜内、皮下或肌肉内途径给药的生理学佐剂联合的蛋白Q组成。
另外，本发明涉及一种用于预防和治疗人类或动物的利什曼病的药物组合物，它：
a)由给予个体(人类或动物)的与完整或片段化的蛋白质LiHsp70联合的嵌合蛋白Q，或该嵌合蛋白Q的含有保守氨基酸修饰或取代的变体组成；或
b)由分离形式的蛋白Q，或与腹膜内、皮下或肌肉内途径给药的生理学佐剂联合的蛋白Q组成。
在另一方面，本发明涉及一种用于预防和治疗人类或动物的利什曼病的药物组合物，它
a)由给予个体(人类或动物)的携带编码嵌合蛋白Q的序列，或该序列的含有编码保守氨基酸的核苷酸的修饰或取代的变体的任何DNA载体组成；或
b)由含有与腹膜内、皮下或肌肉内途径给药的生理学佐剂联合的蛋白Q的DNA载体组成。
本发明另一方面涉及一种用于预防和治疗人类或动物的利什曼病的药物组合物，它：
a)由给予个体(人类或动物)的任何DNA载体组成，所述载体携带：
1)编码嵌合蛋白Q的序列，或该序列的含有编码保守氨基
酸的核苷酸的修饰或取代的变体，以及
2)编码蛋白质LiHsp70或与其在保守氨基酸上不同的变体
的核苷酸序列，或
b)由与腹膜内、皮下或肌肉内途径的生理学佐剂联合给药的含有如上述a)中定义的编码蛋白Q的DNA序列的任何载体组成。
在另一实施方案中，本发明的药物组合物包含针对本发明所述的嵌合基因编码的蛋白或其部分的抗体。
本发明所述的药物制剂还可以包含所有已知的可以作为药物组合物和/或疫苗组分的佐剂、溶剂、缓冲液等等。
在另一方面，本发明涉及一种预防或治疗利什曼病的方法。该方法使用本发明所述的药物组合物或疫苗，或使用包含针对本发明所述的嵌合基因编码的蛋白的抗体的制剂。
这种方法通常是，给人或动物，如狗，施加具有一定药物学活性量的针对嵌合基因或其编码的蛋白的活性物质。
为了预防利什曼病的发生，可以给予人类一种疫苗以激发特异的保护性免疫应答。该疫苗包含嵌合基因编码的蛋白，或编码含有一个或多个抗原决定簇的该蛋白的一个或多个部分。
本发明所述的制剂、抗体和/或疫苗可以通过口服、肌肉内的、静脉、皮下、输液等方式施加给机体。优选地对于制剂和疫苗通过注射的方式，而抗体制剂通过输液的方式。
值得注意的是，当本文中描述嵌合基因时，该术语也包括可以与给出的序列在中等或严格条件下杂交的核酸序列。
本发明所使用的杂交条件为：杂交反应体系为6XSSC(20xSSC/1000ml：175.3g NaCl，107.1g五水合柠檬酸钠，pH 7.0)，0.1％SDS，0.05％焦磷酸钠，5xDenhardt’s溶液(100xDenhardt’s溶液/500ml：10gFicoll-400，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白(Pentax组分5))和20μg/ml变性鲱精DNA，杂交在56℃下反应18-24小时。随后进行2次各30分钟的清洗，清洗条件为56℃下5XSSC，0.1％SDS。然后再进行2次各30分钟的清洗，清洗条件为56℃下2XSSC，0.1％SDS。
例如，可以和以下所述序列进行杂交的序列包括突变的DNA序列，其编码和以下所述序列编码的蛋白具有相同的生物学功能的蛋白。这种突变序列可以包含针对下述序列的一个或几个核苷酸的缺失、取代和/或插入。优选地，突变序列与下述序列至少具有50％的相同性；更优选地，至少70％的相同性；最优选地，超过90％的相同性。
本发明中术语“嵌合基因”包含一个或多个以下所述的序列的部分的核酸序列。优选地，这种至少包含10％的下述核苷酸序列；更优选地，包含至少30％的下述核苷酸序列；最优选地，包含至少50％的下述核苷酸序列。这种序列可以包含下列核酸序列的一个连续片段，也可以包含两个或多个下列核酸序列的片段，它们已组合成和/或掺入一个单一DNA序列。
值得注意的是，本发明所提及的由嵌合基因编码的蛋白，也包括仍基本上具有相同生物学功能的突变蛋白。这些突变的蛋白与由下述序列编码的蛋白相比可以包含有一个或多个氨基酸的缺失、取代和/或插入。优选地，突变体蛋白与下述序列相比至少有50％的氨基酸同源性；更优选地，至少有70％同源性；最优选地，至少有90％的同源性。
本发明中术语“蛋白”也包括由本发明的嵌合基因编码的蛋白的片段，这种片段优选地仍显示全长蛋白的相同生物学功能。优选地，这种蛋白至少包含30％的全长蛋白氨基酸序列；更优选地，包含至少50％的全长蛋白氨基酸序列。另外，由本发明的嵌合基因编码的全长蛋白的两个或多个片段也可以组合成为一个单独的蛋白。
更具体地，本发明涉及一种由编码L.Infantum的四种蛋白的抗原决定簇的DNA序列构成的嵌合基因，其编码一种具有药用价值的蛋白质，主要用于预防和/或治疗利什曼病，尤其是犬科动物利什曼病。构建这个编码包含所有选择的抗原决定簇的多肽的嵌合基因采用以下的克隆策略：以表达蛋白rLiPO-Ct-Q的克隆作为起始载体，通过合适的限制性内切酶位点，编码蛋白LiP2a-Q、LiP2b-Q、LiH2A-Ct-Q和LiH2A-Nt-Q的DNA序列片段依次加入这一载体，每步克隆后，根据表达产物的大小选出具有正确方向的插入片段克隆。在pMal载体中表达出的产物的长度，即最终融合蛋白的全长推导氨基酸序列为：MBP IEGRPLTPRSAKKAVRKSGSKSAKCGLIFPVGRVGGMMRRGYARRIGA 50SGAPRISEFSVKAAAQSGKKRCRLNPRTVMLAARHDDDIGTLLKNVLLSHSGVV 140PNISKAMAKKKGGKKGKATPSAPEFGDSSRPMSTKYLAAYALASLSKASPSQAD 157VEAICKAVHIDVDQATLAFVMESVTGRDVATLIAEGAAKMSAMPAASSGAAAGV 211TASAAGDAAPAAAAAKKDEPEEEADDDMGPSVRDPMQYLAAYALVALSGKTPSK 265STAGAGAGAVAEAKKEEPEEEEADDDMGPVDLQPAAAAPAAPSAAAKAAPEESD 374EDDFGMGGLF(SEQ ID NO，3)
本发明还涉及一种用于预防或治疗人类和动物的利什曼病的药物组合物，它：
a-由给予个体(人类或动物)的嵌合蛋白Q，或该嵌合蛋白Q的含有保守氨基酸修饰或取代的变体组成，所述蛋白Q
b-为分离形式，或与腹膜内、皮下或肌肉内途径给药的任何生理学佐剂联合。
本发明还涉及一种能刺激产生识别利什曼寄生虫的抗体的疫苗，它：
a-由给予个体(人类或动物)的嵌合蛋白Q，或该嵌合蛋白Q的变体组成，所述变体与蛋白Q在保守氨基酸上不同；所述蛋白Q
b-为分离形式，或与腹膜内、皮下或肌肉内途径给药的生理学佐剂联合。
本发明另一方面涉及一种用于预防和治疗人类和动物的利什曼病的药物组合物，它
a-由给予个体(人类或动物)的与完整或片段化的蛋白质LiHsp70联合的嵌合蛋白Q，或该嵌合蛋白Q的含有保守氨基酸修饰或取代的变体组成，所述蛋白Q
b-为分离形式，或与腹膜内、皮下或肌肉内途径给药的生理学佐剂联合。
本发明的另一种用于预防和治疗人类和动物的利什曼病的药物组合物可以：
a-由携带编码嵌合蛋白Q的序列，或该序列的含有编码保守氨基酸的核苷酸的修饰或取代的变体的任何DNA载体组成，其
b-经皮下或肌肉内途径给予个体(人类或动物)。
在另一方面，本发明涉及一种用于预防和治疗人类和动物的利什曼病的药物组合物，它：
a-由任何DNA载体组成，所述载体携带：
1)编码嵌合蛋白Q的序列，或该序列的含有编码保守氨基
酸的核苷酸的修饰或取代的变体，以及
2)编码蛋白质LiHsp70或与其在保守氨基酸上不同的变体
的序列，其：
b-经由腹膜内、皮下或肌肉内途径给予个体(人类或动物)
本发明还涉及一种核苷酸序列和一种蛋白，它们具有药物价值，主要用于预防和/或治疗利什曼病，尤其是犬科动物利什曼病，所述核苷酸序列和蛋白具有在载体PQ31中表达的下述DNA和氨基酸序列。其中氨基酸序列包含载体的片段(AA 1-33)。除了前7个氨基酸序列(AA 1-7)和MBP部分之外，给出的氨基酸序列和SEQ IDNo 3的序列是完全一致的：1 45ATG AGA GGA TCT CAC CAC CAC CAC CAC CAC ACG GAT CCG CAT GCGMet Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala
5 10 1546 90AGC TCG AAC AAC AAC AAC AAT AAC AAT AAC AAC AAC CTC GGG ATCSer Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile
20 25 3091 135GAG GGA AGG CCT TTA GCT ACT CCT CGC AGC GCC AAG AAG GCC GTCGlu Gly Arg Pro Leu Ala Thr Pro Arg Ser Ala Lys Lys Ala Val
35 40 45136 180CGC AAG AGC GGC TCC AAG TCC GCG AAA TGT GGT CTG ATC TTC CCGArg Lys Ser Gly Ser Lys Ser Ala Lys Cys Gly Leu Ile Phe Pro
