山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因以及提高植物耐盐性的方法

摘要

本发明公开了新的山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因及其DNA序列,提供了将该基因转化到宿主植物并使之在其中表达的载体,还提供了转甜菜碱醛脱氢酶基因的植物以及使植物具有高耐盐性的方法。

说明书

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说涉及将外源基因转入植物，使植物的耐盐及耐旱性提高的方法。

环境因子、干旱、低温、高盐等限制了植物的生长和农作物产量，为应答非生物胁迫，细胞内往往积累一些小分子有机化合物，甜菜碱就是其中之一。藜科．早熟禾科、紫苑等在干旱或盐碱胁迫下甜菜碱的积累更为明显。甜菜碱除定位在叶绿体外还存在于微粒体和胞浆中，已知在胁迫下，除参与渗透调节外，还对三羧酸循环的主要酶和末端氧化关键酶有保护作用。植物中甜菜碱的生物合成经两步氧化得到，其中涉及胆碱单氧化物酶和甜菜碱醛脱氢酶(BADH,EC1.2,1.8)。这两个酶的活性都受盐和干旱诱导。Saneoka等人证明，含甘氨酸甜菜碱的玉米在盐胁迫下比缺失型所受损伤明显下降。

我们从耐盐性很强的藜科植物山菠菜中克隆了BADH cDNA，并获得了适用于携带该基因转入植物细胞的载体，以及具有耐盐和耐旱性的转基因植物。

本发明的目的之一是提供了编码山菠菜甜菜碱醛脱氢酶的cDNA序列。

本发明的另一个目的是提供了将山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因转化植物并在其中表达能提高植物耐盐性和耐旱性的方法。

本发明的再一目的是提供了转甜菜碱醛脱氢酶基因的植物，该转基因植物具有高耐盐性和耐旱性。

一．编码山菠菜BADH结构基因的克隆和序列分析及在原核细胞中表达检测

1．植物总DNA和cDNA制备

取4g去脉叶组织为材料提取总DNA,cDNA合成按照Jurgen 1987方法进行。

2．山菠菜BADH结构基因克隆及序列特性

PCR技术关键之一是引物设计，首先从植物其它醛脱氢酶结构基因中推知BADH中内含子的分布情况，再根据已发表的菠菜cDNA序列资料设计了引物。二个引物分别用于扩增BADH的结构基因。

3．PCR扩增

(1)引物设计，我们合成的二个引物分别为：

           引物1,5′AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC3′；

           引物2,5′TTCAAGGAGACTTGTACCATCCCCA3′

(2)扩增反应，扩增反应总体积为50μL含10mmol/L Tris-HCl pH8.350mmo1/L KCL,1.5mmol/L MgCl₂,200μmol/L每种dNTP,25pmol每种引物，1μg总DNA模板或200～500ng单链cDNA，以及1.25U Taq聚合酶，扩增条件为预变性95℃,10分钟之后进入93.5℃,1分钟，55℃,1分钟，72℃,1.5分钟的30圈循环过程，之后再于72℃保温10分钟，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，电泳后将所需条带切出，用Gene Clean Kit回收，回收后的DNA插入质粒pUC19，转化E.clli JM83，所有克隆的PCR产物均经再次PCR扩增验证。

4．序列分析

所有的序列分析均以双链质粒为模板，用Sanger(1977)经双链全测序方法完成。

以山菠菜cDNA为模板，运用引物1和2进行PCR扩增获得约1.5kb的单一条带(图1)，序列分析表明该片段为BADH的cDNA全长基因，其长度为1509bp，有一编码603个氨基酸的开放读码框架(图2，位于773～811密码子所相应十肽Val-Thr-Leu-Geu-Gly-Gly-Lys-Ser-Pro以及与酶功能有关的868～870位编码的Cys(图3)为醛脱氢酶高度保守的序列，同源性分析表明，山菠菜BADH基因与已发表的菠菜BADH cDNA 87.5％的同源性，与甜菜BADH cDNA88.1％同源性(Dnasis Computer Program,Hitachi)(图3)，由它们的核苷酸推测的氨基酸序列的同源性分别为90.1％及87.8％。

