用生化酶标多功能分析仪测试浊度超微量检测技术的方法

摘要

本发明提供了一种利用现有的微孔板代替96只比色杯,在孔内直接进行浊度试验。并用微量采血塑料管及定量加样、移液器,达到无需静脉抽血。用标准品测被测样品,以及采用标准溶液测定出吸光度后再根据样本的定量值,采用线性回归得到单位含量数,代替标准曲线和标准管,使之在浊度检测项目中,大大提高了检测速度,再结合相应配套的生化酶标多功能分析仪测试,完善了浊度的快速检测系统。

说明书

本发明属医学检验领域。具体说是一种用生化酶标多功能分析仪测试浊度项目的超微量快速检测技术的方法。

浊度检验是医学检验的重要组成部分之一。浊度分析朝着微量、快速、准确、方便的方向发展是当前国内外医学检验的必然趋势。

在浊度检验项目中，以血液为材料，病人都少不了静脉抽血，为了避免它就必须要求每项测定的样品尽可能少，但又不影响结果的准确性是当前国内外浊度检验存在的难点。

目前检验浊度的方法，实验室最常用的是与人工的标准浊度管目测对比比较，或透光率比浊法，用比色计以及浊度计测吸光度，再以浓度为横座标，各浓度吸光度为纵座标制备标准曲线查得含量。这些方法稳定性好，但需绘制标准曲线或计算，需单个标本比色操作，工作效率不高。而用激光免疫比浊仪比色，能立即显示所测定的项目含量，即方便，又快速，但也存在着必须单个样品比色测定，而检测下一样品时，又必须重新混匀后再测试的不便。若能实现采用微量、快速比色分析，样品一次混匀后能测试90份标本的设备和技术方法，则具有更大的技术上的优越性和应用上的实际意义。

本发明的目的在于避免上述现有技术中存在的不足之处而采用现有的微孔板代替比色杯，应用末梢微量采血，用不同浓度的标准溶液测定出吸光度后再根据样本的定量值，采用线性回归得到单位含量数，使之达到提高检测速度的一种用生化酶标多功能分析仪测试浊度超微量检测技术的方法。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：

一种用生化酶标多功能分析仪测试浊度检测技术的方法，其特征在于：

a．按末梢血常规采集方法：将微量采血塑料管上端口接触血滴，下端放低，边轻挤边进血至需要量后烧熔下端，用镊子捏紧封固或不封口，将微量采血塑料管折成“V”型插入一次性注射器的针头塑料套内，在针头塑料套管或采血塑料管上贴上不干胶序号，离心分离血清备用；

b．取洁净8×12标准96微孔板一块；

c．采用微量定量加样器，取标准品和被测样品，定量加入微孔板各孔内；

d．用微量移液器，按所需试剂用量，定量加入上述标准孔和被测样品各孔内；

e．将微孔板置生化酶标多功能分析仪测量室内，在90s内时打印出1～90份结果报告。

一种用生化酶标多功能分析仪测试浊度检测技术的方法，其特征在于：

a．按末梢血常规采集方法：将微量采血塑料管上端口接触血滴，下端放低，边轻挤边进血至需要量后烧熔下端，用镊子捏紧封固或不封口，将微量采血塑料管折成“V”型插入一次性注射器的针头塑料套内，在针头塑料套管或采血塑料管上贴上不干胶序号，离心分离血清备用；

