在三维装置中从造血祖细胞产生淋巴组织－特异细胞

摘要

本发明涉及在存在淋巴网状基质细胞不存在外源加入生长因子的情况下,在新颍的三维装置中从造血祖细胞产生淋巴组织－特异细胞的一种方法。淋巴组织－特异细胞可在任何随后的分化阶段分离并进一步扩展。淋巴组织－特异细胞也可在过程的任何阶段进行遗传上的改变。

说明书

相关申请

依据35U.S.C§119，本申请权利要求1998年11月12日提交的，题目为“在三维装置中从造血祖细胞产生淋巴组织-特异细胞”的临时美国专利申请序列No.60/107,972的优先权。临时申请的内容特别参考收入本篇。

本发明的领域

本发明涉及在三维装置中共-培养造血祖细胞和淋巴网状基质细胞，产生出乎意料高产量的淋巴组织-特异细胞子代。

本发明的背景

免疫系统的特点是特异识别抗原。这包括区别自身和非自身抗原的能力和一种能对以前遭受的抗原快速并特异反应的类-记忆潜能。脊椎动物免疫系统对外源抗原反应，产生级联分子和细胞事件，最终产生体液介导和细胞介导免疫反应。

涉及抗原-特异识别的免疫防御的主要途径从通过抗原呈递细胞(APC)，如树状细胞或巨噬细胞捕获抗原，并随后将这些细胞移往淋巴器官(如胸腺)开始。这样，APC呈递抗原到类分为成熟辅助性T细胞的T细胞亚类。依据呈递抗原的特异识别，成熟辅助性T细胞能被触发成为活化辅助性T细胞。活化辅助性T细胞通过诱导成熟B细胞分化成产生抗体的浆细胞调节体液免疫反应，及通过激活成熟细胞毒性T细胞调节细胞介导免疫反应。

在造血细胞的T细胞分化过程中，胸腺已显示出是一种专性因子。根据鼠科动物模型，可相信认为，需要存在三维器官，因为不包括胸腺和三维结构的体外模型不能支持T细胞淋巴细胞生成(Owen JJ，等人，Br Med Bull.，1989，45：350-360)。然而，在祖细胞接触胸腺之前分化过程呈现开始进行。

胚胎肝或骨髓中的原始造血祖细胞产生种系定型细胞，包括对T淋巴种系定型的祖细胞。这些极不成熟的细胞通过CD34的表面表达鉴别。T细胞种系定型细胞表达CD34，但仅在T细胞祖细胞上发现的其他表位的离散表达没有描述。并且，T淋巴细胞分化通常通过一系列不连续的发育阶段来呈现。不表达淋巴细胞特异细胞表面标记(CD34+CD3-CD4-CD8-)的原始祖细胞移到胸腺，在那里通过一系列成熟事件，它们获得表型CD34-CD3-CD4+CD8-。然后这些细胞成熟为双正性CD4+CD8+细胞，其大部分是CD3+，尽管CD3表达通常是不可检测到的。这些细胞进一步进行正性和负性选择，并成熟发育成单正性T细胞(CD4+CD8-或CD4-CD8+)。这些细胞最终移到外周循环中作为原初T细胞。

T细胞病变和疾病代表了大部分健康问题。使用基因治疗法治疗涉及T淋巴细胞的病况，包括AIDS，近来已获得进展。这对发展能在体外评定对这些病况进行可能的基因治疗的实验室技术激发了增大的兴趣。

了解T细胞分化已受到体外允许T细胞分化的技术的有限有效性的阻碍。至今，T细胞分化研究还大大限限制在SCID-hu鼠体内模型中。体外技术还是根据胸腺外植体研究和初始胸腺单层。在最近的技术推进中，初始胸腺基质培养物已显示出提供了有利的，尽管是不充分的，测试T细胞发育的系统，能以可以可再生的方式进行体外T细胞分化。然而，用这种方式产生的T细胞的纯度和数量，以及培养物相当短的半衰期，通常导致对T细胞分化和功能的更先进研究的有限的实用性。

本发明的简述

本发明，在一个重要方面，涉及在没有加入外源生长因子的情况下，培养造血祖细胞定向它们向淋巴组织特异种系方向发育的改进的方法。因此，本发明的一个方面是培养造血祖细胞产生对特异种系定型的子代。另一个方面是对能从造血祖细胞样品中获得的分化子代的速度和数量方面的改进。

我们在本文中描述的系统是利用生物相容性，开孔，三维基质，并使用人类和非人类淋巴网状基质细胞以提供人类和非人类造血祖细胞向特异细胞种系扩展和分化的适当条件。T淋巴细胞，如从这些培养物中产生的，通常对多种刺激产生反应并表达预料成熟T细胞的多种标记。

这种系统提供了比现有技术显著优越的特点。如，它能提供快速产生实验室分析和/或治疗应用所需的大量分化子代，包括体外测试潜在基因治疗法或体内再输注到受试体中所需的。基质本身可移植到受试体中进行体内研究造血细胞生长。系统也能合理地重复造血细胞维持，扩展和/或向特异种系分化的复合过程。

令人惊异地，依据本发明，已发现在没有加入外源生长试剂的情况下，造血祖细胞与淋巴网状基质细胞在多孔固体支架中共培养，快速产生没有预料到的高产量的淋巴特异种系的功能性分化子代。从中衍生淋巴网状基质细胞的淋巴组织协助确定种系-定型造血祖细胞实施，产生分化子代的种系-特异性。同样令人惊异地，依据本发明，发现当与现有方法相比时，在本发明的多孔固体支架中造血祖细胞和淋巴网状基质细胞的共培养物中产生较少量的非淋巴细胞(即髓-单核细胞)。因此，本发明允许从相对少量的造血祖细胞中快速产生大量分化的淋巴特异细胞。使用此领域已知方法，这样的结果以前从未实现过(如在Johnson等人的美国专利No.5,677,139中，其中描述了在初始胸腺基质单层上体外分化CD3+细胞，或如在Naughton等人的美国专利No.5,541,107中，其中描述了三维骨髓细胞和组织培养系统)。

依据本发明的一个方面，提供了一种体外产生淋巴组织特细胞的方法。方法包括将一定量的造血祖细胞和一定量的淋巴网状基质细胞引入到多孔固体基质中，多孔固体基质包括孔大小足以允许造血祖细胞和淋巴网状基质细胞在整个基质中生长的相互连接的孔。然后将造血祖细胞和淋巴网状基质细胞共培养。使用的淋巴网状基质细胞的量足以支持造血祖细胞的生长和分化。在一个实施方案中，共-培养发生在足以产生淋巴组织源细胞的量至少10倍增长的条件下。在较好的实施方案中，共-培养发生在足以产生淋巴组织源细胞的量至少20，50，100，200，300或400倍增长的条件下。在一些实施方案中，在共-培养后，可实施收获淋巴组织源细胞。

在某些实施方案中，造血祖细胞可以是多能性干细胞，多能性祖细胞和/或对特异造血细胞种系定型的祖细胞。对特异造血细胞种系定型的祖细胞可以是T细胞种系，B细胞种系，树状细胞种系，朗氏细胞种系和/或淋巴组织特异巨噬细胞种系。

造血祖细胞可从组织如骨髓，外周血液(包括移动外周血液)，脐带血液，胎盘血液，胎儿肝脏，胚胎细胞(包括胚胎干细胞)，主动脉-生殖腺-中肾衍生细胞，和淋巴软组织中衍生。淋巴软组织包括胸腺，脾脏，肝脏，淋巴结，皮肤，扁桃腺和Peyer膜。在其他实施方案红，淋巴网状基质细胞也可以从至少一种前述淋巴软组织中衍生。在较好的实施方案中，淋巴网状基质细胞是胸腺基质细胞和多能性祖细胞和/或对T细胞种系定型的定型祖细胞。在其他实施方案中，造血祖细胞和/或淋巴网状基质细胞可以是遗传改变的。

在本发明的一个重要的实施方案中，造血祖细胞是人类源的，淋巴网状基质细胞也是人类源的。在另一个实施方案中，造血祖细胞是人类源的，淋巴网状基质细胞是非-人类源的。在较好的实施方案中，非人类淋巴网状基质细胞是鼠科动物源的。

在某些实施方案中，淋巴网状基质细胞与造血祖细胞在相同的时间种在基质中。在其他实施方案中，淋巴网状基质细胞在接种造血祖细胞前种在基质中。

多孔基质可以是开放空间百分比至少50％的开放细胞多孔基质，较好地是至少75％。在一个实施方案中，多孔固体基质具有由相互连接的韧带限定的孔，孔中心间直径平均小于150m。较好地，多孔基质是金属覆盖的含碳物料的网状开放细胞泡沫，金属涂层从下列组中选取，包括钽，钛，铂(包括铂基团的其他金属)，铌，铪，钨和它们的组合。在较好的实施方案中，不论多孔固体基质是否有金属覆盖，基质都由从下列组中选取的生物试剂覆盖，包括胶原，纤连蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白，血管生成因子，抗炎性因子，糖胺聚糖，玻连蛋白，抗体和其片段，这些因子的功能等同物(包括它们的片段)，和它们的组合。更好地，金属涂层是涂覆生物试剂的钽。在某些实施方案中，含有接种造血祖细胞和它们子代，和淋巴网状基质细胞的多孔固体基质，用占据基质孔的凝胶状的试剂充满。

本发明较好的实施方案是固体，单一的宏观结构，即不是珠状或填充的珠状。它们也包括生物不可降解的物料。

依据前述实施方案中的任何一个，本发明的方法可以包括在不含造血祖细胞残存物和增殖因子如白细胞介素3，6和11，干细胞配体和FLT-3配体的环境中培养细胞。本发明的另一个实施方案是在不含基质细胞条件培养基和外源加入促进造血细胞维持，扩展和/或分化的造血细胞生长因子，除了血清的环境中共-培养造血祖细胞和淋巴网状基质细胞。

依据本发明可以理解认为，现在，在不含外源加入促进造血细胞维持，扩展和/或分化的造血细胞生长因子的环境中共-培养造血祖细胞和淋巴网状基质细胞短短7天并获得大量特异种系分化子代是可能的。

依据前述实施方案的任何一个，本发明的方法可以包括在外源加入从包括基质细胞条件培养基，和促进造血细胞维持，扩展和/或分化并影响细胞定位的造血细胞生长因子的组中选取的试剂的情况下，共-培养造血祖细胞和淋巴网状基质细胞。在某些实施方案中，促进造血细胞维持，扩展和/或分化并影响细胞定位的造血细胞生长因子可以是包括白细胞介素3，白细胞介素6，白细胞介素7，白细胞介素11，白细胞介素12，干细胞因子，FIL-2配体，FIT-2配体，Epo，Tpo，GMCSF，GCSF，制癌蛋白M和MCSF的试剂。

依据本发明的另一个方面，提供了一种体内维持，扩展和/或分化造血祖细胞的方法。方法包括将其中接种造血祖细胞(其可包括它们的子代)和淋巴网状基质细胞的多孔固体基质移植到受试体中。多孔基质含有相互连接的孔，孔大小足以允许细胞在整个基质中生长，基质是可以是开放空间百分比至少50％的开放细胞多孔基质，较好地是至少75％。提供了多种实施方案，其中多孔固体基质具有如上所述的一种或多种较好的特性。

在某些实施方案中，通过体外引入一定量的造血祖细胞和一定量的淋巴网状基质细胞到多孔固体基质中，并在不含基质细胞条件培养基及不含外源加入的促进造血细胞维持，扩展和/或分化的造血细胞生长因子，除了血清的环境中共-培养，将造血祖细胞(可以包括子代)和淋巴网状基质细胞附着在基质中。提供了多种其他实施方案，其中共-培养在如上描述的条件下实施。在其他实施方案中，含有接种造血祖细胞(可能包括子代)和淋巴网状基质细胞的多孔固体基质，用占据基质孔的凝胶状的试剂充满。

