从莲子心中提取纯化异莲心碱和莲心碱的制备方法

摘要

一种从莲子心中提取纯化异莲心碱和莲心碱的制备工艺,首先用甲醇浸出法从莲子心中提取以甲基莲心碱、异莲心碱、莲心碱为主要碱的非水溶性总碱,再从非水溶性总碱中分离出含有异莲心碱和莲心碱的强酚性总碱,然后以结晶法分离强酚性总碱得异莲心碱和莲心碱;本发明提供的从莲子心中提取、纯化异莲心碱和莲心碱的方法,与现有的方法相比,具有成本低、收得率高、品质优——含量大于90%、适合于工业化生产等突出的优点。

说明书

本发明涉及医药制备方法，特别是植物药的提取纯化方法。

我国心脑血管疾病发生率及死亡率居各病之首，呈逐年上升趋势，高血压卒中、心律失常、心肌梗死、心衰的死亡率尤高。常用中药莲子心“清心火、固精血”，其中具有心血管活性的主要物质为异莲心碱(Isoliensinine)、[王嘉陵等.中国药学杂志1992；27(6)：359]、莲心碱(Liensinine)[陈维洲等.药学学报1962；9(5)：277-279][熊一力，王嘉陵等.中国心血管杂志1998，(1)，6-9]和甲基莲心碱(Neferine)[胡文淑等.中国药理与毒理学杂志1992；(2)：107-109][史宵燕，王嘉陵等.中国药师1998；1(2)：51]，它们属双苄基异喹啉类；具有抗Ca⁺⁺、抗心律失常、扩张血管、抗羟自由基、抑制血小板聚集和血栓形成等作用；可用于治疗高血压、心律失常、缺血性心肌病、脑血管病等。[³H]-硫氮卓酮受体结合实验证明，异莲心碱和莲心碱抗Ca⁺⁺作用强度高于粉防己碱10多倍，与硫氮卓酮相当。

莲子心中异莲心碱含量相对较低，文献中均前期采用溶剂萃取法获得脂溶性总碱，再用层析法分离其单体(制备性高效液相法、制备性薄层或柱层析法)，费时耗功，成本昂贵，收得率较低，不适合于工业化生产应用；异莲心碱为莲心碱(Liensinine)的同分异构体，两者化学性质十分相似，难于用溶剂萃取法结合成盐法分离；文献中除仅见莲心碱可制成高氯酸盐外[Chao Tse-Yuan et al.Scientia Sinica 1962；11(2)：215][Pan Pei-Chuan et al.Sinica1962；11(3)：321]，未见其它报导。莲子心中生物碱具有药用价值已为公认，但其单体生物碱提取的困难则是困扰其开发应用的主要障碍。

本发明的目的是提供一种低成本、高收得率、优质、适合于工业化生产的从莲子心中提取、纯化异莲心碱(Isoliensinine)和莲心碱(Liensinine)的制备方法。

本发明提供的从莲子心中提取纯化异莲心碱和莲心碱的制备方法的具体方案是：

(1)从莲子心中提取以甲基莲心碱、异莲心碱、莲心碱为主要碱的非水溶性总碱；其特征在于：

(2)从所得的非水溶性总碱中分离出含有异莲心碱和莲心碱的强酚性总碱；

(3)以结晶法分离强酚性总碱得异莲心碱和莲心碱。

下面通过具体实施例对本发明方法作进一步说明。

说明书附图为本发明实施例的工艺流程图。

实施例1：

以湖北产莲子心为原料(从湖北省洪湖市莲心加工厂购得)，首先择净、干燥莲子心8kg，预先用适量3％Na₂cO₃(约100ml/kg生药)浸润湿，再加入适量(约4000ml/kg)甲醇(或乙醇)于室温下浸泡一周，连续浸泡三次。合并甲醇浸泡液，回收甲醇，残留液用3％盐酸调pH至2_3，过滤，滤液用乙醚脱脂，并继续以下步骤：