5.BADH结构基因表达质粒的构建

所用大肠杆菌表达载体为pKK233-3。

6．山菠菜BADH基因在大肠杆菌中的克隆和表达

将山菠菜BADH编码基因插入大肠杆菌表达质粒KK223-3中，转化E.coli JM83，得到一批转化子，选取26个单克隆，提取质粒DNA，以其为模板用引物1和3进行PCR扩增，选取得到单一1.5kb扩增带质粒DNA，再以BADH1.5kb结构基因为探针进行Southern杂交分析，得到12个阳性克隆，随机选取11个，以含有KK223-3质粒的E.coli JM83为对照，测定BADH同工酶活力，含BADH结构基因的转化菌，活力为8.04U/mg蛋白，而对照酶活性很低，仅为0.6U/mg蛋白，转BADH基因菌比对照活性高13倍。

二．山菠菜BADH结构基因在真核细胞中表达

l．DNA提取质粒DNA提取和纯化按Sambrook方法进行，植物总DNA提取按前述方法进行。

2．植物表达载体的构建和植物转化

BADH cDNA植物表达载体的构建按常规方法进行(图5)，双元表达载体pBin438(图4)含双重35S启动子和翻译增强子TMV的“Ω”片段，用BamHI和KpnI将BADH cDNA片段从克隆质粒中切出来后插入pBin438中，所得到的表达质粒再经基因枪法AGL1。

运用35S启动子、Acfui启动子，经基因枪法导入植物。

3．植物的转化、再生和筛选。

转化用宿主为双子叶或单子叶植物如草莓(Fragaria chiloensisi)，烟草(Nicotiana tabacum)水稻、玉米、苜蓿和草坪草等。下以草莓和烟草为例。

将无菌草莓分生组织块和约5mm大小的无菌烟草叶片分别浸入稀释5倍的AGL1农杆菌液中，约30分钟后取出放在无菌滤纸上，吸去菌液。草莓接种在MS1培养基(MS基本培养基+10mg/L 6-BA+0.5mg/L2,4-D)，烟草接种在MS2培养基(MS基本培养基+1mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA)中共培养3天后转入筛选培养基(草莓：MS1+20mg/L卡那霉素+600mg/L头孢霉素；烟草：MS2+100mg/L卡那霉素+600mg/L头孢霉素)。对照除不用农杆菌侵染外其它各步骤相同。再生苗平均25天在相同的筛选培养基上重复筛选4～5次后，抗卡那霉素植株进行农杆菌检菌和耐盐性鉴定。

4．转基因植株的筛选

共培养后的草莓分生组织块在添加6BA 10mg/L、2,4-D 0.5mg/L、卡那霉素20mg/L、600mg/L头孢霉素的MS培养基上，培养20天后再生小芽，这些小芽在附加30mg/L卡那霉素的无激素的MS培养基(MS0)中10天后部分形成小植株，在含50mg/L卡那霉素MS培养基中筛选3代后，共得到17株卡那抗性植株，共转化的烟草叶片在附加0.1mg/L LAA,1mg/L 6-BAr MS培养基中30天后再生成小植株。在100mg/L卡那霉素浓度上共得12株烟草抗性植株。

5．BADH活性分析

2g植物组织在液氮中研磨后，室温下加入蛋白提取液(50mmol/LHepes/KOH pH8.0,1mmol/L EDTA,5mmol/L DTT)抽提，4℃下1400rpm离心10分钟，蛋白浓度用紫外分光光度计280nm比色测定。

酶活性测定反应体系为：50mmol/L Hepes/KOH(pH8.0),5mmol/L DTT,1mmol/L EDTA,1mmol/L甜菜碱醛，1mmol/L NAD及酶提取液1.0mg蛋白，总体积1.0ml,37℃反应10分钟，紫外分光光度计340nm比色测定。上述反应体系下每分钟消耗1nmol的NAD定义为1个酶活力单位。

6．转基因植株的BADH活性测定

选耐盐性检测中表现较好的转基因烟草和草莓各5株进行BADH活性测定，其活性单位为在给出的反应体系下，每10分钟产生1nmNADH定义为1个酶活力单位。测定结果示于表1。由表1可见，对照未能测出BADH活性，转基因株中均能测出BADH活性，但有较大的个体差异。

表1转基因草莓、烟草BADH活性测定

    株号转基因植株种类   1   2   3  4  5对照 CK    烟草Tobacco 0.30 0.45 4.00 4.55 5.1 0    草莓strawberry 0.45 2.65 10.01 5.0 4.3 0