依据本发明的一个方面，提供了一种体外诱导T细胞无反应性的方法。方法包括在多孔固体基质中引入一定量的造血祖细胞，一定量的抗原呈递细胞，和一定量的淋巴网状基质细胞，多孔固体基质含有相互连接的孔，孔大小足以允许造血祖细胞和淋巴网状基质细胞在整个基质中生长，在存在至少一种抗原情况下，在足以诱导形成T细胞和/或T细胞祖细胞及足以抑制形成的T细胞和/或T细胞祖细胞活化的条件下，共-培养造血祖细胞，抗原呈递细胞和淋巴网状基质细胞。

在某些实施方案中，造血祖细胞可以是多能性干细胞，多能性祖细胞和/或对特异造血细胞种系定型的祖细胞。造血祖细胞可从组织如骨髓，外周血液(包括移动外周血液)，脐带血液，胎盘血液，胎儿肝脏，胚胎细胞(包括胚胎干细胞)，主动脉-生殖腺-中肾衍生细胞，和淋巴软组织中衍生。淋巴软组织包括胸腺，脾脏，肝脏，淋巴结，皮肤，扁桃腺和Peyer膜。在其他实施方案中，淋巴网状基质细胞也可以是从前述淋巴软组织中的至少一种中衍生得来。在较好的实施方案中，淋巴网状基质细胞是胸腺基质细胞和多能性祖细胞和/或对T细胞种系定型的定型祖细胞。在其他实施方案中，造血祖细胞和/或淋巴网状基质细胞可以是遗传改变的，在某些实施方案中，抗原呈递细胞包括细胞如树状细胞，单核细胞/巨噬细胞，朗氏细胞，Kupfer细胞，格子细胞，小泡巨噬细胞和B细胞。在其他实施方案中，抗原呈递细胞在体外从细胞祖细胞衍生。提供了多种实施方案，其中多孔固体基质具有一种或多种如上所述所较好的特性。

依据本发明的另一个方面，提供了一种体外诱导T细胞反应性的方法。方法包括在多孔固体基质中引入一定量的造血祖细胞，一定量的抗原呈递细胞，和一定量的淋巴网状基质细胞，多孔固体基质含有相互连接的孔，孔大小足以允许造血祖细胞和淋巴网状基质细胞在整个基质中生长，在存在至少一种抗原情况下，在足以诱导从对至少一种抗原具有特异性的造血祖细胞中形成T细胞和/或T细胞祖细胞的条件下，共-培养造血祖细胞，抗原呈递细胞和淋巴网状基质细胞。提供了多种实施方案，其中造血祖细胞，淋巴网状基质细胞和多孔固体基质具有如上所述的一种或多种较好的特性，细胞如上所述培养。在某些实施方案中，抗原呈递细胞包括树状细胞，单核细胞/巨噬细胞，朗氏细胞，Kupfer细胞，格子细胞，小泡巨噬细胞和B细胞。在其他实施方案中，抗原呈递细胞是体外从造血细胞衍生的。在其他实施方案中，方法进一步包括给共-培养物加入共-刺激试剂。较好的共-刺激试剂包括淋巴细胞功能相关抗原3(LFA-3)，CD2，CD40，CD80/B7-1，CD86/B7-2，OX-2，CD70和CD82。

在本发明的另一个方面，提供了固体多孔基质，其中造血祖细胞，有或没有它们的子代，和淋巴网状基质细胞附着在固体多孔基质中。淋巴网状基质细胞存在的量足以支持造血祖细胞的生长和分化。在某些实施方案中，造血祖细胞附着淋巴网状基质细胞。多孔基质可以是开放细胞多孔基质，具有开放空间百分比至少50％，较好地至少75％。在一个实施方案中，多孔固体基质具有由相互连接的韧带限定的孔，孔中心间直径平均小于150μm。较好地，多孔基质是金属覆盖的含碳物料的网状开放细胞泡沫，金属涂层从下列组中选取，包括钽，钛，铂(包括铂基团的其他金属)，铌，铪，钨和它们的组合。在较好的实施方案中，不论多孔固体基质是否有金属覆盖，基质都由从下列组中选取的生物试剂覆盖，包括胶原，纤连蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白，血管生成因子，抗炎性因子，糖胺聚糖，玻连蛋白，抗体和其片段，这些因子的功能等同物(包括它们的片段)，和它们的组合。更好地，金属涂层是涂覆生物试剂的钽。在某些其他实施方案中，含有接种造血祖细胞和淋巴网状基质细胞的多孔固体基质，用占据基质孔的凝胶状的试剂充满。

在表面的其他方面中，提供了一种鉴别怀疑影响造血细胞发育的试剂的方法。方法包括在多孔固体基质中引入一定量的造血祖细胞和一定量的淋巴网状基质细胞，多孔固体基质含有相互连接的孔，孔大小足以允许造血祖细胞和淋巴网状基质细胞在整个基质中生长，在存在至少一种怀疑影响造血细胞发育的候选试剂情况中(在测试共-培养物中)，共-培养造血祖细胞和淋巴网状基质细胞，通过将测试共-培养造血细胞发育与对照共培养物比较，对照物是造血祖细胞和淋巴网状基质细胞在不存在至少一种候选试剂的情况下共-培养，确定是否在测试共-培养物中有至少一种候选试剂影响造血细胞发育。提供多种实施方案中，其中造血祖细胞，淋巴网状基质细胞和多孔固体基质具有如上所述的一种或多种较好的特性，细胞如上所描述培养。在某些实施方案中，造血祖细胞发育包括造血祖细胞维持，扩展，向特异种系分化，和/或细胞死亡(包括细胞程序死亡)，在较好的实施方案中，淋巴网状基质细胞是胸腺基质细胞。

在本发明的另一个方面，提供了一种从细胞培养物中分离怀疑影响造血细胞发育的试剂的方法。方法包括在多孔固体基质中引入一定量的造血祖细胞和一定量的淋巴网状基质细胞，多孔固体基质含有相互连接的孔，孔大小足以允许造血祖细胞和淋巴网状基质细胞在整个基质中生长，共-培养造血祖细胞和淋巴网状基质细胞，从共-培养物中获得测试上清液，将测试上清液与对照上清液比较，获得含有在对照上清液中没有的怀疑影响造血细胞发育的试剂的测试上清液亚组分。在某些实施方案中，怀疑影响造血细胞发育的试剂可以存在于对照上清液中，但在测试上清液中没有。在其他实施方案中，在一种上清液中的怀疑影响造血细胞发育的试剂可以与在其他上清液中的怀疑影响造血细胞发育的试剂不同(如大小方面，通过翻译后修饰，以可变剪接变体形式等)。提供了多种实施方案中，其中造血祖细胞，淋巴网状基质细胞和多孔固体基质具有如上所述的一种或多种较好的特性，细胞如上所描述培养。在某些实施方案中，造血祖细胞发育包括造血祖细胞维持，扩展，向特异种系分化，和/或细胞死亡(包括细胞程序死亡)，在较好的实施方案中，淋巴网状基质细胞是胸腺基质细胞。在某些其他实施方案中，先有技术领域的对照培养系统(从中可获得对照-上清液)是在Johnson等人的美国专利No.5.677,139中所描述的系统。

本发明的这些和其他方面，以及多种优点和应用，参考较好实施方案的详细描述会更清楚。

本发明示图的简单描述

图1显示了在三维基质中，在与鼠科动物基质细胞共-培养中人类CD34+祖细胞分化成T细胞；图1(a)中的数据显示获得CD2和负调节造血祖细胞标记CD34；图1(b)中的数据显示SP CD4+和SP CD8+细胞的离散群，包括它们的DP CD4+CD8+前体；图1(c)中的数据显示所有CD4+(c)和CD8+(d)细胞共-表达CD3。

图2显示了在本发明的共-培养系统中产生的T细胞数量的样品内可变性。

图3显示了在本发明的共-培养系统中产生的T细胞数量的样品内可变性。

本发明的详细描述

本发明涉及没有预料的发现，在没有外源加入生长试剂的情况下，在多孔固体支架中共培养造血祖细胞和淋巴网状基质细胞，快速产生没有预料到的高产量淋巴组织特异种系的功能性分化子代。同样令人惊异地，依据本发明，还发现当与现有技术比较时，在本发明的多孔固体支架中从造血祖细胞和淋巴网状基质细胞的共培养物中产生较少量的非淋巴细胞(即，髓-单核细胞)。因此，本发明，与在此领域中已获得的技术相比，允许从相对少量的造血祖细胞中快速产生大量分化的淋巴特异细胞。

因此，本发明的方法可特别用来在患有免疫缺损的患者中，如T细胞或B细胞缺损，如胸腺基免疫缺损，如由于胸腺发育不全或功能紊乱引起的先天免疫缺损，在患有获得性免疫病变的患者中，如AIDS，肿瘤疾病导致的无免疫活性，或医疗过程导致的无免疫活性，如化疗，对抗原反应产生的免疫活性，建立免疫活性。

本发明一个方面试剂在多孔固体基质中培养造血细胞，在没有外源生长试剂的情况下，产生淋巴组织源(淋巴组织一特异)细胞。

多孔，固体基质，定义为具有“类海绵”连续孔形成相互连接的网状物的三维结构。基质可以是坚硬的或是有弹性的，它提供了细胞可在整个基质中生长的支架。它的孔相互连接，提供了连续网状通道延伸整个基质，并允许营养物在整个基质中流动。较好的基质是开放细胞泡沫基质，具有开放空间百分比至少50％，较好地是75％。因此，较好地，开放空间占据大部分基质。可相信认为这样最大化了细胞的移动，细胞一细胞的接触，细胞生长的空间和与营养物的接近。较好地，多孔基质制成为网状基质韧带，它们的中心点直径小于150μm，较好地60μm，据此，细胞可位于部分韧带上或与部分韧带相互作用。较好地，平均孔直径大约300μm，其与骨孔相似。适当的基质可使用多种不同的方法获得。这样的方法实例包括聚合物的溶剂铸造或提取，多种物料的径迹蚀刻，聚合物发泡，羟磷灰石的有机骨架复制，和此领域中的技术人员众所周知的其他方法。使用的物料可以是天然的或是合成的，包括生物物料如蛋白质，透明质酸，合成聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮，聚接近丙烯酸甲酯，甲基纤维素，聚苯乙烯，聚丙烯，聚氨基甲酸乙酯，陶瓷如磷酸三钙，铝酸钙，透明质酸钙和陶瓷加固或覆盖的聚合物。如果支架的原材料不是金属，金属涂层可涂在三维基质上。金属涂层提供基质进一步的结构支持和/或细胞生长和附着属性。用作涂层的较好的金属包括钽，钛，铂和相同元素组中的金属如铂，铌，铪，钨和它们合金的组合。金属涂覆方法包括方法如CVD(化学气相沉积法)。

较好的基质，本文全文所指的为细胞泡沫(细胞基质，Woburn，MA)，在美国专利No.5,282,861中详细描述，参考收入本篇。更具体地，较好的基质是由轻质，含碳物料的硬质泡沫制成的网状开放细胞基质，具有由相互连接的网状物限定的开放空间，其中所说的泡沫物料具有相互连接的连续通道，金属物料薄层沉积在网状开放细胞基质上，并覆盖几乎全部相互连接的网状物形成组合多孔生物相容性物料，产生与天然骨孔微观结构相似的多孔微观结构。

因此，这样的基质可用能促进培养的造血祖细胞细胞附着的生物试剂覆盖，允许改进移动，生长和分化。并且，当这些基质用作体内维持，扩展和/或分化造血祖细胞时(即当含细胞的基质移植到受试体中时)，促进血管生成(脉管化作用)的生物试剂和预防/减缓炎症的生物试剂可用作基质的涂层。较好的生物试剂包括胶原，纤连蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白，血管生成因子，抗-炎性因子，糖胺聚糖，玻连蛋白，抗体和其片段，这些试剂的功能等同物，和它们的组合。

