一种利用一步或两步随机化反应制备皂甙库的方法

摘要

本发明涉及一种利用一步或两步随机化反应并经还原反应制备皂甙库的方法。从易得的甙元和单糖出发经过一步随机糖苷化反应或随机酰化与随机糖苷化两步随机化反应联用,再经去除保护基制备出具有所有可能性的单糖、二糖、三糖、四糖和五糖的皂甙混合物库。

说明书

本发明涉及一种皂甙库的制备方法，具体的说是利用一步随机糖苷化反应或者先经随机酰化反应再经随机糖苷化反应，两步随机化反应联用制备各种皂甙库。

近几十年来，人们从自然界中分离得到了大量的结构新颖的皂甙化合物。许多研究结果表明皂甙具有多种生理活性和良好的药理作用，如抗癌、抗菌、消炎、降血压以及调节免疫功能等。皂甙是一类复杂的糖苷。从分子结构上来看，皂甙是由糖链与三萜或甾体通过碳氧共价键相连而成的。皂甙中的糖链一般较短，多含2-5个糖基，而且其糖基组成比较简单，主要的糖基有葡萄糖、甘露糖、木糖、岩藻糖、鼠李糖和阿拉伯糖等。由于糖基上多个羟基的存在使皂甙的结构变化多样，在自然界中它们往往以复杂的同系物存在。许多传统的中草药如人参、远志、麦冬等的有效成分中都含有皂甙。这些有效成分是由多种结构相似的皂甙同系物组成的，它们可以同时起药理作用。但是到目前为止，对于皂甙的合成还局限于传统的上保护基一去保护基的分步方法上[Highly efficient glycosylation of sapogenins．Shaojiang Deng，BiaoYu，lianming Xie，Yongzheng Hui．J．Org．Chem．，1999,64,7265-7266]，这大大限制了皂甙化合物的合成和筛选过程。近年来Hindsgaul等人发展了用随机糖苷化反应制备三糖库的方法[A strategy of“random glycosylation”for the production of oliogosaccharide libraries．Osamu Kanie，Frank Barresi，Yili Ding，Jill Labbe，Albin otter，L．Scott Fors-berg，Beat ernst，Ole Hindsgaul．Angew．Chem．Iht．Ed．Engl．，1995,34,2720-2722]，但是迄今为止，还没有制备皂甙库的报道。因此，发展组合化学的方法从易得的甙元和单糖出发简便地制备含有所有可能同系物的皂甙库是很有意义的。

本发明的目的是提供一种利用一步或两步随机化反应制备皂甙库的方法。通过化学合成制备含有所有可能同系物的皂甙库，并为如药物筛选等提供新的具有生理活性的化合物库。

本发明从易得的甙元和单糖出发经过一步随机糖苷化反应或随机酰化与随机糖苷化两步随机化反应联用，再经去除保护基反应制备出具有所有可能性的单糖、二糖、三糖、四糖和五糖的皂甙混合物库，并使用气相色谱一质谱联用的分析方法对其构成进行表征。

本发明方法制备的皂甙库是一种含有一个糖基到五个糖基的单糖皂甙到五糖皂甙的同系混合物皂甙库，该皂甙库含有如下结构式所述皂甙：上述结构式中，n=0、l、2、3或4，m=3或4，且，n≤m，q=3或4。糖基部分或L型单糖糖基，如葡萄糖基、甘露糖基、木糖基、岩藻糖基、鼠李糖基或阿拉伯糖基等，是相同或不同的基团。

甙元基Y=甾体甙元基或包括齐墩果酸在内的三萜基，所述的甾体甙元基如薯蓣甙元基、剑麻甙元基、地高辛甙元基、提果甙元基或薯麻甙元基等。

本发明的方法中，采用单糖基皂甙为原料，在皂甙糖基部分的任意一位或多位羟基处随机连接另外的糖基得到同系列的糖苷化产物。或者由皂甙和酰基给体首先发生随机酰化，采用经随机酰化后的产物作为糖苷化的原料，再进一步发生上述糖苷化反应。糖苷化反应产物经还原脱保护基后得到皂甙库。这个皂甙库共含有1-16种皂甙，每种皂甙的相对摩尔含量在0．5-50％之间。