7．卡那霉素抗性植株的耐盐性鉴定

转化植株均表现出一定的耐盐性，其中草莓对照在0.4％ NaCl培养基中20天后全部死亡，而12株转基因草莓生长基本正常(图6-1)。其中7株在0.7％NaCl培养基中仍可缓慢生长(图6-2)。转基因烟草在1％NaCl水平上和对照有明显差异；在2％NaCl水平上，转基因植株可在MS0培养基中生根，对照植株不能(图6-3、4)。

8．转基因植株的分子检测，转基因植株的PCR检测、Southerm杂交、Northem杂交均按常规方法进行。

a．转基因植株的PCR检测，用山菠菜BADH cDNA扩增引物对转基因植株进行的PCR检测说明，17株抗卡那霉素草莓和12株抗卡那霉素烟草均有约1.0kb的扩增条带而对照植株没有(图6-5)。

b．转基因植株Northern杂交分析，对检测到BADH活性的转基因烟草和草莓进行Northern杂交分析，其中烟草和草莓各有2株酶活较高的植株检测到转录体(图6-6)。

9．植物叶片相对电导率的测定，称取0.5g新鲜叶片，加5ml超纯水，分成两等份，一份于25℃、40rpm振荡4h，另一份于沸水浴中加热5分钟，分别用DDB-6200型数字电导仪测定溶液电导率，前者为Rc′，后者为Rc，相对电导率为Rc/Rc′×100％。

10．植物大分子渗漏值的测定，根据Leopeld方法略加修改进行，用打孔器自新鲜叶片钻取5个圆片(0.5cm)，加入超纯水2ml，室温下40rpm振荡4h后紫外比色测定OD₂₅₄吸收，得到的是总渗漏值。

11．转基因植株相对电导率和大分子渗漏值的测定取上述转基因草莓、烟草各5株进行盐胁迫下相对电导率和大分子泄漏值测定(表2)。转基因植株的电导率和大分子渗漏值低于对照，表明转基因植株受盐害程度低于对照。

表2转基因草莓、烟草的相对电导率和大分子渗漏值

        植株号对照CK  1   2   3  4  5草莓大分子渗漏值0.31 0.41 0.29 0.21 0.23 0.19相对导电率0.43 0.39 0.47 0.12 0.17 0.29烟草大分子渗漏值0.29 0.37 0.28 0.22 0.170.24相对导电率0.42 0.51  0.37 0.15 0.21 0.23

附图说明：

图1是以山菠菜cDNA为模板经引物1,2 PCR扩增产物的琼脂糖电泳分析图。

图2是BADH cDNA序列图。

图3是BADH和其它的醛脱氢酶在相似位置上都含有10个保守氨基酸序列和脱氨酸残基图。

图4是pBin 438的结构图。

图5是双元载体构建图。

图6是转基因和对照植株的耐盐性图。

实施例1

山菠菜RNA的提取和CDNA合成

参照分子克隆一书，将抽提RNA组织(山菠菜3克)在液氮中碾磨，直到粉沫状；加入2ml提取缓冲液(4M guanidini thiocyanate,25mM sodiumcitrate 0.5％ sarcosyl,100μLB-mercaptoethanoL)振荡混合，加1.5ml 3MNaAc(pH5.2)和8ml酸酚，冰浴中至少保温20分钟，4℃6000转离心20分钟，将上清液转移入新的10ml管中，弃去沉淀，加等体积4MLiCL，静止沉淀RNA,6500转离心20分钟，弃上清，将沉淀沉降在300μl无菌的DEP水中。DEP水是一种抑制核酸酶的生物化学试剂，商业DEP是未经稀释过的，使用时需1∶1000份水稀释后才能使用，因此稀释后的DEP称DEP水。DEP可查文献在《美国科学院报》1970年67卷93页中，是NJ.等人发表的，DEP的英文全称是DIETMYLPYROCARBONAFE，化学分子式为COH1005，分子量162,1，可以从美国Sigma公司委托的中方代理如北京的华美公司、东方公司等，都可以买到，编号D5758(Sigma产品目录)。反转录合成第一链cDNA,lμl 0.5μg/μloligo(dT)primer 20μl(4.7μg)totol RNA 7.5μl H₂O65℃5分钟，然后放冰浴，加最终浓度5mM Mgcl₂,2μl10x反转录缓冲液，1.5单位的逆转录酶，2.5单位的rRNasin(promega)，总体积20ml，42℃1小时，95℃5分钟。