b．取洁净8×12标准96微孔板一块；

c．采用微量定量加样器，取被测样品，定量加入微孔板各孔内；

d．用微量移液器，按所需试剂用量，定量加入上述被测样品各孔内；

e．配制四种浓度的标准溶液；

f．用可调移液器定量吸取标准溶液分别加入微孔板各两孔内；

g．用四种标准溶液测定出的吸光度后再根据样本的定量值，采用线性回归得到单位含量数；

h．将微孔板置生化酶标多功能分析仪测量室内，设置单位含量数，在90s内同时打印出1～90份结果报告。

本发明的目的还可以通过以下措施来达到：

本发明采用1μl.2μl.3μl.5μl.10μl、20μl.25μl微量定量加样器，取标准品和被测样品，定量加入微孔板各孔内。

本发明采用5、10、15、20单位浓度的标准溶液。

本发明采用100-50μl微量可调移液器分别定量吸取标准溶液300μl加入微孔板各两孔内。

本发明采用100-500μl微量可调移液器定量吸取300μl所需试剂加入微孔板各孔内。

本发明采用内径2-3mm的聚乙烯塑料管制成5-7cm规格的微量采血塑料管。

本发明相比现有技术方法具有如下优点：

1．在浊度检验项目中，多以血液为材料，病人都少不了静脉抽血，而本发明采用的一种用生化酶标多功能分析仪测试浊度项目的超微量检测技术的方法，避免了病人静脉抽血。

2．有些检测项目，如：麝香草酚浊度、血清钾等，在全自动、半自动生化分析仪中不能检测，而本发明采用的一种用生化酶标多功能分析仪测试浊度项目的超微量检测技术的方法，弥补了上述的不足。

3．目前我国多数实验室对浊度试验，最常用的是与人工的标准浊度管目测对比比较，或用比色计、浊度计测吸光度，再以浓度为横座标，各浓度吸光度为纵座标制备标准曲线查得含量。检测速度慢、工作效率不高。而本发明采用的一种用生化酶标多功能分析仪测试浊度项目的超微量检测技术的方法，实现了无需绘制标准曲线，无需人工比色和计算，在大批量标本检测中，分析速度快，90份样品仅用90s即可测试打印出结果报告。

4．本发明采用的一种用生化酶标多功能分析仪测试浊度项目的超微量检测技术的方法，只需利用不同浓度的标准液测定出吸光度后，再根据样本的定量值，用线性回归得出单位含量数，以后在此项目检测中只用此单位含量数在同批试剂中代替了标准品、标准曲线和标准管，简化了检测操作步骤，提高了工作效率和节省试剂。

5．结果准确，重复性好。本发明采用的一种用生化酶标多功能分析仪测试浊度项目的超微量检测技术的方法，其精密度、线性、相关系数、标准差、变异系数等都优于其它比色仪。

实施例1

麝香草酚浊度试验(TTT)

1．原理：

肝脏有实质性病变时，血清蛋白质的质与量都发生变化。当血清与麝香草酚饱和的巴比妥缓冲液作用时，麝香草酚可减低血清类脂质的分散力；在起稳定作用的蛋白(如白蛋白)减低或质量变化的情况下，球蛋白在低离子强度缓冲液中溶解度减低而发生沉淀。沉淀物为球蛋白、类脂质及麝香草酚的复合体。其浊度与人工标准浊度管相比较，得出麝香草酚浊度单位。

2．试剂：

麝香草酚-巴比妥缓冲液：

称取巴比妥钠2.06g，巴比妥2.76g，加蒸馏水1L，加温至沸。冷至37℃左右，加入100g/L麝香草酚酒精溶液10ml，用力振摇，放置室温(20-25℃)过夜。其中麝香草酚浓度为1g/L。

3．标准比浊管的制备：

氯化钡溶液(0.0481mol/L)：精确称取氯化钡(BaCI₂2H₂O)1.175g，或无水氯化钡1g，置于100ml容量瓶内，加蒸馏水溶解并稀释到100ml，混匀后存于密塞瓶中，可永久保存。

硫酸钡标准原液：

于100ml容量瓶中，加入0.1mol/L硫酸70ml，缓缓滴加0.0481mol/L氯化钡溶液3ml，随加随摇，最后加0.1mol/L硫酸至刻度。此混悬液相当于22.2麦氏单位。

