甲胎蛋白基因表达的调控序列及其应用

摘要

本发明构建的1.7kb基因表达调控序列ATrAFP,它只在AFP阳性人肝癌细胞中具有较高活性,而在非肝正常细胞、正常肝细胞、AFP阴性肝癌细胞均无活性,可望用于这部分肝癌病人的基因治疗。

说明书

DNA是生物遗传信息的携带者，DNA上面有成千上万个基因，这些基因决定着生物的各种具体形状特征。从DNA和蛋白质的分子水平上说，基因表达包括了基因转录、转录产物的加工、转录物mRNA转译为蛋白质和蛋白质转译后加工等主要过程。这些过程调节与控制着生物的发育、代谢、分化、反应性、老化和病变等生命现象。因此，对基因表达调节控制的研究，在理论上可以阐明各种生命现象的过程和机制，在实践上可以应用于改良生物品种、研制基因工程产物和利用基因治疗技术治疗人类疾病。

癌症是危害人类健康与生命的最严重疾病之一。其中，肝癌又是死亡率最高的一种癌症。尤其是中晚期肝癌患者，失去手术切除病灶的可能，基本上处于等待死亡的状况。研究表明，用基因治疗技术可以杀伤肝癌细胞，从而缓解肝癌症状并延长患者生命。但是，如何在基因治疗过程中只是专一地杀伤肝癌细胞，提高治疗效果；而不损害正常的肝脏细胞，避免毒副作用，也就是说，使治疗基因有控制地表达，是基因治疗中必须解决的一个普遍性难题。本发明将基因表达调节控制这个生命科学的理论研究课题与肝癌的基因治疗这个应用研究问题相结合，设计并构建了一个能使治疗基因在肝癌细胞中专一表达的DNA元件。

本发明的原理在于：甲胎蛋白(AFP)是一个在哺乳动物胚胎发育过程中受到严格调节控制的蛋白质。它是胎儿的主要血浆蛋白，出生后则逐渐减少。但是，患肝癌时，癌细胞中afp基因又高度表达。所以，有70～98％肝癌患者是AFP阳性的。这说明，肝癌细胞中有调节控制afp基因表达的机制存在。因此，AFP成为诊断肝癌的一个重要指标。

同时，这也提示，利用afp基因调控机制就有可能使治疗基因专一地在肝癌细胞中表达，产生出杀伤癌细胞的基因产物，而对正常细胞不会有毒害作用。有研究表明[Wen，P.et al.，1991，1993；Groupp，E.R.et al.，1994]，甲胎蛋白基因的表达除受到基因表达调节元件启动子和增强子的控制外，还受到沉默子的调节。沉默子位于启动子与增强子之间，当基因表达调节蛋白与沉默子结合时，就阻碍了转录因子与启动子和增强子的相互作用，而阻抑基因表达。所以，沉默子是afp基因的一个负调节元件，它在甲胎蛋白基因的发育性阻抑中起重要作用，而在AFP阳性的肝癌细胞中不起作用。如果把治疗基因置于这个元件的调控之下，就有可能使治疗基因只在AFP阳性的肝癌细胞中表达，产生对细胞有毒性的基因产物，杀伤肿瘤细胞，而不会影响正常细胞。但是，具有肝癌专一性的AFP基因上游调控序列太长，约有7kb，而目前许多基因表达载体包括在基因治疗中广泛使用的病毒载体(如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等)无法容纳7kb的基因调控序列，因此，AFP基因调控序列的应用受到了一定的限制。

根据已发表的7kb大鼠AFP基因表达调控序列[Buzard，G.et al.，1990]，我们用聚合酶链反应(PCR)技术从SD大鼠肝中克隆了含启动子、沉默子的片段rAFP(-9l1bp/+1bp)，从人肝癌组织基因组DNA中克隆了具有肝专一活性的α1-AT(胰蛋白酶抑制剂)基因的增强子AT(-755bp/-37bp)。经DNA序列测定证明无误后，将这两个片段连成一个1.7kb的基因表达调控序列ATrAFP，置于CAT报告基因之前，装入质粒pBluescript，形成哺乳动物细胞表达质粒ATrAFP-pCAT。将ATrAFP-pCAT分别转入人非肝细胞Hela、原代培养人成纤维细胞、人肝细胞株L-02、原代培养肝细胞、AFP阴性人肝癌细胞株SMMC7721、AFP阳性入肝癌细胞株HepG2及AFP阳性原代培养人肝癌细胞LTNM4，经CAT分析，CAT报告基因仅在AFP阳性人肝癌细胞株HepG2及AFP阳性原代培养人肝癌细胞LTNM4中获得较高水平的表达，而在其他细胞中均不表达。

