用于治疗雌激素依赖性疾病的化合物以及制备和使用上述化合物的方法

摘要

本文公开了用于治疗雌激素依赖性疾病的新颖硫酸酯酶抑制剂/雌激素受体阻断剂化合物。该类化合物通常含有氨基磺酸酯基团、芳香基团以及雌激素受体阻断基团。本文还公开了合成这类化合物的方法以及在雌激素依赖性疾病的治疗和/或预防性治疗过程中使用它们的方法。

说明书

本发明涉及用于治疗雌激素依赖性疾病的化合物以及制备和使用上述化合物的方法。这类化合物通常可以通过抑制硫酸酯酶和/或阻断雌激素受体来发挥作用。使用这些化合物的方法提供了治疗和预防性治疗雌激素依赖性疾病的方法。

在美国，乳腺癌是最常见的恶性肿瘤。临床上将乳腺癌分为两类，一类是根据存在的雌激素受体(ER)的数量定义的：雌激素依赖型(ER+)以及雌激素不依赖型(ER-)。据估计，在全部的乳腺癌患者中大约有30-40％为雌激素依赖型，在绝经后的妇女中，这个百分比更高。雌激素依赖型乳腺癌最常用的治疗方法是采用抗雌激素的内分泌治疗，例如采用三苯氧胺，其可以阻断雌激素受体。还可以采用孕激素，尽管它们的作用机理尚不清楚。其它治疗雌激素依赖型乳腺癌的方法是通过使用芳化酶抑制剂抑制雌激素的生物合成来实现的。在所使用的化合物当中，可以例举的有非甾体芳化酶抑制剂氨基苯乙哌啶酮以及弱甾体芳化酶抑制剂睾内酯。另一个非甾体芳化酶抑制剂CGS16949A以及甾体芳化酶抑制剂4-羟基雄(甾)烯二酮可用于临床实验的各个阶段。

上述所有的治疗涉及通过阻断雌激素受体或抑制雌激素生成来终止雌激素的作用。在雌激素依赖型乳腺癌患者中，乳腺癌细胞中雌激素水平比血清中高5-10倍。在绝经后的妇女中，雌激素的主要生成途径是通过外周芳构化，使雄(甾)烯二酮(A)向雌酮(E1)转化，后者具有中等程度的生物活性。雌酮可以通过17β-羟基甾体脱氢酶转化为雌二醇(E2)，这是一种非常强的内源性雌激素。在绝经后的妇女中，E1和E2的平均血清水平相应地为100-150pM及30-40Pm。

即使研究已经显示乳腺肿瘤对雌激素没有活性摄取，但是乳腺癌细胞中确实积累了大量的雌激素。其中一种可能的解释是高水平的雌激素是从乳腺癌细胞中的前体底物就地生成的雌激素。的确，已经在乳腺癌细胞中发现了芳化酶并证明了雄(甾)烯二酮向雌酮的转化。另一条就地生成雌激素的途径是通过雌酮硫酸酯酶使雌酮硫酸酯(E1S)向雌酮进行转化(雌酮硫酸酯酶途径)如图1所示。在妇女中雌酮硫酸酯是一种最充足的循环雌激素(1-2nM)，其可以代表一个重要的活性雌激素库。