血管生成因子包括血小板衍生生长因子(PDGF)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，bFGF-2，leptins，血纤蛋白溶酶原激活物(tPA，uPA)，angiopoietins，脂蛋白，转化生长因子-β，血管疏缓激肽，血管生成低聚糖(如，hyaluronan，类肝素硫酸盐)，凝血栓蛋白，肝细胞生长因子(也称为分散因子)和CXC趋化因子受体家族的成员。抗-炎性因子包括类固醇类和非类固醇类化合物，实例包括：阿氯芬酸(Alclofenac)，阿氯米松（AlcometasoneDipropionate)，阿孕奈德(Algestone Acetonide)，阿法淀粉酶(Alpha Amylase)，安西法尔(Amcinafal)，安西非特(Amcinafide)，安芬酸钠(Amfenac Sodium)，盐酸氨普立糖(Amiprilose Hydrochloride)，Anakinra，阿尼罗酸(Anirolac)，阿尼扎芬(Anitrazafen)，阿扎丙宗(Apazone)，巴柳氮二钠(Balsalazide Disodium)，苄吲酸(Bendazac)，苯噁丙酸(Benoxaprofen)，盐酸苄达明(Benzydamine Hydrochloride)，菠萝蛋白酶(Bromelains)，溴四唑哌啶(Broperamole)，布地缩松(Budesonide)，卡布洛芬(Carprofrofen)，环洛芬（Cicpoprofen)，噌戊唑酮(Cintazone)，氯噻托酸(Cliprofen)，丙酸氯氟美松(Clobetasol Propionate)，丁氯倍氟松(Clobetasone Butyrate)，氯苯吡咯酸(Clopirac)，丙酸氯硫卡松(Cloticasone Propionate)，醋酸三氟米松(Cormethasone Acetate)，去痒可的松(Cortodoxone)，去氟可特(Deflazacort)，丙缩羟强龙(Desonide)，去羟米松(Desoximetasone)，双氯芬酸钾(Diclofenac Potassium)，双氯酚酸钠(Diclofenac Sodium)，双醋二氟松(Diflorasone Diacetate)，二氟米酮钠(DiflumidoneSodium)，双氟尼酸(Diflunisal)，醋丁二氟龙(Difruprednate)，二丙酸地塞米松(Dexamethasone Dipropionate)，双酞嗪酮(Diftalone)，二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide)，丙缩氢炎松(Drocinonide)，甲地松(Endrysone)，恩莫单抗(Enlimomab)，塞庚苯胺钠(Enolicam Sodium)，嘧吡唑(Epirizole)，依拖度酸(Etodolac)，依托芬那酯(Etofenamate)，联苯乙酸(Felbinac)，苯四唑胺(Fenamole)，芬布芬(Fenbufen)，二氯苯氧苯乙酸(Fenclofenac)，氯环苯乙酸(Fenclorac)，苯吲柳酸(Fendosal)，苯吡噁二酮(Fenpipalone)，双苯噻酸(Fentiazac)，氟苯哌酮(Flazalone)，氟噁米松(Fluazacort)，氟芬那酸(FlufenamicAcid)，氟咪唑(Flumizole)，醋酸9-去氟肤轻松(FlunisolideAcetate)，氟胺烟酸(Flunixin)，氟胺烟酸葡胺(FlunixinMeglumine)，氟考丁酯(Fluocortin Butyl)，氟甲孕松醋酸酯(Fluorometholone Acetate)，苯氟喹酮(Fluquazone)，氟比洛芬(Flurbiprofen)，炔氟联苯(Fluretofen)，丙酸氟地松(Fluticasone Propionate)，苯呋丙酸(Furaprofen)，氧芴丁酮酸(Furobufen)，氯氟舒松(Halcinonide)，Halobetasol Propionate，双醋溴氟龙(Halopredone Acetate)，异丁苯乙酸(Ibufenac)，布洛芬(Ibuprofen)，布洛芬铝(Ibuprofen Aluminum)，皮考布洛芬(Ibuprofen Piconol)，伊洛达普(Ilonidap)，吲哚美辛(Indomethacin)，吲哚美辛钠(Indomethacin Sodium)，吲哚布洛芬(Indoprofen)，双甲氧苯吲哚(Indoxole)，吲四唑(Intrazole)，醋异氟龙(Isoflupredone Acetate)，氧卓乙酸(Isoxepac)，异噁噻酰胺(Isoxicam)，酮基布洛芬(Ketoprofen)，盐酸洛非咪唑(Lofemizole Hydrochloride)，氯诺昔康(Lornoxicam)，Loteprednol Etabonate，甲氧胺苯酸钠(Meclofenamate Sodium)，甲氯灭酸(Meclofenamic Acid)，二丁酸甲氯松(Meclorisone Dibutyrate)，甲灭酸(Mefenamic Acid)，美沙拉素(Mesalayine)，甲氯噁唑酮(Meseclazone)，磺庚甲泼尼龙(Methylprednisolone Suleptanate)，氟烟吗酯(Morniflumate)，那布米酮(Nabumetone)，萘普生(Naproxen)，萘普生钠(Naproxen Sodium)，甲基萘丙醇(Naproxol)，腈胺唑酮(Nimazone)，偶氮水杨酸纳(Olsalazine Sodium)，超氧化物歧化酶(Orgotein)，苯呋丙酸(Orpanoxin)，口噁丙嗪(Oxaprozin)，Oxphenbutazone，盐酸瑞尼托林(ParanylineHydrochloride)，戊聚糖多硫酸钠(Pentosan Polysulfate Sodium)，Phenbutazone Sodium Glycerate，甲苯吡啶酮(Pirfenidone)，吡啶苯噻酰胺(Piroxicam)，桂皮酸吡罗昔康(PiroxicamCinnamate)，吡罗昔康Piroxicam Olamine，吡洛布洛芬(Pirprofen)，强的松龙-奋乃静(Prednazate)，普立非酮(Prifelone)，丙哚乙酸(Prodolic Acid)，丙喹酮(Proquazone)，胺丙噁二唑(Proxazole)，枸橼酸胺丙噁二唑(ProxazoleCitrate)，双甲丙酰龙(Rimexolone)，氯马扎利(Romazarit)，水杨酸胆碱硫酸镁(Salcolex)，Salnacedin，双水杨酸酯(Salsalate)，血根氯铵(Sanguinarium Chloride)，氯唑噁酮(Seclazone)，苯吲丝氨酸(Sermetacin)，噻氧噻嗪(Sudoxicam)，舒林酸(Sulindac)，噻吩甲酰布洛芬(Suprofen)，他美辛(Talmetacin)，氟烟酞酯(Talniflumate)，醋柳酞酯(Talosalate)，替布费龙(Tebufelone)，替尼达普(Tenidap)，替尼达普钠(TenidapSodium)，替诺昔康(Tenoxicam)，氧喹苯胺(Tesicam)，苯叉异喹酮(Tesimide)，四氢甲吲胺(Tetrydamine)，噻庚乙酸(Tiopinac)，新戊酸替可的松Tixocortol Pivalate，托耳米丁(Tolmetin)，甲苯酰吡酸钠(Tolmetin Sodium)，三氯氟松(Triclonide)，三氟氨酯(Triflumidate)，叠氮吲酸(Zidometacin)，苯酰吡酸钠(Zomepirac Sodium)。

在本发明的某些实施方案中，含有接种造血祖细胞，有或没有它们的子代，和淋巴网状基质细胞的多孔固体基质用占据基质孔的凝胶状的试剂充满。造血祖细胞，有或没有它们的子代，和/或淋巴网状基质细胞可在充满(注入)凝胶状试剂前，几乎同时，或之后接种。如，细胞可以与试剂混合并与用试剂充满基质同时接种。在一些实施方案中，在使用试剂前将细胞接种在多孔固体基质上。在某些实施方案中，淋巴网状基质细胞以相同的方式接种。此领域中的普通技术人员可方便地确定接种条件。较好地，淋巴网状基质细胞在造血祖细胞前和充满试剂前接种。

用凝胶状试剂“充满”可用来，特别地，将细胞包含在基质内，或来协助保持和/或增强对基质的附着。“凝胶状”试剂可以是最初和在将其使用在基质中后能保持在流体状态(即，可凝胶化)，并能基质中原位凝胶化的试剂。这样的凝胶化作用可以多种方式出现，包括改变试剂的温度，用能量源照射试剂(如光)等。“凝胶状”试剂的特点还在于其能使得生长介质的营养物质到达整个基质的细胞。“凝胶状”试剂的示例包括纤维质多糖(包括它们的硫酸盐形式)，琼脂，琼脂糖，清蛋白，藻类粘蛋白，粘蛋白，粘质，胶原质，糖胺聚糖和蛋白多糖(包括它们的硫酸盐形式)。在某些实施方案中，凝胶状试剂可完全地充满基质，在一些实施方案中，部分充满，在其他实施方案中很小量充满，仅用来覆盖全部或部分基质的外表面。在使用凝胶状试剂的重要的实施方案中，“凝胶状”试剂是甲基纤维素，充满作用是完全的。

依据本发明，造血祖细胞和淋巴网状基质细胞在一种前述多孔固体基质中共-培养，在没有外源生长试剂存在的情况下，产生淋巴组织源(淋巴组织-特异)细胞。“淋巴组织源”(淋巴组织-特异)细胞，如本文所使用的，是指体内或体外依据本发明产生的细胞，与从包括骨髓，胸腺，淋巴结，脾脏和粘膜相关淋巴组织(衬于呼吸道，食道和生殖-泌尿道的非胶囊化组织)的器官和组织中天然产生的细胞基本上相同(如，在属性和功能上)。

“造血祖细胞”如本文所使用的，是指能自我更新并分化成更成熟的血液细胞(本文也称为“子代”)的未成熟血液细胞，包括粒细胞(如，前髓细胞，噬中性粒细胞，噬曙红细胞，噬碱性细胞)，红细胞(如，网状细胞，红细胞)，凝血细胞(如，成巨核细胞，血小板生成成巨核细胞，血小板)，和单核细胞(如，单核细胞，巨噬细胞)。此领域中已知这样的细胞可以包括或不包括CD34+细胞。CD34+细胞是存在于下述“血液产品”中的未成熟细胞，表达CD34细胞表面标记，并可相信其包括具有上述“祖细胞”属性的细胞亚群。此领域中众所周知的是，造血祖细胞包括多能性干细胞，多能性祖细胞(如淋巴干细胞)，和/或对特异造血细胞种系定型的祖细胞。对特异造血细胞种系定型的祖细胞可以是T细胞种系，B细胞种系，树状细胞种系，朗氏细胞种系和/或淋巴组织-特异巨噬细胞种系。

造血祖细胞可以从血液产品中获得。使用在本发明中的“血液产品”是指从身体或含有造血源细胞的身体的器官中获得的产品。这样的来源包括未分级的骨髓，脐带，外周血液，肝脏，胸腺，淋巴和脾脏。对此领域中的普通技术人员显而易见的是，所有前面提及的粗制或未分级的血液产品可通过多种方式变成富含具有“造血祖细胞”特性的细胞。如，血液产品可从较分化的子代中耗竭。更成熟，分化的细胞可通过它们表达的细胞表面分子来选取。此外，血液产品可进行分级，选取CD34+细胞。如前面所提及的，此领域中认为CD34+细胞包括能自我更新并具有多能性的细胞亚群。这样的选取作用可使用如商业购得的磁性抗-CD34珠(Dynal，Lake Success，NY)来实施。未分级的血液产品可通过供体直接获得，或从深低温保藏中重新获得。

