用于鱼、贝类及动物的药物和饲料以及用于植物的药物

摘要

一种应用于在有限或过度拥挤环境中饲养的鱼和贝类以及饲养的动物如家畜和家禽以减轻环境压力、激活其固有的免疫功能或消灭致病菌以预防或治疗传染病、并用于其健康和安全地生长的物质。所述物质中含有作为有效组分的代谢物如肽,该代谢物获自属于芽孢杆菌属的苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合培养物,或者所述药物包括具有代谢物的发酵混合物。还有使用该药物的饲料。此外,还有一种用于植物以有效地预防和治疗细菌性疾病的物质,其中含有作为有效组分的代谢物或具有该代谢物的发酵混合物。

说明书

近年来，发展中的鱼和贝类、特别是鱼和甲壳类动物养殖业被产品中多发的病毒和细菌性疾病所严重破坏。病毒性疾病有红海鲷科鱼（red seabream)、狮鱼中的琥珀鱼(yellowtail)和紫狮鱼(amberjack)中的虹彩病毒感染和虾类中的急性“病毒血症”(PVA)，这导致养殖场的巨大经济损失，对于这些疾病目前还没有适宜的治疗方法。同样导致养殖场巨大经济损失的细菌性疾病有琥珀鱼中肠球菌引发的疾病和nodositoloid，琥珀鱼、红海鲷科鱼、虹鳟鱼、香鱼和虾类中的弧菌病及比目鱼中的爱德华氏菌感染。对于这些细菌性疾病已使用各种抗生素和合成抗菌剂进行治疗，但已出现了对于抗菌类物质的抗性株，阻碍了该抗菌类物质充分发挥药效。再有，由于在鱼和甲壳类动物中施用的药物的残余物导致公共健康问题，强烈需求不依赖前述化学疗法的细菌性疾病防治方法。另外，贝类如牡蛎和(“珍珠贝”)养殖场最近有许多病毒性疾病并因此受到严重损害，但除了丢弃已死的贝类外，没有其它的对应措施。

在禽类(鸡)养殖场、养猪场(猪舍)和牛棚(牛舍)等中，禽类和家畜的饲养和生产方式是，所述动物被局限在仅以有效生产为目的的极有限的生活空间内。因而，家禽和家畜经受来自生存条件和饲养方法的环境压力，所以导致它们处于不健康状态并经常发生大规模传染性疾病。再有，还发生：来自配方饲料物质的致病菌或传染剂；由化学物质所致的有害效应及致病；由防止上述有害效应和病态而添加的化学物质所致的免疫降低和不良效应类影响。另外，对传染性疾病常应用各种磺胺类药物和抗生素，对于这些药物出现了抗性株。人们担忧药物效果的下降以及在所饲养的家禽和家养动物体内的残余药物经制成食品带入人体的各种不良作用。由以上可见，家禽和家养动物繁殖力的下降(由于生病引起的风险)以及化学物质和抗生素所引起的品质恶化造成了大量损失，因而急需不依赖化学疗法的预防措施。

近年来植物过分耕作或大量消耗农用化学品，导致环境污染和食品污染的社会问题。已经激发了不使用农用化学品进行耕作或进行生物耕作的趋势，但目前还没有完全实现转换。也急需不产生环境和食品污染的用于植物的药物。

现在已公知使用多糖如源于双歧双歧杆菌(Lactobacillus bifidus)的肽聚糖、β-1,3-葡聚糖等来强化鱼和甲壳类动物的免疫功能。然而，基于代谢物(如肽，从苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合培养物获得)来激活鱼、贝类或动物免疫功能的方法或如按本发明得到的各种肽单独或相互之间的复合效果或作用还未公知。同样，这些代谢物用于鱼、贝类或动物以提供抗环境压力功能的事实也未公知。

如上所述，在饲养的鱼和贝类中爆发许多疾病使得养殖场每年的经济损失数值达250亿日元。其背景是鱼和贝类在有限的小环境中饲养，因环境压力产生应激反应且免疫功能下降。同样在家禽、猪、小猪、牛、小牛饲养中，爆发的疾病使养殖场的损失大大高于养鱼场，且养殖场还受细菌、抗生素等化学品的严重污染问题困扰。此外，所制成的食品对人体的有害影响也是令人担忧的。

本发明的目的之一是提供可用于激活各种鱼、贝类、家畜和家禽所固有的免疫功能的物质，以此来预防疾病从而由所饲养的鱼、贝类、家畜和家禽获得健康且安全的食品。本发明的另一目的是提供用于植物的药物，该药物不造成环境污染并可安全应用。

本发明涉及一种用于鱼和贝类和动物的药物，特别是对激活免疫、预防传染性疾病且对抗环境压力有显著效果的药物。本发明还涉及用于鱼和贝类和动物的饲料，其中以适当的比率含有所述的药物。本发明进一步涉及用于植物的药物，该药物具有预防和治疗细菌性疾病及控制虫害的效果。

图1是感染了肠球菌的琥珀鱼的存活数及存活率与天数的关系图。

图2是感染了PRDV的对虾的存活数及存活率与天数的关系图。

为解决上述问题，在本发明人如下观察和认识的基础上完成了本发明，即：将代谢物(如肽，获自含有苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)和短小芽孢杆菌(B.Purnilus)的混合培养物)、混合培养的培养物中所用的可发酵的二级原料进行发酵所得的中间产物或残余物、芽孢杆菌的孢子的混合物(该混合物此后称为“发酵混合物”)或从所述混合物中分离出的代谢物(如肽)或产物添加到任何饲料中，然后将该饲料应用于鱼、贝类及动物，发现激活了鱼、贝类和动物中所固有的多种免疫功能，减轻了环境压力，并防止了病毒或细菌的感染。此外还发现和认识到如下事实，即，将贝类浸泡(适当长的时间)于水(其中溶解并分散有本发明前述细菌等物质)中，以防止贝类被病毒或细菌感染。

