抑制乙型肝炎病毒复制的反义脱氧寡核苷酸

摘要

一种抑制乙型肝炎病毒DNA复制及乙型肝炎病毒基因表达的反义脱氧寡核苷酸,包括4条分别能与乙型肝炎病毒的1798到1821位,1807到1827位,ε区的1875到1895位及P基因的mRNA起始密码子区域结合的反义脱氧寡核苷酸。在其3’端也可用单磷酸化修饰以提高稳定性,使其抑制乙型肝炎病毒更有效。通过细胞实验证明,该反义脱氧寡核苷酸能抗乙型肝炎病毒,可应用于配制抑制乙肝病毒及治疗乙型肝炎的药物。

说明书

本发明涉及抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)DNA复制及乙型肝炎病毒基因的表达的反义脱氧寡核苷酸，它还可通过3’单磷酸化修饰以提高稳定性，从而提高对HBV的抑制效果。

乙型肝炎病毒(HBV)引起的乙型肝炎是一种严重的传染病。根据世界卫生组织(1988年)估计，全球的HBV携带者大约2-3亿人，主要分布在东南亚及非洲，全世界的所有肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)患者中，有80％是HBV感染者，受HBV慢性感染的人群患HCC的相对危险性至少增加100倍。我国是乙型肝炎高流行区，8-10％的人群(约1亿人口)为乙型肝炎(病毒)表面抗原(Hepatitis B(virus)Surface Antigen,HBsAg)的阳性者。根据1980年全国调查，我国现患肝炎的病人约2千万，其中60％以上为慢性肝炎患者，由此可见，由HBV感染引起的乙型肝炎与其相关的HCC是世界性的主要健康问题之一。但是，到目前为止，临床上仍缺乏有效的直接抑制病毒繁殖的治疗方法。因此，研究新的治疗方法是当今一项紧迫的任务。

HBV是一种嗜肝性DNA病毒，具有很强的宿主特异性，其感染可引起急性或慢性肝炎。HBV的感染、繁殖依赖其DNA的复制及基因组的转录和表达。HBV基因组是一个部分双链环状DNA分子，约3.2kb，它含有4个主要的读码框架，它们分别编码核心抗原(preC,C)，聚合酶(P)，表面抗原(preS1,preS2和S)和X蛋白(X)。控制这些基因表达的顺式调控元件有启动子Cp,Sp1,Sp2和Xp，增强子ENⅠ和ENⅡ，静止子(silencer)和糖皮质激素应答元件GRE等。在它们的调控下，转录产生相应的mRNA:3.5kb,2.4kb,2.1kb和0.8kb mRNA(如图1所示)。起始位点不同的3.5kb mRNA具有不同的功能。较长的前核心mRNA翻译产生前核心抗原，然后加工成e抗原(HBeAg)；而较短的前基因组mRNA翻译产生C蛋白和P蛋白，同时也是HBV DNA复制的模板，通过逆转录产生子代DNA(李载平，汪垣：HBV分子生物学：前进中的生物化学论文集(二)，上海科学技术出版社，1992年，247-256)。

HBV病毒的复制过程已经研究清楚(参见Robinson WS,Klote L,and AokiN.,J.Med.Virol.,1990,31:18-32)，包括：

1,3.5kb的前基因RNA被包装进新合成的衣壳内，成为反转录的模板。衣壳包装的识别位点为ε。

2，在聚合酶的作用下反转录产生负链DNA。引物为聚合酶的N端，结合在3’端的DRⅠ处。形成DNA:RNA杂合双链，然后由聚合酶中的RNase H水解杂合链中的RNA，留下DNA单链。

3，以负链DNA为模板，在3’端的DRⅡ处向DRⅠ合成一段DNA，再从5’端的DRⅠ处合成正链DNA。合成过程中同时被包装运出细胞，出细胞后正链DNA的合成停止，其结果是部分双链部分单链的DNA分子。

