两组分信号系统基因及其所编码的蛋白质

摘要

本发明公开了一种存在于植物中的两组分信号系统基因NTHK1以及所编码的蛋白质。该基因在植物中受伤害(切割)、盐和干旱胁迫诱导的特点,它在植物中为乙烯受体,但不受乙烯诱导。本发明还公开了一种利用这种基因进行作物品种改良的方法。

说明书

本发明涉及植物中的一类新的两组分信号系统基因及其所编码的蛋白质。

植物通过感受环境及内部因子(如各种逆境，植物激素等)并作出反应来调节自身的生长和发育，尽管在生理生化水平上对这些反应已有许多研究，但植物感受和传递这些信号的机制仍不清楚。最新研究表明，植物某些信号传递过程可能与细菌的两组分信号传递系统相似。

在细菌中，两组分信号传递系统参与许多适应性行为的信号传递过程，典型的两组分信号系统包含2个蛋白质组分，一个是感受器(sensor)，通常位于细胞质膜，以监测环境变化的参数，另一个是位于胞质内的反应调节器(response regulator)用于调节基因表达或传递来自感受器的信号。除此之外，还有一小类属于“二合一”的两组分信号系统，即“感受器”和“反应调节器”合二而一，处于同一个蛋白质内。

在植物中已从拟南荠菜和蕃茄中分离到“二合一”两组分信号系统基因，它们参与乙烯信号传递或植物细胞分裂素信号传递。但这种两组分信号系统没有被认为是受干旱、盐碱、伤害诱导(Chang,C.,The ethylene signal transduction pathway inArabidopsis:an emerging paradign？Trends Biochem.Sci.,1996,21:129；Chang,C.,Kwok,S.F.,Bleecker,A.B.等，Arabidopsis ethylene-response gene ETR1:similarity of product to two-component regulators,Science,1993,262:539)。

本发明人通过研究发现了一种新的植物“二合一”两组分信号系统蛋白质，所述蛋白质的表达受伤害(切割)、盐和干旱胁迫的诱导，它在植物中为乙烯受体，但不受乙烯诱导。

所述的蛋白质可以是来自自烟草，拟南荠、大豆、茅草或水稻的两组分信号系统蛋白质。最好是来自Nicotiana tabacum var.Xanthi烟草的两组分信号系统蛋白质。一种这种蛋白质的核苷酸序列如图1所示。

因而，本发明的一个目的是提供一种新的植物“二合一”两组分信号系统蛋白质，其表达受伤害(切割)、盐和干旱胁迫诱导，从而为植物性状改良基因工程提供目的基因和调控元件。

本发明的另一个目的是提供一种编码两组分信号系统的核苷酸序列，这种序列中的一种如图1所示。

本发明的再一个目的是提供一种培育耐盐，耐干旱植物品种的方法，包括将编码本发明的两组分信号系统的基因导入植物细胞并使其表达的步骤。

在本发明的方法中，可将NTHK1以有义或反义形式或点突变的形式连接35S启动子或Ubiquitin启动子，后面连上Nos尾，转入到植物表达载体如pBIN系列中，然后将此表达载体转化到农杆菌如LBA4404中，再通过叶盘法，愈伤组织或真空抽滤法将农杆菌侵染植物细胞，受到侵染的外植体或愈伤组织经培养，可再生出小苗，小苗经筛选(对pBIN系列用卡那霉素)后可确知是否为转基因植株。用真空法可对拟南芥植株(花期)进行转化，得到的种子经抗菌素筛选后可得到转基因植株。另外也可用基因枪法将目的基因NTHK1的表达载体轰击植物愈伤组织，经培养，再生和筛选后可得到转基因植株。对各种转基因植株进行干旱和盐胁迫处理，这样就可获得耐旱耐盐的新品系。本方法可用于对各种粮食作物(如水稻、小麦、玉米、大豆等)和蔬菜进行转基因操作，可获得抗旱抗盐抗逆的新品系。

附图简要说明：图1，烟草两组分信号系统基因NTHK1的核苷酸和氨基酸序列；图2，烟草NTHK1的氨基酸序列与其它两组分组氨酸激酶氨基酸序列的比较，框住的部分代表高度保守的磷酸化位点组氨酸和磷酸接受位点天冬氨酸(*)；图3，剪切伤害对NTHK1转录的诱导作用，采用竞争RT-PCR法，竞争物与目的片段用相同的引物；图4，盐和干旱胁迫对烟草幼苗NTHK1转录的诱导作用，采用竞争RT-PCR法，竞争物与目的片段用相同的引物；图5，乙烯利对伤害诱导的NTHK1转录的影响，采用竞争RT-PCR法，竞争物与目的片段用相同的引物。图6，从各种植物的基因组中扩增NTHK1的3’段同源序列。1：DNA分子量标记；2：拟南芥菜；3：烟草；4：大豆；5：茅草；6：水稻。