发酵混合物按如下方法来获得：使用污水处理残余物(其中普遍存在芽孢杆菌属细菌特别是苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)或含有较高密度所述两种细菌的腐叶土(1eaf mould)作为菌种体；将该菌种体与营养物一起在培养罐中培养，通过通风并添加营养物来重复繁殖过程(其中营养物被分解，并有孢子生成)，使所述残余物含有高密度的苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，干燥所生成的残余物。本发明发酵混合物可以按另外的方式获得，即将残余物产物(通过上述方法获得)进一步发酵以使有机物质(如细菌的细胞膜和原生动物尸体)分解且含有高密度的芽孢杆菌，干燥发酵残余物。另外，可采用苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌菌体并繁殖以用于本发明的用途。

在繁殖和发酵过程中，特别是后一过程中，生命周期短的苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌在芽孢杆菌属细菌中占主导地位。在发酵混合物中苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的浓度为10¹⁰-10¹²/g的数量级。在所述残余物中存在少量其它种类的芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或酵母)无关紧要，只要在所述残余物中苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌占主导地位。同时，当尺寸为直径1.2μm或更大时苏云金芽孢杆菌分解(并作为营养物)淀粉和糖(芽孢杆菌的一些变株也分解酪蛋白)但不分解熟肉。细胞尺寸为直径1.1μm(或略小)的短小芽孢杆菌分解熟肉和酪蛋白但不分解淀粉，因而它们可从其它种类芽孢杆菌中特异性地检出。

发酵混合物还可以按另外方式来提供，即通过：重复消化-发酵(在贫养状态下发酵)以降低活细胞数；或首先大量增加苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的密度以及代谢物或其它物质的浓度，然后提供水、热源物质和氧在贫养状态下重复发酵，以进一步增加代谢物或其它物质的浓度，同时将苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的密度降至低于正常分布密度(10²-10⁴/g)。在这种情况下，芽孢杆菌细胞膜和其它成分被分解并作为唯一的营养物而不复存在。

所述发酵混合物以液体或粉末的形态来提供用作动物或植物的药物，所述液体含有有效成分如通过使用溶剂洗脱(萃取)的代谢物，所述液体进一步干燥则形成粉末。溶剂优选使用水或稀乙醇。所述药物对于鱼、贝类和动物有显著地激活免疫功能、预防传染性疾病和抵抗环境压力效果，而且对于植物有预防和治疗细菌性疾病和控制虫害的效果。发酵混合物(提取有效成分后)的残余物质含有可发酵的二级原料(如发酵中所用的大豆饼、脆玉米片、稻壳)、物质的消化物、未分解的物质以及芽孢杆菌孢子，其可用作土壤改良剂。

含有苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的所述发酵混合物应用于鱼、贝类或动物的优选的用量为0.5-100mg/lkg(施用对象体重)/天，所述混合物与饲料混合。1至50mg的量更有效，约10mg是最有效的。此外，从培养的细菌中分离(并精炼)的代谢物如肽应用于鱼、贝类或动物的优选的用量为0.05-2mg(特别是0.2-1.0mg)/lkg(施用对象体重)/天，该混合物与饲料混合。

本发明中所称的发酵混合物是代谢物如肽或由包括苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合培养物中获得或产生的任何产物；与在混合培养中所用的可发酵二级原料进行发酵所得的中间产物或残余物；以及芽孢杆菌孢子的混合物。发酵混合物中还可包括可发酵的二级原料(如大豆饼、脆玉米片、稻壳木炭)和其消化物。发酵混合物的特征在于它含有极高密度的代谢物，其基于通过重复繁殖循环(包括孢子的萌发、繁殖和分解及孢子形成)使苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌占主导地位，从而增加在孢子萌发、繁殖和分解及孢子形成之后分泌的代谢物的浓度。

上面所称的产物可包括任何产物(由细菌(苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)和/或其代谢物作用于其它物质而产生)或代谢物之间或其中发生的反应所产生的任何其它产物。

已公知短小芽孢杆菌产生抗菌物质、抗生素和生理活性物质(日本经审查的专利申请No.昭57-6913(1982)和61-12914(1986)以及日本专利No.256479)。还公知苏云金芽孢杆菌产生线虫毒素(日本未审查专利申请No.昭64-67192(1989))。但还未公知苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌应用于或进行混合培养；混合培养产生对鱼、贝类和动物免疫激活、传染性疾病预防及抵抗环境压力有显著效果的高浓度物质；且代谢物有协同作用。此外，还未公知苏云金芽孢杆菌产生激活免疫的物质。

一般，依据其种类，芽孢杆菌在需氧或兼性厌氧条件及适宜其生长的温度和湿度下分解(并吸取)任何营养物(蛋白质、糖、脂质、尿素、尿酸等)，并由于缺乏繁殖条件而形成内孢子，然后分解内孢子变为孢子。孢子在不良环境条件下足够强壮以维持生命，并在出现繁殖条件后萌发，并重复上述过程来增加真菌密度(孢子密度)。细菌代谢以进行繁殖，同时产生代谢物。

苏云金芽孢杆菌具有极好的分解多糖的能力，短小芽孢杆菌具有极好的分解单糖、蛋白质和脂质的能力。因此，将苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌两者应用于混合培养，使得它们共享分解的营养物并互相促进繁殖。出现贫养状态时，呈杆状(或杆)或丝状(或束状)形态的芽孢杆菌灭绝，但残余的苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌孢子维持生命，使得苏云金芽孢杆菌分解并吸取(作为营养物)已死的芽孢杆菌细胞壁、细胞质、孢子废弃外壳等中所含的多糖，而短小芽孢杆菌对分解所提供的单糖和蛋白质有同样作用，两种细菌互助以占据优势。重复繁殖过程之后，细菌及苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌孢子的密度变为10¹⁰-10¹²/g。在贫养状态重复出现的情况下，造成孢子休眠或休养，且密度降至10²-10⁴/g如同正常分布。

