利用发酵工业高浓度有机废水生产微生物杀虫剂的方法

摘要

本发明涉及利用发酵工业高浓度有机废水生产微生物杀虫剂的方法。属于废水利用领域。本发明利用发酵工业高浓度有机废水(有时需要经过预处理)和经过驯化的Bt菌种在发酵罐里大量培养苏云金芽胞杆菌微生物(Bcillus thuringiensis),再经过对发酵液适当处理,可获得杀虫效果良好且对高等生物无毒或微毒的液态或固态微生物杀虫制剂。本发明可充分利用发酵工业高浓度有机废水中的营养物质,在低成本处理废水的同时又可大量获得生态效益良好的微生物杀虫剂,变废为宝。该方法具有工艺简单、设备少、能耗低和综合经济效益好等优点。

说明书

本发明涉及发酵行业废水再利用，特别是一种利用发酵工业高浓度有机废水生产微生物杀虫剂的方法。

发酵工业的产品主要是通过微生物液体发酵提取精制得到的，此过程产生的废液虽然部分属于高浓度有机废水，但它们却是发酵工业的主要污染源。高浓度有机废水中的COD(化学需氧量)和BOD(生化需氧量)均大大超过国家规定的废水排放标准。现有技术如果使它们经过处理达到国家规定的排放标准，投资很大且维持费也高。另一方面，发酵工业中的高浓度有机废水常常含有丰富的可再利用的有机物质，如何经济有效地利用它们也一直是人们努力研究解决的课题。

杀虫微生物能灭杀害虫，很少污染环境，且害虫难以对其产生抗药性，一般也不伤害能控制害虫群落的天敌。这样的微生物包括了细菌、真菌、病毒和原生动物等。已经鉴定出的100多种昆虫病原菌分属芽胞杆菌科(Bacillaceae)、微球菌科(Microccaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillacece)和假单胞菌科(Pseudomonadaceae)等。其中只有芽胞杆菌科(Bacillaceae)中的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)被大规模生产与应用。它的制剂广泛被用于防治农业(如粮食、蔬菜、棉花、瓜果和烟菜等)害虫、林业害虫、贮藏害虫和环卫害虫等，经过几十年大范围使用，证明其是世界上一种很有成效的微生物杀虫剂，产量已占微生物农药总量的90％以上，因而在微生物防治病虫害中占有重要的地位。随着人类对生态环境的进一步重视和研究的深入，其需求量也会越来越大。

苏云金芽胞杆菌微生物农药通常简称为Bt生物农药，它主要是通过大规模发酵的方法获得的。在发酵工业的高浓度有机废水中，一般均含有很多Bt增殖和产生杀虫成份的营养。味精和酒精等发酵工业的高浓度有机废水处理量很大，如果能将它们用作发酵培养Bt的原料，可变废为宝，即在解决废水污染的同时又可大量获得生态效益和经济效益良好的微生物农药。

本发明的目的是提供利用发酵工业高浓度有机废水作为一种生产原料进行大规模Bt发酵，以便经济有效地处理高浓度有机废水并大量获得Bt类微生物杀虫剂的方法。

本发明的另一个目的是提供一种采用上述方法制得的产品。

本发明的利用高浓度有机废水生产微生物杀虫剂的方法包括废水预处理、菌种驯化、发酵培养基营养补充、发酵和浓缩过程。

其中，所述废水预处理的主要目的是在发酵前减少废水中的对Bt增殖和产生杀虫成份有严重副作用的成份，以将这些副作用明显降低。予处理方法包括当废水中的金属元素浓度之和大于3500mg/l，采用离子交换树脂技术，以有选择地将对生产有严重副作用的重金属成分去除。