可见，HBV复制过程中重要的元件包括直接重复序列DRⅠ,DRⅡ和衣壳包装的识别位点ε。DRⅠ,DRⅡ是正负DNA链合成的起点。前基因RNA中ε序列可以形成高级结构，是形成衣壳蛋白的识别信号。HBVDNA复制时的聚合酶是P蛋白。P蛋白由3.5kb mRNA从不同翻译起始点翻译而成，是一个95 KD的富含组氨酸的碱性蛋白，可被加工成为多种分子量较小的产物。现已阐明P蛋白的4个功能结构域依次为：①蛋白引物[也称为引发酶(primase)或末端蛋白(terminal protein,TP)](可作为病毒DNA合成的引物，并与新生DNA共价连接[Wang G.H.,Seeger C.Cell 1992,71(4):663-670])；②间隔区(删除大部分以后并不影响逆转录酶的活性)；③逆转录酶；④RNA酶H(RNaseH)。

抑制HBV病毒DNA的复制，减少病毒的数量，可达到抑制HBV基因表达，最终清除病毒的目的。

反义寡核苷酸技术(antisense oligonucleotide technology)为抑制HBV基因的表达提供了一种新的方法(Keoagh T,Shaffer JD,Anal.Chem.,1996,68:3405-12)。反义寡核苷酸通过碱基配对的方式结合到互补的mRNA上，能抑制RNA的剪接及翻译。从统计学上说，在人基因中某一特定的17聚体碱基序列只出现一次，如果采用20或20以上个碱基组成的反义寡核苷酸用于疾病的治疗，几乎不会在基因组中有重复的序列，因此，反义寡核苷酸的作用十分特异，可以显著地减小毒副作用。因此，反义寡核苷酸的特点是能够通过碱基配对的方式，特异地与靶mRNA结合，阻止mRNA翻译，从而专一地抑制特定基因的表达。经过10多年来的丰富和发展，反义核酸已经发展成为一项成熟的技术，它能为研究特定基因的功能、特异抑制癌基因的表达及抑制病毒的繁殖提供有力的工具(Holt,Mol.Med.Yoday,1996,2:184-5；Plenat,Mol.Med.Today,1996,2:250-7)。它也将能成为抑制乙型肝炎病毒基因的表达及乙型肝炎病毒的繁殖和治疗乙型肝炎的药物。

1978年，Zamecnik和stephenson(Zamecnik PC,Stephenson M,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1978,75:280-284；Stephenson M,Zamecnik PC,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1978,75:285-289)首先将寡核苷酸用于专一性抑制病毒基因表达，他们首次证明一段与劳氏肉瘤病毒RNA互补的13核苷酸长的寡核苷酸可以抑制劳氏肉瘤病毒的繁殖。1984年，由Simons、Lzant和Weintraub首次提出反义RNA的概念，从那时起，已发表大量的研究成果证明反义寡核苷酸可以在体外抑制病毒的繁殖，例如对水疱性口炎病毒、单纯性疱疹病毒、流感病毒、人免疫缺陷性病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)(Leonetti,Gene,1988,72:323-327；Smith,Proc.Nail.Acad.Sci.USA,1986,83:2728-32；Zerial,Nucleic Acids Res.,1987,15:9909-13)等。反义寡核苷酸对HBV基因表达的抑制也已经做了较多的工作。国外，几家实验室和公司已申请了几项专利(WO 95/19433,WO 96/03152,WO 96/39502,WO 97/03211)。他们针对S，前S,C，前C,P等基因以及ε位点设计了许多条反义寡聚核苷酸。这些都针对ayw亚型，都采用硫代磷酸修饰。他们的反义寡聚核苷酸有的对一个基因的表达有较强的抑制作用，但对其他基因的抑制作用较弱。其中也有一些反义寡聚核苷酸用来抑制HBV DNA的复制，例如针对ε位点的。国内，赵小侠等(病毒学报，1992,8:125-130)，分别把HBV的S及C基因反向克隆到原核细胞转录载体上，在原核细胞中研究了反向克隆的HBVS和C基因对正向克隆的S基因及C基因表达的抑制作用。姚志强等在体外及细胞内研究了反义寡核苷酸对HBV基因表达的抑制作用(Acta.Virol.1996,40:35-9；1995,39:227-30)。但是，他们选用的乙型肝炎病毒亚型也是ayw亚型，此型在我国较少，在我国adr亚型较多。因此，诸多的研究由于抑制效率不够高或者寡核苷酸稳定性差或不适合于中国亚型的原因，至今仍处于实验室的研究之中，未进入临床研究阶段。