本发明的特征是通过使用两种细菌的特性来提供用于鱼、贝类和动物的药物，其中主要含有能有效的激活免疫、预防传染性疾病及改进环境压力耐受性的代谢物，还提供含有所述药物的用于鱼、贝类和动物的饲料。需指出的是，苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌不可能在动物体内萌发及发生作用或对动物产生有害影响(EPA报告，WHO报告等)。另外，经实验确定，芽孢杆菌孢子(保持其状态)仅是通过动物身体。同时，本发明对代谢物进行的分离和精炼，其方式是：使用水、稀乙醇等从本发明发酵混合物中萃取出代谢物，或将通过离子交换色谱法或亲和色谱法得到的级分(具有激活免疫作用)进行或经过“spalose”凝胶过滤。

本发明所指的鱼类可包括所有海鱼和淡水鱼，其中包括琥珀鱼、红海鲷科鱼、河豚、比目鱼、虹鳟鱼、鳝鱼(eel)等。甲壳类动物包括所有种类的虾和蟹或其变种。贝类包括所有种类的贝，包括珍珠贝、牡蛎、扇贝等。此外，传染性疾病是指所有种类的病毒、细菌、真菌和寄生虫引起所有传染性疾病，包括由病毒如虹彩病毒、棒状病毒及由细菌如链球菌、肠球菌、爱德华氏菌、假单胞菌和弧菌病引起的传染性疾病。在本发明中应用的饲料不应有具体限制，但可使用任何依据鱼和贝类的种类可使用的饲料，其形式可为粉末、固体、湿颗粒、干颗粒、EP饲料、活食。对于贝类，一般不使用饲料，可将贝类浸于悬浮有本发明药物的海水中。此外，本发明药物和饲料可应用于公共养鱼池、家庭等生长的以及养殖场所饲养的鱼和/或贝类。

其次，本发明所指动物可包括家养动物(如猪、小猪、牛、小牛)、宠物(狗、猫等)、家禽(雏鸡、公鸡、母鸡、鹌鹑、鸭、公鸭等)、作为宠物的鸟、动物园中饲养的动物等。传染性疾病是细菌性疾病，如猪丹毒、牛和小猪的炭疽病、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、雏鸡白痢，病毒性疾病如猪霍乱、猪日本脑炎、牛Ibaragi病、牛短暂热、雏鸡新城疫以及所有种类病毒、细菌、真菌、和寄生虫引起的那些疾病。在本发明中应用的饲料不应有具体限制，但可使用任何依据家养动物、家禽和其它动物的种类可使用的饲料。

不仅致病菌或病毒引起传染性疾病，而且猪、雏鸡等的不良和拥挤的饲养环境、使用小的笼子的环境压力引起对致病菌的抵抗力降低或降低免疫力都可引起传染性疾病。环境压力会使猪腹泻和咬尾巴，雏鸡会掉羽毛和腹泻。此外，沙门氏菌感染是一个严重问题。作为对应措施，饲养的猪和雏鸡施用了各种药物。与此相反，本发明的药物有抗环境压力的作用，能消除或降低由环境压力引起的现象并大大降低饲养猪、雏鸡等的风险。此外，在猪舍和鸡栏中出现的臭味导致臭味污染的社会问题。本发明发酵混合物(药物)可用于消除猪舍等中的臭味。由于芽孢杆菌和其代谢物等消除了大部分造成臭味的厌氧生物、腐败细菌和致病菌。再者，臭味使得苍蝇大量产生，促进了传染性疾病的发生。本发明发酵混合物含有肽如多肽或环肽和作为有效成分的代谢物，具有杀菌和杀虫作用，防止产生苍蝇并提供了清洁的猪舍、鸡栏等。可见，本发明药物具有提供抗环境压力功能和减少粪便臭味的作用，并能预防和医治致病菌等引起的疾病。另外，可大量减少鸡栏和猪舍中的害虫如苍蝇，且使之不产生或到达该处。1-100mg/lkg体重/天的发酵混合物的剂量是有效的，优选5-15mg/lkg体重/天，最优选8-13mg/lkg体重/天。从发酵混合物中分离并精炼的代谢物或产物可取代发酵混合物，并可以较少的剂量施用。在这种情况下，代谢物如肽和产物(基于以苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合培养物/消化-发酵/洗脱-分离)以与饲料混合的形态的剂量优选为0.04-5mg/lkg鱼或动物体重/天(更优选0.2-1.0mglkg体重/天)。也可以按直接给目标物施用的方式来给药，或先与饮用水、饲料或高档食料混合，普通地与各种饲料混合。

优选以连续的方式每天给药或以多达7天的周期间歇给药。需指出的是，芽孢杆菌在干燥状态(含30％或更低的水分)下不萌发但保持孢子状态。且芽孢杆菌仅是在鱼、贝类和动物体内的消化系统通过，攻击致病菌并因代谢物的极佳功能而高度表达用于肠内疾病的药物，从而该药物能有效地保持和改进鱼和动物的健康，预防和治疗传染性疾病并改进抗环境压力的能力。此外，对于植物的流行病预防和虫害控制来说，制备水溶液(其中含有代谢物等，数量为20-500mg/l)并喷洒在植物上是有效的。实施例(预备实验)确定发酵混合物限制和杀灭致病菌的功能试验方法：使用铂圈取大肠杆菌(O157)a和沙门氏菌b，植入平面培养基中并在无菌恒温器中39℃下培养30天，作为对照组水平。①a｀：取0.1ml溶液(发酵混合物，(缩写为F混合物))0.5g/无菌水10ml，使用均质器均匀混合)并施加在大肠杆菌平面培养基上，在39℃下恒温器中培养三天。②b｀：取0.1ml发酵混合物溶液并施加在沙门氏菌平面培养基上，在39℃恒温器中培养三天。③a＂：取0.1ml上清液(发酵混合物溶液离心6000c/s 15分钟而得，仅含代谢物的产物)并施加在大肠杆菌平面培养基上，以相同方式培养。④b＂：取0.1ml发酵混合物上清液，并施加在沙门氏菌平面培养基上，以相同方式培养。上述平面培养基是以葡萄糖0.8％、营养肉汤(熟肉)0.8％、盐0.6％和琼脂1.5％来制备。试验结果：①a和b分别出现大量大肠杆菌和沙门氏菌菌落，覆盖了平面培养基的全部表面。②a｀和b｀在平面培养基(其上施加了发酵混合物溶液)上没有大肠杆菌和沙门氏菌菌落繁殖，但大量出现苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的菌落。③a＂和b＂仅在部分平面培养基表面(其上施加了发酵混合物上清液)上未出现大肠杆菌和沙门氏菌菌落，但在其余部分分别有大量大肠杆菌和沙门氏菌菌落繁殖。