所述予处理还可以包括当废水中的硫酸根SO₄^2-浓度大于0.5％时，可添加钙的氧化物使它们反应生成CaSO₄沉淀，然后利用重力沉淀分离或离心分离方法将部分沉淀物去除。在含SO₄^2-的废水中添加0.5％至5％的钙的氧化物，所述钙的氧化物为CaCO₃、CaO和Ca(OH)₂以生成CaSO₄沉淀。添加钙的氧化物的量应确保废水中游离的硫酸根浓度小于0.5％。在这个过程中，应给予废水适当搅拌，确保反应的均匀性；并利用重力沉淀分离或离心分离方法去除固态CaSO₄，确保发酵液中不含过多的沉淀物。添加钙的氧化物和反应生成的CaSO₄沉淀去除过程可以在同一生产设备中进行。

所述予处理方法并不是必不可少的或分先后的。如离子交换树脂工艺去除某些金属离子也可首先进行。离子交换树脂的选择应根据具体废水成份和所使用的菌种性质而定。但当废水中的SO₄^2-含量大于0.5％时，发酵结果不太稳定，此时加钙的氧化物步骤是需要的。钙的氧化物一般为CaCO₃、CaO和Ca(OH)₂。添加的量应确保废水中游离的硫酸根浓度小于0.5％。

所述Bt菌的驯化是为了提高Bt菌种对废水中某些成分的适应能力，以获得高杀虫效价的发酵液并降低生产成本。驯化可在斜面、平板和摇床上接种后30℃培养72小时，反复进行。经过几十代或几百代的的驯化培养，可以筛选出对废水适应能力较强的Bt菌株。待驯化后的菌株的杀虫效价接近或达到原始出发菌株在正常培养基中的杀虫效价时，即可用在生产上。为加快这一驯化过程和强化Bt菌种对废水中某些成分的适应能力，还可以在培养基中人工添加某些对Bt增殖和产生杀虫成份有严重副作用的成份。一般来讲，对每类高浓度有机废水都应从原始Bt菌种出发重复进行这一驯化过程才能获得较好的发酵结果。

在斜面和平板上进行Bt菌种驯化，所用的培养基配方一般为：

牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％，其余为原始废水或预处理后的废水。

当废水中的硫酸根浓度较高时，为加快驯化过程，可以在上述一般培养基配方中添加(NH₄)₂SO₄ 1.0％-5.0％。

在摇床上进行Bt菌种驯化所用的培养基配方一般为：

豆饼粉1.0％，酵母粉1.0％，淀粉1.0％，其余为原始废水或预处理后的废水。

当废水中的硫酸根浓度较高时，为加快驯化过程，也可以在上述摇床培养基配方中添加1.0％-5.0％的(NH₄)₂SO₄。

每次驯化培养结束后，都应在显微镜下观察驯化结果并挑选出晶体和芽孢均正常或基本正常的Bt菌株作为进一步驯化的菌株。如果驯化过程中出现了菌体形态均较正常但伴胞晶体形状有较大差异的菌株，则应分别驯化。驯化培养这些有较大差异的菌株的一般规律为：在斜面和平板上驯化十次后，再在摇床上驯化两次并取最后一次摇床上驯化培养的结果进行杀虫效价测定比较以决定下一轮哪些菌株值得进一步驯化培养。如此不断的驯化培养和筛选直到驯化后的菌株的杀虫效价接近或达到原始出发菌株在正常培养基中的杀虫效价。

所述发酵培养基营养补充是为了获得高杀虫效价的发酵液以降低生产成本。添加的营养主要为碳源、氮源和矿物质。碳源营养主要来自碳水化合物，包括玉米淀粉、土豆淀粉、黄豆面、玉米面、葡萄糖和含碳水化合物的液体；氮源营养主要来自有机态氮源，包括鱼粉、酵母粉、豆饼粉、玉米浆和胶原蛋白；所述矿物质，包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸钾、硫酸锰、硫酸锌。在废水中添加的各营养物质的确切量应视废水中的营养成份含量及废水浓缩的程度而定。当初始发酵培养液中的总糖(用葡萄糖计算)含量和总氮含量的总和超过3％和C/N在0.5-5之间及其无机盐营养成分之和在0.02％-1.5％之间时，可获得高毒力效价的发酵液。即所添加的各营养物质应保证发酵培养液中的总糖(用葡萄糖计算)含量和总氮含量的总和超过3％和C/N在0.5-5之间及其它无机盐营养成分之和在0.02％-1.5％之间。