为此，本发明的目的是提供一种能有效抑制乙型肝炎病毒(包括adr亚型)DNA的复制及乙型肝炎病毒基因的表达的反义脱氧寡核苷酸，它包括四条分别能与HBV基因中1798到1821位，1807到1827位，ε区的1875到1895位及HBV的P基因的mRNA起始密码子区域结合的反义脱氧寡核苷酸。它们能通过3’单磷酸化修饰以提高其稳定性，从而提高该寡核苷酸在细胞内对乙型肝炎病毒的抑制作用。该反义脱氧寡核苷酸可应用于作为治疗乙型肝炎的药物。

本发明提供一种抑制乙型肝炎病毒DNA复制及乙型肝炎病毒基因表达的反义脱氧寡核苷酸，该反义脱氧寡核苷酸与HBV的1798到1821位，1807到1827位，ε区的1875到1895位及HBV的P基因mRNA起始密码子区域结合。该反义脱氧寡核苷酸包括4条反义脱氧寡核苷酸，即AsC,AsD,AsE和AsP，它们分别与HBV的1798到1821位，1807到1827位，ε区的1875到1895位及HBV的P基因mRNA起始密码子区域结合，它们的序列如下：

AsC 5’TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCA 3’

AsD 5’AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTG 3’

AsE 5’GCC ACC CAA GGC ACA GCT TGG 3’

AsP 5’GGG CAT TTG GTG GTC TGT AAG CAG 3’。

该反义脱氧寡核苷酸可通过3’单磷酸化修饰，以提高稳定性，使其抑制乙型肝炎病毒更有效，它们的结构如下：

AsC(3’P)5’TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCAp 3’

AsD(3’P)5’AAAAGT TGC ATG GTG CTG GTGp 3’

AsE(3’P)5’GCC ACC CAA GGC ACA GCT TGGp 3’

AsP(3’P)5’GGG CAT TTG GTG GTC TGT AAG CAGp 3’。

在考虑抑制HBV的DNA复制时我们采用如下的几种策略：

1)，根据HBV DNA的复制过程，选在DRⅠ和DRⅡ之间的1798到1821位和1807到1827位区域设计AsC和AsD，它们位于前基因RNA的3’和5’端。也是前C基因的起始密码子和前基因RNA的帽子区的位置。AsE结合到前基因RNA的3’端的1798到1821位或AsF结合到前基因RNA的3’端的1807到1827区，形成DNA:RNA杂交双链，首先在RNaseH的作用下，水解杂合链中的RNA，使前基因RNA 3’端不带DRI位点，它将不能被反转录成DNA。而AsC和AsD本身3’端为磷酸基团不能作为DNA合成的引物，从而抑制了病毒DNA的复制(见图2)。此外，HBV的4种mRNA都在同一个位点终止转录并加上polyA尾巴。即4种mRNA的3’端都带有DRⅡ,DRⅠ,ε元件和TATAAA。在DRⅡ与DRⅠ之间有ASC,AsD的结合位点。AsC,AsD与4种mRNA在3’端的靶序列结合，可由RNaseH将mRNA切断。mRNA被切去polyA尾巴后，寿命大大缩短，导致所有蛋白质的表达的减少。AsC位点也在前C蛋白的起始码处，AsD还在前基因RNA的帽子区，因此也能抑制前C蛋白和C蛋白，P蛋白的表达。