50 55 60181 225GTG GGC CGC GTC GGC GGG ATG ATG CGC CGC GGC CAG TAC GCT CGCVal Gly Arg Val Gly Gly Met Met Arg Arg Gly Gln Tyr Ala Arg
65 70 75226 270CGC ATC GGT GCC TCT GGC GCC CCC AGG ATT TCA GAA TTC TCC GTGArg Ile Gly Ala Ser Gly Ala Pro Arg Ile Ser Glu Phe Ser Val
80 85 90271 315AAG GCG GCC GCG CAG AGC GGG AAG AAG CGG TGC CGC CTG AAC CCGLys Ala Ala Ala Gln Ser Gly Lys Lys Arg Cys Arg Leu Asn Pro
95 100 105316 360CGC ACC GTG ATG CTG GCC GCG CGC CAC GAC GAC GAC ATC GGC ACGArg Thr Val Met Leu Ala Ala Arg His Asp Asp Asp Ile Gly Thr
110 115 120361 405CTT CTG AAG AAC GTG ACC TTG TCT CAC AGC GGC GTT GTG CCG AACLeu Leu Lys Asn Val Thr Leu Ser His Ser Gly Val Val Pro Asn
125 130 135406 450ATC AGC AAG GCG ATG GCA AAG AAG AAG GGC GGC AAG AAG GGC AAGIle Ser Lys Ala Met Ala Lys Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Lys
140 145 150391 495GCG ACA CCG AGC GCG CCC GAA TTC GGA TCC TCT AGA CCC ATG TCCAla Thr Pro Ser Ala Pro Glu Phe Gly Ser Ser Arg Pro Met Ser
155 160 165496 540ACC AAG TAC CTC GCC GCG TAC GCT CTG GCC TCC CTG AGC AAC GCGThr Lys Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Lys Ala
170 175 180541 585TCC CCG TCT CAG GCG GAC GTG GAG GCT ATC TGC AAG GCC GTC CACSer Pro Ser Gln Ala Asp Val Glu Ala Ile Cys Lys Ala Val His
185 190 195596 630ATC GAC GTC GAC CAG GCC ACC CTC GCC TTT GTG ATG GAG AGC GTTIle Asp Val Asp Gln Ala Thr Leu Ala Phe Val Met Glu Ser Val
200 205 210641 675ACG GGA CGC GAC GTG GCC ACC CTG ATC GCG GAG GGC GCC GCG AAGThr Gly Arg Asp Val Ala Thr Leu Ile Ala Glu Gly Ala Ala Lys
215 220 225676 720ATG AGC GCG ATG CCG GCG GCC AGC TCT GGT GCC GCT GCT GGC GTCMet Ser Ala Met Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Ala Ala Gly Val
230 235 240721 765ACT GCT TCC GCT GCG GGT GAT GCG GCT CCG GCT GCC GCC GCC GCGGly Asp Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Asp Glu Pro
245 250 255766 810AAG AAG GAC GAG CCC GAG GAG GAG GCC GAC GAC GAC ATG GGC CCCThr Ala Ser Ala Ala Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met Gly Pro
260 265 270811 855TCT AGA GTC GAC CCC ATG CAG TAC CTC GCC GCG TAC GCC CTC GTGSer Arg Val Asp Pro Met Gln Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Val
275 280 285856 900GCG CTG TCT GGC AAG ACG CCG TCG AAG GCG GAC GTT CAG GCT GTCAla Leu Ser Gly Lys Thr Pro Ser Lys Ala ASP Val Gln Ala Val
290 295 300901 945CTG AAG GCC GCC GGC GTT GCC GTG GAT GCC TCC CGC GTG GAT GCCLeu Lys Ala Ala Gly Val Ala Val Asp Ala Ser Arg Val Asp Ala
305 315 315946 990GTC TTC CAG GAG GTG GAG GGC AAG AGC TTC GAT GCG CTG GTG GCCVal Phe Gln Glu Val Glu Gly Lys Ser Phe Asp Ala Leu Val Ala
320 325 330991 1035GAG GGC CGC ACG AAG CTG GTG GGC TCT GGC TCT GCC GCT CCT GCTGlu Gly Arg Tnr Lys Leu Val Gly Ser Gly Ser Ala Ala Pro Ala
335 340 3451036 1080GGC GCT GTC TCC ACT GCT GGT GCC GGC GCT GGC GCG GTG GCC GAGGly Ala Val Ser Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Val Ala Glu
350 355 3601081 1125GCG AAG AAG GAG GAG CCC GAG GAG GAG GAG GCC GAT GAT GAC ATGAla Lys Lys Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met
365 370 3751136 1170GGC CCC GTC GAC CTG CAG CCC GCC GCT GCC GCG CCG GCC GCC CCTGly Pro Val Asp Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro
380 385 3901171 1215AGC GCC GCT GCC AAG GAG GAG CCG GAG GAG AGC GAC GAG GAC GACSer Ala Ala Ala Lys Glu Glu Pro Glu Glu Ser Asp Glu Asp Asp
395 400 405TTC GGC ATG GGC GGT CTC TTC TAAGCGACTC GCCATCTCTT 1256Phe Gly Met Gly Gly Leu Phe
410 4121257AGCCTCCTTG TGGTGCGCTT GAGGTGCTCT CGCTCTGCTT CTCCTTGCAG 13061307TGTTGGCTGA CTCTGGCGGG TATGTGCCGT CGCATTACAC CCACCTCTCC 13561357CACCCCTTTG CCCTACGCGC TCGCATGCGC AATCCGTGAA TCATCGAGGG 14061407AAGTCTCTCT GGGTGGCAGT GGGTAAGCTT 1436
(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)本发明还涉及可以用于在人体或动物体产生针对利什曼病的保护性免疫应答反应的上述核苷酸或蛋白的突变体或片段。本发明也涉及预防和治疗人类和动物的利什曼病的药物组合物，该药物组合物包含这一蛋白或其可以用于在人体或动物体产生针对利什曼病的保护性免疫应答反应的突变体或片段。该蛋白是通过将基因PQV插入到表达载体pQE31中再进行表达所得。在这里，所述的嵌合基因优选地编码一个分子量为38KD，等电点为7.37的多肽。