试验结果表明在②中，苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌杀灭了(与它们的代谢物的功能有关)大肠杆菌和沙门氏菌，并进一步以它们作为营养物进行繁殖，还表明在③中苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的代谢物具有限制或破坏大肠杆菌和沙门氏菌的作用。实施例1-强化鱼的免疫功能试验方法：在各有10条琥珀鱼(平均重量340g)的四组中，对第1、第2、和第3部分或组(本发明)7天内分别给予呈湿颗粒的发酵混合物(含有苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)，数量分别为1、10、和50mg/lkg体重/天。第4部分(对照)给予不含发酵混合物的湿颗粒。在第3和第7天，从各部分中的五条鱼中提取前肾。在塑料盘中分离血细胞，所述盘中具有添加了RPM1-1640-HAH培养基的0.25％NaCl，然后经细胞过滤器获得细胞悬浮液。将该悬浮液Percoll中分层并在4℃下以1,600转/分离心20分钟获得白细胞层。将白细胞层取出，离心洗涤并悬浮在添加有RPM1-1640-H培养基的0.25％NaCl中以将白细胞调整到1.0×10⁷/ml。将白细胞悬浮液500μl和酵母悬浮液500μl(在琥珀鱼血清中调理)(1.0×10⁸/ml)放入玻璃试管中，在25℃下培养(每10分钟搅拌)60分钟。培养后，每条鱼作5个涂片，经瑞特染液染色并密封。使用光学显微镜随机观察每个试样的500个血细胞以计数白细胞吞噬(engloging)的酵母。使用如下公式获得吞噬率、每个白细胞摄入酵母的平均数和吞噬指数。吞噬指数：试验结果：表1可见鱼中(施用发酵混合物3天)的吞噬率、摄入酵母平均数和吞噬指数在10mg、50mg、1mg、和对照组中由高到低排列。在10mg组的吞噬、摄入酵母平均数和包球及在50mg组的吞噬和包球与对照组明显不同。给药7天，1mg组的吞噬、摄入酵母平均数和包球与对照组明显不同。从以上可见，给鱼施用发酵混合物改进了白细胞的吞噬活性。实施例2-强化鱼免疫功能的多重效果试验方法：在各有5条琥珀鱼(平均重量275g)的6个组中，第1至第5部分或组(本发明)在7天内给予定量(预定数量见表2)的呈湿颗粒的来自培养的苏云金芽孢杆菌中如多肽的代谢物和来自培养的短小芽孢杆菌中如环肽的代谢物。第6部分(对照组)给予不含这类代谢物的湿颗粒。在第7天，从各部分的5条鱼中提取前肾。以如实施例1相同的方法，计数白细胞吞噬的酵母以获得吞噬率、每个白细胞摄入酵母的平均数和吞噬指数。试验结果：表2示出了本发明试验组和对照组中获得的吞噬率、摄入酵母平均数和吞噬指数。7天内每天供给鱼苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌代谢物(分别为0.2mg/lkg鱼体重/天)，总量为0.4mg，其吞噬率、摄入酵母平均数和摄入显著高于对照组。此外，同时使用苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的组的具体值高于仅使用苏云金芽孢杆菌或短小芽孢杆菌的其它组。考虑到0.4mg数量的代谢物(苏云金芽孢杆菌0.2mg+短小芽孢杆菌0.2mg)是由约10mg的发酵混合物精炼出的这一事实，提示在实施例1中应用10mg发酵混合物组的琥珀鱼的显著激活的免疫功能是如在发酵混合物中所含的不同肽的代谢物的多重功能所因起的。实施例3-琥珀鱼源于肠球菌的疾病的预防试验方法：在各有20条琥珀鱼(平均重量130g)的六组中，第一、第二和第三部分或组(本发明)每天给予呈湿颗粒的发酵混合物(表3中“混合物”(同样在表1和9-12中)，含有苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)，数量分别为1、10和50mg/lkg鱼体重/天。对照No.1组给予发酵混合物(仅含苏云金芽孢杆菌(BT))，数量为10mg/lkg鱼体重/天，对照No.2组给予相同量的含短小芽孢杆菌的(BP)的发酵混合物。对照No.3组给予不含这类物质的湿颗粒。在第7天，给鱼腹内接种杀鱼肠球菌(Enterococcus seriolicida)(琥珀鱼肠球菌病病因)，数量为每条琥珀鱼7×10⁶以在接种后15天获得死亡率。试验结果：表3示出了在发明和对照组中死亡鱼的累积数和死亡率(接种致病菌后)。同样，图1示出了天数与被肠球菌源病感染的琥珀鱼的存活数和存活率之间的关系。对照No.3组中接种15天后死亡率为75％，第1至第3组(本发明)为10至30％，与对照No.3组有显著区别。由于与1mg和50mg混合物组相对比，第2组(混合物10mg)的死亡率明显低，发酵混合物的最佳剂量推断为约10mg/lkg鱼体重。10mg混合物组的死亡率显著低于仅使用10mg苏云金芽孢杆菌或短小芽孢杆菌的组。这推断是因为由混合培养的苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌之间相互反应所获得的代谢物(如肽)达到激活(以其多重功能)鱼的免疫功能所适宜的数量而造成。相应的，察觉到本发明改进了鱼的免疫功能，有效地防止了鱼被致病菌感染。实施例4-发酵混合物限制和杀灭致病菌试验方法：使用大型养鸡场内不再使用的两个小的旧鸡舍(各容纳1200只鸡)，检测发酵混合物的恰当剂量和可获得的效果。在鸡舍A中的1200只鸡(白来亨鸡)按普通方式饲养，为对照组，在鸡舍B中的1200只白来亨鸡配给混有发酵混合物(由苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌组成的混合培养物)的饲料。对A和B鸡舍在18个月试验期内剂量为分组1-6。