有报道指出，在绝经后的乳腺癌患者中雌酮硫酸酯的血清水平明显高于正常人。另外乳腺癌细胞中雌酮硫酸酯的浓度也明显高于血清水平。进一步的，在人类乳腺癌细胞中也合乎情理地发现了雌酮硫酸酯。血液和乳腺癌细胞中存在的高浓度的雌酮硫酸酯可以为乳房肿瘤提供高流量的游离雌激素。Vignon等人在Endocrinology 106：1079-1086(1980)中证明在人类MCF-7人类乳腺癌细胞系中，雌酮硫酸酯进入细胞并代谢，产生了未结合的雌酮和雌二醇，它们最终与母体雌激素受体结合并导致了分子量为46,000至160,000的蛋白质。Wiling等人在Eur.J. Cancer16：1339-1344(1980)中描述了用23个乳腺癌患者的体外乳房肿瘤组织匀浆证明了[³H]雌酮硫酸酯向[³H]雌酮和[³H]雌二醇的转化。Pasqualini等人在J Steroid Biochem34：155-163(1989)中报道了在不同的激素依赖乳腺癌细胞系(MCF-7，R-27，T-47D)中[³H]雌酮硫酸酯向雌二醇的高比例转化。但在非激素依赖乳腺癌细胞系(MDA-MB-231，MDA-MB-436)中，仅有很少的转化或没有发现转化。Santen等人在J.Clin.Endocrinol.&Metab59：29-33(1984)和Am.NY Acad.Sci.464：126-137(1986)中评价了在乳腺肿瘤中经过雌酮硫酸酯向雌酮转化(硫酸酯酶途径)的雌激素生成，并将其与雄(甾)烯二酮向雌酮转化(芳化酶途径)进行了比较。当在底物的生理水平下将人类肿瘤中的硫酸酯酶与芳化酶活性进行比较时，在人类肿瘤中通过硫酸酯酶生成的雌酮比通过芳化酶途径生成的雌酮高10倍(2.8pmol雌酮/g蛋白质vs0.27pmol雌酮/g蛋白质)。Santen建议硫酸酯酶途径是显著的并且可能是乳腺肿瘤组织中局部雌激素最初的生成方法。另外尽管存在这样一个事实，即芳化酶抑制剂可以抑制几乎全部(95-98％)的雄(甾)烯二酮向雌酮转化的外周芳构化，但是在接受芳化酶抑制剂治疗的患者中，其雌酮和雌二醇的血浆水平仍保持在对照水平的45-65％、且雌酮硫酸酯的血浆水平为对照的40-50％。这些残留量的雌酮硫酸酯是硫酸酯酶途径中雌激素的潜在来源。

初期的报道指出了雌酮硫酸酯酶途径在供应雌性甾体以支持乳腺癌生长方面的重要性。这条途径的抑制剂可以是雌激素依赖型乳腺癌潜在的治疗剂。在所有的雌酮硫酸酯酶抑制剂中，雌酮-3-O-氨基磺酸酯(EMATE)是曾经报道过的最强的硫酸酯酶抑制剂，将其归类为指向活性部位的不可逆抑制剂。在由EMATE导致的硫酸酯酶的钝化过程中可以释放出雌酮，因此使得抑制剂本身具有雌激素作用。所以该化合物不能用于雌激素依赖型疾病的治疗。

在下列文献中，Reed和他的同事报道了雌酮-3-O-甲基硫代膦酸酯、雌酮-3-O-烷基和芳基磺酸酯、雌酮-3-O-膦酸酯及硫代膦酸酯以及雌酮氨基磺酸酯的硫酸酯酶抑制活性：Duncan等人，“雌酮-3-甲基硫代膦酸酯对雌酮硫酸酯活性的抑制”，Cancer.Res.53：298-3030(1993)；Howarth等人，“作为硫酸酯替代物的膦酸酯及硫代膦酸酯：雌酮硫酸酯酶强抑制剂——雌酮-3-甲基硫代膦酸酯的合成“，Bioorg.Med.Chem.Lett.3：313-318(1993)；Howarth等人，“雌酮氨基磺酸酯：具有治疗潜力的雌酮硫酸酯酶强抑制剂”J.Med.Chem.37：219-221(1994)；以及Purohit等人，“雌酮-3-O-氨基磺酸酯对雌酮磺酸酯酶和脱氢雄甾酮磺酸酯酶的体内抑制”，Int.J. Cancer，63；106-111(1995)。