本发明还涉及可以刺激机体产生识别利什曼寄生虫的抗体的疫苗，该疫苗包含上述蛋白或其可以用于在人体或动物体产生针对利什曼病的保护性免疫应答反应的突变或片段。
本发明另一方面包括用于预防或治疗人类和动物的利什曼病的药物组合物，该药物组合物包含针对上述蛋白或其优选地包含一个或多个抗原决定簇例如一个表位的突变体或片段的抗体。
本发明还涉及一种预防或治疗人类和动物的利什曼病的方法，包括对人体或动物体施加上述的药物组合物；本发明也涉及一种预防人类和动物患利什曼病的方法，包括对人体或动物体施加上述的疫苗。
由编码L.infantum的四种蛋白的抗原决定簇的DNA序列构成的嵌合基因及其表达的蛋白可以有效的预防和/或治疗利什曼病。在本发明中，将编码蛋白LiP2a、LiP2b、LiPO和H2A特异的抗原决定簇的DNA序列依次组合起来，通过合成的方式就可以得到本发明所述的嵌合基因。它所表达的蛋白富含有抗原决定簇。这个嵌合基因在大肠杆菌中进行表达，根据对表达的产物的抗原性的检验，证实这个嵌合蛋白保持了亲本蛋白的抗原决定簇，对犬科动物VL具有一定的药用价值。它的灵敏度在80％至90％之间浮动，特异性在96％至100％之间变化。
更具体地，在本发明中，可以有效的预防和/或治疗犬利什曼病的由编码L.infantum的四种蛋白的抗原决定簇的DNA序列构成的嵌合基因及其表达的蛋白是通过下列步骤得到的：
-构建嵌合基因，方法：
克隆策略
克隆编码组蛋白H2A抗原决定簇的DNA序列
克隆编码蛋白rLiP2a-Q和rLiP2b-Q的DNA序列
克隆编码蛋白rLiPO-Q的DNA序列
克隆嵌合基因
-从构建的中间产物构建嵌合基因
克隆特异针对L.Infantum抗原的表位
-构建最终产物
构建编码包含所有选择的抗原决定簇的多肽的嵌合基因
-任选地表达获得的序列
-评价最终产物
原初样品：血清
蛋白质纯化
蛋白质电泳和免疫分析
通过快速酶联免疫吸附法进行测量
-评价最终产物
抗原性
在犬科动物VL血清测试中嵌合蛋白CP的灵敏度和特异性
克隆编码每种选择的抗原决定簇的DNA序列的策略是相同的，第一步，先将感兴趣的序列进行PCR扩增，使用两端包含特定的限制性内切酶酶切位点的引物。
进行克隆时，将扩增产物用合适的限制性内切酶处理，再插入到载体pUC18中。
在对DNA进行测序确认后，插入片段被取出进行亚克隆，插入到名为pMAL-c2的修饰了的质粒载体的对应的酶切位点中。修饰方式是在原质粒载体pMal-c2的多克隆位点的HindIII酶切位点下游插入一个终止密码子，修饰后的质粒载体名为pMal-c2*。
为了克隆编码组蛋白H2A的抗原决定簇的DNA序列，使用编码L.Infantum组蛋白H2A的克隆cL71的cDNA作为PCR反应的模板。在PCR反应中，为了扩增出组蛋白H2A的N端区域，更确切的说，为了扩增出rLiH2A-Nt-Q区域，使用以下序列的引物：5’端引物5′-CCTTTAGCTACTCCTCGCAGCGCCAAG-3′(对应于cL71序列的第84-104位)；3’端引物5′-CCTGGGGGCGCCAGAGGCACCGATGCG-3′(与cL71序列第204-224位核酸序列反向互补)。
引物中不包括在亲本cL71序列中的部分用粗体标出。
扩增出的DNA片段通过载体pMAL-c2*的限制性内切酶位点XmnI直接进行克隆。
片段可以使用起始子#1234malE进行测序，组蛋白H2A的C端抗原决定簇，即rLiH2A-Ct-Q，使用下列引物进行扩增：有义引物5′-GAATTCTCCGTAAGGCGGCCGCGCAG-3′(对应于cL71序列的第276-296位)；反义引物5′-GAATTCGGGCGCGCTCGGTGTCGCCTTGCC-3′(与cL71序列第456-476位核酸序列反向互补)。
反义引物包含一个编码脯氨酸残基的密码子(在划线区域后的GGG)。上述的有义和反义引物中均含有限制性内切酶EcoR I的酶切位点，用下划线表示。
编码rLiP2a-Q的序列的克隆，是从编码LiP2a和LiP2b的cDNA中通过PCR的方法扩增而来的。
用于构建表达克隆LiP2a-Q的引物为：有义引物5′-GTCGACCCCATGCAGTACCTCGCCGCGTAC-3′反义引物5′-GTCGACGGGGCCCATGTCATCATCGGCCTC-3′
其中引物5’端下划线部分是引入的限制性内切酶Sal I的酶切位点。
用于构建表达克隆LiP2b-Q的引物为：有义引物5′-TCTAGACCCGCCATGTCGTCGTCTTCCTCGCC-3′反义引物5′-TCTAGAGGGGCCATGTCGTCGTCGGCCTC-3′其中引物5’端下划线部分是引入的限制性内切酶Xba I的酶切位点。为了克隆的需要在限制性酶切位点之后插入了一个编码脯氨酸残基的密码子。
为了克隆L.Infantum的蛋白PO的C端区域的rLiPO-Q序列，需要使用下列引物以编号为L27的cDNA为模板进行扩增：有义引物5’-GTGCAGCCCGCCGCTGCCGCGCCGGCCGCC-3′(对应L27cDNA中第1-24位)和pUC18序列的起始子(#1211)。扩增产物使用Pst I和Hind III进行双酶切处理，再插入质粒载体pMAL-c2中。
所得的克隆命名为pPQI。其中，限制性酶切位点Pst I通过有义引物引入，用下划线表示，另一个限制性酶切位点Hind III包括在L27cDNA中。
为了克隆得到最终的嵌合基因，需要将编码5个抗原决定簇的DNA序列组装成为一个单独的嵌合基因，这一组装在克隆pPQI上进行，依次在该克隆的3’方向加入编码抗原决定簇LiP2a-Q的序列(得到的克隆命名为pPQII)，加入编码抗原决定簇LiP2b-Q的序列(得到的克隆命名为pPQIII)，加入编码抗原决定簇LiH2a-Ct-Q的序列(得到的克隆命名为pPQIV)，加入编码抗原决定簇LiH2A-Nt-Q的序列(得到的克隆命名为pPQV)。
得到的克隆pPQV可以通过限制性内切酶Sac I和Hind III进行双酶切处理，所得插入片段插入表达质粒载体pQE31中，命名得到的最终的克隆为pPQ。
附图说明
为使说明书更完整且为了帮助了解本发明的特征，本发明附有附图，其作为本发明的一个有机的组成部分，在此仅仅起说明的作用而非限制作用。
图1：对应于与麦芽糖结合蛋白融合的每种重组蛋白的表达(A)；经过直链淀粉柱的纯化(B)，以及抗原性(C：Western印迹；D：ELISA)。图1D还示出在ELISA中这些重组蛋白相对于完整蛋白的反应性。
图2：给出了构建本发明所述的嵌合基因的不同载体的图谱，从中将表达用于精确诊断人和动物利什曼病的相关蛋白。
图3：给出了图2所示的融合有麦芽糖结合蛋白的嵌合基因表达的蛋白的氨基酸序列图。
图4：对应于与麦芽糖结合蛋白融合的中间产物和最终嵌合蛋白(PQI-PGV)的表达(A)；经直链淀粉柱的纯化(B)；以及抗原性(C：Western印迹；F：ELISA)。该图还示出嵌合蛋白的表达(D，泳道1)，在Ni-Nt琼脂糖柱中的纯化(D，泳道2)以及纯化的蛋白对VL血清(E：Western印迹)和血清集合(F：在ELISA中的PQ)的抗原性。
图5：给出了分成3组的各种狗血清的反应性图。第一组包括实际感染了L.infantum的动物；第二组包括来自具有各种临床症状但没有被利什曼原虫感染的狗的血清；第三组由来自健康的狗的15个对照血清组成。这些数据显示本发明在进行VL血清学诊断中的价值。
本发明的优选实施方案
L.Infantum的四种蛋白的抗原决定簇在犬科动物利什曼病的血清学检测中非常有用，编码这四种蛋白的抗原决定簇的DNA序列组成的嵌合基因及其表达的蛋白是通过各种中间产物构建得来的。首先，特异针对L.Infantum的抗原的表位被克隆，这项工作是建立早期的研究成果上的，通过早期对L.Infantum的四种蛋白抗原(LiP2a、LiPO、LiP2b、LiH2a)抗原性的研究确定了B表位的存在，其由VL狗血清特异性识别。
为了进一步提高这些来自L.Infantum的蛋白抗原的抗原特异性，首先将这些蛋白中的特异的抗原决定簇克隆出来。去除这些蛋白中的某些区域后，这些蛋白可以被患VL和其它疾病的动物的血清识别。
通过使用特定的引物，利用PCR反应可以将基因LiP2a、LiP2b、PO和H2A的特定区域扩增出来，从而得到分别表达重组蛋白rLiPO-Ct-Q、rLiP2a-Q、rLiP2b-Q、rLiH2A-Ct-Q和rLiH2A-Nt-Q的克隆。在本发明描述方法学的部分已经给出了具体信息。
使用到的重组蛋白包括：
-rLiPO-Ct-Q，对应于核糖体蛋白LiPO的C端30个氨基酸残基。
-rLiP2a-Q和LiP2b-Q，它们分别来自核糖体蛋白LiP2a和LiP2b。
-两个来自组蛋白H2A的亚区，分别对应于N端46个氨基酸残基(xLiH2A-Nt-Q)和C端67个氨基酸残基(xLiH2A-Ct-Q)。