依据本发明的方法与造血祖细胞共-培养的细胞是淋巴网状基质细胞。如使用在本文中的“淋巴网状基质细胞”可以包括，但不限于，不是淋巴细胞或淋巴细胞前体或祖细胞的存在于淋巴组织中的所有细胞类型，如上皮细胞，内皮细胞，间皮细胞，树状细胞，脾细胞和巨噬细胞。淋巴网状基质细胞还包括通常不起淋巴网状基质细胞作用的细胞，如成纤维细胞，其已发生遗传上的改变，分泌或在它们细胞表面表达维持，生长和/或分化造血祖细胞，包括它们的子代所需的因子。淋巴网状基质细胞是从一片淋巴组织的解体中衍生的(参看下面的讨论和实施例)。依据本发明这样的细胞能体外支持造血祖细胞，包括它们的子代的维持，生长和/或分化。“淋巴组织”是指包括骨髓，外周血液(包括移动外周血液)，脐带血液，胎盘血液，胎儿肝脏，胚胎细胞(包括胚胎干细胞)，大动脉-生殖腺-中肾衍生细胞，和淋巴软组织。“淋巴软组织”，如本文所使用的，包括，但不限于，组织如胸腺，胰脏，肝脏，淋巴结，皮肤，扁桃腺，腺状肿大和Peyer膜，和它们的组合。

淋巴网状基质细胞在完整淋巴组织中提供维持，生长和/或分化造血祖细胞，包括它们的子代的支持微观环境。微观环境包括由多种包含淋巴网状基质的细胞种类表达的可溶的细胞表面因子。通常，淋巴网状基质细胞提供的支持可以具有接触一依赖和非接触-依赖两种特点。

就造血祖细胞来说，淋巴网状基质细胞可以是同种异型，同基因型或异基因型的。淋巴网状基质细胞可以在器官/组织已发育到它可以支持造血祖细胞的维持，生长和 或分化的阶段(即成熟阶段)的任何时候，从人类或非人类受试体的淋巴组织中获得。这个阶段随着器官/组织的不同和受试体的不同而变化。在灵长目中，如胸腺发育的成熟阶段在第二个三个月期间完成。在发育的这个阶段，胸腺可以产生肽激素如胸腺肽，α1和β4-胸腺素，和胸腺生成素，以及为T细胞分化提供适当微观环境所需的其他因子。不同器官/组织和不同受试体间的不同的成熟阶段在此领域中是众所周知的。

衍生淋巴网状基质细胞的淋巴组织通常确定种系一定型造血祖细胞实施，产生分化子代的种系特异性。在某些实施方案中，淋巴网状基质细胞是胸腺基质细胞和多能性祖细胞和/或对T细胞种烯定型的定型祖细胞。在其他实施方案中，淋巴网状基质细胞可以是脾基质细胞和多能性祖细胞和/或对B细胞种系定型的定型祖细胞。同样令人惊异地，依据本发明，已发现当人类造血祖细胞在存在异基因(非人类)淋巴网状基质细胞存在中培养时，产生最大产量的分化子代。较好地，异基因淋巴网状基质细胞是鼠科动物源的。

没有预料地，还发现当与现有方法比较时，从前述共-培养物中产生较少量的非淋巴特异细胞(即，髓-单核细胞)。换句话说，从本发明的培养物中在细胞泡沫上获得更同源的分化细胞，带有较少的污染细胞种类(非淋巴细胞)，当促进更成熟T子代分化时，能保存不成熟祖细胞(CD34+)。

提供了多种其他实施方案，其中淋巴网状基质细胞可以进行遗传上的改变。淋巴网状基质细胞可以用如能编码上述一种造血细胞生长因子的外源DNA转染(参看上面讨论的成纤维细胞)。

如前面所提及的，淋巴网状基质细胞是从一片淋巴组织的解体中衍生的，形成细胞悬浮液。较好地，产生单细胞悬浮液。这些淋巴网状基质细胞悬浮液可直接使用，或通过组织培养领域中标准方法实施非一有丝分裂。这种方法的实例有用γ-射线源照射淋巴网状基质细胞，或用丝裂霉素C温育细胞足够长的时间以使细胞灭活有丝分裂。当淋巴网状基质细胞是人类源时较好进行有丝分裂灭活(以消除可能存在与悬浮液中的祖细胞)。然后将淋巴网状基质细胞接种在本发明的三维基质中并使其附着在多孔固体基质的表面。应指出的是，淋巴网状基质细胞可以可替换地深冷保藏以作后来使用，或作为向远处的运输和保存，如应用在试剂盒销售中。深冷保藏体外培养的细胞在此领域中已发展完善。随后分离(和/或有丝分裂灭活)细胞样品，通过首先将细胞悬浮在深冷保藏介质中然后逐渐冷冻细胞悬浮液进行深冷保藏细胞。冷冻细胞通常存储在液体氮中，或存储在相同温度下含血清和深冷保藏剂如二甲基亚砜的介质中。

造血祖细胞(和它们的子代)和淋巴网状基质细胞的共-培养，较好地在足以产生从造血祖细胞衍生的淋巴组织源细胞的数量百分比增加的条件下进行。使用的条件是指此领域中已知的条件的组合(如温度，二氧化碳和氧气的含量，营养性介质，时间长短等)。足以增加细胞数量的时间是可由此领域中的技术人员方便地确定的时间，可以随着接种细胞初始数量的变化而变化。根据试验的需要，初始(和随后接种的)引入到多孔固体基质的造血祖细胞和淋巴网状基质细胞的量可以是变化的。根据需要此领域中的技术人员可方便地确定理想数量。较好地，淋巴网状基质细胞应在基质上形成铺满层。造血祖细胞可以以不同量加入。作为一个实施例，经一段时间介质的变色可用作铺满的指示。因此，更精确地，不同数量的造血祖细胞或不同体积的血液产品可在相同的条件下培养，并经规定的时间间隔收获细胞并计数，因此产生“对照曲线”。这些“对照曲线”可用来评估随后情况中的细胞数量(参看实施例部分)。

确定集落形成潜能的条件同样地确定。集落形成潜能是细胞形成子代的能力。对这种潜能的测试对此领域中的普通技术人员是众所周知的，包括将细胞接种在半固体基质中，用生长因子处理并计数集落数。

在本发明较好的实施方案中，可收获造血祖细胞，“收获”造血祖细胞是指从基质上取下或分离细胞。这可使用多种方法实施，如酶解和非酶解，离心，电解或通过大小分级，或在本发明中一个较好的实施方案中，通过使用细胞在其中温育的介质冲洗细胞。这些细胞可进一步收集，分离并进一步扩展产生甚至更大的分化子代群。

如上面所提及的，造血祖细胞，和它们的子代可进行遗传上的改变。对造血祖细胞遗传上的改变包括所有通过加入外源遗传物质产生的细胞遗传物质的瞬间并稳定的变化。遗传上改变的实例包括任何基因治疗过程，如引入功能基因以替换突变的或非表达基因，引入编码显性失活基因产品的载体，引入基因工程设计来表达核糖酶的载体，及引入编码治疗基因产品的基因。天然遗传上变化如没有引入任何试剂的情况下T细胞受体基因的自发重排不包括在这种概念中。外源遗传物质包括引入到造血祖细胞中的核酸或寡聚核苷酸，是天然的或是合成的。外源遗传物质可以是天然存在于细胞中的复制品，或其可能是在自然细胞中找不到的。其通常至少部分是已置于载体构建中启动子的可操作控制下的天然存在的基因。

本发明涉及没有预料到的发现，如果当造血祖细胞在如上描述的固体多孔基质中或上时遗传变化发生，造血祖细胞可进行更有效地遗传上的改变。

可使用多种技术将核酸引入到细胞中。这样的技术包括核酸-磷酸钙沉淀物的转染，与DEAE相关的核酸的转染，用包括有兴趣的核酸的逆转录病毒转染，脂质体介导转染，等等。对于某些应用，较好地将核酸靶中具体细胞。在这样的情况中，依据本发明将核酸运送到细胞中所使用的载体(如逆转录病毒，或其他病毒；脂质体)可有靶分子附着在上面。如，分子如对靶细胞上表面膜蛋白特异的抗体，或靶细胞上受体的配体可与核酸运送载体结合或掺入到其中。如，脂质体用来运送本发明的核酸时，与细胞内吞作用有关的表面膜蛋白结合的蛋白质可掺入到脂质体配方中以靶中和/或促进吸收。这样的蛋白质包括对具体细胞种类具有嗜性的蛋白质或其片段，在循环中进行内化作用的蛋白质的抗体，触发细胞内定位并增强细胞内半衰期的蛋白质，等等。聚合物运送系统液成功地用来运送核酸到细胞中，如此领域中的技术人员所熟知的。这样的系统甚至允许口服核酸。

在本发明中，将外源遗传物质引入到造血细胞中较好的方法是通过使用复制缺损型-逆转录病毒在基质上原位转导细胞。复制缺损型-逆转录病毒能指导所有病毒粒子蛋白质的合成，但不能制备感染颗粒。因此，这些遗传上改变的逆转录病毒载体具有在培养的细胞中高效转导基因的效用，并特异使用在本发明的方法中。逆转录病毒已广泛地用来将遗传物质转移到细胞中。制备复制缺损型-逆转录病毒(包括将外源遗传物质掺入到质粒中，用质粒将包装细胞系转染，通过包装细胞系制备重组逆转录病毒，从组织培养介质中收集病毒颗粒，用病毒颗粒感染靶细胞的步骤)的标准方法在此领域中已提供。

使用逆转录病毒的主要优势是病毒有效地将单拷贝编码治疗试剂的基因插入到宿主细胞基因组中，从而当细胞子代分裂时允许将外源遗传物质传递到细胞子代上。此外，在LTR区域的基因启动子序列已有报道能增强多种细胞种类中插入编码序列的表达。使用逆转录病毒表达载体的主要不利之处有(1)插入性突变产生，即将治疗基因插入到靶细胞基因组中不想要的位置，如导致不规范的细胞生长，(2)为了使载体携带的治疗基因整合到靶基因组中，需要靶细胞增殖。尽管有这些明显的限制。如果转导效率是高的和/或可用于转导的靶细胞数量是大的，通过逆转录病毒运送治疗上有效量的治疗试剂还是有效的。

另一种可用作为造血细胞转化的表达载体的病毒候选者是腺病毒，一种双链DNA病毒。和逆转录病毒一样，腺病毒基因组适合用作为基因转导的表达载体，即，通过移去控制病毒自身产生的遗传信息。因为通常腺病毒以染色体外方式起作用，所以重组腺病毒没有插入突变产生的理论上的问题。在另一个方面，靶造血细胞的腺病毒转化可能不产生稳定的转导。然而，最近，已有报道某些腺病毒序列使载体序列具有染色体内整合特异性，因此产生外源遗传物质的稳定转导。

因此，对领域中的普通技术人员显而易见的是，有多种适用的载体可使用在将外源遗传物质转移到造血细胞中。在适于基因替换治疗的具体条件下选取适当的载体运送治疗试剂及优化将所选取的表达载体插入到细胞中的条件，在不需要过分试验的情况下在此领域中的普通技术范围内。启动子特别地具有初始转录需要的特异核苷酸序列。任意地，外源遗传物质进一步包括为获得所需基因转录活性需要的其他序列(即，增强子)。为了进行这项讨论，“增强子”是简单的任何未翻译的DNA序列，其与编码序列(顺式)邻接起作用来改变由启动子指示的基础转录水平。较好地，外源遗传物质迅速从启动子下游引入到造血细胞基因组中，以便启动子和编码序列实施连接，以使编码序列转录。较好的逆转录病毒表达载体包括一个外源启动子元件以控制插入外源基因的转录。这样的外源启动子包括组成型和诱导型启动子两种。

