法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2008-09-17
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
2003-07-16
授权
授权
2001-05-09
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
2001-01-24
公开
公开
本发明属医药领域中的重组蛋白质药物。
白细胞介素11(Interleukin11,简称IL-11)是人体内分泌的一类重要细胞因子,它作用于骨髓细胞中的原始造血干细胞,促进巨核细胞成熟,增加血小板数目,促进血小板再生。重组白细胞介素11于1997年11月由美国FDA批准上市,成为治疗癌症病人经放、化疗后血小板数降低的唯一药物。
目前,用基因工程方法生产IL-11是唯一有效的途径。但重组的完整IL-11在大肠杆菌中直接游离表达时有很大困难,以至不可能,这是因为完整的IL-11cDNA 5端GC含量特别丰富,尤其是前8个氨基酸中有6个脯氨酸,严重地阻碍了完整IL-11的直接表达。为了表达完整的IL-11只能用融合蛋白的方法,即在IL-11 N端前加入一段前导肽,构成融合蛋白,以使IL-11得以高效表达,然后再将融合蛋白中的前导肽切掉,产生完整的IL-11。现在一般采用的方法是用专一蛋白酶肠肽激酶(enterokinase)来切割融合蛋白产生IL-11,但这种酶切方法产生了切割用酶价格昂贵及异源蛋白污染等严重问题,使重组IL-11成本居高不下,纯化困难。
本发明的目的是用大肠杆菌表达系统高效表达重组的完整IL-11的融合蛋白,并在融合蛋白的前导肽与IL-11之间的结合部位插入化学试剂切割位点,以使生产成本大幅降低,纯化工艺简化,同时IL-11的生物学活性保持不变。
本发明的原理:羟胺作为价格低廉的蛋白切割化学试剂,可以专一性地切开蛋白与多肽中的Asn-Gly肽键。
我们在实验中发现,白介素11多肽中不含有羟胺切割位点Asn-Gly肽键,而其N端又恰好为甘氨酸Gly,这样我们在融合蛋白的前导肽与IL-11的连接处即IL-11的N端引入羟胺切割位点Asn-Gly(AACGGG),在用大肠杆菌高效表达IL-11的融合蛋白后,再用羟胺进行切割,恰好切出N端为Gly的完整的IL-11,且具有天然的生物学活性。
经上述改造后转化的工程菌种,在发酵表达后,经菌体收集→菌体破碎→离心分离→阴离子交换层折→羟胺切割→阳离子交换层折等纯化步骤,可制备得到纯度大于95%,比活性达到8×106IU/mg的完整的白介素11。
最佳实施例:
在构建IL-11融合蛋白的克隆过程中,在IL-11的前面放置大肠杆菌硫氧还蛋白(thioredoxin)作为前导肽,在thioredoxin和IL-11之间引入羟胺切割位点Asn-Gly,其中Gly既为该位点中的氨基酸又为IL-11的N端氨基酸。将上述改造后的IL-11融合蛋白cDNA放在表达载体pThioA中,转化入大肠杆菌DH15a,用IPTG诱导的方式可高效表达产生IL-11融合蛋白,表达水平达30%,同时thioredoxin引导融合蛋白以可溶状态存在于大肠杆菌的细胞浆中,且具天然活性。这一优势可以免去包涵体形式的蛋白所需的变性、复性及异构体分离等问题。在用羟胺切割后,产生完整的IL-11。这样纯化工艺得以简化,生产成本大大降低。
表达和制备方法如下:在菌种平板上挑取一单菌落,接种于2ml LBA培养基中(LBA:每升含10g蛋白胨,5g酵母膏,5g NaCl,60mg氨苄青霉素,PH7.0),37度培养过夜作为种子,按1%的接种量接种于50ml LBA中,37度生长至O.D600=0.5时,加入IPTG至1mM诱导表达6小时,离心收获菌体。将菌体悬浮在50mM PB(Na2HPO4+NaH2PO4,pH8.0)缓冲液中,超声破碎菌体,20000g×20分钟离心。取上清,上清过阴离子柱DEAE-Sepharose层析纯化,用20mMPB,PH8.0缓冲液洗脱,收集IL-11融合蛋白富集峰。再加入羟胺至2M,调PH7-9,在37-45度下切割2-20小时,释放出完整的IL-11。透析后再用阳离子柱CM-Sepharose进一步纯化,用0-1M NaCl,20mM PB,PH8.0线性梯度洗脱,在0.25mM NaCl左右浓度处洗下IL-11活性峰。SDS-PAGE电泳分析表明,得到的IL-11纯度大于95%,测活结果为比活性达到8×106IU/mg。通过上述方法,可以得到高纯度,高比活性的完整的重组白介素11。
本发明提供了一种成本低廉的用融合蛋白方式表达和切割制备IL-11的方法。它与世界上唯一生产IL-11的美国Genetics Institute的生产工艺相比具有如下优点:1、融合蛋白切割试剂为价格低廉的化学试剂一羟胺,而G.I.公司的工艺需用价格昂贵的enterokinase来切割融合蛋白。2、本工艺采用的羟胺为小分子无机物质,不带来异源蛋白污染。而G.I.公司的工艺中存在着融合蛋白前导肽和加入的enterokinase的异源蛋白污染问题。3、由上述二个特点决定了本工艺纯化方便且成本低廉。上述优势使本发明具有明显的技术创新性和工艺先进性,更适合于工业化生产且经济实用。
机译: 重组质粒DNA pTEV-TMS编码用于蛋白水解切割的融合蛋白,形成人肿瘤抑素的人肿瘤抑素的BLUM片段[L69K-95]的抗血管生成肽,大肠杆菌BL21(DE3)/ pTEV-TMS-生产者蛋白质的制备及其制备重组抗血管生成肽的方法
机译: 重组质粒DNA pET32M / mTrx-rhIL-11编码人类白细胞介素11,生产方法和大肠杆菌BL21(DE3)/ pET32M / mTrx-rhIL-11菌株-重组白细胞介素11的生产者
机译: 重组质粒编码人胰岛素(变种)的融合蛋白-胰岛素,大肠杆菌菌株-人胰岛素(变体)的融合蛋白-前列腺素的生产者,人胰岛素的制备方法