实验结果表明：本发明构建的1.7kb基因表达调控序列ATrAFP(见图1)的专一性很好，只在AFP阳性人肝癌细胞中具有较高的活性，而在非肝正常细胞、正常肝细胞、AFP阴性肝癌细胞中均无活性。由于70％原发性肝癌病人的AFP水平明显升高，因此，ATrAFP可望用于这部分肝癌病人的基因治疗，以期获得治疗基因在肝癌细胞中的专一性表达。提高对肝癌细胞杀伤的针对性，尽可能降低对正常细胞尤其是肝细胞的毒副作用。

综上所述，本发明构建的ATrAFP基因表达调控序列具有以下特点：

1、7kb的AFP基因调控序列无法应用于多种基因表达载体包括在基因治疗中广泛使用的病毒载体(如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等)。而本发明构建的ATrAFP基因表达调控序列长度仅1.7kb。可望用于这些病毒载体。

2、保持了特异性并具有较高活性。即只在AFP阳性人肝癌细胞中有活性，而在非肝细胞(如Hela、原代培养人成纤维细胞)、肝细胞(如肝细胞株L-02、原代培养肝细胞)、AFP阴性人肝癌细胞(SMMC7721)中均无任何活性。在AFP阳性人肝癌细胞株HepG2及原代培养人肝癌细胞LTNM4中的活性分别为SV40强启动子的157.3％和56.5％。

本发明可通过下述的实施例来具体描述，当然不应理解它的权利要求仅限于此。

实验材料说明：

1.试剂：限制性内切酶，T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶及PCR试剂盒，λ/HindIII及100bp DNA分子量标准，CAT报告基因检测试剂盒，β-半乳糖苷酶检测试剂盒购自Promega公司；¹⁴C-氯霉素，DNA测序试剂盒购自Amersham；细胞转染用脂质体试剂Lipofectin、LipofectAmine，Genomic DNA抽提试剂DNAzol，细胞培养液DMEM、RPMI1640，肝细胞培养液、肝细胞贴壁液，小牛血清(NCS)，胎牛血清(FBS)为LifeTechnologies公司产品；其余为国产分析纯试剂。

2.质粒与菌种：pBluescript购自Stratagene；CAT报告基因阴性对照质粒pCAT-Basic、CAT报告基因阳性对照质粒pCAT-Control购自Promega；克隆用菌种DH5α购自Life Technologies公司。

3.细胞株与动物：人宫颈癌细胞株Hela，人肝癌细胞株HepG2为本组保存；大鼠肝细胞株BRL-3A，人肝细胞株L-02，大鼠肝癌细胞株CBRH7919，人肝癌细胞株SMMC7721均购自中科院上海细胞所细胞库。SD大鼠及Balb/C小鼠购自中科院上海实验动物中心；表达甲胎蛋白的人肝癌裸鼠模型LTNM4由上海医科大学肝癌研究所提供。

附图说明：

图1是ATrAFP基因序列。共1706bp(718bp AT增强子+910bp rAFPsilencer和promoter+78bppolylinker区(加下划线))。

图2是ATrAFP-pCAT质粒结构示意图。

图3是质粒ATrAFP-pCAT酶切鉴定图。

A. λ/HindU III DNA分子量标准。

B. ATrAFP-pCAT用限制性内切酶Sma I+BamH I切出0.72kb的AT片段及0.9kb的rAFP片段。

C. ATrAFP-pCAT用限制性内切酶Sma I切出1.7kb的ATrAFP调控片段。

实施例1.PCR反应制取基因表达调控片段：

用Genomic DNA抽提试剂DNAzol从SD大鼠肝组织中抽提出大鼠的gemomic DNA。以大鼠肝细胞genomic DNA作模板，用PCR反应制取含大鼠甲胎蛋白(α-fetoprotein)基因启动子及沉默子的片段rAFP(-911bp/+1bp)[Buzard，G.et al.，1990；Wen，P.et al.，1991]，5′引物：5′GAGGGATCCAATGCCCTCTTC，3′引物：5′TATCCCGGGATACTGTGAGCAGTAGCGCT3′，反应条件为94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，30个循环。PCR产物经Sma I+BamH I酶切，Klenow酶补平后，克隆入pUC19之Sma I位点。