2)，设计AsE作用于HBV的ε位点。HBV的ε位点在基因的1849位到1910位，在前基因RNA中这段序列可以形成高级结构，是形成衣壳蛋白的识别信号。AsE与HBV的前基因RNA的ε位点的1875到1895位作用，其中1880到1885位是环区。AsE的结合使前基因RNA的这个区域不能形成高级结构，即不能形成衣壳蛋白的识别信号，从而可抑制反转录的起始。它也可以作用于4种mRNA。

3)，设计AsP作用于HBV的P基因的起始码区域。HBV的P基因从2310位开始，AsP与P基因的2292到2315位核苷酸互补，即它能与P基因的起始密码子区域(-18～+6位)结合。抑制P蛋白的合成。用AsP抑制HBV P基因的表达将会抑制HBVDNA的复制。

根据以上理论及HBV基因序列(包括adr亚型)，针对HBV 1798到1821位，1807到1827位，ε位点及P基因，本发明设计相应的反义脱氧寡核苷酸：AsC 5’TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCA 3’与HBV1798到1821位核苷酸互补，AsD 5’AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTG 3’与HBV1807到1827位核苷酸互补。即它们能与4种mRNA的3’端靶结合。ASE 5’GCC ACC CAAGGC ACA GCT TGG 3’与HBV的1875到1895位核苷酸互补。AsP 5’GGGCAT TTG GTG GTC TGT AAG CAG 3’与HBV的2292到2315位核苷酸互补。其中ASC和ASP专门针对adr亚型，ASD,AsE，则对各亚型通用，与已有的报道相比，序列上有一些不同，更大的差别在于文献报道用化学修饰，本发明采用3’单磷酸化修饰。

本发明提出的4种寡核苷酸的作用机理主要着眼于抑制病毒DNA的复制，而不是单纯抑制某个RNA的翻译，尤其是用AsC和ASD激活RNaseH在DRⅠ和DRⅡ中间将前基因RNA切断以及ASC,ASD和AsE与4种mRNA结合，使之被RNaseH水解这一机制均未见有报道。通过抑制病毒DNA的复制，减少病毒DNA数量，进而导致病毒基因的表达即病毒抗原蛋白合成的减少。在实验中可以通过检测HBV病毒DNA的减少和病毒抗原蛋白的减少来了解这些寡核苷酸的抑制作用。

考虑到血清中及细胞内有较高活性的核酸水解酶，其中主要为3’→5’核酸外切酶，它要求3’端为OH基团的核酸为底物。根据本发明人以前的研究成果(参见发明专利申请号97106495.4，申请日1997年6月28日)，本发明对寡聚核苷酸也进行3’单磷酸化修饰，当寡核苷酸3’的OH基团被磷酸化后，就不能作为3’→5’核酸外切酶的底物，延长了其在血清中及细胞内的滞留时间，因此能够更有效地与目的基因的互补序列相结合，抑制作用也更强。此外，寡核苷酸3’的OH基团被磷酸化后也不能作为病毒DNA合成的引物，可抑制病毒DNA的复制。因此，在DNA合成仪上合成了本发明的上述4条3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P),AsD(3’P),AsE(3’P)和AsP(3’P)，用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法进行了纯化。

为了研究本发明设计的四条反义脱氧寡核苷酸对于HBV DNA复制及基因的表达的抑制作用，本发明采用HBV质粒DNA(p1.2Ⅱ)转染到肝来源的HepG2细胞作为模型来研究反义脱氧寡核苷酸的作用。质粒(p1.2Ⅱ)含有1.2倍长度的HBV(adr亚型)基因克隆，包括全长的HBV基因组及1403～1983的重叠区，它能表达所有的HBVmRNA，转染到肝来源的HepG2细胞之后，可以表达HBsAg和HBeAg及产生完整的有感染活力的病毒颗粒。由于它是adr亚型，因而可以作为研究本发明设计的四条反义脱氧寡核苷酸对乙型肝炎的抑制作用的模型。测定细胞中HBV DNA的考贝数可以观察反义脱氧寡核苷酸对HBVDNA复制的抑制作用。用已有的测定试剂盒可以测定HBsAg和HBeAg的表达量，可以观察反义脱氧寡核苷酸抑制HBVDNA复制后，使病毒DNA减少，进而产生的对HBV基因表达的抑制作用。研究结果证明本发明合成的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P),AsD(3’P),AsE(3’P)和AsP(3’P)能够抑制HBV病毒DNA的复制和HBV的S抗源和E抗源的表达。在下面的实施例中将表示出本发明反义脱氧寡核苷酸对乙型肝炎病毒在HepG2细胞中DNA复制和基因表达都有明显的抑制作用，证明本发明反义脱氧寡核苷酸可用于配制抑制乙型肝炎病毒及治疗乙型肝炎的药物。