天然产生的组成型启动子控制重要细胞功能的表达。所以，在组成型启动子控制下的基因在细胞生长的所以条件下表达。组成型启动子的示例包括下列编码某些组成性或“持家”功能的基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，二氢叶酸还原酶(DHFR)(Scharfmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：4626-4630(1991))，腺苷脱氨酶，甘油磷酸激酶(PGK)，甘油磷酸变位酶，肌动蛋白启动子(Lai等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10006-10010(1989))，和其他此领域中的技术人员已知的组成型启动子。此外，许多病毒性启动子在真核细胞中起组成性作用。这些包括：SV40早期和晚期启动子；Moloney白血病病毒和其他逆转录病毒的长末端重复序列(LTRS)；HerpsSimplex病毒的胸苷激酶启动子，以及许多其他启动子。因此，上面提及的任何一个组成型启动子可用来控制异源基因插入的转录。

在存在诱导试剂的情况下，仅表达在诱导型启动子控制下的基因或表达到较大的程度，(如，在存在某些金属离子的情况下，在金属硫因启动子控制下的转录大大增加)。诱导型启动子包括当它们的诱导因子被结合时刺激转录的效应元件(RE)。如有血清因子，类固醇激素，视黄酸和环状AMP的RE。为了获得诱导型反应及在一些情况中，可选取含有特别RE的启动子，RE本身可以附着在不同启动子上，从而使重组基因具有可诱导性。因此，通过选取适当的启动子(组成型对诱导型，强对弱)，使在遗传修饰的造血细胞中控制治疗试剂的表达的存在和量成为可能。考虑到上面公开的因子和患者的临床分布，为运送治疗上有效量的具体治疗试剂选取及优化这些因子相信在不用进行过分试验的情况下在此领域普通金属范围内。

除了至少一种启动子和至少一种编码治疗试剂的异源核酸，表达载体较好地包括一种选择基因，如新霉素抗性基因，以便选择已被表达载体转染或转导的造血细胞。可替换地，造血细胞被两种或多种表达载体转染，至少一种载体含有编码治疗试剂的基因，其他载体含有选择基因。选取适当的启动子，增强子，选择基因和/或信号序列(上面描述的)相信在不用进行过分试验的情况下在此领域普通技术范围内。

为了在分离的造血细胞中表达特异基因产品选取和优化具体表达载体可通过获得基因，较好地用一种或多种适当的对照区域(如启动子插入序列)；制备包括在其中插入基因的载体的载体构建；体外用载体构建转染或转导培养的造血细胞，确定是否基因产品在培养的细胞中呈递来实施。

         表1 RAC认同的人类基因治疗方案：1991-1994

ADA缺损引起的重度联合免疫缺损(SCID)用人类ADA基因转导自体同源淋巴细胞7/31/90晚期癌症用肿瘤坏死因子基因转导肿瘤-渗透淋巴细胞7/31/90晚期癌症用肿瘤坏死因子基因转导的自体同源癌细胞免疫接种10/07/91晚期癌症用白细胞介素-2基因转导的自体同源癌细胞免疫接种10/07/91感染HIV-1的无症状患者编码HIV-1基因[HIV-IT(V)]的鼠科动物逆转录病毒载体6/07/93AIDSRev基因的转显性形式对AIDS感染的作用6/07/93晚期癌症人类多种药物抗性(MDR)基因转移6/08/93HIV感染用裂解HIV-1 RNA的催化核糖酶转导自体同源淋巴细胞(I期研究)9/10/93转移性恶性黑素瘤产生白细胞介素-2的基因工程设计的自体同源肿瘤疫苗 9/10/93HIV感染编码HIV-IT(V)基因的鼠科动物逆转录病毒载体(公开标签I/II期试验) 12/03/93HIV感染(一卵双生)同基因细胞毒性T淋巴细胞的过继转移(中间研究I/II期) 3/03/94乳腺癌(治疗期间化学保护)使用修饰的逆转录病毒将化疗抗性序列引入到正常造血细胞中(中间研究) 6/09/94Fanconi贫血症Fanconi贫血症互补组C基因的逆转录病毒介导基因向造血祖细胞中转移 6/09/94转移性前列腺癌自体同源人类粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子基因转导前列腺癌疫苗(在加速审查过程中首先被认同的方案；ORDA＝重组DNA活性办公室) ORDA/N IH 8/03/94转移性乳腺癌体内用表达反义c-fox或反义c-myc RNA的乳腺癌靶中逆转录病毒载体感染 9/12/94转移性乳腺癌(难以控制的或复发的)运送人类白细胞介素-2基因到自体同源肿瘤细胞中的非病毒性系统(脂质体基的)(中间研究)9/12/94Mild Hunter症艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因的逆转录病毒介导向淋巴细胞中转移9/13/94晚期间皮瘤使用重组腺病毒(I期研究)9/13/94

前述表1中，表示了依据本发明的方法能被运送的基因实施例。适于这种基因的启动子，增强子和载体等在与前述试验相关的文献中公开。通常，有用的基因替换或补充功能，包括编码缺少酶如已用在临床试验中治疗ADA缺损的腺苷脱氨酶(ADA)和辅因子如胰岛素和凝聚因子VIII的基因。影响调节作用的基因也可服用，单独服用，或与补充或替换特异功能的基因组合服用。如，可服用编码抑制具体编码-蛋白质基因的表达的蛋白质的基因。本发明特别可应用在运送刺激免疫反应的基因中，包括编码病毒性抗原，肿瘤抗原，细胞因子(如肿瘤坏死因子)和细胞因子诱导物的基因(如内毒素)。

使用下面非常详细描述的培养条件，依据本发明使保藏造血祖细胞和刺激造血祖细胞数量和/或集落形成单位潜能扩展成为可能。一旦扩展，如细胞能重新回到身体中以补充，重建等患者造血祖细胞群。这对于如，个体已进行化疗后是很适合的。还有其中造血祖细胞减少的某些遗传病况，本发明的方法也可使用在这些情况中。

还可能的是，利用依据本发明制备的增加数量的造血祖细胞，用促进造血细胞维持，扩展和/或分化，并影响细胞定位的造血细胞生长试剂刺激它们，以体外产生更成熟的血液细胞。如上所述，这种扩展的血液细胞群可体内使用，或如此领域中的普通技术人员会认识到的，进行试验使用。这种分化细胞包括上面描述的那些，还有T细胞，浆细胞，红细胞，巨核细胞，嗜碱性细胞，多形核白细胞，单核细胞，巨噬细胞，嗜曙红细胞和血小板。

依据本发明，在所有培养方法中，除了特别提供的，使用的介质是传统培养细胞的介质。实施例包括RPMI，DMEM，Iscove等等。一般，这些介质用人类或动物血浆或血清补充。这样的血浆或血清可含有少量造血细胞生长因子。然而，依据本发明使用的介质也可不用在先有技术中传统使用的介质。具体地，已惊异地发现，在不需要加入任何外源生长试剂(除了含在血浆或血清中的生长因子)的情况下，在没有用基质细胞温育培养物环境的情况下，在没有使用基质细胞条件培养介质的情况下，造血祖细胞可在上面描述的基质中培养延长的一段时间。在本发明之前，至少一种前述试剂相信认为是培养造血祖细胞所必需的。

与本发明有关的具体有兴趣的生长试剂是造血细胞生长因子。造血细胞生长因子是指影响造血祖细胞生存，增殖或分化的因子。仅影响生存和增殖但相信认为不促进分化的生长试剂，包括白细胞介素3，6和11，干细胞因子和FLT-3配体。促进分化的造血细胞生长因子包括集落刺激因子如GMCSF，GCSF，MCSF，Tpo，Epo，制癌蛋白M，和除了IL-3，6和11的白细胞介素。前述因子对此领域中的普通技术人员是众所周知的。大部分可购得。它们可通过提纯，通过重组法获得，或可衍生或合成获得。

“基质细胞条件培养介质”是指在其中前述淋巴网状基质细胞已进行温育的介质。温育实施足够长的时间以使基质细胞在介质中分泌因子。然后，可使用这样的“基质细胞条件培养介质”来补充造血祖细胞的培养物，促进它们的增殖和/或分化。

因此，在没有任何前述试剂的情况下培养细胞时，本文是指，在没有加入这样的试剂的情况下，除了存在于血清，普通营养性介质中的，或在分级的或未分级的含有造血祖细胞的血液产品分离物中的这种试剂，进行细胞培养。

依据本发明另一个方面，提供了一种体内维持，扩展和/或分化造血祖细胞的方法。方法包括在受试体中植入含有接种造血祖细胞，造血祖细胞子代和淋巴网状基质细胞的多孔固体基质。与本发明基质相同的基质的植入在此领域中是众所周知的(Stackpool，GJ，等人，联合整形外科研究界会议1995年11月6-8日，圣狄亚哥，CA，摘要册P45；Turner，TM等人，生物物料界第21次年会，3月18-22日，San Francisco，CA，摘要册P125)。这样的基质是生物相容的(即，无免疫反应性-无排斥)，并能植入和移植到受试体的多种不同的组织中。这样的方法可以多种方式应用，包括在受试体的多种不同组织中，和/或不同受试体间研究造血祖细胞维持，扩展，分化和/或体内定位。

如本文所使用的，受试体是人类，非人类灵长类动物，牛，马，猪，绵羊，山羊，狗，猫和啮齿类动物。人类造血祖细胞和人类受试体是特别重要的实施方案。如上面所描述的，当本发明的基质用在如体内植入研究中时，促进血管生成(脉管化作用)和/或预防/减缓炎症的生物试剂也可用来涂覆基质。较好的生物试剂如上所述。同样如上面所描述的，依据本发明，在植入受试体前，造血祖细胞预先接种在多孔固体基质中并在体外培养。依据本发明，将一定量的细胞引入到多孔固体基质中，并与淋巴网状基质细胞在不含基质细胞条件培养介质，和促进造血细胞维持，扩展和/或分化的外源加入造血细胞生长因子，除了血清的环境中共-培养。然后实施植入。在某些实施方案中，基质细胞条件培养介质和外源造血细胞生长因子在植入前体外培养期间可加入。

依据本发明的一个方面，提供了一种体外诱导T细胞反应性/激活的方法。诱导T细胞反应性/激活包括在存在抗原呈递细胞和抗原的情况下，在一种前述基质中，在足以从对抗原具有特异性的造血祖细胞中诱导形成T细胞和/或T细胞祖细胞的条件下，共-培养造血祖细胞和淋巴网状基质细胞。在不同过分试验的情况下，此领域中的普通技术人员可方便地确定前述条件(参看Sprent J等人，免疫治疗期刊，1998，21(3)：181-187；Berridge MJ，Crit Rev Immunol，1997，17(2)：155-178；Owen MJ等人，免疫学当前观点，1996，8(2)：191-198；Whitfield JF等人，分子细胞生物化学，1979，27(3)：155-179；Fauci AS等人，国际医学年刊，1983，99(1)：61-75)。存在APC时T细胞的抗原刺激作用，诱导可使用增殖测试法测定的或仅通过测定IL-2产出测定的抗原特异反应(参看下面讨论)。这些细胞可通过在存在APC的情况下，在适当浓度(如0.1-1.0μM破伤风类毒素)下用抗原培养T细胞来检测。如果抗原特异T细胞存在，它们可使用如下所述的测试法在自我耐受性/无反应下检测。在存在APC情况下刺激T细胞可包括与共-刺激性试剂的共同刺激作用。共同-刺激试剂包括淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3)，CD2，CD40，CD80/B7-1，CD86/B7-2，OX-2，CD70，和CD82。共同-刺激试剂也可用来替换APC，只要MHC类II分子和抗-CD3抗体与共同刺激试剂共同服用。