可用两种反应途径完成，反应式简述如下：其中是单糖基，是单糖基皂甙，

R=甲酰基(Formyl)、乙酰基(Ac)、丁二酰单甲酯基(COCH₂CH₂COOCH₃)、苯甲酰基(Bz)或三甲基乙酰基(Piv)等。

R¹是含有1-7个碳原子的酰基或苄基，p=0、1、2、3或4，q=3或4，且p或q≤m，n+p≤m，m，n，Y如上所述。

本发明A方法为两步随机化反应联用再经还原脱除保护基制备皂甙库：

首先进行随机酰化反应。所用的起始原料为由一个糖基与甙元脱水后通过碳氧共价键相连而成的分子式为的单糖皂甙，单糖皂甙和酰基给体在至少含有一个氮原子的有机碱催化下，在或不在极性溶剂中，发生酰化反应，使上述单糖皂甙的糖基上的羟基发生部分酰化反应。所用酰基给体是含有1-8个碳原子的酸酐或酰卤及其衍生物，如乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐、丁烯二酸酐、邻苯二甲酸酐、乙酰氯、乙酰溴、正丁酰氯、三甲基乙酰氯、苯甲酰卤、对硝基苯甲酰氯。所用有机碱可以是三乙胺(Et₃N)、吡啶(Py)、二异丙基乙基胺(DIEA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)或联二吡啶等。所用单糖皂甙、酰基给体和有机碱的摩尔比是1∶0．5-5∶1-1000，推荐摩尔比为1∶1-2∶1-1000。酰化反应时间为0．5-25小时，反应温度为-20℃至室温。

然后进行随机糖苷化反应：用上述随机酰化产物作为起始原料，酰化产物和糖基给体在极性溶剂中、促进剂及吸水剂作用下发生随机糖苷化反应，使随机酰化产物中的未被酰化的羟基与糖基给体发生糖苷化。其中酰化产物、糖基给体和促进剂的摩尔比为1∶0．5-8∶0-5，推荐摩尔比是1∶1-4∶0-5，所述促进剂是C₁-C₆的卤代酰胺、C₁-C₆的卤代烃基磺酸、C₁-C₆的卤代烃基磺酸酯、C₁-C₆的卤代烃基磺酸盐、C₁-C₆的三甲基硅基卤代磺酸酯、三氟化硼-乙醚或它们的混合物，如：N-碘代丁二酰亚胺(NIS)、N-碘代丁二酰亚胺(NIS)-三氟甲磺酸银(AgOTf)混合物、N-碘代丁二酰亚胺(NIS)-三氟甲磺酸(TfOH)混合物、三甲基硅基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)、三氟甲磺酸银(AgOTf)、三氟化硼-乙醚(BF₃·Et₂O)。所用吸水剂是分子筛、硅胶、硅藻土或离子交换树脂，所用糖基给体是由的异头碳位置经过活化且其它羟基经全保护后的糖基，其分子式为：其中x是卤基、-SEt、-Sph或R¹是含有1-7个碳原子的酰基或苄基，如前所述。

例如：全苄基化的鼠李糖硫苷，分子式是：全乙酰化的鼠李糖硫苷，分子式是：全苯甲酰化的鼠李糖三氯亚胺酯，分子式是：全苯甲酰化的鼠李的糖溴苷，分子式是：全苯甲酰化的葡萄糖三氯亚胺酯，分子式是：全苄基化的阿拉伯糖溴或碘苷，分子式是：

糖苷化的反应时间为0．5-25小时，反应温度为-20℃至室温。

随机酰化或糖苷化反应所用极性溶剂是四氢呋喃(THF)、N，N二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶、二氯甲烷或二氧六环等，推荐使用二氯甲烷和二氧六环。