分组1：    发酵混合物    1mg/lkg体重/天

分组2：    发酵混合物    10mg/lkg体重/天

分组3：    发酵混合物    20mg/lkg体重/天

分组4：    发酵混合物    30mg/lkg体重/天

分组5：    发酵混合物    50mg/lkg体重/天

分组6：    发酵混合物    100mg/lkg体重/天试验结果：表4列出了在所述分组(本发明)和对照组中平均体重、产蛋率、传染病发生、掉毛和恶臭情况。显而易见，在鸡舍A中(对照组)的鸡有腹泻、污秽、掉毛和皮肤完全暴露的情况，且产蛋率大幅度下降。这推断为由环境产生的压力所致。此外，生长不均衡。相反的是，在鸡舍B中的鸡分组自2-6的组无感染、掉毛和污秽，状况良好。生长状况同样良好且以高产蛋率平稳产蛋。分组2和3组特别优异。蛋黄不易破，蛋壳坚硬，这推断为是在发酵混合物中所含的肽改进了对Ca的吸收所导致。此外，在鸡舍B中无苍蝇产生。

由试验结果可见，在鸡粪中的芽孢杆菌分解(并吸收)恶臭组分以及未消化的营养物，限制了腐败菌和致病菌，或使其消失。将鸡粪稀释并在实施例1中所用的平面培养基上培养，使用相差显微镜测量产生的菌落，其中观察到苏云金芽孢杆菌3×10⁸/gr和短小芽孢杆菌5×10³/gr。芽孢杆菌对生命物质无害且使鸡的肠内菌结构优化。还可清楚地看到，发酵混合物的剂量水平为10-20mg/lkg体重/天足够有效。实施例5-养猪的效果(芽孢杆菌对葡萄球菌的作用)初步研究：患严重传染病如猪霍乱的猪。提取被造成发烧和急性腹泻的传染病感染的猪舍中的粪便，并将1g粪便(湿)在100ml无菌水中稀释并作为致病菌种体培养。在含有0.8％肉汤(熟肉)、0.8％葡萄糖、0.6％盐和1.5％琼脂的平面培养基(对照组)中殖入所述菌种体。在平面培养基上施加在实施例1中使用的发酵混合物上清液和发酵混合物溶液，随后在无菌装置中39℃下培养3天。使用相差显微镜观察产生的菌落，同时按其性质分类。

表5列出的试验结果，表明在发酵混合物中所含的代谢物对葡萄球菌非常有效，殖入的芽孢杆菌破坏或限制了葡萄球菌的繁殖。在从猪舍中获得的粪便中也观察到链球菌，但在分别使用发酵混合物上清液或同类物质溶液的分组中未观察到。实施例6-养猪效果试验方法：在4只猪笼(每只30m2)中各放入10头猪(各为2月龄)。笼No.1为普通组，其中在3月内每天供给通常的配方饲料，笼No.2在3月内每天配给混有发酵混合物10mg/lkg体重/天的饲料，同上笼No.3其饲料混有发酵混合物20mg/lkg体重/天，笼No.4的饲料中混有发酵混合物50mg/lkg体重/天。试验结果：在表6中可见，给予发酵混合物的分组没有任何传染病，猪生长充分。未观察到尾巴缺损(猪由环境压力而咬尾巴)且在猪舍中未有苍蝇产生，提供了适宜的养猪环境。通过稀释-培养分析来对各笼中的粪便进行细菌检测。笼No.1(对照组)有致病大肠杆菌(或大肠杆菌致病变种)，而芽孢杆菌未大量繁殖为3×10³/gr。笼No.2-4未发现任何致病大肠杆菌，检测到的芽孢杆菌为苏云金芽孢杆菌8×10⁸/gr和短小芽孢杆菌17×10⁸/gr。在停止配给发酵混合物后持续观察两月未出现传染病，表现出免疫功能的明显改进。实施例7-发酵混合物有效组分的提取试验方法向发酵混合物中添加稀释的乙醇或水，随后通过超声或渗透混合以溶解并萃取代谢物(如肽)或产物，发酵混合物的活性组分。使用离心或膜过滤来对代谢物或产物进行固/液分离。含有代谢物(溶解的肽)或产物的液体、或在低温下蒸发并干燥液体得到的粉末直接或以与饲料混合的形式给动物或植物施用，或者直接喷洒到动物或植物感染皮肤病的任何部位等来治疗细菌性疾病或预防及驱除有害昆虫。

在这一实施例中，在第3过程中(其中芽孢杆菌占优势)及在消化过程中(细菌数目下降)的发酵混合物称重100g，随后添加500ml乙醇(1∶3)并在超声箱(50KHz)中洗脱15分钟。将洗脱物保存在独立的烧瓶中，再次添加50ml乙醇和150ml蒸馏水并在超声箱中洗脱。重复相同的操作后，用蒸馏水将洗脱物洗出使总体积为1L，再进一步离心(1000G×15分钟)以分离成固体和液体，如果洗脱物在液体的上部。

将100ml洗脱物置于蒸发皿中并在恒温器中在45℃下干燥，对在蒸发残余物中的代谢物如肽及发酵混合物定量分析得到如下结果。

第3过程        6.90％

消化过程       8.36％

可见，发酵混合物含有很高的代谢物(如肽)及任何产物。此外，当滴加酸使呈酸性时，洗脱物(有高透明度且不含沉淀和悬浮物)有蛋白质快速凝固并沉淀。这确证在洗脱物中溶有蛋白质，且同时可推断沉淀的是较高分子量的蛋白质而不是低分子量的蛋白质。再有，低分子量的肽被溶解。实施例8-保持鸡的健康并排除恶臭的洗脱组分的剂量