在下列文献中，Li和他的同事报道了含有雌酮母体的磺酸酯及其同类物、亚甲基磺酸酯和磷酸酯的合成以及对硫酸酯酶的抑制活性。Li等人，“雌酮硫酸酯抑制剂的合成及生化研究”，Steroids，58：106-111(1993)；等人，“雌酮硫酸酯合成同类物对人类胎盘Steryl硫酸酯酶的抑制，J.Steroids.Biochem.Molec.Biol.，52(3)：281-286(1995)；以及Li等人，“作为雌酮硫酸酯酶抑制剂的雌酮硫酸酯同类物”，Steroids，60：299-306(1995)。Selcer等人报道了雌酮-3-氨基衍生物，“雌酮-3-氨基衍生物对胎盘雌酮硫酸酯酶活性的及MCF-7乳腺癌细胞增殖的抑制”，J.Steroids.Biochem.Molec.Biol.，59：83-91(1996)。

美国专利No.5,567,831中描述了非甾体硫酸酯酶抑制剂化合物在雌激素依赖型疾病治疗中的用途。

美国专利No.5,571,933中描述了雌-1，3，5(10)三烯-17-酮，3-氨基化合物的衍生物以及在雌激素依赖型疾病治疗中使用这些化合物的方法。

美国专利No.5,556,847和No.5,763,492中相应地描述了甾体和非甾体硫酸酯酶抑制剂以及使用这些抑制剂提高记忆的方法。其中未公开使用这些化合物治疗雌激素依赖型疾病。

美国专利No.5,616,574中公开了甾体硫酸酯酶抑制剂以及使用它们的方法。与本发明中的化合物相反，这些化合物是强雌激素，并可以代谢生成雌酮。

美国专利No.5,047,431中公开了1，1，2-三苯基丁-1-烯，也就是已知的三苯氧胺。相对于双键C-原子2上的未取代苯基基团的位置，该431化合物具有一个与双键C-原子1上苯环的3’位相连的羟基基团。

美国专利No.5,273,993中公开了具有至少一个氨基磺酰氧基基团的化合物以及这类化合物治疗慢性关节炎和骨质疏松方面的用途。

因此仍有需要开发一些代谢稳定、更具选择性并避免有雌激素活性的强硫酸酯酶抑制剂。

本发明通过提供可用作甾体硫酸酯抑制剂的化合物满足了上述要求。本发明化合物与已报道的化合物相比还具有进一步的优势，即它们还具有阻断雌激素的受体的作用。这些化合物具有下列通式：其中芳香环与R基团一起代表阻断雌激素受体的基团；其中R₁和R₂独立地选自氢、具有1-6个碳原子的低级烷基；并且其中的氨基磺酸酯基团与芳香环上的2’C、3’C或4’C相连。

另外，本发明涉及在雌激素依赖型疾病的治疗中使用本发明化合物的方法。这些方法通常包含将一或多种化合物混入合适的药物载体中，并给予患者治疗或预防有效剂量的化合物。

本发明的目标是提供能够实质上抑制体内产生的甾体硫酸酯酶的化合物。

本发明的另一个目标是提供能够阻断雌激素受体的化合物。

本发明进一步的目标是提供具有硫酸酯酶抑制作用和雌激素受体阻断作用的化合物。

本发明进一步的目标是提供具有抵抗雌激素依赖型疾病活性的化合物。

本发明进一步的目标是为雌激素依赖型疾病患者提供治疗和预防方法。

本发明的另一个的目标是为雌激素依赖型疾病的治疗提供化合物，并且所述的化合物不会代谢为具有雌激素性质的化合物。

通过下面的描述和权利要求，本领域技术人员会更充分地理解本发明的这些和其它目标。

图1一般性地说明了雌酮硫酸酯途径。

图2说明了(Z)-4-羟基三苯氧胺氨基磺酸酯钝化甾体硫酸酯酶的可能的机理。

图3说明了按照实施例1所述方法制备化合物的路线。

图4是一个双倒数图，其说明了按照实施2所述方法测定得到的三苯氧胺氨基磺酸酯在大鼠肝脏微粒体中对雌酮硫酸酯酶活性的抑制。

图5说明的是按照实施3所述方法，对三苯氧胺氨基磺酸酯及4-羟基三苯氧胺在人类乳腺癌细胞中对于雌酮硫酸酯酶活性的抑制所进行的比较。

这里所用的术语“患者”是指包括但不限于人类在内的动物界。

本发明涉及具式(I)的化合物其中芳香环与R基团一起代表阻断雌激素受体的基团；其中R₁和R₂独立地选自氢、具有1-6个碳原子的低级烷基；并且其中的氨基磺酸酯基团与芳香环上的2’C、3’C或4’C相连。