如图1A所示，每个重组蛋白都与一个麦芽糖结合蛋白(MBP)融合，在大肠杆菌中表达。表达产物通过直链淀粉柱B进行亲和层析纯化。纯化后进行蛋白质电泳(见泳道1至泳道5)。
为了分析重组蛋白是否可以被VL狗血清识别，将这些重组蛋白和3个VL狗血清的混合物温育，进行Western印迹。由于所有的重组蛋白都可以被VL狗血清识别，所以推测这些重组蛋白保留了亲本蛋白中的所有的抗原决定簇(C)。
为了测试重组蛋白的抗原性，通过FAST ELISA测试26份VL狗血清的方法，比较重组蛋白和亲本蛋白的抗原决定簇的抗原性。数据在图1D中给出。结果显示，所选抗原区和相应全长蛋白具有相似的反应活性，证实了在克隆过程中抗原性表位并未改变。
为了构建最终产物，即构建编码含有所有选择的抗原决定簇的多肽的嵌合基因，克隆策略在图2的A部分中给出。同时也给出了在此过程中产生的中间产物。
表达蛋白rLiPO-Ct-Q的克隆(pPQI)被作为初始载体，编码蛋白rLiPO-Ct-Q、rLiP2a-Q、rLiP2b-Q、rLiH2A-Ct-Q和rLiH2A-Nt-Q的DNA片段通过合适的限制性内切酶位点依次插入载体。
在每一步克隆之后，根据表达产物的大小，确定具有正确插入方向的克隆。确定最终克隆pPQV的完整的核苷酸序列，由该序列推导的氨基酸序列见图3。
产生的多肽的分子量为38KDa，等电点为7.37，其中包括间隔的脯氨酸序列，图3中用下划线表示。加入间隔序列的目的在于有效的分隔不同的抗原决定簇区域，防止可能形成的影响最终产物稳定性和抗原性的三级结构。
每种中间产物的表达和分离在图4的A和B部分给出。如所预期的，每次插入一个新的片段，载体pMAL的表达产物的分子量都逐渐增加直至达到80Kda，并且观察到纯化过程中产物有一定程度的破坏。
该嵌合基因同时也被克隆进入质粒载体pQE，通过这个表达载体可以在表达产物的N端融合一个由6个组氨酸构成的片段。插入了嵌合基因的载体称为pPQ，表达的重组蛋白称为PQ。
使用质粒pPQ转化细菌，该细菌表达该蛋白的水平和纯化后的蛋白在图4特别是D中给出。在变性的条件下进行亲和层析纯化的蛋白PQ，比图4D的第2道的重组蛋白pPQV更稳定。
为了评估最终产物，下列一系列物质被使用，同时根据所使用的物质，使用相应的方法。
使用了从不同来源的狗得来的VL血清。这些动物都在相关的实验室，通常在研究寄生虫的系里，进行了临床的分析，所有阳性的血清都使用间接的免疫荧光法(IIF)进行分析。
这些动物身上寄生虫无鞭毛体的存在通过对胭淋巴结和pleescapular淋巴结的直接观测确定。从其它地区来源的第二组33份VL血清样本在ELISA和/或IIF中都对寄生虫中抽提出的蛋白总提取物呈阳性。
使用不同来源的患有其它种类疾病而不是VL的狗的血清。在这些血清中，发现有以下种类的感染：
中殖孔绦虫(mesocestoides spp)
dyphylidium caninum
uncinaria stenocephala
犬钩蛔虫
dipetalonema dranunculoides
犬蠕螨
犬巴贝西虫
Ehrlichia cannis
Ricketsia ricketsiae
其余的血清来自那些具有并不是由传染造成的症状的狗。对照血清来源于15只仔细看护的健康的动物。
由克隆pMA1-c2表达的重组蛋白通过直链淀粉柱的亲和层析进行纯化，由克隆pPQ表达的重组蛋白通过Qigen公司的Ni-NTA树脂柱在变性的条件下进行纯化。
在进行蛋白质分析时，使用含有SDS的10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上进行免疫分析。转移的蛋白的封闭条件为：含有5％的脱脂奶粉和0.5％吐温20的磷酸缓冲液。
硝酸纤维素膜先后使用含有一抗血清和二抗血清的封闭液进行处理，其中二抗带有过氧化物酶标记，从而可以使用ECL系统显示特异的结合。图4E给出了蛋白PQ的Western印迹图。
分析中使用快速ELISA而不是传统的ELISA方法，所使用的抗原的敏化在室温下持续12小时。
包被的方法是在酶标板中加入100μl的浓度为2μg/ml的抗原。
加入抗原后，在酶标板的各孔中加入封闭液温育1小时(封闭液成分：含有5％的脱脂奶粉和0.5％吐温20的磷酸缓冲液，还加入了稀释了300倍的血清)。
然后在各孔中加入血清在室温下温育2小时，在加入抗体后，各孔使用含有吐温20的磷酸缓冲液进行清洗。
标记了过氧化物酶的抗体作为二抗，按照1∶2000的稀释度使用。酶的生色底物选用邻苯二胺，在450nm下测量光吸收值。
为了测试最终产物的抗原性，对嵌合蛋白和每个中间产物都进行Western Blotting分析检验它对VL犬的血清的反应性。结果显示，在克隆的每一步的中间产物包括最终产物pPQV都具有相应的抗原性(图4C)。
由质粒pPQ表达的重组蛋白也可以被VL血清识别。为了以更高的精度分析嵌合蛋白和中间产物蛋白的抗原性，使用多种VL犬血清对重组蛋白的反应活性进行了快速ELISA分析。数据由图4的F部分给出。数据显示随着步骤的增加，中间产物的反应活性增加。其中，蛋白pQI可以被绝大多数的VL血清识别，pQII与之相似，也可以被绝大多数的血清识别，pQIII也可以被大多数血清识别，而且能识别其的血清比例更高，蛋白pQIV、pQV和pQ就几乎被所有的血清识别。
根据上述，数据显示血清识别嵌合蛋白pQV和pQ的程度与识别重组蛋白rLiPO-Ct-Q、rLiP2a、rLiP2b和rLiH2A的混合物的程度相当。可见在重组蛋白pQ中5个选择的抗原决定簇区域都存在。这样，重组蛋白就可以取代上述单独表达的每个抗原的混合物进行诊断。
为了确定嵌合蛋白是否可以用以犬科动物VL血清诊断，多种狗血清样本被用以对该蛋白进行相关的测试。所使用的血清根据动物的临床特征可分为3组。第一组血清来自患利什曼病的狗；第二组血清来自那些未患利什曼病的狗，其中有些狗被其它种类的寄生虫感染，这些狗具有多种临床症状，有些症状与患利什曼病的狗非常接近。
第三组血清为对照血清，来自健康的狗。
在图5中，给出了每组血清的反应性的平均值。VL血清的平均反应性达到0.8(S.D.＝0.4)。
在这组中，12种血清的反应性显示出阳性结果，但是反应性低于0.35；有10种血清的反应性介于0.35和0.5之间；还有23种血清的反应性介于0.5和1.0之间；14种血清的反应性超过1.0。
第二组血清中，即被不同于利什曼虫的其它寄生虫感染的血清的平均吸收值为0.2(S.D.＝0.05)，对照血清，即第三组血清的反应性仅仅为0.1(S.D.＝0.003)。在第二组中，仅有2个血清样本显示阳性结果，反应性介于0.35和0.4之间。
上述数据显示，如果截断值为第二组的平均反应性加上3个S.D.值，(即0.35)，则嵌合蛋白pQ在快速ELISA反应中对于VL的灵敏度为80％。
如果按照对照组的反应性数据定义截断值，分析组的灵敏度可以达到93％。如果根据上述第二组的数据定义截断值，蛋白Q对VL的诊断灵敏度为96％。如果考虑到健康狗的反应性，分析灵敏度可以达到100％。
检测的步骤如下：
1-对微滴板进行包被，在孔中加入100μl的浓度为1μg/ml的抗原，抗原溶在含有5％的脱脂奶粉和0.5％吐温20的磷酸缓冲液(缓冲液A)中。
在室温下温育12小时，再用不含抗原的上述缓冲液清洗板3次。晾干的抗原化板可以保存在室温。
2-将动物的血清按照1∶200在缓冲液A中进行稀释，加入孔中温育1小时。
3-用洗瓶如第一步一样用缓冲液A清洗反应孔3次。
4-将二抗(标记了过氧化物酶的IgG)按照1∶2000在缓冲液A中稀释，温育1小时。
5-如第三步一样，用缓冲液清洗反应孔3次，也要用洗瓶。
6-使用生色底物邻苯二胺显色，测量450nm处的光吸收。
来自嵌合基因的可以用于诊断的蛋白的序列和编码其的核苷酸序列如下：1 45ATG AGA GGA TCT CAC CAC CAC CAC CAC CAC ACG GAT CCG CAT GCGMet Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala
5 10 1546 90AGC TCG AAC AAC AAC AAC AAT AAC AAT AAC AAC AAC CTC GGG ATCSer Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile
20 25 3091 135GAG GGA AGG CCT TTA GCT ACT CCT CGC AGC GCC AAG AAG GCC GTCGlu Gly Arg Pro Leu Ala Thr Pro Arg Ser Ala Lys Lys Ala Val
35 40 45136 180CGC AAG AGC GGC TCC AAG TCC GCG AAA TGT GGT CTG ATC TTC CCGArg Lys Ser Gly Ser Lys Ser Ala Lys Cys Gly Leu Ile Phe Pro
50 55 60181 225GTG GGC CGC GTC GGC GGG ATG ATG CGC CGC GGC CAG TAC GCT CGCVal Gly Arg Val Gly Gly Met Met Arg Arg Gly Gln Tyr Ala Arg