在初步实验中确证活性组分杀灭沙门氏菌的基础上，清楚可见发酵混合物的活性或有效组分具有消灭致病菌功能这一事实。构想采用该消灭致病菌的功能来预防和治疗动物和植物的细菌性疾病。在养有4000只鸡的大型鸡舍中，给鸡施用稀释的洗脱物来保持其健康和排除鸡舍中恶臭(由腐败菌所引起)。

具体来说，鸡舍中的每排笼设置5组，自开始喂养雏鸡时起三月内在饮用水中给予稀释的洗脱物。分组为对照组(自来水)、和实验No.1(发酵混合物洗脱上清液，0.5kg/m³)、No.2(发酵混合物洗脱上清液，1kg/m³)、No.3(同上，3kg/m³)和No.4(5kg/m³)。在各分组中在饮用水中洗脱组分的浓度为对照组0ppm、实验1组38ppm、实验2组75ppm、实验3组225ppm、实验4组375ppm。乙烯基塑料隔板将对照组与实验组隔开。

表7列出了试验结果。可见发酵混合物中的洗脱组分(代谢物如肽或基于代谢物的任何产物)防止了疾病发生并排除了有害昆虫如苍蝇，以保持雏鸡健康。在对照组中鸡舍内外散发浓烈恶臭，从而不可避免的需要防护面罩和眼镜以进入鸡舍。再有，通常有大量苍蝇产生，在这种不良环境中饲养的鸡有潜在的危险。相反，实验组未产生苍蝇和出现恶臭，雏鸡一直保持健康。从试验结果还可看出，含有38ppm或更高洗脱组分的饮用水表现出高的效果。在对照组中的雏鸡在饲养中接种疫苗。实施例9-配给洗脱组分来预防猪流行病试验方法：在4只笼(各为30m²)中各放入猪(平均体重10.5kg)，见表8，进行60天的饲养试验。为配给洗脱组分，将10g发酵混合物预先在100L水中洗脱，将上清液保存在罐中，每天应用于实验组(混于饲料中)。所述洗脱物含洗脱组分6.9g/l。

表8列出了试验结果。证实每天配给少量的洗脱组分可预防传染病并改进免疫功能。在对照组中，大量出现推断由环境压力造成或引起的行为，食欲改变(减少或增加)，猪之间争斗，嚎叫增加，重复发生腹泻并应用抗生素，生长不均一。在实验组中，未发现由于过度拥挤状况下饲养而产生的应激反应，可见洗脱组分具有抗环境压力作用。再有，在对照组中在猪粪和原污水中检测到链球菌，但在实验组中未检测到(稀释培养物10²)。此外，实验组中的猪舍中恶臭降低或大大改善。实施例10-对鱼的抗环境压力作用试验方法：在各有10只青鱼(black carp)的三组中(平均重量240g)，第1组(本发明)在20天内在饲料中给予数量为10mg/lkg体重/天的发酵混合物(苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)。第2和第3组(对照组)给予无发酵混合物的饲料。第1和第2组在20天中经水温改变造成环境压力，第3组保持恒定水温25℃。即，第1和第2组在20天中每12小时经受水温改变为25至30℃、30至25℃、25至20℃20至25℃、和25至30℃的环境压力。之后，从青鱼心脏中取血测量红细胞、血细胞比容和血色素来测试水温改变的环境压力的生理影响。试验结果：表9列出了试验组(本发明)和对照组中施加水温改变的环境压力后的红细胞、血细胞比容和血色素。已公知当鱼经受水温改变的环境压力时会改变血液状态。在给青鱼高度施加环境压力20天后，第2组(对照组)受环境压力作用红血球、血细胞比容和血色素降低，表现出贫血。相反，试验组(本发明)表现出与未受环境压力作用的第3组相同的血液状态。显而易见，本发明发酵混合物不仅改进了鱼的免疫功能，而且对鱼有抗环境压力功能。实施例11-强化龙虾的生物防御试验方法：在各有10只对虾的四组中(平均重量25g)，第1、第2和第3组(本发明)在7天内在饲料中分别给予数量为1、10和50mg/lkg重量/天的发酵混合物(苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)。第4组(对照组)给予无发酵混合物的饲料。7天后，由注射器(具有K-199培养基，含抗凝血剂L-半胱氨酸)从对虾的胸腔取血，离心分离获得血细胞。悬浮液(具有血细胞5×10⁵/m1)与胶乳珠(1×10⁸，直径1.986μm)混合使之在25℃下反应30分钟，随后使用戊二醛固定，洗涤并在空气中干燥，然后在载玻片上进行吉姆萨氏染色和固定。每只对虾制作5个试样，使用外照明荧光显微镜随机观察每个试样的200个血细胞以计数包入胶乳珠的血细胞。按与实施例1相同的公式得到吞噬率、每个血细胞获取的胶乳珠的平均数和吞噬指数。试验结果：由表10可见，与对照组对比，本发明组中的对虾(在7天中给予发酵混合物)的吞噬率(被对虾血细胞)、获取的平均胶乳珠数和吞噬指数高，具有显著差异(P＜0.05)。在本发明组中10mg组的吞噬激活最高，50mg组高，1mg组低，该特征与对鱼的白细胞的作用相同。由上可见，给对虾施用发酵混合物激活了血细胞的吞噬。实施例12-预防对虾急性病毒血病试验方法：在各有20只对虾的四组(平均重量8.5g)中，第1、第2和第3组(本发明)在17天内在饲料中分别给予数量为1、10和50mg/lkg重量/天的发酵混合物(苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)。第4组(对照组)给予无发酵混合物的饲料。