上述化合物优选的实施方案由式(2)代表：其中R₁和R₂独立地选自氢、具有1-6个碳原子的低级烷基；其中R₃和R₄独立地选自氢、具有1-6个碳原子的低级烷基；或R₃和R₄一起表示具有4-6个碳原子的环状结构；其中的X选自氢、具有1-4个碳原子的低级烷基，OH，NH₂以及选自氟、氯、溴和碘的卤素；并且其中的氨基磺酸酯基团与2’、3’或4’位相连。

式(2)的变形也是本发明化合物的优选实施方案，其由式(3)表示：

其中R₁-R₄同上所述；X同上所述；Z为(CH₂)_n；n等于1-4。

在式2和3的优选实施方案中，R₃和R₄等于CH₃，R₁和R₂等于H，X等于H或Cl，并且氨基磺酸酯基团处于4’位，在式3中，n优选为2。

正如本领域技术人员所意识到的，由式2和3所表示的本发明化合物是(Z)-4-羟基三苯氧胺(“三苯氧胺”)的衍生物。因此如式1所示，在这些式子中由芳香环与R基团一起表示的基团是三苯氧胺或三苯氧胺衍生物。这里所用的术语“三苯氧胺衍生物”是指具有三苯氧胺分子的基本三苯基乙烯结构、但又有所变化(如上述R₁-R₄，X和Z所定义的)的化合物；三苯氧胺分子的其它取代和变化也包括在本发明的范围之内。已知三苯氧胺及其衍生物可以阻断雌激素受体。带有基团R取代的芳香环所表示的基团(如式1所示)可为任意可以阻断雌激素受体的化合物(象三苯氧胺)。因此至少具有一个带有氨基磺酸酯基团的芳香环的任意雌激素受体阻断剂均在本发明的范围之内。实施例包括(但不限于)其它的三苯基乙烯化合物。本领域技术人员可以利用子宫重量获得分析(例如Sclcer和Li，J.Steroid.Biochem.Molec.Biol.，Vol.52，No.3，pp.281-286(1995)所描述的)来确定一个化合物是否可以阻断雌激素受体。

图1说明了通过雌酮硫酸酯酶途径的雌激素的生成。如反应路线所示，借助雌酮硫酸酯酶可使雌酮硫酸酯(E1S)转化为雌酮(E1)，雌酮再借助17β-羟基甾体脱氢酶转化为雌二醇(E2)。形成的雌二醇可以与雌激素受体结合，并在雌激素依赖型癌中刺激肿瘤细胞的生长。

已有报道将与甾体环系统相连的氨基磺酸酯化合物用于雌激素依赖型疾病的治疗。该甾体环系统(或称母体)由4个环组成，其中3个是六元环(A，B和C)，一个是五元环(D)。正如前面所注意到的，这些化合物本身可以分裂形成雌激素，因此也对肿瘤细胞的生长有所贡献。这类化合物通过抑制雌酮硫酸酯酶发挥作用。现已表明，甾体的B，C和D环对于硫酸酯酶的识别来说不是必需的；需要的仅仅是甾体的“A”环和氨基磺酸酯基团。本领域技术人员对“A”环可理解为作为与氨基磺酸酯基团相连的甾体母体中的芳香环。本发明化合物含有与氨基磺酸酯基团相连的芳香环。氨基磺酸酯基团可以识别甾体硫酸酯酶或雌酮硫酸酯酶并与之结合，从而防止了雌酮硫酸酯向雌酮的转化。当硫酸酯基团与酶结合后，认为本发明化合物的芳香环部分与基团R一起释放出来。芳香环/基团R(根据定义其本身是一个可以阻断雌激素受体的化合物)便可以自由地以此形式发挥作用。正如前面所注意到的，雌激素受体的阻断防止了雌激素与受体的结合，从而防止了雌激素刺激肿瘤细胞的生长。