65 70 75226 270CGC ATC GGT GCC TCT GGC GCC CCC AGG ATT TCA GAA TTC TCC GTGArg Ile Gly Ala Ser Gly Ala Pro Arg Ile Ser Glu Phe Ser Val
80 85 90271 315AAG GCG GCC GCG CAG AGC GGG AAG AAG CGG TGC CGC CTG AAC CCGLys Ala Ala Ala Gln Ser Gly Lys Lys Arg Cys Arg Leu Asn Pro
95 100 105316 360CGC ACC GTG ATG CTG GCC GCG CGC CAC GAC GAC GAC ATC GGC ACGArg Thr Val Met Leu Ala Ala Arg His Asp Asp Asp Ile Gly Thr
110 115 120361 405CTT CTG AAG AAC GTG ACC TTG TCT CAC AGC GGC GTT GTG CCG AACLeu Leu Lys Asn Val Thr Leu Ser His Ser Gly Val Val Pro Asn
125 130 135406 450ATC AGC AAG GCG ATG GCA AAG AAG AAG GGC GGC AAG AAG GGC AAGIle Ser Lys Ala Met Ala Lys Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Lys
140 145 150391 495GCG ACA CGG AGC GCG CCC GAA TTC GGA TCC TCT AGA CCC ATG TCCAla Thr Pro Ser Ala Pro Glu Phe Gly Ser Ser Arg Pro Met Ser
155 160 165496 540ACC AAG TAC CTC GCC GCG TAC GCT CTG GCC TCC CTG AGC AAG GCGThr Lys Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Lys Ala
170 175 180541 585TCC CCG TCT CAG GCG GAC GTG GAG GCT ATC TGC AAG GCC GTC CACSer Pro Ser Gln Ala Asp Val Glu Ala Ile Cys Lys Ala Val His
185 190 195596 630ATC GAC GTC GAC CAG GCC ACC CTC GCC TTT GTG ATG GAG AGC GTTIle Asp Val Asp Gln Ala Thr Leu Ala Phe Val Met Glu Ser Val
200 205 210641 675ACG GGA CGC GAC GTG GCC ACC CTG ATC GCG GAG GGC GCC GCG AAGThr Gly Arg Asp Val Ala Thr Leu Ile Ala Glu Gly Ala Ala Lys
215 220 225676 720ATG AGC GCG ATG CCG GCG GCC AGC TCT GGT GCC GCT GCT GGC GTCMet Ser Ala Met Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Ala Ala Gly Val
230 235 240721 765ACT GCT TCC GCT GCG GGT GAT GCG GCT CCG GCT GCC GCC GCC GCGGly Asp Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Asp Glu Pro
245 250 255766 810AAG AAG GAC GAG CCC GAG GAG GAG GCC GAC GAC GAC ATG GGC CCCThr Ala Ser Ala Ala Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met Gly Pro
260 265 270811 855TCT AGA GTC GAC CCC ATG CAG TAC CTC GCC GCG TAC GCC CTC GTGSer Arg Val Asp Pro Met Gln Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Val
275 280 285856 900GCG CTG TCT GGC AAG ACG CCG TCG AAG GCG GAC GTT CAG GCT GTCAla Leu Ser Gly Lys Thr Pro Ser Lys Ala ASP Val Gln Ala Val
290 295 300901 945CTG AAG GCC GCC GGC GTT GCC GTG GAT GCC TCC CGC GTG GAT GCCLeu Lys Ala Ala Gly Val Ala Val Asp Ala Ser Arg Val Asp Ala
305 315 315946 990GTC TTC CAG GAG GTG GAG GGC AAG AGC TTC GAT GCG CTG GTG GCCVal Phe Gln Glu Val Glu Gly Lys Ser Phe Asp Ala Leu Val Ala
320 325 330991 1035GAG GGC CGC ACG AAG CTG GTG GGC TCT GGC TCT GCC GCT CCT GCTGlu Gly Arg Thr Lys Leu Val Gly Ser Gly Ser Ala Ala Pro Ala
335 340 3451036 1080GGC GCT GTC TCC ACT GCT GGT GCC GGC GCT GGC GCG GTG GCC GAGGly Ala Val Ser Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Val Ala Glu
350 355 3601081 1125GCG AAG AAG GAG GAG CCC GAG GAG GAG GAG GCC GAT GAT GAC ATGAla Lys Lys Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met
365 370 3751136 1170GGC CCC GTC GAC CTG CAG CCC GCC GCT GCC GCG CCG GCC GCC CCTGly Pro Val Asp Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro
380 385 3901171 1215AGC GCC GCT GCC AAG GAG GAG CCG GAG GAG AGC GAC GAG GAC GACSer Ala Ala Ala Lys Glu Glu Pro Glu Glu Ser Asp Glu Asp Asp
395 400 405TTC GGC ATG GGC GGT CTC TTC TAAGCGACTC GCCATCTCTT 1256phe Gly Met Gly Gly Leu Phe
410 4121258AGCCTCCTTG TGGTGCGCTT GAGGTGCTCT CGCTCTGCTT CTCCTTGCAG 13061307TGTTGGCTGA CTCTGGCGGG TATGTGCCGT CGCATTACAC CCACCTCTCC 13561357CACCCCTTTG CCCTACGCGC TCGCATGCGC AATCCGTGAA TCATCGAGGG 14061407AAGTCTCTCT GGGTGGCAGT GGGTAAGCTT 1436(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)
本发明已经详细描述，本领域技术人员能够理解本发明及其优点。
只要不改变本发明的实质部分，所有在此给出的要素的材料、形式、大小、部署都是可以进行修改的。
本文给出的各种术语在此并不起限制的作用。
针对利什曼原虫的疫苗
发明背景