在开始配给发酵混合物后的第8天，使用PRDV(对虾杆状DNA病毒)进行攻击或侵袭试验，所述PRDV是对虾急性病毒血症的病因，其应用方式是，将3只死于该病的对虾(各约10g)的头胸部甲壳剥下并在40ml灭菌的海水中匀浆，随后离心(10,000×g,10分钟，4℃)获得上清液，将1ml上清液添加到21海水中，将对虾(已给予发酵混合物8天)浸入该海水中两小时以经受侵袭。观察进行攻击10天后死亡的发生，并对死亡的对虾用PCR方法和病理检测以确证由PRDV致死。试验结果：表11列出了本发明试验组和对照组在PRDV攻击后累积死亡对虾数和死亡率。图2是天数与被PRDV感染的对虾的存活数及存活率的关系图。在被PRDV攻击后，对照组中的对虾在10天后100％死亡。相反，本发明的死亡率为，发酵混合物10mg组15％,50mg组30％,1mg组35％，与对照组有显著差异(P＜0.05)。由于发酵混合物10mg组的死亡率低于1mg和50mg组，对于虾的发酵混合物最佳剂量推断为约10mg/lkg重量，与鱼相似。可见，本发明物质改进了虾的生物防御功能并防止了虾被病毒感染。实施例13-对虾的抗环境压力功能试验方法：使用在底部具有沙子(高度5cm)且在下部有过滤器和通气设备的三个水箱(容积：60×40×30cm³)，在第1和第2组中各放入40只对虾(各平均重量15g)，在第3组中放入20只。第1组在1月中每天在饲料中给予发酵混合物(含苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)，数量为10mg/lkg虾重量/天。第2和第3组给予无发酵混合物的饲料。在所有试验组中饲养虾的水温为23±1℃。饲养1月后，在各试验组的10只对虾的胸腔中取血，通过xylidyl bluemethod(Magnesium B Kit,Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)测量在血淋巴中的镁离子浓度。试验结果：表12列出了在本发明试验组和对照组中施用过度拥挤的环境压力之前和之后在血淋巴中的镁离子浓度。已公知经受环境压力的虾的血淋巴中镁离子浓度增加。对虾由于过度拥挤而经受环境压力，第2组(对照组，施加环境压力)镁离子浓度明显增加，而本发明(发酵混合物10mg组)保持低浓度的镁离子，其浓度与未施加环境压力的第3组相似。可见，本发明的发酵混合物改进了虾的生物防御功能而且还给对虾提供了抗环境压力功能。实施例14-牡蛎病毒性疾病的预防试验方法和试验结果：将含苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的发酵混合物以2％的浓度分散并溶解于海水中。将各装有10只牡蛎(两年龄，总共50只)的五个箱笼浸入该海水中60分钟，然后返回试验饲养筏。在3月内每周重复该操作1次。将两只牡蛎(死于病毒性疾病)放入设置试验饲养筏的海水箱中。在箱笼中的牡蛎几乎未出现病毒性疾病，死亡率为2％(1只牡蛎)。相反，浸于海水箱中用作对照组(如上所述，未应用发酵混合物)的各装有10只两年龄牡蛎的相同五个箱笼(总数50只)中发现14只牡蛎死亡(死亡率28％)。实施例15-给植物应用洗脱组分来控制虫害

在实施例9中施用的洗脱物用水稀释10倍，使用喷雾器喷洒在植物上来消除害虫和致病菌，使植物恢复健康。在7天内每天早晨在日本杏树上(已大量产生植物白虱和树叶包卷)喷洒稀释的洗脱物(1L/3.3m²)，可见害虫明显衰退和减少。再继续喷洒7天，植物白虱和树叶包卷消失，树恢复健康。冬天三次在感染介壳虫(scales)的紫薇(Crape myrties)上喷洒石硫合剂，但未完全清除害虫，在夏季产生介壳虫并出现炭疽病。在植物根部周围施用发酵混合物并在躯干、枝权和枝叶上喷洒稀释的洗脱物15天，从而使植物完全排除了介壳虫，并由炭疽病康复。

对于蔬菜，感染了根肿病的农田通常通过焚烧农田或喷洒杀菌剂或抗生素来消毒，但难以恢复。在感染根肿病的农田喷洒发酵混合物，并通过农用拖拉机来使土壤与发酵混合物混合。此外，施用有机肥料并种入卷心菜秧苗。用喷雾器以1L/10天/10m²的数量喷洒稀释的洗脱物直到收获时间，未出现根肿病。此外，进行土壤细菌试验，发现根肿病消失。此后，在同一农田种植大白菜秧苗(未消毒)，并每月喷洒稀释的洗脱物2次，未发生根肿病。

对于园艺，发酵混合物可有效的用于控制和排除各种有害昆虫和消灭各种致病菌。例如，通过喷洒给受黑霉破坏的大丁草施用稀释的洗脱物达到100％康复。发酵混合物还表现出对玫瑰有消灭霉粉和植物黑斑病病菌的作用。可预防认为难以生长的非洲紫苣苔(saintpaulias)其被疾病感染并使之良好的生长。这些效应可认为是来自发酵混合物有效或活性组分消灭害虫和细菌及改进植物免疫功能的事实。

如上所见，本发明涉及用于鱼、贝类和动物的药物，其中含有获自苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌混合培养物的代谢物的有效组分如肽或由其产生的任何产物，还涉及混合有该药物的鱼、贝类和动物饲料。另外，由发酵混合物萃取或洗脱的有效组分(代谢物如肽，或由其产生的任何产物)可适用于喷洒在植物上来排除和消灭害虫和细菌并改进免疫功能。

基于由混合培养苏云金芽孢杆菌和短小芽孢杆菌所获得的发酵混合物中所含的代谢物如各种不同的肽所表现的多重作用，该药物对鱼、贝类和动物可提供相当优异的激活免疫功能、预防传染病和提供抗环境压力作用的效果。此外，还发现连续施用发酵混合物或其有效组分使得免疫功能增加的生命物质可在一定的时间内保持其获得的免疫功能。因而，本发明在防止传染病和死亡方面对鱼、家禽和其它动物饲养领域有很大贡献。

