用于重组腺伴随病毒生产的全功能辅助病毒的产生及其用途

摘要

本发明包括了一种装载了2型腺伴随病毒(AAV－2)rep－cap基因的重组单纯疱疹病毒(HSV1－rc)的产生方法及其在重组腺伴随病毒(rAAV)生产中的用途。这种重组单纯疱疹病毒能提供rAAV质粒在细胞内复制和包装成rAAV毒粒所需的全部辅助功能,并能用于rAAV的大量制备。HSC1－rc的产生是在对一套含有HSVl病毒全基因组的粘性质粒(Set C粘粒,包括cos6,cos14,cos28,cos48,cos56)进行改造的基础上实现的。首先,用重组DNA技术将AAV－2 rep－cap基因插入基中一个粘粒的HSV－1基因组中,例如插入cos6的HSV1 UL2基因中构建成cos6－rcΔUL2;插入cos56的HSV1 UL44基因中构建成cos56－rcΔUL44。然后,将插入了rep－cap的重组粘粒与相应的其余4个粘粒经酶切切去粘粒骨架部分后用脂质体方法共转染HSV11敏感细胞如BHK－21,5个HSV1片段在细胞中发生同源重组而产生HSV1－rc。用HSV1－rc感染rAAV载体质粒转染的细胞或稳定携带rAAV载体质粒的细胞株,就能产生大量有感染性的rAAV毒粒。用这种方法产生的rAAV能将外源基因导入哺乳动物细胞中并表达。

说明书

本发明属于病霉基因工程领域，具体涉及大量生产重组腺伴随病毒(rAAV)所需的复制和包装功能系统。本发明涉及一种装载了2型腺伴随病毒(AAV-2)rep-cap基因(4.3kb)的重组单纯疱疹病毒(HSV1-rc)的产生方法及其在重组腺伴随病毒(rAAV)生产中的用途。这种重组单纯疱疹病毒能提供rAAV质粒在细胞内复制和包装成rAAV毒粒所需的全部辅助功能，并能用于rAAV的大量制备。HSV1-rc的产生是在对一套含有HSV1病毒全基因组的粘性质粒(Set C粘粒，包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56)进行改造的基础上实现的。用HSV1-rc感染rAAV载体质粒转染的细胞或稳定携带rAAV载体质粒的细胞株，就能产生大量有感染性的rAAV毒粒。用这种方法产生的rAAV能将外源基因导入哺乳动物细胞中并表达。

腺伴随病毒(adeno-associated virus，AAV)是微小病毒科(parvovirus)成员，其基因组为4682个核苷酸组成的单链DNA。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态，而不产生子代病毒。

AAV-2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中。其中含有2个各145bp长的倒转末端重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)。它们是AAV基因组的复制起点，并与AAV复制、整合或包装等功能有关。其基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区。rep基因有4种不同的形式的产物：Rep78，Rep68，Rep52，Rep40。它们为AAV复制和病毒基因表达等所必需的调节蛋白。cap基因编码3种结构蛋白，VP1，VP2，VP3，共同组装成AAV病毒的外壳。rep和cap基因编码的蛋白在AAV产毒性复制中都是反式作用蛋白。

AAV被认为是基因治疗理想的候选载体之一。许多实验室都构建了能将外源基因导入细胞的rAAV病毒。AAV载体质粒的主要结构特征是将rep-cap基因从病毒基因组中切除，代之以所需的DNA片段。

产生rAAV病毒的经典方法为将rAAV载体质粒与含有rep-cap基因的辅助质粒导入腺病毒或单纯疱疹病毒感染的细胞中。2-3天后从培养上清及病变的细胞中即可收获到rAAV病毒，同时还含有所用的腺病毒或单纯疱疹病毒。腺病毒和单纯疱疹病毒都可用热处理(55℃30分钟至2小时)而灭活，但不影响AAV病毒的活性。

虽然这种生产rAAV病毒的方法比较简单，但仍存在许多明显的缺点。首先，每次制备rAAV病毒时都需要转染细胞。由于转染方法自身的限制，转染及共转染效率较低，是产生rAAV病毒滴度较低的原因之一。而且，用转染方法目前还难以大规模转导细胞，因此不适应大量生产rAAV病毒的需要。因此，有必要研究一种能用于大量生产rAAV病毒的系统和方法。