1.非水溶性总生物碱的分离

将上述脱脂后酸性溶液，用浓氨水调pH至9左右，用氯仿提取各5000ml×3次，回收氯仿，蒸馏水洗至近中性，回收氯仿，得非水溶性总碱54.4g。

2.强酚性总碱的分离

将总碱54.4g溶于1％氢氧化钠中，用氯仿提取1500ml×1次，得氢氧化钠层，用氯化铵调节pH至9，有大量沉淀析出，用乙醚萃取2500ml×5次，乙醚层用蒸馏水洗至中性，回收乙醚，残留物经真空干燥后，得强酚性总碱29.4g。

3.结晶法分离异莲心碱和莲心碱

将酚性总碱溶于无水甲醇中，冰水浴上降温至4℃，用高氯酸调节pH至2_3，静置于冰箱中(4℃)结晶，滤取结晶，甲醇(或乙醇)中反复结晶，得莲心碱高氯酸盐，白色结晶。游离成碱，得莲心碱。

将过滤除去结晶(莲心碱高氯酸盐)之母液，用氨水调pH至大量沉淀析出，乙醚萃取500ml×3次(或氯仿萃取500ml×2次)，乙醚层经蒸馏水洗至中性，回收乙醚，残留物经真空干燥后得无定型粉末。溶于苯和乙酸乙酯混合溶剂中(95∶5)，加入浓盐酸，调节pH至2_3，4℃静置析晶，滤取结晶，水中反复结晶，得异莲心碱盐酸盐，白色针型结晶。游离成碱，得异莲心碱。

本发明方法提取物质的确认(理化及波谱鉴定)：

(1)异莲心碱

主要理化常数及波谱数椐：白色无定型粉末(乙醚)，MP：70-72℃；异莲心碱盐酸盐(水)：白色针型结晶，MP：195-197℃。Rf值为0.52(硅胶G-CMC-Na板，苯∶乙酸乙酯∶二乙胺 7∶2∶1展开)，254nm紫外光照射，显兰色荧光。UVλ_max^95％EtOHnm 284.5，256.4nm。IRV_max^KBrcm^-1，3450(-OH)、2960、1620、1520、1252、1125。MS M/Z：609(M^-1)、489、297、266、192、177、148、121、77、42。NMR(CDCl₃)δppm：2.49、2.37(各3H，2×N-CH₃)；3.78(6H，2×O-CH₃)；3.72(3H，O-CH₃)6.00(2H，宽峰2×-OH)，6.92-6.31(11H，芳-H)。上述数据与文献[M.Tomita et al.TetrahedronLetters：No.37 1964；2637-2642][郭毛娣等. 中草药 1984；15(7)：291][潘竞先等.北京医利大学学报1989；21(5)：401][王嘉陵等.中国中药杂志1991；16(11)：673-675]相符，故可确定为异莲心碱(Isoliensinine)，其化学名：苯酚，-4-[(1，2，3，4-四氢-6-甲氧基-7-羟基-2-甲基-1-异喹啉)]甲基-2-[(1，2，3，4-四氢-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6-甲氧基-2-甲基-7-异喹啉)氧基]-，[R-(R*，R*)]；分子量为：610.72；分子式为：C₃₇H₄₂N₂O₆；化学结构式为：

高效液相及薄层扫描：本法提取之异莲心碱含量为93_96％。

高效液相：Water’s公司810型，YWG₁₈柱，流动相：甲醇∶磷酸钾盐缓冲液(73∶27)，三乙胺调pH至9；柱温：28℃，流速：1.0ml/min，泵压：5000Psi。与标准品比较，异莲心碱含量92_95％。

薄层扫描：CS-930型扫描仪，反射法测定，信号经计算机自动积分并给出曲线下面积，λmax：287nm，薄层法及条件同上证实：与标准品比较，异莲心碱含量94_97％。