所述发酵过程可采用高效气升式反应器或搅拌式反应器作为废水发酵罐。当采用高效气升式反应器时，发酵过程的通气速率是标准状态计算下的气体流速)为0.01-0.15m/s之间，培养温度为26-37℃。当采用搅拌式反应器时，发酵过程的通气比在0.03-3之间，培养温度为26-37℃。发酵培养结束后，可用传统的加热蒸发、离心分离方法或膜分离技术浓缩发酵液。发酵液是否浓缩及浓缩的倍数主要根据Bt生物农药制剂的品种来定。当制剂为粉剂时，浓缩的总倍数一般在3-10倍后再进行喷雾干燥和包装。当制剂为液剂时，浓缩的总倍数一般在1-3倍。要获得能长期保存和再增加杀虫效果的制剂，在发酵液的后处理过程中还应添加稳定剂和增效剂。

本发明的利用高浓度有机废水生产微生物杀虫剂的方法还可以包括为充分利用废水，将废水浓缩1-10倍后再利用，也可以在发酵后将发酵液给以浓缩。浓缩的方法有加热蒸发、离心分离或膜过滤分离技术。

本发明的利用高浓度有机废水生产微生物杀虫剂的方法科学合理，完全有效地利用了发酵工业的高浓度有机废水，变废为宝，既解决了发酵工业的废水污染问题，又获得可以防治病虫害的微生物杀虫剂，生态效益、社会效益显著。所使用的苏云金芽胞杆菌应是在其所使用的废水中经过驯化筛选后对该废水具有较强适应能力的菌株。

下面结合实施例进一步描述本发明。

实施例1

很多味精厂产生的高浓度有机废水中的硫酸根，由于谷氨酸发酵液在等电点分离谷氨酸时要添加浓硫酸，因此硫酸根浓度高达1％以上，远超过常规微生物适应的范围，这也是现在用生物法处理味精废水的一个难点。利用此种废水生产杀虫剂，首先要不断地在这些废水中驯化Bt菌，筛选出较能适应这种环境的菌种，同时还要对废水进行发酵前的予处理。

具体过程是：

取味精厂经过等电点分离谷氨酸后的发酵废母液COD含量78000mg/l、经离子交换树脂进一步分离谷氨酸后的离交废母液COD含量35000mg/l，和再经絮凝沉淀部分蛋白后的废母液(COD含量15000mg/l)各1份混合后，用ICP，即等离子体原子发射光谱分析仪测定的主要元素成份含量如下：

   单位：mg/l

  S  Na   K  P  Mg  Ca  Fe  B  Ni  Cr  8072  1487  749  191  100.2  52.8  30.1  6.01  2.432  1.39  Mn  Sr  Ti  Ba  Zn  al  Co  Cu  V  Pb  3.13  0.40  0.13  0.14  0.45  0.60  0.10  0.15  0.06  0.15

从上面可看出，味精废水中元素S的含量远远高于其它各元素，按SO₄^2-计算含量约1.8％。如果将该废水浓缩到10倍，废水中的SO₄^2-浓度又要大幅度增加，所以此时添加钙的氧化物以形成CaSO₄沉淀的予处理步骤不能省。本实例中味精废水没有浓缩，添加工业级CaCO₃的总量为2％，边添加CaCO₃边搅拌。反应结束后用自然沉降去除50％的固含物，去除的固含物水洗后另作它用。分离了CaSO₄沉淀后的废水经测定含氮素0.65％，还原糖0.51％，因此需添加的营养成份如下：

玉米淀粉0.8％  葡萄糖0.2％    豆饼粉0.6％

酵母粉0.4％    玉米浆0.3％    MnSO₄0.01％

MgSO₄0.02％   ZnSO₄0.02％

用添加上述营养后的废水分别进行了在搅拌式发酵罐Bt发酵培养，发酵所使用的Bt菌种为经过25代在味精废水中驯化并筛选后的Bt菌种。驯化培养过程是在斜面上进行的，接种后30℃培养72小时，所用的培养基配方为：牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl0.5％，琼脂2.0％，其余为预处理后的废水。为加快驯化过程，在上述培养基配方中添加(NH₄)₂SO₄ 3.0％。