颜子颖等1996年曾申请名为“能用于包装重组腺病毒伴随病毒的单纯疱疹病毒载体及其用途”的发明专利(中国专利申请号96 120549.0，公开号CN 1159480A)。该专利介绍了一种将AAV-2 rep-cap基因置于HSV1扩增子载体质粒，构建成pHSV-AAV(+/-)。将该质粒导入细胞中，在HSV-1野生型病毒的存在下，可获得一种野生型HSV-1和含rep-cap基因的假病毒的混合病毒，该混合病毒具有提供rAAV病毒复制和包装的全部辅助功能。最近Conway等(Conway JE et al，Recombinant adeno-associated virus type 2 replication and packaging isentirely supported by a herpes simplex virus type 1 amplicon expressing rep and cap JVirol.71(11)：8780-8789，1997)也报道了类似的研究。但是，这种混合病毒中假病毒所占的比例较小(＜10％)，所能提供的辅助功能有限：并且假病毒与野生型病毒的比例在病毒传代中不固定，不利于大量生产的质量控制。

本发明的目的在于提供用于简便而大量生产rAAV病毒的技术方法和全功能辅助病毒HSV-rc。本发明的目的是通过提供含有rep-cap基因的重组粘粒及其构建方法、HSV-rc病毒及其构建方法及用HSV-rc生产rAAV病毒的方法而实现的。

本发明提出的全功能辅助病毒HSV-rc为重组的HSV-1病毒，其特征在于在HSV-1基因组中插入了一个拷贝的rep-cap基因(4.3kb，方向不限定)。本发明所构建的2种HSV-rc中，rep-cap基因分别插入在HSV-1 UL2基因(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)和HSV-1 UL44基因(编码糖蛋白C)的XbaI位点中，分别称为HSV-rc/ΔUL2(图1a)和HSV-rc/ΔUL44(图1b)。UL2和UL44基因产物对于HSV-1在体外培养细胞中的增殖和传代不是必需的。这2种重组HSV1病毒均可以在HSV敏感细胞(如BHK-21)中增殖和稳定传代。

本发明所产生的HSV-rc病毒是通过对一套含有HSV1病毒全基因组的粘性质粒(Set C粘粒，包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56)(Conningham C，Davision AJ.A cosmid-based system forconstructing mutants of herpes simplex virus type 1.Virology，1993，197：116-124)进行改造的基础上产生的。首先，用重组DNA技术将AAV-2 rep-cap基因插入其中一个粘粒所含的HSV-1基因组中。然后，将插入了rep-cap的重组粘粒与相应的其余4个粘粒经酶切切去粘粒骨架部分后用脂质体方法共转染HSV1敏感细胞如BHK-21，5个HSV-1片段在细胞中发生同源重组而产生重组病毒。

用这种重组HSV1病毒感染含有报告基因GFP(绿色荧光蛋白基因)的rAAV载体质粒转染的细胞，获得的细胞裂解液上清用于感染培养的哺乳动物细胞，在荧光显微镜下(激发光波长490nm)可见到大量的绿色细胞。表明产生的rAAV病毒具有感染性，并能将外源基因导入细胞中表达。

本发明在pBDZ(+)质粒(中国专利申请号97 116981.0)的基础上构建成含有GFP基因的重组质粒，EBUF5。将该质粒导入293c18细胞(ATCC CRL10852，F9766，该细胞中含有并表达EBV病毒的EBNA1基因)，获得的HygromycinB抗性细胞株命名为293c18/EBUF5。用HSV1-rc病毒感染稳定携带rAAV载体质粒pEBUF5的细胞株293c18/EBUF5，可方便地产生大量有感染性的rAAV/GFP毒粒，该方法可实现rAAV病毒批量生产。

本发明用于构建重组病毒HSV-rc的原始生物材料有：Set C粘粒：由依次分载了HSV-1病毒全基因组的5个粘粒组成：cos6，cos14 cos28，cos48，cos56(Conningham C，Davision AJ.A cosmid-based system for constructing mutants of herpes simplexvirus type 1.Virology，1993，197：116-124)。为Davision AJ赠送。该套粘粒中装载的每一HSV-1病毒基因组片段的末端与装载于另一粘粒中的HSV-片段的末端序列重复，这是5个HSV-1基因组片段在细胞中发生同源重组的基础。pSub201：Samulski et al，A recombinant plasmid from which an infectious adeno-associated virusgenome can be excited in vitro and its use to study viral replication。HSV-rc重组病毒的制备方法：