糖苷化反应还可加入弱碱淬灭反应，通常可加入NH₃、(CH₃)₃N、(C₂H₅)₃N等淬灭反应。

然后取随机糖苷化反应产物，在极性溶剂和液氨中用一价金属还原剂还原，通过脱除糖基受体上随机酰化时所连的酰基以及随机糖苷化所连的糖基给体上的保护基，将上述基团还原为羟基，获得最终产物皂甙库。该还原反应中随机糖苷化产物与还原剂的摩尔比为1∶1-500，每克随机糖苷化产物用1-1000ml的液氨，采用更多量的液氨对反应没有影响。还原反应时间为0．1-2h，所述的一价金属是锂、钠、钾、铷或铯等。

本发明的方法B为一步随机化反应后经还原脱除保护基制备皂甙库：所用起始原料是结构式为的单糖皂甙，单糖皂甙和糖基给体在极性溶剂中、促进剂及吸水剂作用下发生随机糖苷化反应，生成随后还原，上述两步反应条件与方法A中的随机糖苷化反应和去保护基的还原反应的相同。

由A或B方法所得皂甙混合物再经衍生化制成部分甲基化的阿尔迪醇乙酸酯后，进行气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析，从气相色谱图上可以算出每一组分的相对摩尔含量。将与每组色谱峰相对应的色谱图和标准质谱图相比较，便可知每一组分的化学组成，从而可推知相应皂甙的具体结构。

本发明首次提供了一种化学合成具有生理活性的皂甙库的方法。随机化反应拓展了皂甙化合物的合成和筛选过程，而且原料易得，方法简便，条件易于控制，大大提高了合成此类化合物的效率，为发现和筛选新的皂甙化合物提供了一种高效、方便的方法，与从天然植物中提取方法相比，具有工业化前景。通过一步或两步随机化反应，不仅可以获得各种类型的皂甙库，而且也可以为如药物筛选等制备新的具有生理活性的化合物库。

通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容：

实施例1

随机酰化反应的一般步骤

取延龄草甙230mg(0．4mmol)于1-5mlPy或DMAP、Et₃N以及10ml二氯甲烷溶液中，冰浴冷却下缓慢滴加乙酸酐、乙酰氯或丁二酸酐0．2-2．0mmol。冰浴维持0．5h后撤去，于-20℃至室温继续搅拌反应0．5-24h。后处理如下：减压下将溶剂大部分除去。残余物用70ml CH₂Cl₂萃取，用饱和NaCl水洗三次并干燥。将溶剂减压蒸除后得白色固体。

实施例2

随机糖苷化的一般步骤

取随机酰化产物(或延龄草甙)0．16mmol，全苄基保护的鼠李糖硫苷或全苯甲酰化保护的鼠李糖三氯亚胺酯0．32mmol-0．64mmol溶于二氧六环3-5ml中，并转移至经火烘干的带支管的试管中(含1-5埃分子筛160mg)。氩气保护下于-20℃至室温搅拌30min后，加入NIS或BF₃·Et₂O的量为0．35mmol-0．70mmol，并迅速加入AgOTf甲苯溶液(0．19M)0．33-0．67ml。于-20℃至室温反应0．5-24h后加入Et3N 1ml淬灭反应。将反应液过滤，用CH₂Cl₂洗涤滤饼。滤液与洗涤液合并，CH₂Cl₂ 100ml稀释，依次用饱和Na₂S₂O₃，饱和NaCl水洗涤，MgSO₄干燥。减压蒸除溶剂，残余物用粗硅胶拌样上柱，用硅胶H柱层析纯化。用石油醚(10∶1)梯度洗脱，收集CH₂Cl₂与CH₂Cl₂-CH₃OH(20∶1)洗脱的洗脱液，将其减压浓缩后得棕色固体或油状物。