本发明的优点在于：

1，提供了一种反义脱氧寡核苷酸，它能通过RNaseH切断病毒DNA复制的模板前基因RNA或抑制病毒DNA复制的起始或抑制病毒聚合酶的合成，达到抑制乙型肝炎病毒DNA的复制，减少病毒DNA数量，进而抑制病毒的繁殖及乙型肝炎病毒基因的表达。这是一种直接抑制乙型肝炎病毒DNA复制及病毒基因的表达的物质，为乙型肝炎的治疗提供了新的方法。

2，用反义脱氧寡核苷酸抑制HBV病毒DNA复制及基因的表达具有专一性高的特点，而不会对人体细胞本身产生影响。

3，本发明提供的反义脱氧寡核苷酸还可以通过在反义脱氧寡核苷酸的3’末端加上一个磷酸提高其在体内的稳定性。使它们对乙型肝炎病毒的抑制作用更加明显。由于本发明设计合成的反义脱氧寡核苷酸不含非天然的修饰成分，其降解产物不会对人体产生毒副作用。

本发明通过以下附图和实施例作进一步的阐述，但并不限止本发明的范围。

图1 HBV基因组的结构，转录产物，反义寡核苷酸作用位点。

图2 HBV病毒复制过程和AsC或AsD抑制作用图解。

图3点杂交检测HBV DNA

图中1，对照脱氧寡核苷酸；2，不加脱氧寡核苷酸；3,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P)；4,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P)；5,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsE(3’P)；6,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P)。

图4不同浓度的反义脱氧寡核苷酸对HBeAg表达的抑制作用

图中■,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P)；◆,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P)；●,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsE(3’P)；▲,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P)；×，对照脱氧寡核苷酸(NC)。

图5不同浓度的反义脱氧寡核苷酸对HBsAg表达的抑制作用

图中■,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P)；◆,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P)；●,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsE(3’P)；▲,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P)；×，对照脱氧寡核苷酸(NC)。

图6反义脱氧寡核苷酸对HBeAg表达抑制的时间曲线

图中A₄₉₂表示492毫微米光吸收值。■,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P)；◆,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P)；●,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsE(3’P)；▲,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P)；×，对照脱氧寡核苷酸(NC)；*，不加脱氧寡核苷酸。

图7反义脱氧寡核苷酸对HBsAg表达抑制的时间曲线

反义脱氧寡核苷酸或对照脱氧寡核苷酸浓度为10umol/L。

图中A492表示492毫微米光吸收值。■,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P)；◆,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P)；●,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsE(3’P)；▲,3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P)；×，对照脱氧寡核苷酸(NC)；*，不加脱氧寡核苷酸。

实施例1寡核苷酸的合成

合成了4条反义脱氧寡核苷酸AsC,AsD,AsE和AsP；它们的结构是：

AsC      5’ TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCA 3’

AsD      5’ AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTG 3’

AsE      5’ GCC ACC CAA GGC ACA GCT TGG 3’

AsP      5’ GGG CAT TTG GTG GTC TGT AAG CAG 3’。

及4条3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P),AsD(3’P),AsE(3’P)和AsP(3’P)；它们的结构是：

AsC(3’P)      5’ TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCAp 3’

AsD(3’P)      5’ AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTGp 3’