尽管发明者不希望与任何特定的机理联系起来，但认为本发明化合物在治疗雌激素依赖型疾病方面具有双重的作用：硫酸酯基团与甾体硫酸酯酶结合并对其活性产生抑制作用；雌激素受体阻断剂基团与雌激素受体结合，防止因雌激素分子与雌激素受体接触而导致的肿瘤生长。因此，由于化合物从抑制雌激素生成及其对肿瘤细胞刺激两条途径发挥作用，故本发明化合物的作用是加和性的。

图2中描述了本发明优选实施方案可能的机理。其中芳香环/R基团为三苯氧胺。化合物的氨基磺酸酯部分与甾体硫酸酯酶结合并产生抑制作用。当与硫酸酯酶结合后，认为其会释放出三苯氧胺基团并自由地阻断雌激素受体。

本发明进一步提供了合成上述化合物的方法。该合成通常包括向非甾体抗雌激素中加入氨基磺酸酯基团。优选化合物的合成总结于图3。图3描述了以(Z)-4-羟基三苯氧胺作为起始原料，向其中加入2，6-二叔丁基-4-甲基吡啶和氨磺酰氯，生成(Z)-4-羟基三苯氧胺氨基磺酸酯化合物。可以意识到的是图3中所描述的化合物的合成方法可以代表本发明所有化合物的合成。图3中制备的特定三苯氧胺氨基磺酸酯化合物通常可用上述式2来表示，其中R₁和R₂均为氢，R₃和R₄均为CH₃，X也为氢。本发明中氨基磺酸酯化合物的合成可按此通法进行，在实施例部分会有更详细的描述。

本发明进一步提供了使用上述化合物对患有雌激素依赖型疾病的患者进行治疗性和/或预防性治疗。这类疾病包括但不限于乳腺癌、阴道癌、子宫内膜癌、卵巢癌和子宫内膜异位。

本发明方法包括以下步骤：a)将一或多种本发明化合物混入合适的药物载体中；和b)给予患者已混入合适药物载体中的治疗有效剂量或预防有效剂量的本发明化合物。

术语“合适的药物载体”是指任何制药领域内已知的用于化合物给药的载体。根据本发明，只要不存在配伍问题，可以使用任何合适的药物载体。优选的药物载体是生理盐水(0.9％氯化钠)，95％葡萄糖水溶液。

给予患者有效剂量的药物可以通过非肠道注射来完成，例如静脉内、鞘内、肌内或动脉内等。还可经口服和皮透途径给予本发明化合物，或通过本领域技术人员已知的任意方法给予本发明化合物。其中口服是优选的。

这里所用的术语“治疗有效剂量”是指治疗性处理患者所需的一或多种本发明化合物的量。这种治疗对于患有雌激素依赖型疾病的患者而言是合适的。相似地，术语“预防有效剂量”是指预防性处理患者所需的一或多种本发明化合物的量。这种处理对于患者而言是合适的，例如通过外科手术切除肿瘤；给予患者本发明化合物可以抑制任何不能通过外科手术切除的肿瘤细胞的生长，或者可以抑制出现的任何新生肿瘤细胞的生长。

本领域技术人员知道，给予化合物的剂量、给药途径以及治疗持续时间将根据治疗个体的情况进行决定，需要考虑的因素有：所治疗的特定雌激素依赖疾病的情况，患者体重，受治患者所用的其它治疗以及患者的状况、临床反应和耐受性等。在对这些和其它相关因素作出评价的基础上，本领域技术人员可以决定给药剂量、给药方式和治疗持续时间。典型的患者是绝经后妇女或卵巢已被切除的绝经前妇女。尽管患者和患者之间的给药剂量和给药方式有所不同，典型的给药剂量范围在1mg-2mg/kg体重，并每日进行给药。