在前述培养系统中温育可同时使用一种或多种抗原。较好地，当进行扩展的造血祖细胞是人类的时，淋巴网状基质细胞是胸腺基质细胞，是鼠科动物源的。因此，在短时间内可获得大量抗原特异成熟T和未成熟T细胞，这在以前使用现有技术方法从未实现过。本发明因此在广泛的应用范围内变得很有用，包括用预先制备好的T细胞预-曝露免疫接种个体，使用肿瘤-定向T细胞免疫治疗法治疗癌症患者，治疗骨髓移植患者(机会性感染，如CMV，没有解决并仍然进行用定向T细胞如CMV-定向细胞毒性淋巴细胞治疗的患者)，通过T细胞辅助治疗增强传统免疫接种的效用，治疗紧急的或复发紧急病原体的发作，等等。抗原呈递细胞包括细胞如树状细胞，单核细胞/巨噬细胞，朗氏细胞，Kupfer细胞，格子细胞，小泡巨噬细胞和B细胞，它们的分离方法在此领域中是众所周知的。抗原呈递细胞也可从造血祖细胞体外衍生。

免疫学耐受性是指对受试体表现免疫反应的能力的抑制作用，如对供体抗原，否则，免疫反应应在将非自身-抗原引入受试体时发生。耐受性可包括体液，细胞，或体液和细胞反应。胸腺驯育致使产生T细胞能对自身-MHC环境中多种外源抗原反应，但只不对自身抗原反应。根据自身-限制的主题，这可首先通过将适当的胸腺细胞从编程性细胞死亡中系统拯救，并将这些细胞释放到外周作为自身-耐受T细胞来实现。

自身耐受性可在体外此领域中已知的条件下建立，包括在存在从另一种个体(B)衍生的胸腺基质的情况下共-培养从供体(A)衍生的CD34+祖细胞。简单地，胸腺基质从用胶原酶(20μg/毫升，Sigma化学公司)消化成单细胞悬浮液的新鲜分离的胸腺组织中建立。胸腺基质培养物通过将细胞悬浮液铺在24培养皿板中，浓度为每个培养皿在体积2毫升的R10(RPMI加10％FCS)中有4×10⁶个活细胞。培养物在标准湿润组织培养温育箱中在37℃5％二氧化碳中温育。一天到两天后，将没有附着的细胞用R10冲洗三次除去。基质还需要7-10天变成铺满。将基质保持在R10中，R10至少每周换两次。培养7-10天后，将R10中的CD34+细胞加入到基质中，浓度为每个培养皿上1-3×10⁵个细胞。通过用R10替换部分介质，没有在这些培养物中加入外源细胞因子的情况下培养两周培养物。14-21天后，将没有附着的细胞从培养物中除去。剩余的附着的细胞是在体外发育的自身-耐受T细胞。

确定是否体外已建立了耐受性的方法对此领域中的技术人员是众所周知的，包括测定增殖反应，对：自身(A)，以及对胸腺供体(B)，和第三方(C)，外周血液单核细胞(PBMC)。简单地，A，B和C的PBMC可通过Ficoll梯度离心作用制备。将1×10⁵个效应器细胞(体外从A产生的T细胞)铺在多复制板96培养皿板中。照射(3000Rad)刺激物细胞(从A，B，和C获得的PBMC)，并将其加入到12个复制板中，每个培养皿1×10⁵个细胞。Con-A(5μg/毫升)用作为正对照物。4天后，将1μCi的³H-胸苷加入到每个培养皿中，18-24小时后收获板。如果耐受性已建立，当与不相关的第三方(C)混合时，体外产生的T细胞会反应并增殖，但当与从自身(A)或胸腺供体(B)产生的PBMC混合时T细胞不增殖。

依据本发明的另一个方面，提供了体外诱导T细胞无反应性的方法。诱导T细胞无反应性包括，在存在抗原的情况下，在足以诱导T细胞和/或T细胞祖细胞形成和抑制形成的T细胞和/或T细胞祖细胞激活的条件下，在一种前述基质中共-培养造血祖细胞和淋巴网状基质细胞。

无反应性定义为T细胞的无反应状态(即，它们对重新刺激不产生IL-2，或当重新刺激时不增殖)(Zamoyska R，免疫学当前观点，1998，10(1)：82-87；Van Parijs L等人，科学，1998，280(5361)：243-248；Schwartz R H，免疫学当前观点，1997，9(3)：351-357；免疫学评述，1993，133：151-76)。然而，无反应性可能是不可逆的。无反应性可以在不存在共同-刺激作用(一种信号对两种信号假设)的条件下通过抗原-特异T细胞刺激诱导。可替换地，甚至在存在共同-刺激作用的情况下，低亲和力的肽或非常高浓度的肽也能诱导无反应性。无反应性可在体外通过在不存在抗原呈递细胞(B细胞，巨噬细胞或树状细胞)的情况下培养T细胞来诱导。然后将这些T细胞用抗原处理，如破伤风类毒素(如0.1-1.0μM)。T细胞的等分份用来呈递抗原。这组成了没有共同-刺激作用的抗原呈递，会诱导无反应性(Nelson A等人，免疫学，1998，10(9)：1335-46)。可替换地，T细胞可与APC共-培养，在非常高(10-100μM)或非常低(0.01-0.05μM)浓度的破伤风类毒素环境中，也会诱导无反应状态。

无反应性可通过获得上面描述的T细胞，并在存在APC的情况下用抗原(如0.1-1.0μM破伤风类毒素)重新刺激它们来测定。如果细胞是无反应性的，它们在APC环境中在适当的浓度下将不对抗原反应。通过培养细胞如3-5天并如下测定增殖或增殖缺乏来测定无反应性。简单地，将APC铺在96培养皿板的多复制板中，照射后(3000Rad)。将这些细胞用抗原(如0.1-1.0μM)脉冲2小时，然后将T细胞加入到12复制板中，每个培养皿中1×10⁵个细胞。Con-A(5μg/毫升)用作为正对照物。4天后，将1μCi的3H-胸苷加入到每个培养皿中，18-24小时后收获板。如果细胞是无反应性的，它们对抗原刺激作用将不增殖。可替换地，在如上所述培养物的上清液中可测定产出的IL-2。每天收集上清液，并使用商业ELISA测定法测定IL-2产出。另一种方法包括流式细胞计数法，根据对细胞因子IL-2，γIFN和TNFα的细胞内表达的特异染色，使用特异于这些因子的人类形式的抗体(Becton Dickinson)。并且，也可使用这些因子的mRNA的半量RT-PCR。

依据本发明的另一个方面，提供了一种鉴别怀疑影响造血细胞发育的试剂的方法。方法包括将一定量的造血祖细胞和一定量的淋巴网状基质细胞引入到本发明的多孔固体基质中，在存在至少一种怀疑影响造血细胞发育的候选试剂的条件下，在造血祖细胞和淋巴网状基质细胞的测试共培养物中共-培养。“造血细胞发育”是指包括造血祖细胞维持，扩展，分化，和/或细胞程序性死亡(编程性细胞死亡)。“维持”包括造血祖细胞能维持其多能性。“扩展”包括造血祖细胞能分裂并生长。“分化”包括造血祖细胞能向特异细胞种系分化。“细胞死亡”包括编程性细胞死亡(细胞程序性死亡)。“影响”造血细胞发育因此包括影响造血祖细胞维持，扩展，分化，和/或细胞死亡。这样的作用(或影响)性质上可以是正的或负的/抑制作用。如，正影响应是维持祖细胞的多能性，和/或增加多能性祖细胞的数量。负影响应是导致祖细胞分化并损失多能性，或甚至导致祖细胞死亡。对一种具体细胞群的负影响也可能对不同细胞群有正影响。如对B细胞种系的抑制作用可能会对，如T细胞种系产生正影响。怀疑影响造血细胞发育的试剂可以转染核酸到淋巴网状基质细胞中以及直接加入到介质中的形式服用。

为了确定是否在测试共-培养物中至少一种候选试剂影响造血细胞发育，将在测试共-培养物中产生的造血细胞的显型和/或基因型(以及数量)与在对照共-培养物中产生的造血细胞的显型和/或基因型(以及数量)比较。对照共-培养在与测试共-培养相同的条件(即，在相同的基质中，在相同的培养介质中，相同初始量和种类的造血祖细胞和淋巴网状基质细胞，等等)下实施，但除了在对照共-培养物中不含至少一种怀疑影响造血细胞发育的候选试剂。确定造血细胞的显型和/或基因型的方法在此领域中是众所周知的，在整篇申请中可找到几个

实施例。

在本发明的另一个方面中，还提供了一种在细胞培养物中分离怀疑影响造血细胞发育的试剂的方法。方法包括在本发明的多孔固体基质中引入一定量的造血祖细胞和一定量的淋巴网状基质细胞，共-培养造血祖细胞和淋巴网状基质细胞，从共-培养物中获得测试上清液(和其部分组成)。然后将测试上清液(或其部分组成)与对照-上清液(或其部分组成)比较。“比较”意指将存在于测试上清液中和从共-培养物的细胞分泌的试剂分布(怀疑影响造血细胞发育的)，与存在于对照-上清液中和从对照培养物或共-培养物中的细胞分泌的相似试剂分布比较。获得分泌试剂的这种分布的方法在此领域中是众所周知的，包括二维(2D)凝胶电泳法。其他方法还包括多种类型的HPLC，薄层层析法。

为了获得与在本发明的共-培养系统中确定的结果相关(即，近似)的结果，“对照培养物或共-培养物”可包括此领域中已知的类似培养系统(如Johnson等人的美国专利No.5,677,139)中的造血祖细胞培养物。如，依据本发明的测试共-培养物，包括人类造血祖细胞和从鼠胸腺获得的淋巴网状基质细胞的共-培养物，产生多样(多种亚类)群的对T细胞种系定型的人类淋巴细胞。然后将从这种共-培养物中获得的测试上清液，与从在先有技术的类似系统(如上所述的)中的也产生对T细胞种系定型的人类淋巴细胞群的人类造血祖细胞培养物中获得的对照上清液比较。对照培养物或共-培养物的其他实施例包括造血祖细胞和与使用在本发明基质中的测试共-培养物中的组织源不同的组织源的淋巴网状基质细胞的共-培养物。因此，组织可能是或可能不是淋巴源的。此领域中的普通技术人员应能方便地选择并建立这样的对照培养物或共-培养物。一旦获得怀疑影响造血细胞发育的试剂的分布，然后可分离并进一步定性表现与对照-上清液不同或对照-上清液不含有的，含有怀疑影响造血细胞发育的试剂的测试上清液的亚组成。如，在测试-上清液的2D凝胶电泳印迹中表现不同迁移的候选试剂可通过蛋白质测序和质谱法进行提纯并进一步定性。在2-D凝胶电泳印迹中呈现但不存在于测试上清液的印迹中的试剂也怀疑影响造血细胞发育，也能进行进一步的提纯。

参照下列实施例可更全面地理解本发明。然而，这些实施例仅仅是演示本发明的实施方案，不解释为对本发明范围的限制。

实施例

试验方案

分离人类CD34+细胞

在人类胚胎剖腹产期间脐带切断前，使用肝素化的注射器提取5到10毫升的静脉脐带血液(UCB)。脐带切断胎儿分娩后，通过夹住脐静脉最近处，切断距胎盘最远处取出胎盘。在取出胎盘后马上松开脐静脉，将含在胎盘中的血液排到适当的肝素化的容器中。在操作前，将脐带和胎盘血液混合在一起。提取后，用冲洗介质(RPMI 1640，10IU/毫升青霉素，10μg/毫升链霉素，1mM L-谷氨酰胺)以2∶1稀释脐带/胎盘血液。然后将样品用体积相当于一半稀释样品体积的Ficoll-Hypaque(1.077克/毫升)垫起，以形成明显的样品/Ficoll界面。在400xg离心45分钟后，将含单核细胞的界面除去。细胞通过重新悬浮到培养介质中并在400xg离心10分钟进行冲洗。产生的碎片重新悬浮到6毫升的氯化铵裂解缓冲液(0.15M氯化铵，1.0mM碳酸氢钾，0.1M的Na2EDTA)中3分钟以裂解任何剩余的红细胞。悬浮液重新用介质稀释并再冲洗两遍。最后冲洗后，细胞重新悬浮到1-2毫升介质中，通过锥虫蓝排阻法确定生存细胞的数量。