AsE(3’P)      5’ GCC ACC CAA GGC ACA GCT TGGp 3’

AsP(3’P)      5’ GGG CAT TTG GTG GTC TGT AAG CAGp 3’。

1条非互补的对照脱氧寡核苷酸：

NC:5’GAT CAT GGC GCG CTT TGA GGA 3’

3′-单磷酸化寡核苷酸的合成使用0.2μmole 3′磷酸固相柱(3′-phosphateCPG Glen Research公司产品，全称2-[2-(4,4’-二甲基三苯甲氧基)乙磺酰]乙基-丁二酰长链烷基胺-微孔玻璃珠(2-[2-(4,4’-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfomyl]ethyl-succinoyllong chain alkylamino-CPG)，在ABI 391EP DNA合成仪上用0.2μmole合成顺序合成。非修饰的反义脱氧寡核苷酸和对照脱氧寡核苷酸分别用0.2μmole dG固相柱和dA固相柱(Glen Research产品)，用相同的合成顺序合成。产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

实施例2反义脱氧寡核苷酸对乙型肝炎病毒在HepG₂细胞中DNA复制的抑制作用

一、实验步骤

(1)质粒DNA及反义脱氧寡核苷酸的转染

HepG₂细胞培养于1×DMEM(含10％胎牛血清)培养液中，37℃,5％CO₂培养，转染前一天，接种细胞于12孔板，培养过夜，转染前5小时换新鲜的培养液。准备溶液A：质粒p1.2Ⅱ(中国科学院上海生物化学研究所汪垣教授提供)10μg，反义脱氧寡核苷酸(3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P),3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P),3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsE(3’P),3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P))或对照脱氧寡核苷酸各10μmol/L，加不含血清的DMEM至100μl，混匀；溶液B:6μllipofectin(Gibco BRL产品)，94μl不含血清的DMEM，混匀，室温放置30分钟。溶液A和溶液B混匀，室温放置30分钟。用不含血清的DMEM洗细胞两次，加入上述转染混合液(每个样品重复3次，)，37℃,5％CO₂培养5小时，加入2ml含10％胎牛血清的DMEM培养基，继续在37℃,5％CO₂培养120小时。

(2)细胞DNA的抽提

10μmol/L寡核苷酸作用5天后，细胞经胰酶消化后，合并重复三次的细胞，在4℃以3000g离心2分钟，收集细胞于1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol试剂，充分混匀，室温静置5分钟，加入0.2ml氯仿，振荡15秒，室温放置2～3分钟，4℃1200g离心15分钟，将水相转移至另一个1.5ml离心管中，用于细胞总RNA抽提。在中层及下层有机相加入0.3ml无水乙醇，混匀，室温放置5分钟，然后10,000g离心5分钟，弃上清，加入1ml 0.1mol/L柠檬酸钠，10％乙醇溶液，室温放置30分钟，每5分钟混匀一次，然后于4℃,10,000g离心5分钟，重复用1ml 0.1mol/L柠檬酸钠，10％乙醇溶液洗一次，悬浮于75％乙醇，室温放置20分钟，每5分钟摇动一次，于4℃,10,000g离心5分钟，置于空气中干燥后，加入100μl 8mmol/L NaOH溶解。

(3)HBV基因探针的制备

质粒p1.2Ⅱ用BamHⅠ酶切、电泳，纯化出含3.2 kb长度的完整线性HBVDNA，用随机六核苷酸引物法制备HBVDNA探针，(参见：分子克隆实验指南，第二版，J.Sambrook &,E.F.Fritsch及T.Maniatis著，金冬雁等译，科学出版社，1986年，502-504)。

(4)用点杂交(Dot Blot)检测HBV DNA

用抽滤加样器把变性的DNA样品点到尼龙膜上，用紫外交联于膜上，然后与32P标记的HBVDNA探针杂交。具体方法参见：现代分子生物学实验技术，卢圣栋主编，高等教育出版社，1993年，209-210；分子克隆实验指南，第二版，J.Sambrook &,E.F.Fritsch及T.Maniafis著，金冬雁等译，科学出版社，1986年，483-490。