麝香草酚标准浊度管的配制步骤

麦氏单位05101520硫酸钡原液(ml)01.352.704.055.400.1mol/L硫酸(ml)64.653.301.960.60

充分混匀，按如下操作：

4．麝香草酚标准浊度测定：

(1)取洁净8×12标准96微孔板一块。

(2)用100-500μl微量可调移液器定量吸取上述5、10、15、20不同浓度单位的标准溶液300μl分别加入微孔板各两孔内。

(3)将微孔板置生化酶标多功能分析仪测量室内，用630nm，单波长，设空白孔和各标准孔位，启动测量浊皮含量及同时打印出结果和吸光度报告。

(4)结果：

麝香草酚标准浊度测定         比浊法

试剂：                       按试剂配制方法配制

批号：                       002022

标准液(品)：                 应用前自配：5、10、15、20麦氏单位

波长方式：                   单波长

测量波长：                   630nm

报告方式：                   1．标准浓度测试结果2．吸光度测试结果

标准溶液设置：               1=0000、2=0005、3=0010、4=0015、

                             5=0020

两种报告方式、测量结果如下：

1、标准浓度测试结果：        A行01、02孔为空白孔，03、04孔为“0”

                             点孔，05、06孔为标准浊度5单位，07、08

                             孔为标准浊度10单位，09、10孔为标准浊度

                             15单位，11、12孔为标准浊度20单位测试结

                             果。2、吸光度测试结果：          与标准浊度测定结果相对应的各孔吸光度值。

板号：06空白孔：波长：630    标准浓度测试结果    日期：00-02-22    方式：单波长    湿度：    时间：08:28    代码：01    温度：01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 A+000.1+000.0-000.0-000.0+005.0+005.1+010.0+009.9+014.9+015.0+019.5+019.7

    板号：06    空白孔：    波长：630    空白孔值：+0.035    吸光度测试结果    日期：00-02-22    方式：单波长    湿度：    时间：08:28    代码：01    温度：01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 A+0.001-0.001-0.002-0.003+0.106+0.109+0.214+0.214+0.321+0.323+0.421+0.425

5．操作：

(1)末梢血采集：

a．采血部位成人以左手无名指为宜，半岁以下婴幼儿通常以拇指或足跟采血。

b．轻轻按摩采血部位，使其自然充血，用75％乙醇棉球消毒局部皮肤、待干。

c．紧捏刺血部位，用无菌采血针穿刺取血。动作应迅速，深度约2-3mm，以稍加挤压血液能流出为宜。将微量采血塑料管上端口接触血滴，下端放低，边轻挤边进血至需要量后烧熔下端，用镊子捏紧封固或不封口，将微量采血塑料管折成“V”型插入一次性注射器的针头塑料套内，在针头塑料套管或采血塑料管上贴上不干胶序号，离心分离血清备用；

(2)取洁净8×12标准96微孔板一块；

(3)用微量定量加样器取被测血清5l加入上述微孔板孔内；

(4)用100-500l可调移液器定量吸取试剂300l加入微孔板各孔内；

(5)用上述四种标准溶液测定出的吸光度后再根据样本的定量值，采用线性回归得到单位含量数为：046.2。

(6)将试验酶标孔板置生化酶标多功能分析仪测量室内，用630nm，单波长，设空白孔位，确认Au*C公式，设置单位含量数，C=046.2，在90s内同时测量打印出1～95份浊度测试结果报告。

(7)结果：

麝香草酚试验：           比浊法

试剂：                   按试剂配制方法配制

批号：                   002022

波长方式：               单波长

测量波长：               630nm

报告方式：               浊度测试结果

单位含量数设置：         C=046.2

测量结果如下：

浊度测试结果：           A行01、02孔为原空白孔，03、04孔为原“0”