本发明提供了许多优于本领域内已知治疗的方面。由于本发明化合物既具有甾体硫酸酯酶抑制活性又具有雌激素受体阻断活性，因此这些化合物可以通过两条途径来防止癌中雌激素依赖型肿瘤的生长。使用本发明化合物的结果是获得了其它药物不曾见到的加和作用。另外，已知其它许多可以阻断雌激素受体的药物(例如三苯氧胺)对于患者来说是非毒性的，因此最大程度地降低了与其它化疗方案有关的副作用。最后，本发明化合物是非甾体的；因此这些化合物的破坏不会产生更多的雌激素。本发明的这些和其它优点对于本领域技术人员来说是显而易见的。

                     实施例

下列实施例将说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

对于所有的实施例而言，化学品及硅胶均采购自Aldrich化学公司(Milwaukee，WI)。用TCL和NMR检查了化学品的纯度。生化制品以及雌酮和雌酮硫酸酯得自Sigma化学品公司(St Louis，MO)。[6，7-³H]雌酮硫酸酯采购自杜邦公司。在Thomas Hoover毛细管熔点测定仪上测定熔点，未进行校正。用Bruker WH-300(300MHz)分光光度计获得质子NMR光谱。元素分析由Atlantic Microlab Inc.(Norcross，GA)公司进行。放射活性样品的分析用Packard Tri-Carb4530液体闪烁计数器进行。液体闪烁鸡尾酒来自Ecolume(ICN，Costa Mesa，CA)。

                        实施例1

             (Z)-4-羟基三苯氧胺氨基磺酸酯的合成

搅拌下，向(Z)-4-羟基三苯氧胺(150mg，0.39mmol)和2，6-二叔丁基-4-甲基吡啶(246mg，1.2mmol)的二氯甲烷溶液中分次加入氨磺酰氯(347mg，3mmol)。搅拌3小时后，用水洗涤溶液至中性，硫酸钠干燥，减压蒸发得到浅黄色残留物。用硅胶层析纯化，以石油醚∶乙酸乙酯(4∶1)进行洗脱，得到泡沫状纯化合物(168mg，产率93％)。

        ¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ0.85(t，3H，J＝7.2Hz，CH₃)，2.18(s，6H，N(CH₃)₂)，2.40(q，2H，J＝7.2Hz，CH₂CH₃)，2.54(t，2H，J＝5.7Hz，CH₂N)，3.90(t，2H，J.＝5.7Hz，CH₂O)，6.61(d，2H，J＝8.1Hz，ArH)，6.75(d，2H，J＝8.1Hz ArH)，7.12-7.30(m，9H，ArH)，8.04(brs，2H，NII₂).元素分析：C₂₆H₃₀N₂O₄S×0.5CH₃COOC₂H₅；理论值：C，65，86；H，6.75；N，5.49；S，6.28

                                         实测值：C，65，70；H，6.51；N，5.81；S，6.28

                  实施例2

       大鼠肝脏微粒体硫酸酯酶分析程序

以大鼠肝脏微粒体作为硫酸酯酶的来源，在体外对得自实施例1的(Z)-4-羟基三苯氧胺氨基磺酸酯进行实验。

将得自幼年雌性Sprague-Dawley大鼠的肝脏在一个冰冷的0.25MTris-蔗糖缓冲液(1∶2，w∶v)中用剪子剪碎，并用Tissue Tearor进行匀浆，共三次，每次30秒。在4℃下离心15分钟(1500×g)，使得核心部分成为小丸。倾出上清液，在4℃下离心30分钟(10,000×g)，以使线粒体部分成为小丸。除去生成的上清液，离心(100,000×g)，得到微粒体部分。将微粒体小丸再悬浮于50nM的Tris-HCL缓冲液(1∶5，w∶v)中，用BCA分析方法测定来自微粒体悬浮液中的蛋白质。