二、实验结果及分析

从图3中可以看出，用3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P),3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P),3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsE(3’P)、3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P)作用的HepG2细胞中，其HBV DNA的考贝数要少于不加寡核苷酸及加不与HBV RNA配对的对照脱氧寡核苷酸的HepG₂，细胞中HBV DNA的考贝数，表现为杂交点直径较小，杂交点较浅。说明反义脱氧寡核苷酸可以抑制HBV DNA的复制。

实施例3不同浓度反义脱氧寡核苷酸对乙型肝炎病毒基因表达的抑制试验

一、实验步骤

(1)质粒DNA(p1.2Ⅱ)及反义脱氧寡核苷酸转染HepG₂细胞

HepG₂细胞培养于1×DMEM(含10％胎牛血清)培养液中，37℃,5％CO₂培养，转染前一天，接种细胞于96孔板，培养过夜，转染前5小时换新鲜的培养液。配制溶液A:0.8μg质粒p1.2Ⅱ，及不同浓度的反义脱氧寡核苷酸及对照用的脱氧寡核苷酸，它们分别是0、40、80、120、160、200pmol。当转染体积是20μl时，脱氧寡核苷酸的终浓度分别是0、2、4、6、8、10μmol/L)，加DMEM至10μl，混匀；溶液B:0.3μl lipofectin,9.7μlDMEM，混匀，室温放置30分钟。溶液A和溶液B混匀，室温放置30分钟。用DMEM洗细胞两次，加入上述转染混合液(每个样孔做6次，其中3个样品的上清用重复测定HBsAg，另三个样品的上清用于重复测定HBeAg),37℃,5％CO₂培养5小时，加入100μl含10％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养120小时，取100μl细胞培养上清用于HBsAg及HBeAg的测定。

(2)细胞培养上清中HBsAg及HBeAg的测定

在包被抗HBs或HBe反应板加入100μl待测标本，并设HBsAg或HBeAg阳性对照2孔，阴性对照2孔，空白对照1孔，然后每孔加入酶结合物100μl(空白不加)，充分混匀，封板。37℃孵育1小时。弃去反应板孔内液体，用洗涤液注满每孔，静置20秒钟，甩干，反复5次。然后每孔加底物液100μl，封板。37℃孵育15分钟，加终止液50μl。最后，在酶标仪上用空白孔校零，读取各孔反应液的492毫微米光吸收A₄₉₂值。

(3)反义脱氧寡核苷酸对HBsAg及HBeAg抑制率的计算方法如下：

二、实验结果及分析

(1)抗HBV的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P),AsD(3’P),AsE(3’P),AsP(3’P)对HBV抗原表达的抑制作用

如图4、图5所示，抗HBV的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P),AsD(3’P),AsE(3’P),AsP(3’P)，既抑制了HBV DNA的复制也表现出对HBV基因表达的抑制。3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P)从2μmol/L开始即可明显抑制HBeAg及HBsAg的表达，随着3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P)浓度的提高，对HBeAg及HBsAg表达的抑制作用也逐渐增强，至10μmol/L时，对HBeAg及HBsAg的抑制率分别是78.3％及84.0％；AsD(3’P)从2μmol/L开始即可明显抑制HBeAg及HBsAg的表达，随着3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P)浓度的提高，对HBeAg及HbsAg表达的抑制作用也逐渐增强，至10μmol/L时，对HBeAg及HBsAg的抑制率分别是82.2％及88.0％；AsE(3’P)浓度提高至10μmol/L时，对HBeAg及HBsAg的抑制率分别是80.1％及87.0％；3’末端单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P)从2μmol/L开始也可明显抑制HBeAg及HBsAg表达，随着3’末端单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P)浓度的提高，对HBeAg及HBsAg表达的抑制作用也逐渐增强，至10μmol/L时，对HBeAg及HBsAg的抑制率分别是47.6％及33.8％。