通过解体从16-22周大的流产胎获得人类胎儿胸腺制备人类CD34+祖细胞。解体过程参看下面的鼠胸腺基质。

使用Dynal CD34祖细胞选择系统(Dynal，Lake Success，NY)或MiniMACS系统(Miltenyi Biotec，Bergisisch Gladbach，德国)，将表达表面抗原CD的细胞分离。将从UCB(或骨髓)分离的单核细胞悬浮到分离缓冲液(PBS，2％热灭活胎牛血清，10IU/毫升青霉素，10μg/毫升链霉素，)中，浓度为2.5×10⁵个细胞/毫升。然后，在园底试管中将悬浮液加入到磁性抗-人类CD34+珠(Dynal M-450 CD34)中，速度为4.0×10⁷个珠每毫升悬浮液。(Dyna珠M-450 CD34是与对CD34特异的单克隆抗体结合的超顺磁性珠)。使用Dynal样品混合器将混合物轻柔旋转，并轻柔倾斜旋转在4℃温育45分钟。温育后，珠/细胞混合物重新悬浮到大体积分离缓冲液中，并置于磁性分离装置中2分钟，以使细胞/珠复合物积聚在试管壁上。当仍用试剂处理时，没有结合磁性珠的含有细胞的悬浮液吸出。用这种方式将细胞/珠复合物冲洗三遍，将含有CD34负细胞的悬浮液集中到相同的试管中。将含有释放细胞(CD34-)的试管置于磁性分离器上，除去任何残留的珠，并将上清液转移到新锥形管中。附着珠的所有CD43+细胞用最小量为10毫升的分离缓冲液伴随2000rpm离心8分钟冲洗两次。将结合磁性珠的细胞重新悬浮到每4×10个使用的珠100μl的分离缓冲液，最小体积为100μl。通过加入等体积的抗一个体基因型抗体(DETACHaBEADCD34，Dynal)，旋转，并使用Dynal样品混合器在室温轻柔混合1小时，将CD34正细胞从珠上分离。通过加入分离缓冲液并将试管置于磁性分离装置上2分钟，将细胞从细胞/珠悬浮液中分离。在珠移动到试管壁上后，将含CD34正细胞的上清液转移到新试管中。用集中在相同试管中的含有释放细胞的上清液冲洗珠三次。将含有释放CD34+细胞的试管置于磁性分离器上以除去任何残留的珠，将上清液转移到新试管中。细胞用最小量为10毫升的分离缓冲液伴随2000rpm离心10分钟冲洗两次。

可替换地，依据公共机构评定委员会指导方针及得到了解事实后的应允后，通过背部髂骨骨栉吸出，从健康成年志愿者获取人类骨髓。将10-15毫升人类骨髓收集在肝素化的无菌注射器中，在室温下运送并在6小时内使用。骨髓稀释在5倍体积的PBS中，通过密度梯度离心经Ficoll-Paque柱(生物技术制药有限公司，Piscataway，NJ)分离单核细胞(MNC)。然后将获得的MNC在10毫升PBS中冲洗，剩余的红细胞通过使用ACK裂解缓冲液(Bio Whittaker，Walkersville，MD)裂解除去。

为了在CD34+群中选择更不成熟的祖细胞显型，我们选择使用免疫磁性珠选择系统，使用新型干细胞抗原AC133的抗体，AC133是表达在20-60％人类CD34+细胞上的5-跨膜细胞表面抗原，包括CD38^neg/dim亚集(表示非-种系-定型前体)，但不在成熟白细胞上表达(Yin AH等人，血液，1997，90：5002-12；Nfiraglia S等人，血液，1997，90：5013-21；Buhring HJ等人，Ann N Y Acad Sci，1999，872：25，讨论38-9)。尽管少量成熟CD2+T细胞与AC133+祖细胞一起被转移到我们的共-培养物中，但我们不认为这个系统中产生的T细胞是从CD2+成熟淋巴细胞或CD2+淋巴定型前体衍生的。我们和其他人(Fisher AG等人，国际免疫学，1990，2：571-8)，已观察到预先引入成熟人类T细胞到共-培养物中没有产生增加数量的T细胞或它们的前体。使用AC133细胞分离试剂盒(Miltenyi生物技术有限公司，Auburn，CA)，依据制造商方案，通过免疫磁性珠选择分离AC133+MNC组成。

鼠胸腺基质：

从新鲜杀死的6周大B6(BALB/C)鼠获取胸腺。为了制备含有小于0.5立方毫米大小的胸腺组织组成的细胞悬浮液，用外科手术剪刀解体胸腺。将含胸腺组成的细胞悬浮液置于0.5厘米×0.5厘米×0.2厘米的细胞泡沫(80ppi)上，置于24培养皿板的每个培养皿中。每个培养皿含有至少5×10⁶个细胞，每块细胞泡沫板上有4部分胎儿胸腺，将细胞在补充满IMDM中培养。在胸腺培养物中的介质在建立培养物后48小时进行初始更换，之后三天间隔更换。在10到14天之间，在细胞泡沫上建立平均80％铺满的胸腺基质单层。在培养10天到14天时，将每块含有亚-铺满层胸腺基质的细胞泡沫板从24培养皿板上取出，并置于新的24培养皿板的培养皿中，与CD34+细胞共一培养。

人类CD34+/鼠科动物胸腺基质共-培养条件：

将从UCB或人类骨髓衍生的五千个CD34+细胞置于照射过的胸腺基质上。在使用细胞泡沫的情况中，CD34+细胞直接置于24培养皿组织盘中的细胞泡沫上。共-培养物中的介质每三天更换，并且不补充外源细胞因子。CD34+细胞产生的细胞在建立共-培养系统后7天收获，对衍生获得的细胞实施流式细胞计数和功能研究。

测定共-培养物中衍生的细胞的免疫显型和功能：

使用非-胰蛋白酶分离溶液(细胞分离溶液，Sigma，St Louis，MO)收获附着细胞以最小化表面染色特性的改变。为了从细胞泡沫上恢复附着细胞，将单元通过浸没在PBS中冲洗两遍，通过在过量细胞分离溶液中短暂旋转饱和，在37℃温育20分钟，并在1500rpm离心10分钟。

通过轻柔吸出收获细胞，并用PBS冲洗两遍。收获的细胞计数，并通过锥虫蓝排阻法测定生存能力。计数后，细胞在终体积为100μl的2％鼠血清(Dako，Carpentiera，CA)和下列荧光染料缀合抗体中染色，荧光染料缀合抗体：TCRαβ，TCRγδ，CD2，CD3，CD4，CD8，CD14，CD33和CD34(Betcon Dickinson，San Jose，CA)。对每中培养物使用所有四种荧光染料的缀合异型对照抗体(FITC，PE，Peridinin叶绿素蛋白质(PerCP))，和别藻蓝素(APQ)。用PBS冲洗染色样品三次，用1％多聚甲醛固定，并用FACScaiibur流式细胞计数器(Becton Dickinson)分析。适当的对照物包括建立正和负四个象限的匹配异型抗体，以及建立补偿的适当的单色染色剂。对于每种样品，收集了至少10,000个清单模式事件。抗-CD3和抗-CD4用来检测CD34+选择的MC亚群中污染的T细胞和单核细胞。

通过对CD45+群的门控，在免疫显型分析中将人类白细胞从鼠细胞中区别出来。14天后，共-培养物中，＞70％的CD45+细胞共同表达CD3，CD4，和/或CD8。经2周在这个系统中示踪T-淋巴前体的连续分化是可能的(图1)。在三维基质(细胞泡沫)上，将CD34+祖细胞加入到含鼠科动物胸腺基质细胞的共-培养物中。在建立共-培养物后7，14和21天收获非一附着细胞，通过FACS分析法确定它们的免疫显型。试验组中的数据(a)：显示出获得CD2及造血祖细胞标记，CD34的负调节作用。在共-培养物中获得细胞表面CD4和CD8标记出现在14天后；(b)：显示出SP CD4+和SP CD8+的离散群，包括它们的DP CD4+CD8+前体。在14天获得CD4与获得CD3有关；(c和d)：所有CD4+共表达CD3。CD3与大部分CD8+细胞共同表达；是CD3-CD8+的那些细胞发现表达TCRγδ。尽管也检测到小部分群(20％)CD3+细胞表达TCRγδ，但78％CD3+细胞表达TCRαβ(6％CD3+CD8+TCRγδ，14％CD3+CD8+TCRγδ)。

T细胞功能：

通过确定对有丝分裂原反应的CD69表达和对有丝分裂原Con-A反应的³H-胸苷吸收来测定T细胞功能。还对在共-培养系统中产生的T细胞检测它们的HIV-1可感染性和它们的MFG鼠科动物逆转录病毒载体可转导性。共-培养物产生的T细胞显示出预期的对有丝分裂原C0n-A反应的大量³H-胸苷吸收(10倍对照无反应细胞)，和由流式细胞计数法确定的增长4倍的激活标记CD69的表达。

HIV-l攻击HPC/胸腺基质共培养物产生的T细胞

用T细胞嗜性分离HIV_IIIB在感染1复数下攻击HPC产生的T细胞。使用此领域中众所周知的标准方式产生HIV-1的滴定浓度的贮存物。从HIV攻击使用ELISA(Coulter，Miami，FL)进行的HIV-1 p24抗原检测后3，6，9，14和28天的培养物中移出培养物上清液样品。其次，从BM HPC和胸腺基质的共-培养物中产生的分选CD4+T细胞用HIV_IIIB在感染l复数下攻击。在用HIV-l攻击单核细胞和T细胞后使用锥虫蓝排阻法确定细胞生存能力。HPC产生的T细胞可被HIV-1感染并培养10天可产生高达0.69ng/ml的HIV-1 p24。从在细胞泡沫上的鼠科动物胸腺基质上的HPC共-培养物产生的并用热灭活D HIV_IIIB处理的分选的和未分选定T细胞产生检测不到量的HIV-1 p24。用HIV-1感染处理后T细胞的生存能力显著下降。从细胞泡沫共-培养系统中产生的T细胞中产生的HIV-1 p24抗原的量与从人类激活外周血液T细胞产生的HIV-1 p24的量相似。

用双嗜性鼠科动物逆转录病毒载体转导从HPC/胸腺基质共一培养物中产生的T细胞

在M.O.I.为10时，在三种情况中，将从HPC产生的并在IL-2和PHA中扩展的T细胞用鼠科动物逆转录基病毒载体，MFG，编码核内定域酶β-半乳糖苷酶处理72小时。使用标准方法从人类基FLYA4包装细胞系中产生滴定浓度的逆转录病毒载体。T细胞也用灭活的MFG处理。在用逆转录病毒处理后第7天收获转导的T细胞，并用标准方法染色表达β-半乳糖苷酶转基因。在从细胞泡沫上培养的HPC和鼠科动物胸腺基质共一培养物中产生的T细胞中观察到12到26％的转导效率。在用热灭活的逆转录病毒载体处理的T细胞中检测不到β-半乳糖苷酶活性。从细胞泡沫共-培养系统中产生的人类T细胞的转导效率与在激活外周血液T细胞中观察到的相似。

mRNA提取及cDNA分析：

为了确定T细胞受体基因表达，将产生的细胞裂解，从细胞中制备RNA进行RNA PCR。从在基质单层上培养的细胞中提取信使RNA。使用硫氰酸胍和寡聚-dT离心柱(快速制备微型mRNA提纯试剂盒；Pharmacia，Piscataway，NJ)，依据制造商指示实施提取。将mRNA样品储存在-70℃。使用约2μgmRNA，1μg随机引物，和6.25单位的AMV逆转录酶(GIBCO/BRL)在终体积为40μl中合成cDNA的第一条链。将样品在室温温育10分钟，在42℃温育1小时，在95℃温育5分钟，在4℃温育5分钟。使用逆转录，使用随机引物和MoloneyMul V逆转录酶(GIBCO/BRL，Grand Island，NY)实施大量淋巴特异基因(包括RAG-2)的RT-PCR。使用基因特异引物扩增cDNA，如来进行仅由进行淋巴细胞分化的细胞瞬时表达的人类RAG-2基因，Vβ基因表达，等等。在GeneAmp9600循环变温加热器(Perkin Elmer，Norwalk，CT)中，使用比领域中众所周知的条件实施PCR扩增。