利什曼病是一种多发于热带和亚热带地区的具有复杂症状的传染病，它是由原生动物寄生虫中的利什曼属寄生虫引发的，人和动物都有可能患病。据估计，每年新患内脏型利什曼病的人数达500，000，这只是几千万受感染者中的一小部分。据估计，每年患表皮利什曼病和粘膜利什曼病的人数达到2,000,000(Modabber，1990)。虽然估计大约有350,000,000人处于感染各种类型的利什曼病的危险之下，考虑到无法对仍然未显露出症状的患者的确认和潜在的未知的感染，所以世界上受利什曼病感染的人数应该远远高出这一数据。其实，在世界范围内利什曼病作为一种特定区域的寄生虫病，已经在寄生虫病排名中列第4或第5位。
可以将利什曼病分为3类：表皮型、粘膜型和内脏型利什曼病。这种分类主要是根据寄生虫的寄生位置、寄生虫所属的种类以及它造成的临床表现划分的。主要分布在亚洲和地中海地区某些特定区域的利什曼属寄生虫主要引发表皮型利什曼病，造成表皮的溃疡，但是常常可以自愈。L.major、L.Tropica和L.aethiopica(分布于地中海地区、亚洲和非洲)也可以引发上述表皮型利什曼病的症状，但是它们的临床表现更复杂。在美洲，由L.Mexicana也可以引发表皮型利什曼病，但是它一般不会自愈。人类的粘膜型利什曼病通常由L.brasiliensis造成，它可以造成口鼻或咽喉部位的表皮损伤，破坏粘膜组织的结构。在美洲、欧洲、非洲和亚洲，最常见的利什曼病是内脏型利什曼病，由L.Chagasi、L.donovani和L.infantum引发。这种形式的利什曼病的症状为发烧、贫血和严重的肝/脾脏肿大，如果不在适当的期限内进行正确的治疗，这种疾病是致命的。随着疾病的恶化，会使得宿主失去进行有效的免疫应答的能力。所有这些利什曼属寄生虫的主要寄生源是犬类和部分啮齿动物。在地中海盆地地区，由L.infantum引发的健康问题已经非常严重。那里的狗患或感染利什曼病的几率非常高，使得那里携带寄生虫的昆虫也非常多。据计算，在那些地区，狗感染利什曼病的比例介于7％至20％之间。在西班牙的某些地区，这个比例甚至达到30％。这是一个非常严重的问题，由于该病可以造成人类的免疫力消退，所以还会潜在的提高其它传染病传播的几率。在欧洲，现在大约有11,000,000只狗面临着患利什曼病的危险。
L.infantum和本属内其它种类一样，具有两种形态的生命周期。它的中间体宿主是Phlebotomus属的Psychodidae家族的昆虫。在欧洲的地中海地区，已经证明了虽然还有P.papatosi、P.longicuspis和P.sergenti和类的存在，但P.ariash和P.perniciosus是最主要的传播源。混有寄生虫的脊椎动物宿主的血液被昆虫摄入体内，存在于昆虫肠的细胞外，在那里，寄生虫转变为前鞭毛体并进行分裂。具有感染活性的寄生虫随后转移到昆虫的咽喉和突出的吻突处，从而传给一个新的脊椎动物宿主。前鞭毛体的形态特征为具有鞭毛，呈约15-20微米的细长形结构，具有园形的末端和尖锐的前端。核物质位于寄生虫的中间区域，运动部分位于前端。在培养基中，寄生虫的形态多变。当寄生虫传递到脊椎动物宿主的表皮上以后，有两个因素决定机体的感染与否：一个因素是是否存在合适的细胞群落一巨噬细胞或其它单核吞噬细胞系统，另外一个因素是寄生虫是否具有在这些细胞环境中存活并扩增的能力。
L.infantum穿透巨噬细胞的第一步估计是通过L.infantum与靶细胞质膜的粘连实现的。体外的研究表明，巨噬细胞对前鞭毛体没有直接的趋化作用。在组织中，游离的前鞭毛体通过选择性方式激活补体系统，形成补体因子C5a的浓度梯度，从而吸引巨噬细胞以及其它炎症细胞向感染部位移动。一旦寄生虫形成液泡的形式，溶酶体就可以和它融合形成吞噬溶酶体。当外源微生物感染机体时，吞噬溶酶体可以有效的消除这些外源微生物，可以通过直接破胞的方式，也可以通过其它的机制，例如产生毒性氧自由基，通过氧化代谢途径，通过水解溶菌酶的作用，通过阳离子蛋白或低pH值环境。如果寄生虫抵抗和防止上述机制作用的能力，那么这种寄生虫就可以在吞噬溶酶体中存活下来。
通过对疾病的研究发现，当机体初次发生利什曼感染时，同时会诱发体液免疫和细胞免疫。体液免疫的类型和利什曼寄生虫的种类相关。如果是表皮型利什曼寄生虫，免疫应答非常微弱，但如果是内脏型利什曼寄生虫，会产生很高水平的抗体应答反应。在表皮型感染中，无论使用体内的延迟型超敏测试(DTH)技术还是体外的成淋巴细胞转移测试或巨噬细胞迁移抑制测试技术，都可以观测到显著的细胞介导的免疫应答。在这些情况中，血清中抗体的滴度通常较低，且滴度的水平与宿主感染疾病的程度直接相关。一旦鞭毛体进入巨噬细胞，寄生虫的传播就将依赖于细胞介导的免疫机制。细胞应答是由巨噬细胞、B细胞、一些亚型T细胞以及它们所分泌的不同种类的淋巴因子。被寄生虫感染的巨噬细胞在其细胞膜的表面表达L.infantum的抗原，并在MHC-II型分子的帮助下进行呈递。此外，巨噬细胞分泌的IL-1可以作为T淋巴细胞的第二激活信使。在人体中，通过延迟型超敏测试(DTH)和细胞增殖方法测试都发现内脏型利什曼病和黑热病都可以引起细胞免疫应答的减弱或缺失。而且，即使在促细胞分裂剂，如concanavelin A和phytohaemagglutinin的作用下，仍然可以发现T细胞不再增殖，而且被激活的T细胞产生IL-2的过程也被抑制。
在老鼠体内，T淋巴细胞(CD4表型)群落可以根据它们产生的淋巴因子而分化为至少两种群落。这些细胞对于机体产生针对表皮型利什曼病的保护性免疫(Th-1)是非常重要的，但是同时这些细胞对于机体的保护性免疫应答反应(Th-2)又进行抑制。由抗性鼠c57BL/6或患病后已经治愈的鼠BALB/c得来的T细胞主要为Th-1型，而从未治愈的鼠得来的T细胞主要为Th-2型。通常而言，这些淋巴细胞分泌的淋巴因子进一步增强能够分泌它的淋巴细胞的产生，而对另外一种亚型的细胞则具有抑制作用。这样，由Th-2型细胞分泌的IL-4和IL-10促进Th-2细胞的增加，有助于感染的发展。它们可以直接作用于巨噬细胞，但是无法激活巨噬细胞。对于怀疑已经感染了利什曼病而且缺失了编码IL-4的老鼠，却观察到了相互矛盾的现象。在某些情况，缺乏这些细胞因子反而可以重新指导免疫应答反应从而增强对疾病的抑制作用，但是有些时候却没有观察到异常现象。对于抗性老鼠，如果IFN-γ或其受体(CD40或CD40配基)基因不再表达，就会增加感染发生的几率。CD40和它的受体之间的相互作用对于产生IFN-γ是必须的，IFN-γ可以指导Th-1细胞的免疫应答。对于具有抗性产生Th-1型应答的老鼠，如果缺失了IL-12的表达，就会诱发Th-2型应答，容易被感染。近期的数据显示，IL-12的产生对于指导Th-1型应答反应是非常重要的，而缺失IL-4却可以防止Th-2型的应答。
有大量的利什曼寄生虫的蛋白可以使用Western Blotting方法检测。在患有利什曼病的人和狗的血清中可以检测到抗膜蛋白gp63、gp46、PSA和KPM-11的抗体的存在。另外，还可以检测到一些位于细胞内的细胞质中的抗原，如Hsp70、Hsp83、LIP2a、LIP2b、LILIPO、H2A、H3和一种和激动素相关的蛋白，即来自L.Chagasi的K39。这些识别患病的狗的血清中的保守蛋白的抗体识别的却是这些蛋白中相对不太保守的区域。在自然的感染中，某些膜蛋白本身就具有很高的抗原性。在所有的自然感染的情况中，针对这些蛋白的体液免疫应答总是存在一定的局限性，由于这些在感染过程中产生的抗体是仅仅识别蛋白的特定的区域的。体内的IgG的水平和寄生虫引发的感染强度和抗原性持续时间相关。一种和C型激酶受体(LACK)同源的利什曼抗原最近被发现，它可以刺激机体产生Th-2型的早期应答反应。将LACK转基因鼠置入易感染的环境，发现对这种抗原的诱导可以保护老鼠不受Leishmania major的感染。在体外的实验中，发现抗利什曼抗体在补体的辅助下可以杀死前鞭毛体，其具体的机制为诱导一些颗粒与前鞭毛体的鞭毛体的表面粘附，从而进行细胞吞噬。
研究表明，病理反应和受感染的巨噬细胞的密度相关。在内脏型利什曼病中，巨噬细胞倾向于分布在多种而不是特定的一种组织或器官中。炎症的类型与不同细胞的渗透相关，这些细胞主要是淋巴细胞和血浆细胞，也包括增生细胞和吞噬细胞。感染引发的炎症会给受感染的器官带来严重的生理学变化。某些情况下，会增生出局部的肉芽，严重的还会在不同的器官和组织都引发增生出肉芽。这些肉芽的组成为：内部为巨噬细胞和组织细胞(可以是被感染的细胞，也可以是未被感染的细胞)，外面包裹了一层血浆细胞和淋巴细胞，某些情况下，也可以包裹一层成纤维细胞。炎症发生的同时还伴随着受感染器官的损伤。有些研究者发现患病后在各种器官中会发生淀粉样沉淀。还有一些研究者提出假说，认为这些由疾病引发的损伤并不是由病原体本身引发的，而是由机体对病原体的反应而引发的。
抗利什曼病疫苗
在研究表皮利什曼病的过程中，研究者发现机体对于表皮利什曼病可以产生很强的免疫性，这就促使人们开展预防性疫苗的研究。这种免疫性的机制在于，T应答反应被诱导，从而产生了炎症因子，炎症因子可以激活巨噬细胞，杀死寄生虫。这种情况下，寄生虫一般与宿主共生，免疫性可以通过称为共生型免疫的方式被记忆。
上世纪40年代最初的关于利什曼病疫苗的研究使用的是活体的利什曼虫作为免疫原。研究出的疫苗可以非常有效的保护机体免受二次感染。但是，众所周知，活体的寄生虫可能会产生真正的感染而不仅仅是免疫。所以，研究疫苗倾向于采用已经死了的寄生虫。这些研究最早验证了研制可以有效抵抗这种寄生虫的疫苗的可行性。