实施例3

Li／NH₃还原的一般步骤

取随机糖苷化反应产物180mg溶于3ml THF中备用。让NH₃冷凝在三口瓶中。干燥后，再将其蒸馏至50ml反应瓶中0．2-180ml左右，加入Li或钾丝300mg并搅拌。缓慢滴加随机糖苷化产物的THF溶液进行还原反应。滴完后-70℃左右继续反应0．1-2h，让其自然升至室温，至NH₃基本挥发完后，冰浴下加入CH₃OH淬灭反应，并调体系的PH值为酸性。减压蒸除甲醇余一油状物，用约70ml正丁醇稀释，用蒸馏水充分洗涤。待有机相与水相充分分层后，将正丁醇分出，在油泵减压下于水浴室温-35℃将其浓缩至小体积。加入大量无水乙醚后产生白色沉淀，过滤得Li／NH₃还原产物。

实施例4

皂甙库甲基化分析的一般步骤

甲基化：5mg皂甙库样品溶于2ml DMF中，再加入NaH 30mg。室温搅拌1h后，加入MeI 2ml，继续室温搅拌反应过夜。后处理如下：鼓入Ar气约20min将过量的MeI除去。而后用CH₃Cl 20ml稀释反应液，依次用饱和Na₂S₂O₃，蒸馏水洗涤，干燥。将其浓缩，取少量样品真空干燥2h进行IR分析。如此甲基化直至无羟基峰。其余样品抽干后备用。

水解：将甲基化后的样品用甲酸水溶液溶解并转移至封管中100℃水解6h。6h后减压，浓缩至干，再用CF₃COOH 3 ml溶解并水解。水解后浓缩至干，用甲醇共沸蒸馏除去CF₃COOH。

后处理：水解后样品用蒸馏水溶解，加氨水调为碱性，再加NaBH₄ 25mg，室温反应2-5h。加几滴HOAc至无气泡产生。减压浓缩。再加甲醇5ml及HOAc减压浓缩带走硼酸衍生物。反复6次。将还原产物用Ac₂O 2ml溶解，100℃封管反应1h，减压除过量的Ac₂O直至出现白色固体，用CHCl₃萃取。洗涤干燥有机相，浓缩除去溶剂后用于GC-MS分析。

实施例5

通过两步随机化反应构建的甾体皂甙库T1中共含有16种化合物，Rha∶Glc=1．8-2．2∶1，每种皂甙的含量为1．5-14．3％之间，总产率为32-55％。T1中单糖皂甙的含量为4．5-7．0％，二糖皂甙的含量为13．0-29．0％，三糖皂甙的含量为41．5-42．5％，四糖皂甙的含量为15．5-33．5％，五糖皂甙的含量为6．5-7．5％。

实施例6

同实施例2和3(一步随机反应)及实施例1、2和3(二步随机反应)的反应条件，采用不同的单糖基甙元和糖基给体，获得结果如表1和表2所示。

表1反应条件及皂甙库的分布表2依照表1条件制备的皂甙库中各皂甙的相对摩尔百分含量

实施例7

抗肿瘤生物活性体外筛选实验结果评定：无效：l0^-5mol／l＜85％

弱效：10^-5mol／l≥85％或10-6mol／l≥50％

强效：10^-6mol／l≥85％或10-7mol／l＞50％

表3筛选方法：磺酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法细胞株：A-549人肺腺癌           作用时间：72h

对肿瘤细胞生长的抑制率％

库号A-549平价10^-410^-510^-610^-710^-8L110027．85．92．46．9无效L410099．54．23．45．7弱效L579．481．384．936．529．6弱效

表4筛选方法：四氮唑盐(microculture tetrozolium，MTT)还原法细胞株：P388小鼠白血病          作用时间：48h

对肿瘤细胞生长的抑制率％

库号P-388评价10^-410^-510^-610^-710^-8L199．869．122．315．410．3无效L497．387．915．1-1．2弱效L596．480．919．8-0．6弱效