实验例实验例1

本发明人利用烟草(Nicotiana tobacum var.Xanthi)为材料，以PCR技术从花芽cDNA1链扩增了NTHK1基因片段，PCR扩增条件为94℃,1分钟；56℃,1.5分钟；72℃,2分钟；共40个循环，所用的5’端引物为5’-ATTGAGAG(G/A)TACAAGAAAGC-3’,3’端引物为：5’-CTG(G/A)AGAGC(C/G)GTTTG(A/G)TC-3’，扩增的cDNA片段克隆于载体SK⁺中。

采用Amersham的DNA测序试剂盒在ABI373型自动测序仪(PE公司)上测定了克隆片段的DNA序列，表明该片段含448碱基对(bp)，其5’端编码110个氨基酸，终止密码子后有约100bp的3’端非翻译区。构建烟草花芽cDNA文库，以此片段为探针，筛选得到十几个阳性克隆，经检测挑取插入片段最大的克隆，进行序列分析，表明该克隆包含上述片段，是一段完整的cDNA(图1)。

用BLAST(GAPPED)程序对上述cDNA编码的氨基酸序列与其它两组分信号系统基因产物的氨基酸序列作了比较，示于图2，与之比较的几种氨基酸序列中NTETR1为烟草中的乙烯受体类似物(accession No.AF022727),SHK为兰细菌中负责信号传递的两组分系统组氨酸激酶序列(accession No.D90910)；RcsC为大肠杆菌K-12调节荚膜多糖合成的蛋白(accession no.P14376)；Sln1为出芽酵母中感受渗透压变化的组氨酸激酶。由图2可见，与其它两组分信号系统基因产物比较，在该序列中磷酸化受体部位的氨基酸如天冬氨酸及组氨酸激酶结构域中的组氨酸均极保守，因此将该基因命名为NTHK1(Nicotiana tobacum histidine kinase-like)。实验例2：

关于NTHK1的特性：NTHK1的表达受伤害(切割)诱导

将烟草叶片剪至2-3cm²，浸入0.5×MS培养基(pH5.8)中，振荡5,10,15,30,60,180及480分钟，以未处理叶片为对照，对样品的RNA进行竞争RT-PCR分析，图3说明在15分钟后NTHK1的转录水平即有明显升高，至60分钟达到最高值，说明NTHK1基因的表达受伤害诱导。实验例3：

NTHK1基因受盐胁迫诱导

分别将五叶期的烟草浇以0,100,200,400mM NaCl,24小时后以竞争RT-PCR分析测定NTHK1的转录，图4说明在盐胁迫下，NTHK1基因转录有明显增加，说明此基因受盐胁迫诱导。实验例4：

NTHK1基因受干旱诱导

五叶期烟草分别放入0,5,10,20％PEG(聚乙三醇6000)中24小时后以NTHK1为探针对样品的RNA进行竞争RT-PCR分析，表明，在5％,10％,20％PEG胁迫下NTHK1转录上升，说明干旱能诱导NTHK1基因表达(图4)。实验例5：

乙烯对NTHK1的转录没有影响

将剪切的烟草叶片(2-3cm²)在含0,0.00393,0.0393,0.393,3.93,39.3mM的乙烯利溶液中摇动30分钟后对样品的RNA进行竞争RT-PCR，结果表明乙烯利对伤害诱导的NTHK1转录水平没有影响(图5)。实验例6：

NTHK1基因广泛存在于植物中

提取拟南荠菜、大豆、水稻等植物基因组DNA，用PCR方法进行扩增。在每一基因组DNA中均有扩增产物，说明NTHK1广泛存在于植物中(图6)。

本发明中克隆的两组分信号系统基因NTHK1具有“二合一”两组分信号系统的特征与已知此类基因编码的氨基酸序列相似性为30-50％，并且其受伤害(切割)、盐和干旱胁迫诱导表达及不受乙烯诱导表达的特性与已知的不同，因此，界定NTHK1为一个新的两组分信号系统基因。