将³H-雌酮硫酸酯(53Ci/mmol)用50mM Tris-HCL缓冲液进行稀释，然后向所有的分析管中加入50μl该溶液(140,000dpm)。将放射惰性的雌酮硫酸酯溶于乙醇中，用50mM Tris-HCL缓冲液进行稀释。为了获得雌酮硫酸酯的最终浓度，向分析管中加入l00μl所需浓度的溶液。将按照实施例1所制备的化合物溶于乙醇中，用50mM Tris-HCL缓冲液进行稀释。为了获得最终10μM的溶液，向设计好的管子中各加入50μl每个化合物的溶液。不含实施例1化合物的管子中含有50μl等浓度的乙醇及50mM Tris-HCL缓冲液。用Tris-HCL缓冲液稀释大鼠肝脏微粒体至25μg/300μl缓冲液。以15秒钟的间隔向含有化合物的管子中加入微粒体(300μl)开始进行分析。不含抑制剂的对照样品中加入微粒体，而没有膜的对照样品中不加。在37℃培养20分钟后，以15秒钟的间隔向所有管子中加入500μl0.1NaOH溶液，以终止分析。向每个管子中加入3ml甲苯来提取放射标记的雌酮。使停止反应的样品成涡(vortex)1分钟，并离心5分钟(1500×g)，加入4ml闪烁鸡尾酒(cocktail)，从每个样品中移出两份500μl等量有机相。将所有的等量试样置于Packard Tri-Carb闪烁计数器中来测定产品形成，每个样品做两个平行样。将含有抑制剂样品的产品形成情况与对照样品中的情况进行比较，通过MichaelisMenten和Lineweaver-Burk计算得到K_m和K_i数据。K_m是酶-底物复合物的解离常数，K_i是酶-抑制剂复合物的解离常数。结果列于图4。

图4是一个双倒数图(Lineweaver-Burk)，其说明了三苯氧胺氨基磺酸酯在大鼠肝脏微粒体中对雌酮硫酸酯酶活性的抑制。在图4中显示了在缺乏抑制剂以及有固定浓度抑制剂存在下测定得到的酶反应的速率，并将两套数据在双倒数图上进行了比较。结果显示最大酶反应速率没有变化，但K_m有所增加。这一结果证明三苯氧胺氨基磺酸酯是一个具有竞争力的抑制剂。根据此图可以得到三苯氧胺氨基磺酸酯的K_i大约为17μM。

                         实施例3

             完整的乳腺癌细胞雌酮硫酸酯酶分析

采用完整的单层MDA-MD-231乳腺癌细胞对按照实施例1制备得到的化合物阻断雌酮硫酸酯水解的能力进行了测定。

将MDA-MD-231细胞置于6池平皿的生长介质中，浓度大约为1×10⁶个细胞/池，并在37℃下培养过夜，使之与平皿粘合。生长介质中含有0.2％(v/v)碳酸氢钠，5％热灭活的胎儿牛血清，10mg/mL庆大霉素以及1％(v/v)抗菌素/抗真菌剂。培养后除去生长介质，用含有³H-雌酮硫酸酯(100,000dpm/ml)的生长介质(其中含有或不含实施例1化合物(10μM))替代之。将细胞培养18h，使平皿冷却5分钟。从每个池中取出500μl的等量介质至16×100mm的管子中。向每个管子中加入3ml甲苯提取未结合的甾体。使管子成涡(vortex)1分钟，并离心5分钟(2500×g)，以分离出水相和有机相。将1ml有机相(含有放射标记的未结合的甾体)转移至闪烁小瓶中，加入5ml闪烁鸡尾酒。在³H效力为50％的情况下用Packard Tri-carb闪烁计数器对总放射活性进行计数。所有的提取物做两份平行样，所有的处理做三份平行样。将含有抑制剂样品中的产品形成与同时进行的对照样品中的情况进行比较，并以对照样品的百分抑制来表示结果。结果列于图5，其表明在10μM的浓度下，三苯氧胺氨基磺酸酯可以抑制约50％乳腺癌细胞MDA-MD-231中的雌酮硫酸酯酶。图5的数据是以对照的百分比来表示的，其为在缺乏抑制剂的情况下雌酮硫酸酯酶的活性。

尽管为了说明本发明例举了以上一些实施例，但对本领域技术人员来说显而易见的是，可以进行如附录权利要求中所定义的不背离本发明的各种细节变化。