使用死了的利什曼前鞭毛体作为免疫原的尝试也从上世纪40年代开始。这些疫苗可以显著的对机体进行保护，根据被使用者的不同，有效率在0-82％之间浮动。但是，这些疫苗的效果较之使用活体利什曼虫为免疫原的疫苗效果差。从L.Major中分离的减毒疫苗可以很好的保护老鼠免受疾病的感染，这证明了使用减毒疫苗也是一种可能的途径。但是，可能存在的突变可以造成毒性的减弱或丢失，也可以产生出具有毒性的突变株，这些情况在现在限制了这种疫苗的广泛使用。
近来，在可以作为候选疫苗的分子的研究上取得了重大的进展，发现了许多可能有应用前景的分子，例如gp63、gp46/M2、表面抗原PSA-2、蛋白dp72和gp70-2、LACK蛋白和Kmp11。特别是蛋白gp63上的T表位只存在于上述的某几种蛋白上，且可以诱导T应答反应(包括Th-1和Th-2)的产生。当将这些抗原和佐剂一起施加给实验动物后，可以有效的保护这些动物免受再次的感染。Leishmania的PSA-2蛋白可以使得被免疫动物产生Th-1型免疫应答以抵御L.Major的再次感染。为了实验是否可以将这种蛋白制成疫苗作用给人体以使得人体可以免受Leishmania的感染，将这种蛋白施加给那些曾经患过了什曼病但是已经痊愈的人，考察他们体内T细胞的增殖状况。结果发现，这些蛋白可以使得这些人体内的T细胞大量增殖，但是对于那些原先没有患利什曼病的人却不能诱导T细胞的大量增殖。通过应答反应产生的细胞因子诱导类型确定应答反应是Th-1型。
亚单位疫苗的研究主要集中在蛋白抗原上，因为蛋白容易确定、分离和克隆。但是，并不是所有潜在的疫苗分子都是蛋白质。实际上，磷脂聚糖(LPG)在感染过程中起了很关键的作用。针对磷脂聚糖的免疫可以十分有效的防止被L.Major的感染。尽管原先认为T细胞无法识别非蛋白类抗原，但是LPG分子似乎可以被表皮的Langerhans细胞呈递给T细胞。而且，实验表明，通过CD-1途径，T细胞可以识别微生物的糖脂和其它非蛋白类分子。虽然没有直接的证据表明和LPG相连的蛋白KMP11可以诱导保护性应答反应。但是另外的实验证明，和LPG相连的蛋白部分可以诱导T应答反应并产生IFN-γ，而不包括蛋白部分的LPG部分则没有这种功能。
通常认为亚单位疫苗也可具有预防性，但是它诱导的仅仅是短期免疫。这个问题在传染病多发地区并不严重，抵抗疾病的能力可以在反复的自然感染中不断加强。但是对于某些人群，由于基因型的缺陷，特别容易遭受某些种类蛋白的感染，但是亚单位疫苗仅仅针对少数种类的蛋白抗原，并不一定正好可以抵御易受感染的抗原。在这些情况下，包含有B和T应答诱导剂的混合抗原可以解决这个问题。最近的研究表明，将Leishmania infantum的膜蛋白的抽提物进行腹腔注射，可以诱导机体抵御带有毒性的前鞭毛体的感染。如果将这些蛋白装载在正电荷脂质体中，再施加给机体，可以进一步增强对机体的保护。
也可以使用包含带有编码Leishmania蛋白的基因的核酸作为疫苗物质。这些核酸物质可以被细胞吸收，引入到细胞核区域，然后被转录和翻译，产物进入细胞质中。这些疫苗的优点在于它可以通过MHC-1和MHC-2途径指导机体的免疫应答反应。抗原在细胞中产生，多肽在细胞表面表达并和MHC-1型分子相连。这样，就会增强对毒性T细胞的诱导。在胞外产生的抗原，将由特异的抗原呈递细胞，通过MHC-II型分子呈递，从而诱导和激活CD4+细胞，促使它分泌可以调节免疫系统中其它效应的细胞因子。
用于利什曼病的最早的DNA疫苗中使用的DNA载体包含gp63基因。另外，PSA-2基因也曾被转入质粒载体作为疫苗，它可以使得机体产生Th-1型应答反应从而实现保护机体的功能。使用包含Ag-2的质粒载体作为疫苗可以诱导机体产生Th-1型应答反应，实现对L.Major的免疫。但是在被激活了的免疫复合物中，Ag-2可以同时诱导Th-1和Th-2型应答反应，而且同时需要IFN-γ才能实现对机体的保护。在另一个实验中，编码LACK蛋白的基因转入一种表达载体的细胞肥大病毒启动子的下游区域，将这个载体通过皮下注射的方式注入BALB/c老鼠的体内，观察到了对L.Major的免疫现象。除了在某些场合，需要使用较低数量的DNA颗粒，可以使用真皮下注射，其它的几乎所有的实验中，DNA物质都是通过肌肉注射的方式进行的。其它的免疫方式还可以使用沙门氏菌、卡介苗和牛痘病毒作为载体。值得一提的是，带有gp63基因的卡介苗可以牛痘病毒作为载体。值得一提的是，带有gp63基因的卡介苗可以有效的诱导机体产生抵御L.Major的能力。
可以在灭活的沙门氏菌的delta araC基因的rac启动子的下游插入编码蛋白gp63的基因。口服1X109的转化细菌可以诱导细胞的T应答反应，反应包括产生Th-1应答反应和产生抗可以表达gp63的肥大细胞瘤细胞的毒性细胞。以gp63-rSCOMs复合物形式存在的gp63蛋白可以保护老鼠免受疾病的威胁，它可以降低发炎的程度防止功能性损伤。在血清中，抗体IgG2a可以诱导IL-2、IFN-γ和IL-10的产生，促使机体发生Th-1型应答反应，且在此过程中未发现有DTH应答。被gp63编码基因转化了的salmonella typhi nramp 1可以诱导IL-2和IFN-γ的产生，并且可以消除机体的损伤。来自L.Pifanoi的名为P-4的蛋白可以非常有效的保护机体使其免受Leishmania的感染。最近，在研究人的表皮型利什曼病时发现，这种蛋白或来自于这种蛋白的肽段可以刺激T细胞的增殖。在这过程中，没有发现IL-4的诱导，却发现了IFN-γ的诱导。Salmonella typhi的aro-A和aro-D型突变辅以IL-2、IFN-γ和TNF-α可以作为一种治疗L.Major的药方。非常有趣的现象是，在那些服用了上述药物的病人的体内，发现诱导出了很高水平的iNOS。研究表明，口服克隆有Gp63基因的aro-A和aro-D型突变体可以在体内表达出这些蛋白，从而保护机体免受L.Major的感染。同样是这种gp63蛋白，如果将其编码基因和某些种类salmonella(GID105和GID106)的启动子组合在一起，也可以表达出蛋白从而保护机体免受利什曼病的感染。
最近，我们所在的研究小组研制了一种人造蛋白质(命名为Q)，它包括Leishmania infantum的四种蛋白质(LiP2a、LiP2b、PO和H2A)的一些抗原性片段。已经证明了在犬类利什曼病的检测方面，这种蛋白具有非常重要的应用价值。如果将这种蛋白作为抗原，通过对患病动物血清和对照血清的检测数据的比较，得出这种蛋白的检测特异性达到100％，灵敏度达到93％。而且我们所在的研究小组证实，在Leishmania infantum这种寄生虫感染的过程中，hsp70蛋白是免疫应答作用的重要分子靶标。
为了探索我们研制的蛋白Q或蛋白Q和hsp70应用于研制防治Leishmania infantum引起的利什曼病的疫苗的可能性，我们以仓鼠为实验动物，设计了3组实验进行研究。这3个实验，第一个实验是测试蛋白Q是否可以在短期内保护动物免受利什曼病的感染；第二个实验是测试蛋白Q是否可以长期保护动物免受利什曼病的感染；第三个实验是测试蛋白Q和hsp70共同作用下的效果。实验证明，蛋白Q可以不仅可以短期的预防感染，也可以长效的保护被疫苗的动物免受感染，被免疫动物被再次人为感染后，蛋白Q可以显著的降低动物肝和脾脏中的寄生虫的数量。如果将蛋白Q和hsp70一起施加给动物，被免疫动物被再次人为感染后，也可以显著的降低动物体内的寄生虫的数量。
实施例1：使用蛋白Q进行免疫
将5微克蛋白Q溶解在40微升的弗氏佐剂中，分别免疫4只实验动物；另外，将同样剂量的佐剂溶解在40微升磷酸缓冲液中，分别给4只对照组的实验动物注射。第一次免疫时，将弗氏完全佐剂和蛋白一起使用；在接着的后两次免疫中，将弗氏完全佐剂改为弗氏不完全佐剂，其中蛋白和佐剂的比例与第一次免疫保持一致。这3次腹膜内的免疫间隔为15天。在每次免疫后的第二周和整个免疫接种的过程中，血液样品被抽提出，以便于使用ELISA方法检测针对蛋白Q的体液免疫程度。结果显示，在初次免疫的第二周，体内仍然有针对蛋白Q的IgG应答反应，在感染后的第二周，这种应答水平进一步增强，并且随着时间的增加而增强，直至达到1/100.000的滴度。如果使用图1所示的寄生虫感染宿主，所观察到的针对蛋白Q的应答反应也和本文上述的一致。
在第三次免疫后的第15天，使用来自受感染的仓鼠的感染了的鞭毛体分化而来的前鞭毛体(剂量：105)感染宿主。原先发现，被寄生虫感染的接种体动物，在感染的4个月后，毫无例外的100％的患寄生虫病和寄生虫血症。表1给出了对照和接种动物每毫克肝和脾组织的寄生虫血症的水平。数据显示，和对照动物相比，再次感染时，75％的接种动物肝脏内的寄生虫的水平较低。当比较脾脏内的数据时，也有75％的接种动物的寄生虫的水平和对照动物相比，大大降低，RPL达到83％-86％。这些动物肝脏的RPL为20％，脾脏为48％。