(2)抗HBV反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P),AsD(3’P),AsE(3’P),ASP(3’P)对HBV基因表达影响的比较

3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸ASC(3’P),3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P),3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsE(3’P)，及3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸ASP(3’P)均能抑制HBV基因的表达。但是，3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸ASD(3’P)在0、2、4、6、8、10μmol/L时对HBeAg表达的抑制率分别是0、31.4％、51.8％、67.1％、72.9％和82.2％；对HBsAg表达的抑制率分别是0、31.4％、51.9％、76.3％、81.7％和88.0％。3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸ASC(3’P)在0、2、4、6、8、10μmol/L时对HBeAg表达的抑制率分别是0、28.3％、47.8％、62.7％、76.0％和78.3％；对HBsAg表达的抑制率分别是0、28.2％、46.8％、73.8％、78.0％和84.0％。3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsE(3’P)在0、2、4、6、8、10μmol/L时对HBeAg表达的抑制率分别是0、29.7％、49.3％、63.8％、73.7％和80.1％；对HBsAg表达的抑制率分别是0、30.1％、49.8％、76.3％、80.2％和87.0％。而3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P)在0、2、4、6、8、10μmol/L时对HBeAg表达的抑制率分别是0、17.9％、26.6％、32.9％、45.2％和47.6％；对HBsAg表达的抑制率分别是0、10.0％、23.8％、29.4％和33.8％。3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P),ASE(3’P)和AsC(3’P)

对HBV基因表达的抑制作用比3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P)对HBV基因的抑制作用要高出一倍左右。

实施例4反义脱氧寡核苷酸抑制乙型肝炎病毒基因表达的时间效应

一、实验步骤

HepG₂细胞培养于1×DMEM(含10％胎牛血清)培养液中，37℃,5％CO₂培养，转染前一天，接种细胞于12孔板，培养过夜，转染前5小时换新鲜的培养液。准备溶液A：质粒p1.2Ⅱ10μg，反义脱氧寡核苷酸(3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P)、3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P),3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsE(3’P),3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P))或对照脱氧寡核苷酸各10μmol/L，加不含血清的DMEM至100μ1，混匀；溶液B:6μl lipofectin,94μl不含血清的DMEM，混匀，室温放置30分钟。溶液A和溶液B混匀，室温放置30分钟，用不含血清的DMEM洗细胞两次，加入上述转染混合液(每个样品重复3次，)，37℃,5％CO₂培养5小时，加入2ml含10％胎牛血清的DMEM培养液，继续在37℃,5％CO₂培养，并每隔12小时取200μl细胞培养液用于HBsAg及HBeAg的测定，具体步骤同实施例2。

二、实验结果及分析

从图6及图7可以看到，HBV基因转染HepG2细胞后，当不加寡核苷酸时，HBeAg及HBsAg在第二天开始表达，随着时间的增加，表达量逐步升高。当加入10μmol/L 3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsC(3’P)或3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P),3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsE(3’P)，或3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsP(3’P)时，HBeAg及HBsAg的表达比不加反义脱氧寡核苷酸时要明显降低，尤其是加入3’单磷酸化修饰的反义脱氧寡核苷酸AsD(3’P),AsE(3’P)和AsC(3’P)时，对HBeAg及HBsAg表达的抑制作用尤其显著，而且这种抑制作用持续至实验结束前4天。HBeAg及HBsAg的表达量上升很慢，至第4天之后，HBeAg及HBsAg的表达量才有稍明显的升高。说明反义寡核苷酸对HBV基因表达的抑制作用可持续至DNA转染后第5天。同时，当加入不能与HBV mRNA互补的对照脱氧寡核苷酸时，HBeAg及HBsAg的表达量也有些降低，这可能是由于DNA转染系统中的脱氧寡核苷酸影响了HBVDNA的转染效率，因此，HBeAg及HBsAg的表达量有所下降。但是，HBeAg及HBsAg表达量下降的幅度要明显小于反义脱氧寡核苷酸对HBeAg及HBsAg表达的抑制作用。