(2)莲心碱：

主要理化常数及波谱数椐：白色无定型粉末(乙醚)，MP：95-98℃，Rf值为0.42(硅胶G-CMC-Na板，苯∶乙酸乙酯∶二乙胺7∶2∶1展开)，254nm紫外光照射，显兰色荧光。UVλ_max^95％EtOH nm282.4，，277.3，250.3nm；IRV_max^KBrcm^-1，3440，2940、1610、1510、1250、1120。MS M/Z：611(M⁺¹)、503、297、206、192、176、162、146、107。NMR(CDCl₃)δppm：2.57、2.54(各3H，单峰2×N-CH3)；3.42、3.83、3.89(各3H，单峰3×O-CH3)，6.48-7.02(11H，多重峰，11个芳-H)。所得数据与文献[Chao Tse-Yuan et al.ScientiaSinica 1962；11(2)：215][Pan Pei-Chuan et al. Scicntia Sinica1962；11(3)：321S][郭毛娣等.中草药 1984；15(7)：291][潘竞先等.北京医科大学学报1989；21(5)：401][张先洲，王嘉陵等.药物分析杂志1991；11(3)：183][王嘉陵等.中国中药杂志1991；16(11)：673-675][古川宏.他.药学杂志(日)1965；85(4)：353][吴继洲王嘉陵等.中草药1998 29(6)：364]相符，故确定为莲心碱(Liensinine)，其英文名为：Liensinine；其化学名为：苯酚，-4-[(1，2，3，4-四氢-6，7-二甲氧基-2-甲基-1-异喹啉)]甲基-2-[(1，2，3，4-四氢-1-[(4-羟苯基)甲基]-6-甲氧基-2-甲基-7-异喹啉)氧基]-，[R-(R*，R*)]；分子量：610.0；分子式为：C₃₇H₄₂N₂O₆；化学结构式为：

高效液相(条件同上)及薄层扫描(λ：290nm，条件同上)证实：与标准品比较，本法提取之莲心碱含量为88-93％。

实施例2：

最佳非水溶性总碱提取法的比较。

分别采用苯苯浸出法、甲醇浸出法、甲醇回流法、0.5％盐酸水浸出法，以非水溶性总碱提取物重量为指标，对最佳非水溶性总碱提取方案进行了对比。每法取5个样本，每样本称取莲子心生药50克，全部实验取同一批号莲子心生药，室温下浸泡6天，连续浸泡3次，或回流8小时，连续3次，减压回收溶剂。总碱提取采用0.5％盐酸溶解，过滤除去非生物碱部分，酸性滤液用浓氨水调Ph至9左右，充分产生絮状沉淀，氯仿萃取5次，回收氯仿，残留物(即非水溶性总碱提取物)干燥称重。结果列表如下：

    不同方法提取的总碱含量比较(X±SD，n＝5)

    方法    总碱重量(g)    苯浸出法    0.37±0.08    甲醇浸除法    0.42±0.06    酸水浸出法    0.39±0.11    甲醇回流法    0.40±0.09

比较的结果是，甲醇浸出法效率最高，且稳定性好。

实施例3：

分别以江西瑞昌、湖南岳阳出产的莲子心为原料，按照实施例1所述的提取工艺步骤，得到与实施例1相同的结果。

本发明提供的从莲子心中提取、纯化异莲心碱和莲心碱的方法，与现有的前期采用溶剂萃取法获得脂溶性总碱，再用层析法分离其单体(制备性高效液相法、制备性薄层或柱层析法)的方法相比，具有成本低、收得率高、品质优——含量大于90％、适合于工业化生产等突出的优点。

异莲心碱(Isoliensinine，IL)抗实验性心律失常作用及机制研究结果与结论。

一、异莲心碱(Isoliensinine，IL)抗实验性心律失常作用

1.IL对哇巴因诱发的豚鼠心律失常的影响

              哇巴因诱发心律失常剂量

Drugs    VP(μg/kg)     VF(μg/kg)    lethal(μg/kg)

(mg/kg)

NS      182.8±20.8    278.1±59.0     332.4±64.3

Qui5    235.6±26.8    329.4±39.9     365.0±47.6

IL1.25  216.7±64.0    319.2±57.8     364.4±44.7

IL2.5   288.8±66.5    374.8±37.3     402.7±33.3

2.IL对CaCl₂(3.5％CaCl₂，14mg/kg，

  iv，10s)诱发的大鼠心律失常的作用

组别      例数    室颤    死亡    存活数

NS          8       7       7       1

IL5mg/kg    8       1       1       7

3.IL对冠脉结扎复灌诱发的大鼠心律失常的作用

药物      例数    室颤    死亡    心律失常

(mg/kg)                       发生数/持续时间(min)