表1：使用蛋白Q对仓鼠进行腹膜内接种后，仓鼠肝脏和脾脏内寄生虫负荷(parasitic load)。感染后4周，通过有限稀释法(短期)测量寄生虫负荷。表中，寄生虫负荷的数据的单位是每毫克组织寄生虫的数量。RPL＝寄生虫负荷的减少百分比。
用蛋白Q免疫的仓鼠
仓鼠 肝脏 (RPL) 脾 (RPL)
1 4±1 (71％) 49±3 (83％)
2 3±2 (78％) 39±2 (86％)
3 5±1 (64％) 50±4 (83％)
4 11±3 (20％) 153±19 (48％)
表中的数据是3次测量的平均值
对照
4只仓鼠 14±5 295±30
数据是4只动物的平均值。
实施例2
为了验证蛋白Q作为疫苗以降低寄生虫数量的长期效应，我们尝试了其它的接种方式，将5微克蛋白Q溶解在40微升PBS中，再和40微升弗氏佐剂混合，通过皮下注射的方式给4只实验动物接种。一共接种3次，第一次使用弗氏完全佐剂，后两次使用弗氏不完全佐剂。每次接种间隔15天。第3次接种后的15天，使用105剂量的寄生虫感染实验动物。在整个免疫过程中(5个月)，实验动物的血被抽提出来以检测针对蛋白Q和寄生虫总蛋白的体液免疫应答水平。图2显示，在免疫后的第2周，针对蛋白Q的应答就已经呈阳性，在先前的试验中，在3只实验鼠中，第一次免疫后2周针对蛋白Q的应答已经非常显著了。在随后的接种中，应答反应一直维持在一个较高的水平，在第3次接种的那一周，滴度达到1/75.000。4只实验动物中的另外一只虽然在实验的最后达到了和其它3只相同的应答水平，但是在实验过程中，它的应答反应始终较慢。从例1和例2的数据可以推断出，通过腹腔注射和皮下注射两种方式进行接种，都可以产生特异的、迅速的免疫应答反应，其中通过腹腔注射的方式在相同的时间内应答反应可以达到更高的滴度(1/75.000∶1/30.000)。图3给出了对照动物的针对蛋白Q的应答。可以看到，在感染后的第12-14周可以检测到蛋白，这同时也是利什曼病的最初症状可以被检测的时间。表2给出了被接种动物和对照动物肝脏和脾脏内的寄生虫的水平。可以看到，在50％的实验动物的肝脏可以被疫苗保护，其中寄生虫的数量较原来降低的很显著，达到87-89％。其中有1只动物没有获得免疫力，另一只动物的肝脏内的寄生虫数量才下降了22％。相反，在脾脏的水平，所有的实验动物都受到保护，寄生虫的数量较原来降低了98-99％。
表2：使用蛋白Q对仓鼠进行皮下注射的方式接种后，仓鼠肝脏和脾脏内寄生虫负荷。感染后20周，通过有限稀释法(长期)测量寄生虫负荷。表中，寄生虫负荷的数据的单位是每毫克组织寄生虫的数量。RPL＝寄生虫负荷的减少百分比。
用蛋白Q免疫的仓鼠
表2
仓鼠 肝脏 (RPL) 脾 (RPL)
1 1.4×106 (22％) 1.0×107 (98％)
2 2.0×105 (89％) 4.9×105 (99.9％)
3 2.4×105 (87％) 3.3×105 (99.9％)
4 2.4×106 (0％) 6.3×105 (99.9％)
表中的数据是3次测量的平均值
对照
4只仓鼠1.8×106+1.2×105 5.2×108±2.6×107
数据是4只动物的平均值
为了测试蛋白Q是否可以和来自Leishmnaia infantum的蛋白LiHsp70一起实现保护机体的目的，我们以Balb/c鼠为实验动物进行实验。实验显示，接种之后，动物体内肝脏和脾脏内的寄生虫的数量大大降低，某些动物中，甚至降低了整整4个数量级。
实施例3：使用蛋白Q＋蛋白LiHsp70以及弗氏佐剂进行接种
将5微克蛋白Q和5微克蛋白LiHsp70溶解在40微升PBS中，再和40微升弗氏佐剂混合，通过腹腔注射的方式给4只实验动物接种。一共接种3次，第一次使用弗氏完全佐剂，后两次使用弗氏不完全佐剂。每次接种间隔15天。
第3次接种后的15天，使用106剂量的寄生虫通过心脏途径感染实验动物。在整个免疫过程中，每隔两周，实验动物的血被抽提出来以检测针对蛋白Q和蛋白LiHsp70的体液免疫应答水平。
使用蛋白Q和蛋白LiHsp70接种的鼠中相对寄生虫负荷在表3中给出。实验显示，所有受到接种的动物都可以很有效的抵御感染的再发生。在某些实验动物中，脾脏的寄生虫的数值降低了2-3个数量级。
表3：感染4个月后用蛋白Q和蛋白LiHsp70接种的Balb/c小鼠的相对寄生虫负荷
用蛋白Q和蛋白LiHsp70免疫的小鼠
小鼠 肝脏 (RPL) 脾 (RPL)
1 1.5×103 (97％) 1.5×104 (99％)
2 0.9×103 (98％) 1.4×103 (99％)
3 2.0×104 (60％) 5.6×104 (99％)
4 0.8×104 (84％) 1.2×105 (96％)
表中的数据是3次测量的平均值。
对照
4只小鼠5.1×104±2×103 3.2×106±8×104
数据是4只对照动物的平均值。
表4和表5给出了实施例1和例2中所有实验动物针对蛋白Q的免疫应答状况，从接种的第2周起，针对蛋白Q的应答反应就已经较高，并且程度一直在增加直至第2次接种(第4周)。表6显示在整个实验过程中，针对蛋白LiHsp70的应答反应始终是阳性的，但是在例3中，这个应答反应没有针对蛋白Q的应答反应强。
表4和表5给出了用5微克蛋白Q进行腹膜内注射的4只实验仓鼠的免疫应答的状况(表4-实施例1，短期效应)和用5微克蛋白Q进行皮下注射的4只实验仓鼠的免疫应答的状况(表5-实施例2，长期效应)。
表4：实施例1，短期效应
使用蛋白Q接种的小鼠(短期)
针对蛋白Q的免疫应答
光密度为3的血清(经过200倍稀释)的滴度大于1/45000。
对照鼠
针对蛋白Q的免疫应答(短期)
表5：实施例2，长期效应
使用蛋白Q接种的小鼠(长期)
针对蛋白Q的免疫应答
对照小鼠
针对蛋白Q的免疫应答(长期)
表6给出了用5微克蛋白Q和5微克蛋白LiHsp70进行腹膜内注射的4只实验仓鼠的免疫应答的状况(实施例3，长期效应)
使用蛋白Q＋Hsp70接种的小鼠
针对蛋白Q的免疫应答
对照小鼠
针对蛋白Q的免疫应答
用蛋白Q＋Hsp70接种的小鼠
针对蛋白Hsp70的免疫应答
对照小鼠
针对蛋白Hsp70的免疫应答
实施例4：对Balb/c鼠使用蛋白Q和BCG进行接种
将5微克蛋白Q和集落形成单位(CFU)为106的BCG溶解在40微升磷酸缓冲液，通过腹腔注射的方式给4只Balb/c鼠接种。接种分3次完成，每次间隔15天。第3次接种后的15天，使用105BCN150L.infantum通过心脏途径感染实验动物。在整个免疫过程中，每隔两周，实验动物的血被抽提出来以检测针对蛋白Q体液免疫应答水平。感染后第8周实验动物死去。
表7(a和b)显示接种动物从第2周起对蛋白Q的应答就呈阳性，而且应答的水平逐渐升高，直至达到400,000。表8给出了接种动物和对照动物体内肝脏和脾脏的寄生虫负荷的差异。
表7：用5微克蛋白Q和集落形成单位(CFU)为106的BCG接种的Balb/c小鼠体内针对蛋白Q的免疫反应
小鼠1，2，3，4被接种
小鼠5，6，7，8为对照组，未被接种表7：对蛋白Q的反应周 小鼠1 小鼠2 小鼠3 小鼠4接种前 0 0 0 0第1次接种
1 0 0.2 0.1 0第2次接种
3 0.5 0.7 0.8 0.9第3次接种
6 1.6 2.1 2.6 2.7
7 1.8 2.3 2.4 2.1
9 2.1 2.6 2.5 1.9
11 2.7 2.9 3 3
13 3 3 3 3周 小鼠5 小鼠6 小鼠7 小鼠8接种前 0 0 0 0第1次接种
1 0 0 0 0第2次接种
3 0 0 0 0第3次接种
6 0 0 0 0
7 0 0 0 0
9 0 0 0 0
11 0 0 0 0
13 0 0 0 0
表中的数据3的部分表示检测值已经超出了检测系统的上限
血清在所列出的周的开始时抽取
第一次接种在第0周，第二次在15天后，第三次在30天后
表8：在用蛋白Q＋106 BCG皮下接种的Balb/c小鼠的肝脏和脾脏中的寄生虫负荷(parasitic burden)。在感染后8周，通过测量含有7000个成核细胞的不同视野而经组织压片光学显微镜术测定寄生虫负荷。寄生虫负荷的表示单位为每毫克组织含有的寄生虫的数量，先前已计算出每1000个成核细胞中含有1个寄生虫相当于大约每毫克组织中含有210个寄生虫。
RPB＝寄生虫负荷的减少百分比。
小鼠 肝脏 (RPB) 脾 (RPB)
1 72 (82％) 457 (89％)
2 40 (90％) 207 (95％)
3 48 (88％) n.d. (100％)
4 n.d. (100％) 90 (98％)对照4个动物平均 400±15 4155±30n.d.寄生虫在5000个成核细胞中未检测到。
机译： 由编码四种乳酸链球菌的抗原决定簇和有用基因编码的蛋白质的抗原决定簇的DNA序列所组成的嵌合基因，以及用于预防和/或治疗动物或人类利什曼病的药物成分
机译： 嵌合基因，由编码婴儿乳杆菌的四种蛋白质的抗原决定簇和有用基因编码的蛋白质的DNA序列，以及可用于预防和/或治疗动物或人类的利什曼病的药物组成组成
机译： 由DNA序列形成的嵌合基因，所述DNA序列编码婴儿乳杆菌的四种蛋白质的抗原决定簇和由所述基因编码的蛋白质，以及可用于预防和/或治疗动物或人类利什曼病的药物组合物