                         点孔，05、06孔为原标准浊度5单位，07、08

                         孔为原标准浊度10单位，09、10孔为原标准

                         浊度15单位，11、12孔为原标准浊度20单位

                         测试结果。经测试与原标准浓度测定结果无误

                         差。其余孔为被测样品结果。

板号：02空白孔：波长：630阴性对照孔值(N)：公式：Au*C    浊度测定结果    日期：00-02-22    方式：单波长    湿度：    时间：11:55    代码：01    温度：010203 04 05 06 07 08 09 10 11 12 A+000.1+000.0-000.0-000.0+005.0+005.1+010.0+009.9+014.9+015.0+019.5+019.7 B+015.4+015.6+015.3+007.2+012.1+014.1+008.6+015.4+009.8+008.9+015.2+010.2 C+014.3+019.6+009.6+011.1+011.4+005.4+012.3+011.4+021.0+011.9+020.3+016.4 D+011.7+014.2+005.7+010.0+011.0+016.2+011.8+006.1+008.9+010.9+014.0+012.6 E+009.6+009.3+014.6+012.9+007.8+01 5.1+012.0+009.8+007.3+008.3+010.3+011.5 F+009.1+011.8+009.1+015.6+014.7+010.9+013.2+014.4+012.9+009.7+008.4+012.6 G+010.1+006.8+013.8+012.3+006.8+01 4.6+009.2+016.1+007.2+007.6+011.7+009.6 H+009.8+014.6+011.4+016.1+021.7+009.3+010.4+006.9+010.3+007.4+014.0+007.8

实施例2

血清钾测定－新四苯硼化钠直接比浊法

本法不同于被淘汰的四苯硼化钠比浊法。本试剂是加入NaOH提高pH值增加了灵敏度和使结果稳定，并加入EDTA-Na2消除干扰基础上研制的。本法与钾钠分析仪对比测定r=0.96，CV=3.98％，回收率95～103％。

1．原理：

血清中钾离子与四苯硼化钠作用，由于试剂pH在12以上，提高了试验的灵敏度形成不溶于水的四苯硼化钾沉淀，产生的浊度在一定范围内与钾离子的浓度成正比。根据浊度可测得血清中钾的含量。

2．试剂：

a、四苯硼化钠试剂：于100ml容量瓶中加生理盐水约70ml，1mol/L NaOH 1ml，EDTA-Na2 75mg，四苯硼化钠2.5g，溶解后加生理盐水至100ml。

b、钾标准液5mmol/L。

3．标本采集：按末梢血常规采集方法，将微量采血塑料管上端口接触血滴，下端放低，边轻挤边进血至需要量后烧熔下端，用镊子捏紧封固或不封口，将微量采血型料管折成“V”型插入一次性注射器的针头塑料套内，在针头塑料套管或采血塑料管上贴上不干胶序号，离心分离血清备用；

4．加样：取洁净96微孔板一块按下表加样：

加入物(μl)空白孔标准孔测定孔蒸馏水5标准液(0.5mmol/L)5血清(浆)5四苯硼化钠试剂300300300

混匀，置室温5分钟后，再混匀。

5．测试：将微孔板置生化酶标多功能分析仪测量室内，用630nm单波长、设空白孔和标准孔位，确认Au/As*C公式，设置标准品单位含量C=005.0进行比色测量各孔血清钾含量。

6．结果：

血钾测定：                      新四苯硼钠比浊法

试剂：    按试剂配制方法自配    批号：              000808

波长方式：            单波长    测量波长：          630nm

标准液(品)：        5mmol/L      使用公式：         Au/As*C

标准品单位含量设置：C=005.0     1、血钾测定结果：A行01、02孔为

空白调“0”孔，03、04孔为标准品测定结果，其余为标本测定孔结果。

2、吸光度测试结果：             与血钾测定结果相对应的各孔吸光度值。

    板号：01    空白孔：    波长：630    阴性对照孔值(N)：+0.265    公式：AU/A5*C    血钾测定结果    日期：00-08-08    方式：单波长    湿度：    时间：10:27    代码：01    温度：01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 A+000.1-000.1+004.9+005.0+004.0+003.5+004.3+004.6+003.8+004.5+003.5+004.6 B+004.3+005.0+005.4+004.7+005.1+007.3+004.7+004.7+004.2+.007.5+004.8+0052 C+002.4+004.2+002.5+005.2+005.4+003.0+003.1+002.9+002.3+002.4+002.1+002.0    板号：01    空白孔：    波长：630    空白孔值：+0.045    吸光度测试结果    日期：00-08-08    方式：单波长    湿度：    时间：1 0:28    代码：01    温度：01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 A+0.008-0.008+0.264+0.265+0.213+0.187+0.231+0.246+0.202+0.240+0.189+0.248 B+0.232+0.267+0.287+0.252+0.274+0.389+0.254+0.249+0227+0.102+0.256+0.275 C+0.127+0.227+0.135+0.273+0.287+0.161+0.164+0.156+0.125+0.128+0.113+0109