实施例1：共-培养系统中产生的人类细胞

的生存能力，免疫显型和功能

共培养系统中产生的存活细胞的数量和它们的免疫显型在表2中列出。当人类胎儿胸腺CD34+细胞和UCB CD34+细胞与在细胞泡沫上培养的鼠科动物胸腺基质共-培养时，可观察到最大量的人类T细胞增殖。从直接比较在细胞泡沫上的鼠科动物胸腺基质上的CD34+细胞共-培养物和培养成简单单层的鼠科动物基质上的CD34+细胞共-培养物得到的数据也在表2中列出。

在共-培养系统中产生的T细胞也显示出可被T-嗜性HIV-1_IIIB感染，这些细胞也可被MFG载体转导，转导效率为12-22％(n＝3)。

实施例2：未成熟祖细胞的维持

依据本发明，还发现胸腺基质细胞的细胞泡沫培养物能诱导CD34+祖细胞的T细胞分化，并仍然保存CD34-细胞的部分组成。灵长类动物CD34+祖细胞在已在细胞泡沫组织支架上建立的人类或猪胸腺上培养。14-21天后，CD3+CD4+CD8+三正细胞和CD3+CD4+和CD3+CD8+双正细胞可靠地恢复。此外，14-21天后，发现CD3-细胞部分组成含有CD34+祖细胞。这些CD34+细胞不仅是CD3-，而且许多还是CD2+。这说明在细胞泡沫组织支架中的胸腺培养物能支持T细胞分化，并同时保存长时间存活的CD34+祖细胞群。对此领域总的技术人员显而易见的是，这种令人惊异的发现说明在细胞泡沫中进行T子代分化并保持未成熟祖细胞是可能的。

实施例3：T细胞功能(增殖/无反应性)测试

使用标准测试法通过对特异和非特异抗原的增殖潜能评定T细胞功能。具体地，测试评定使用抗-CD3抗体(BectonDickinson)T细胞受体反应(TRR)介导增殖，以及使用伴刀豆球蛋白A(Con-A)基线非-特异增殖。简单地，将细胞用含10％FCS的RPME冲洗并以浓度106个细胞/毫升悬浮到其中。在96培养皿板的每个培养皿上加入100μl(10⁵个细胞)。在存在IL-2(20单位/毫升)和照射过的单核细胞(MC)(100毫升含10％FCS的RPMI中每个培养皿10⁵个细胞)的情况下，用Con-A(5μg/毫升)(非特异反应)或CD3的单克隆抗体刺激细胞。对于其中使用CD3的单克隆抗体的试验条件，提纯的山羊抗-鼠F(ab’)₂片段(Kirkegard和Perry实验室，Gaithersberg，MD)用作交联试剂。在加入CD3和CD8单克隆抗体前，将培养皿在37℃用1.25μg/毫升的山羊抗-鼠抗体预处理45分钟。对照组仅包括T细胞。T细胞加照射过的MC，T细胞加有丝分裂原刺激，没有IL-2或照射过MC。在37℃培养7天后，通过放射性测试法或商业购得的非放射性，ELISA基测试法(如，Promega)测定细胞增殖。细胞共-培养5-7天，诱导T细胞增殖(刺激物细胞也进行照射，因此是非增殖的)。刺激物细胞仅作为对照物。

另一种测试T细胞功能的方法使用流式细胞计数，基于染色细胞因子IL-2γIFN和TNFα的细胞内表达，使用对人类形式的这些因子特异的抗体(Becton Dickinson)。在抗原特异体外增殖测试中在T子代中产生这些细胞因子。这使得在大量鼠细胞群中可检测出少量人类细胞，选择性第突出人类子代而排除鼠细胞。并且，这些因子的mRNA的半量RT-PCR也可使用。

在一个具体实施例中，如，当置于含有完全介质和IL-2(10IU/毫升)和植物凝集素(PHA，2μg/毫升)的液体培养物中时，14天后从共-培养物中移出的细胞显示显著的增殖。再培养7天后，细胞数量增加45倍：＞90％是CD3+CD4+TCRαβ+；3％CD3+CD8+TCRαβ+，和3％CD3+CD8+CD4+TCRαβ+。没有检测到表达TCRγδ的细胞。

表2胸腺基质/人类胎儿CD34+细胞共-培养系统的应用

标准方案n＝3人类UCB CD34+人类胎儿胸腺基质人类胎儿胸腺基质6周大鼠科动物胸腺基质新生猪胸腺基质人类胎儿胸腺基质6周大鼠科动物胸腺基质新生猪胸腺基质n＝3细胞泡沫胸腺CD34+n＝3细胞泡沫胸腺CD34+n＝3细胞泡沫胸腺CD34+n＝3单层胸腺CD34+n＝3单层胸腺CD34+n＝3单层胸腺CD34+ D14 D28 D7 D7 D7 D7 D7 D7 CD4 2.8 3.8 81.54 85.8 67.8 88.7 81.1 69.2 CD3 1 5 1.1 12.75 87.1 80.7 13.1 90.1 79.2 CD4/CD3 4.2 1.4 9.83 75.2 64.65 10.6 68 1 66.3 CD8/CD3 2.1 2.8 0.13 74.5 28.8 0.46 71.9 28.3 CD4/CD8 1.8 1 0.37 79.5 25.4 0.89 89.1 22.9 CD2 4.1 12.5 ND 23.2 50.7 ND 20.4 48.1 CD14 33.4 16.1 59.6 0.17 6.8 63.1 0.81 4.6 CD33 48.2 20.2 90.61 0.33 ND 84.1 0.59 ND CD2/CD14 1.6 7.3 ND 0.85 ND ND 0.26 ND CD2/CD33 4.8 12.8 ND 3.76 ND ND 4.12 ND CD33/CD14 8.4 60.73 0 13 ND 56.13 0.11 ND    存活细胞计数 T₀＝5,000 195,000 210,000 98,000 1,800,000 220,000 15,000 79,000 51,000

实施例4：T细胞淋巴细胞生成测试

将ACl33+祖细胞加入到鼠科动物胸腺基质培养物中，细胞密度为1×10⁵个细胞/培养皿，或1×10³个细胞/培养皿，在37℃5％二氧化碳湿润环境中培养两周。每4天更换共-培养物中的介质，并且不补充外源细胞因子。在建立共-培养物后7天和14天收获从前体产生的细胞。

选择的AC133+细胞代表高提纯度的祖细胞群。免疫显型分析显示98％是CD34+；没有共同-表达表面CD3，CD4或CD8。在AC133+选择群中通过流式细胞计数法可检测到少量污染CD2+细胞：这仅包括0.57％±0.29％(平均±标准误差平均；n＝6)的从选择过程得到的细胞。

实施例5：确定优化基质尺寸和植入细胞数

从已进行测试的不同尺寸的基质，我们可以确定使用在这个系统中的优化尺寸基质是10毫米直径×1毫米厚度。同样地，植入细胞密度对优化T细胞产生很重要：使用植入细胞密度小于1×10⁴个细胞/培养皿不产生淋巴细胞。然而，当使用10×1毫米基质植入细胞密度为1×10⁴个细胞/培养皿或1×10⁵个细胞/培养皿时，共-培养14天后，我们能产生大量人类细胞，其中71.21％±9.87％(平均±标准误差平均；n＝7)是CD3+。

实施例6：产生T细胞数量的样品内和样品间可变性

为了确定在给定祖细胞源中T细胞产出的变化，使用单一源AC133+细胞以固定细胞密度(1×10⁴个细胞/培养皿)在鼠科动物胸腺基质的独立10×1毫米基质上建立多共-培养物。通过使用锥虫蓝排阻法进行细胞计数和免疫显型分析法分析产生的T淋巴细胞样品内变化。通过表面表达CD45区别人类细胞。共-培养7天后，检测到的成熟T细胞的量特别低；CD3+细胞占2.02％±0.87％(平均±标准误差平均)的CD45+门控群，CD3+CD4+T-细胞占1.0％±0.52％的门控群，CD3+CD8+占0.58％±0.1％的相同门控群。然而，14天后，T细胞数量显著增加：CD3+细胞群增加到62.16％±4.53％；CD3+CD4+和CD3+CD8+的百分比分别是42.7％±2.87％和22.39％±1.29％。这些数据在图2中示意表示。

通过比较从不同源CD34+祖细胞产生的T细胞量计算样品间的变化。在每中情况中，将固定量的细胞(1×10⁴个细胞/培养皿)引入到共-培养系统中。对共-培养7天后产生的细胞进行的免疫显型分析显示，对于CD45门控群，1.57％±0.97％的细胞表达CD3；2.27％±2.70％的细胞共同表达CD3和CD4；0.46％±0.23％的细胞都表达CD3和CD8。14天后，收获细胞的免疫显型显示，71.21％±9.87％的是CD3+；37.44％±8.44％的是CD3+CD4+，38.06％±19.13％的是CD3+CD8+，如图3中所示。

这些数据说明了系统内的高度再现性，显示其在植入群的比较分析中的可能。

实施例7：对TCR切除循环(TREC)的分析

TCR Vδ位于TCR Vα和TCR Jα区段之间。为了完成重排TCRα VD-J，将TCR Vδ区段切除：TCR切除循环(TREC)(Berenson RJ，等人，J Clin Invest，1988，81：951-5；Broxmeyer HE等人，Proc Antl Acad Sci USA，1989，86：3828-32)。当T细胞分裂时TREC不可重复(Blom B等人，免疫学期刊，1997，158：3571-7)。因此，在最近胸腺外移时TREC量是最大的，随后就稀释在外移子代中。通过PCR已显示出是一种从头监测T细胞产生的可靠工具的测试法(TjormfordGE等人，J Exp Med，1993，177：1531-9)，可检测得TCRδTREC。TREC正细胞的绝对数量随着所分析的细胞总量的变化而变化。我们确定，通过计算检测到的TREC的量与检测到的β-肌动蛋白拷贝的量的比率，可非常清楚地解释TREC阳性的显著性。我们将14天后在共-培养物中收获的T细胞中检测到的TREC的量与外周血液单核细胞，B细胞，从植入群获得的AC133+细胞，和人类胎儿胸腺细胞中的TREC的量进行比较。最大量的TREC：β-肌动蛋白比率在14天后共-培养物中产生的T细胞中发现(0.54)，接着是16-22周大人类胎儿的胸腺细胞(0.017)。胎儿和成年PBMC和AC133+骨髓单核细胞的TREC：β-肌动蛋白比率非常低。这些数据在下列表3中列出。在任何测试的B细胞样品中都没有检测到TREC(n＝6)。

                         表3

    来源 n TREC/β-肌动蛋白比率(平均)鼠科动物胸腺细胞 6    0骨髓AC133+祖细胞 3    0.000014成年外周血液MNC 3    0.00141胎儿外周血液MNC 1    0.0024胎儿胸腺细胞 2    0.017体外产生的T细胞 2    0.54

这些数据结论性地说明TCR重排发生在培养过程期间。TREC正性细胞的充裕促进与在新鲜胎儿胸腺中观察到的相比，并在T细胞分化的这个方面支持体外系统的生理性等同物。

此领域中技术人员在仅使用常规试验的情况下，会识别出，或能确定本文所描述发明的具体实施方案的许多等同物。这样的等同物包括在下列权利要求书的范围内。

本文所公开的所有文献全文参考收入。