实施例2

山菠菜BADH基因的PCR扩增；

取上述合成的第一链CDNA2μl，作PCR扩增摸板。于50μl反应体系中，加入TaQ酶0.5μl(su/μl),4种dNTP(每种dNTP终浓度为200μmol/L)Mg²⁺(终浓度为1.5mMol/L,10×反应缓冲液5μl，双端引物(5’端为5’AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC3’,3’端为5’TTCAAGGAGACTTGTACCATCCCCA3’)各2μl，其余加双蒸水补齐。反应条件为：94℃预变性10分钟，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟以补齐末端。取少量扩增产物于2％的琼脂糖(购自Promega公司)凝胶中电泳鉴定。

实施例3

BADH基因的克隆和序列分析：

将PCR扩增的大小约1.5bp的BADH基因产物用内切酶BamH1和KPn1在370°消化2小时，然后75℃反应10分钟以失活内切酶；连接到经同样酶处理的puc19载体，16℃连接过夜，然后转化感受态大肠杆菌JM83，这样BADH定向插入到puc19的BamH1和KPnⅠ位点；在含有100μg/μl氨青霉素及X-g al和IPTG各800μg的LB(1升LB含10g蛋白胶、10g氯化钠、5g酵母提取粉、PH7.0)平板上经蓝白色斑系统筛选出阳性克隆。序列分析表明，克隆的CDNA片断。其长度为1.509bp，有一编码503个氨基酸的开放续码框架为醛脱氢酶高度保守的序列。同源性分析，山菠菜BADH基因与已发表的菠菜的BADHCDNA有87.5％的同源性，3′端片段特性分析表明以菠菜及山菠菜总DNA为模板，2个不同来源BADH基因的编码序列有极高的同源性。而它们的内含子区却存在着很大差异，山菠菜的内含子为105bp。菠菜为479bp，它们之间无明显同源性。

实施例4

BADH基因的植物表达载体质粒的构建：

用限制性内切酶BamH1和KpnⅠ双酶切消化已插入大小约1.5Kp BADH基因的pUC19载体，连接到同样酶处理的植物表达载体PBin438上，16℃连接过夜，然后转化感受态大肠杆菌DH52，这样BADH基因定向插入到PB438质粒BamH1和Kpnl位点处。其5’端有植物中高效表达的caMV35s启动子，3’端有增强表达的nos终止子，以保证BADH基因在植物中高效表达。PBin438上的卡那霉素抗性基因作为转化植株的筛选标记；然后用BamH1,KPnⅠ双酶切鉴定BADH基因的插入，并用没有插入BADH的PB438载体作对照，构建的载体切出了1.509Kb的BADH基因，说明BADH已经正确插入到PB438的质粒BADH和KPnⅠ位点处，这样BADH基因的植物表达载体已构建成功，可以用农杆菌、基因枪、激光、聚乙二醇等转化技术导入植物中。

附图说明：

图1：以山菠菜cDNA为模板经引物1,2PCR扩增产物和琼脂糖电泳分析，1为标准分子量，2为山菠菜cDNA PCR扩增产物。

图5：双元载体构建图。

图5中：NPTII：卡那霉素抗性基因

       RB：序列右

       LB：序列左

       35S：花椰菜花叶病毒35S启动子

       nos：终止子

       Apr：氨苄青霉素抗性基因

       Ω：增强子基因

       32S：山菠菜启动子

图6中：1．转基因草莓及其对照在0.4％NaCl培养基上的生长情况，左1及右1为对照，中间为转基因植株；2．转基因草莓和对照及其在0.7％NaCl培养基上的生长情况；3．转基因烟草及对照在2.0％NaCl培养基上的生长情况，左边为转基因植株，右边为对照；4．转基因烟草及对照在2.0％NaCl培养基上的生根情况，右边为转基因植株，左边为对照；5．转基因草莓，烟草PCP检测：1-4为烟草，1为对照，5-10为草莓，5为对照；6．转基因草莓、烟草Northern检测：1-4为草莓，1为对照，5-7为烟草，5为对照。