在搅拌式发酵罐的发酵条件如下：

1、菌种：在等电点分离谷氨酸后的发酵废母液中驯化并筛选后的Bt菌株H_3ab型，斜面接种后30℃培养72小时待用。

2、发酵罐：日本丸菱公司生产的MSJ-U3-30L全自控搅拌式发应器。

3、控制条件：灭菌前pH用NaOH调至8.5，121℃蒸气加热灭菌25分钟后，冷却到32℃，灭菌后发酵液定容在18L，控温32℃±0.2℃，通风量1.2m³/hr，罐压0.05MPa，搅拌转速250至400r.p.m。

发酵45小时后取样，按国家标准进行杀虫效果测定。结果表明，发酵液的毒力效价在1500IU/mg到2100IU/mg之间，接近于在正常浓度培养基内的发酵结果。

实施例2

味精厂高浓度有机废水取样同实例1。但为充分利用废水，本例为浓缩废水。先经纤维膜超滤系统使废水浓缩2倍，其它予处理和菌种驯化过程同实例1，且发酵是在气升式发酵罐中进行的。发酵48小时后取样按国家标准进行杀虫效果测定，发酵液毒力效价均在2000IU/mg以上。这说明采用浓缩2倍后的高浓度有机废水作为Bt发酵原料，不但可行而且效果更好。在气升式发酵罐的发酵条件如下：

1、菌种：同实施例1。

2、发酵罐：Ф0.2m×1.6m的高效气升式反应器(结构见中国发明专利CN1186853a)。

3、控制条件：灭菌前pH用NaOH调至8.5，121℃蒸气加热灭菌25分钟后，冷却到

32℃，灭菌后发酵液定容在36L，控温30℃±1℃，通风速率0.005m/s-0.06m/s，罐压0.15MPa。

实施例3

本例为酒精废水生产Bt微生物农药。取薯干为主要原料的酒精厂的已用离心分离方法把酒精废醪中的部分固含物去掉后的废水，用ICP等离子体原子发射光谱仪测定的主要元素成分如下：

  单位：mg/l

  S  Na  K  P  Mg  Ca  Fe  B  Ni  Cr  50.9  35.9  721  135  112  143  103  0.29  7  0.34  3  0.1  9  Mn  Sr  Ti  Ba  Zn  al  Co  Cu  V  Pb  3.21  0.56  3  10.8  1.31  1.23  87.6  0.11  2  1.12  0.28  9  0.4  5

从上面可明显看出，酒精废水中元素S的含量远远低于味精废水中的，无需实施添加钙的氧化物以形成CaSO₄沉淀的予处理。本例中对该废水没有浓缩也没有采取予处理，直接补充营养即进行发酵，添加的营养成份如下：

玉米淀粉0.8％、    豆饼粉2.5％     酵母粉0.4％

玉米浆1.2％        P₂HPO₄0.1％   MnSO₄0.02％

MgSO₄0.02％       ZnSO₄0.02％    CaCO₃0.3％

为加快驯化过程，Bt菌种的驯化是在浓缩过的酒精废水中进行的，驯化培养过程是在斜面上进行的，接种后30℃培养72小时，所用的培养基配方为：牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％，其余为预处理后的废水。发酵是在高效气升式发酵罐内进行的，发酵条件如下：

1、菌种：为在浓缩2倍后的酒精废水中驯化15代的Bt菌株H_3ab型，斜面接种后30℃培养72小时待用。

2、发酵罐Ф0.2m×1.6m的气升式发酵罐(结构同例1)。

3、控制条件(同实例1中的气升式发酵罐)。

发酵38小时后取样按国家标准进行杀虫效果测定，发酵液毒力效价在1200IU/mg至1600IU/mg之间。发酵液又经纤维膜超滤系统浓缩2.5倍，毒力效价超过4000IU/mg。