采用与制备HSV1-lacZ100重组病毒(吴小兵等，中国专利申请号98101753.3)相同的策略和方法。

cos6及cos56粘粒中的装载的HSV-1基因组片段中各有一个XbaI单酶切位点，分别位于UL2和UL44基因内。用XbaI将rep-cap基因从pSub201中切出，分别插入cos6及cos56的XbaI位点中，构建成重组粘粒cos6-rcΔUL2(图2a)及cos56-rcΔUL44(图2b)。两种重组粘粒均寄存于大肠杆菌DH5α株(MAX E_FFICIANCY DH5α，GIBCO#18258-012)中。含有此两个重组粘粒的菌株已于1998年9月24日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.0361-1，2。

将cos6-rcΔUL2与cos14，cos28，cos48，cos56组合称为SetH(图2a)；将cos56-rcΔUL44与cos6，cos14，cos28，cos48组合称为Set I(图2b)。按Set H和Set I的5个粘粒等摩尔混合，用PacI酶切去cos骨架，用脂质体共转染BHK-21细胞，5个HSV-1片段在细胞内发生同源重组而产生HSV-rc重组病毒：5天后细胞开始出现病变，待细胞完全病变后收培养液上清，2000r/min离心5min，上清分装保存于-20℃。将Set H粘粒产生的重组HSV-rc命名为HSV1-rc/ΔUL2(附图1a)和将Set I粘粒产生的重组HSV-rc命名HSV1-rc/ΔUL44(附图1b)。用该方法产生的含有目的DNA片段的重组HSV-1病毒的概率达50～100％。通过空斑筛选很容易获得纯一的重组病毒。

以下实施例对本发明的用于重组腺伴随病毒生产的全功能辅助病毒的制备和用途作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。实施例1粘粒DNA的制备

参照Molecular Cloning--A Laboratory Manual，2nd ed(Sambrook J.et al，1986)用碱裂解法大量制备质粒DNA的方法提取粘粒DNA，用聚乙二醇沉淀法纯化。实施例2重组HSV-rc的制备

分别将Set H(cos6-rcΔUL2与cos 14，cos28，cos48，cos56)和Set I(cos56-rcΔUL44与cos6，cos14，cos28，cos48)的5个粘粒等摩尔混合，用PacI酶切去cos骨架(不必分离去除)，用酚、酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次，吸取上清，用2.5倍无水乙醇沉淀DNA。用lipofactamine(GIBCO BRL)20ul与10ug DNA按产品说明书共转染80％铺满的BHK-21细胞(约2×10⁶)细胞，5个HSV-1片段将在细胞内发生同源重组而产生HSV-rc重组病毒。转染24h后换用含2％FBS的1640培养液37℃培养，每天换液一次。5天后细胞开始出现病变，待细胞完全病变后收培养液上清，2000r/min离心5min，上清分装保存于-20℃。将SetH粘粒产生的重组HSV-rc命名为HSV1-rc/ΔUL2，将SetI粘粒产生的重组HSV-rc命名HSV1-rc/ΔUL44。对获得的重组病毒进行两次空斑纯化，可得到纯一的HSV1-rc/ΔUL2和HSV1-rc/ΔUL44。实施例3 293c18/pEBUF5细胞株的建立

在pBDZ(+)质粒(中国专利申请号97 116981.0)的基础上构建成含有GFP基因的重组质粒pEBUF5，其结构见附图3。将该质粒用脂质体方法导入293c18细胞(ATCC CRL10852，F9766)，用Hygromycin B 200ug/ml选择培养10-15d，获得的抗性细胞株命名为293c18/EBUF5。实施例4 用HSV-rc感染pAAV-GFP转染的细胞制备rAAV-GFP

用这种重组HSV1病毒感染含有报告基因GFP(绿色荧光蛋白基因)的rAAV载体质粒转染的细胞，细胞病变(36-72h)后反复冻融4次裂解细胞以释放细胞中的rAAV-GFP，低速离心去除细胞碎片，取上清56℃灭活30min，用于感染培养的哺乳动物细胞。实施例6 用HSV-rc感染293c18/pEBUF5细胞株制备rAAV-GFP

用0.5～5moi的HSV1-rc病毒感染稳定携带rAAV载体质粒pEBUF5的细胞株293c18/EBUF5，24～48h后细胞发生完全病变，将细胞和其培养液一起反复冻融4次，1000r/min离心5min，上清中即含有大量的rAAV-GFP病毒。用这种方法可方便地产生大量有感染性的rAAV/GFP毒粒，并可实现rAAV病毒批量生产。实施例7 rAAV病毒转导培养细胞

取rAAV-GFP病毒上清1ml加入培养的BHK细胞(80％铺满)中，24-48h后在荧光显微镜下(激发光波长490nm)观察，可见到大量的绿色细胞。表明产生的rAAV病毒具有感染性，并能将外源基因导入细胞中表达。