本发明药物在很小的剂量下具有激活免疫、预防传染病和抗环境压力的优异效果，费用低，无须使用昂贵的通用抗菌素。此外，该药物还具有各种优点，如可应用于各种类型的饲料，可简易的添加到饲料中并可有效的给所饲养的鱼、贝类和动物饲喂。

【表1】

(实施例1)

施用混合物天数试验组  吞噬(％)摄入酵母(平均) 吞噬 3天1mg 21.9±3.051.9±0.70 9.1±2.3610mg 33.1±2.63※2.5±0.52※ 27.4±2.73※50mg 30.7±4.02※2.1±0.64 19.8±3.06※对照 19.6±3.161.8±0.51 6.9±2.51 7天1mg 31.9±4.13※2.6±53※ 26.5±2.91※10mg 38.5±3.30※3.0±0.46※ 44.5±4.12※50mg 27.2±3.60※2.2±0.38 16.3±2.44※对照22.3±4.27 1.9±0.60 9.4±2.08※p＜0.05：与对照组有显著差异。 【表2】(实施例2)试验组 吞噬(％)摄入酵母(平均) 吞噬第1组：苏云金芽孢杆菌0.2mg+短小芽孢杆菌0.2mg 36.4±2.98※2.9±0.33※ 38.4±4.06※第2组：苏云金芽孢杆菌0.2mg 26.5±3.72 1.9±0.55 13.3+2.93※第3组：苏云金芽孢杆菌0.4mg 30.2±4.11※ 2.3+0.72 21.0±3.17※第4组：短小芽孢杆菌0.2mg 22.9±3.36 1.8±0.61 9.4±2.13第5组：短小芽孢杆菌0.4mg 25.3±3.76 2.0±0.47 12.8±2.05※第6组：对照，未施用混合物 20.7±3.24 1.7±0.63 7.3±204※P＜0.05：与对照组有显著差异。 【表3】(实施例3)试验组接种后天数1  2  3  4  5  6  7  8  9 10 11 12 13 14 15死亡(％)第1组：混合物1mg         1※2  2  2  3  3  5  5  5  5  5  6 30※※第2组：混合物10mg            1  1  1  1  1  2  2  2  2  2  2 10※※第3组：混合物50mg      1  1  1  2  2  4  4  6  6  6  7  7  7 25※※对照No.1BT10mg            1  1  4  4  4  4  5  5  6  6  8 35※※对照Bo.2BP10mg            1  1  4  4  4  4  5  5  6  6  8 40※※对照未施用         2  3  5  5  8  9  9  9 11 14 15 15 75※累积死亡※※P＜0.05：与对照No.3有显著差异。 【表4】(实施例4)分组 平均重量 12～18月平均产蛋15～18月平均产蛋第7月感染掉毛恶臭对照组 1.46±0.18kg 75％69％腹泻多多B组1 1.46±0.08kg 75％70％无少无组2 1.45±0.04kg 92％90％无无无组3 1.455±0.04kg 90％88％无无无组4 1.44±0.06kg 88％85％无无无组5 1.47±0.08kg 85％86％无无无组6 1.47±0.10kg 80％82％无少无 【表5】(实施例5)分组葡萄球菌链球菌芽孢杆菌对照高高-上清液消失消失-溶液消失消失高 【表6】(实施例6)感染平均重量差尾巴缺损污秽恶臭 No.1 25.6kg 3严重NH₃ 25PPM No.2无2.6kg无清洁无(NH₃ 5PPM或更少) No.3无2.2kg无清洁无(NH₃ 5PPM或更少) No.4无0.8kg无清洁无(NH₃ 5PPM或更少) 【表7】(实施例8)分组萃取感染药物恶臭等级苍蝇健康A对照组 0ppm掉毛，腹泻抗菌素5大量产生一般B实验l 38ppm无无1无好实验2 75ppm无无1无好实验3 225ppm无无1无好实验4 375ppm无无1无好 【表8】(实施例9)箱笼No.猪数应用感染药物环境压力1 10 0mg/猪/天腹泻抗生素食欲改变2 20 0mg/猪/厌腹泻抗生素反复腹泻等3 10 5mg/猪/天无无无4 20 10mg/猪/天无无无 【表9】(实施例10)试验组红细胞(×10⁴/mm³)血细胞比容(％)血色素(g/100ml)第1组：混合物10mg，环境压力188±9.3※ 40.2±3.31※ 9.4±0.56※第2组：对照，环境压力147±11.5 31.5±3.69 7.1±0.74第3组：对照，温度196±7.2 42.3±3.22※ 9.8±O.51※※P＜0.05：与第2组有显著差异。 【表10】(实施例11)试验组 吞噬(％)摄入胶乳珠(平均)吞噬第1组：混合物1mg 59.6±1.27※ 3.5±0.26※124.3±7.72※第2组：混合物l0mg 66.3±2.01※ 3.9±0.30※171.4±10.13※第3组：混合物50mg 61.8±2.32※ 3.4±0.21※129.9±12.06※第4组：对照 42.5±1.76 2.8±0.2550.6±8.35P＜0.05：与对照组有显著差异。 【表11】(实施例12)试验组    PRDV侵袭后天数1  2  3  4  5  6  7  8  9 10死亡(％)第1组：混合物1mg   1※1  3  3  4  4  5  7  7 35※※第2组：混合物10mg         1  1  1  2  3  3  3 15※※第3组：混合物50mg   1  1  2  2  5  5  6  6  6 30※※第4组：对照1  2  5  8 10 13 15 18 20 20 100※累积死亡数※※P＜0.05：与对照组有显著差异。 【表12】(实施例13)测量血淋巴中镁离子(mg/dl)第1组：(环境压力，混合物10mg)第2组：(环境压力，对照)第3组：(无环境压力，对照)在施加环境压力前15.6±1.72 15.2±2.03 15.9±2.15在施加环境压力后17.3±3.05 22.7±4.06※ 16.4±2.28数值为累积死亡数。※P＜0.05：与第1和第3组有显著差异。