NS          8       6       2     7/12.8±5.1

Qui 8       8       1       0     6/6.1±4.8**

IL  3       8       0       0     2/1.5±0.7**

4.IL对Adr(0.01％Adr，0.06ml/kg，iv，

  5s)诱发的家兔心律失常的影响

  药物     例数        心律失常

  (mg/kg)          发生数/持续时间(min)

  NS         8         8/3.2±1.2

  Qui 8      8         6/1.8±0.6*

  IL  3      8         8/0.64±1.1**

5.IL对乌头碱诱发的大鼠心律失常的影响

              乌头碱诱发的心律失常剂量(μg/kg)

Drugs(mg/kg)  室速及室颤        死亡

NS             42.8±4.6     153.8±51.4

Qui 5          46.6±4.2     216.4±53.6

IL 2.5         42.7±5.8     181.7±68.4

二、异莲心碱(Isoliensinine，IL)心肌细胞动作电位的作用

1.异莲心碱(Isoliensinine，IL)对离体豚鼠心肌细胞动作电位的影响

IL(1-100μmol/L)可剂量依赖性地降低离体豚鼠右心室乳头肌细胞动作电位的APD20，而对其他指标几乎无作用。这与对照药维拉帕米相似。表明其有抗钙剂样作用。

表：IL对离体豚鼠右心室乳头肌细胞动作电位的影响

                Isolinsinine(μmol/L)Paramters

             0            1            3            10             30            100Vmax(V/s)   183.2±62.6  178.5±62.3   170.5±65.2   155.4±63.6    151.4±59.6    146.8±45.7OS(mV)      28.3±10.1   27.8±13.3    26.4±13.3    26.1±14.1     25.3±14.1     23.8±11.9RP(-mV)     83.7±5.4    84.1±6.6     84.1±8.8     82.2±12.8     85±8.7        85.6±7.2APA(mV)     111.3±7.8   112.4±9.8    111.7±9.6    110.0±10.3    111.2±10.4    109.2±8.4APD₂₀(ms)  105.4±24.1  101.2±23.6   93.3±16.3^*  86.4±21.6^*   83.2±17.3^**  81.1±25.3^**APD₅₀(ms)  181.2±19.5  171.5±21.1   167.3±19.2^* 156.3±26.7^*  148.2±31.4^** 141.7±33.4^**APD₉₀(ms)  217.3±21.2  198.2±30.1   199.8±25.4   193.8±28.2    187.6±32.58^* 177±4.9^*

2.异莲心碱(Isoliensinine，IL)对高K+部分去极化的离体豚鼠乳头肌慢反应动作电位的影响

IL(1-100μmol/L)可剂量依赖性地降低高K+(24mmol/L KCl)部分去极化的离体豚鼠右心室乳头肌细胞慢反应动作电位的最大上升速率(Vmax)、超射(OS)、动作电位幅度(APA)，IL3-10μmol/L即有明显的作用(P＜0.05或0.01)。IL100μmol/L才对动作电位时程(APD)有明显延长作用。表明IL主要抑制钙离子内流，较少抑制钠离子内流，IL对两种电流抑制作用的有效浓度相差10倍。

表：IL对乳头肌慢反应动作电位的影响(X±SD，n＝6)

                concentrntion(μmol/L)Paramters

              0           3             10           30               100Vmax(V/s)    42.8±15.7   37.8±13.8    31.8±10.2^*    27.8±6.9^**     22.3±5.3^**OS(mV)       26.1±7.6    20.5±61^*    16.6±10.3^**   12.8±12.6^**    9.2±13.1^**RP(-mV)      52.7±7.5    52.3±8.0      54.0±10.3      52±8.3          53.8±8.4APA(mV)      78.7±4.1    71.4±4.3^*   70.1±6.1^**    66.0±8.1^**     60.2±9.4^**APD₂₀(ms)   62.3±19.2   64.5±18.6    67.0±26.4      75.5±29.4^*     79.8±32.6^*APD₅₀(ms)   117±44.1    119±39       117±34         127±58          133±51^*APD₉₀(ms)   140±47      147±41       143±41         181±93          186±102^*