用Genomic DNA抽提试剂DNAzol从人肝癌细胞株SMMC7721中抽提出gemomic DNA。以人肝癌细胞株SMMC7721的genomic DNA作模板，PCR反应制取含人胰蛋白酶抑制剂(α1-antitrypsin)基因增强子的片段AT(-755bp/-37bp)[De Simone，V.et al.，1987；Ciliberto，G.et al.，1985]，5′引物：5′TCTGGATCCGTGTGCCAGGCACTTCACCCGAG 3′，3′引物：5′AGTGGATCCAGAGGGGCAACGGG3′，反应条件为94℃1分钟，60℃1分40秒，72℃1分30秒，30个循环。PCR产物经BamHI酶切，克隆入pUC18之BamHI位点。

实施例2.拼接基因表达调控元件并连接CAT报告基因：

用分子克隆的手段将含α1-antitrypsin基因增强子的片段(AT)放在含大鼠甲胎蛋白基因启动子及沉默子的片段(rAFP)的上游，连成一个1.7kb的基因表达调控序列ATrAFP，经DNA序列测定，证明无误(见图1)。将ATrAFP置于CAT报告基因之前，装入质粒pBluescript，形成哺乳动物细胞表达质粒ATrAFP-pCAT(见图2)。存放标志：Escherichia coli SIB-203-4AT-rAFP-pCAT(CCTCC NO：M97002)用限制性内切酶Sma I可切出1.7kb的ATrAFP调控片段，限制性内切酶Sma I+BamH I可切出0.72kb的AT片段及0.9kb的rAFP片段(见图3)。

实施例3.细胞培养：

人宫颈癌细胞株Hela，人肝癌细胞株HepG2及SMMC7721培养于含10％小牛血清的DMEM培养液。大鼠肝细胞株BRL-3A，大鼠肝癌细胞株CBRH7919，人肝细胞株L-02培养于含10％小牛血清的RPMI1640培养液。原代大鼠肝细胞按文献[Lobo-Alfonso，J.，1995]方法从成年SD大鼠肝中制备，在含5％胎牛血清的肝细胞贴壁液中贴壁6小时后，换肝细胞培养液继续培养。原代培养人肝癌细胞LTNM4制备方法：将取自荷瘤裸鼠皮下表达AFP的LTNM4瘤块剪成小碎块，培养于含5％胎牛血清的肝细胞贴壁液，12小时后换液。原代培养人成纤维细胞制备方法：将病人手术废弃物中的小块皮肤剪碎，培养于含20％胎牛血清的DMEM培养液。

实施例4.基因转染：

采用脂质体法将质粒ATrAFP-pCAT分别转入各种细胞。Hela、HepG2、SMMC7721、LTNM4等细胞采用LipofectAmine试剂，六孔板每孔分别铺1.5×10⁵、4×10⁵、2.5×10⁵、4×10⁵个细胞。BRL-3A、CBRH7919、L-02、大鼠原代肝细胞等采用Lipofectin试剂，六孔板每孔分别铺2.5×10⁵、2.5×10⁵、2.5×10⁵、8×10⁵个细胞。24小时后，按脂质体试剂的使用方法转基因，DNA量为1μg，脂质体试剂用量为6-9μl，转染时间6-10小时。转染后48小时，用细胞刮棒将细胞刮下，分别检测CAT及β-半乳糖苷酶活性。每种细胞转染时，以含CAT报告基因质粒pCAT-Basic、pCAT-Control作为阴性及阳性对照。在转染各种CAT表达质粒时，共转染β-半乳糖苷酶表达质粒CMVβ作为内参照，通过测定β-半乳糖苷酶活性来消除由转染效率、细胞数及后处理过程所照成的CAT表达差异。

实施例5.ATrAFP基因表达调控序列的专一性和活性测定：

(1).CAT分析：按CAT报告基因检测试剂盒(Promega公司)说明进行。

(2).甲胎蛋白检测：细胞长满单层后换新鲜培养液，24小时后取出培养上清，送上海医科大学中山医院检验科按放射免疫法(李长生等，1989)测定。

CAT结果表明，本发明构建的ATrAFP基因表达调控序列在两种甲胎蛋白强阳性的肝癌细胞株HepG2及原代培养肝癌细胞LTNM4中均有较强的活性，强度分别为SV40启动子的157.3％和56.5％。而在不产生甲胎蛋白的非肝细胞如原代培养人成纤维细胞、人宫颈癌细胞Hela中没有活性；在不产生甲胎蛋白的肝细胞(如大鼠肝细胞株BRL-3A、原代培养大鼠肝细胞、人肝细胞株L-02)中也没有活性。甚至在某些肝癌细胞(如大鼠肝癌细胞株CBRH7919、人肝癌细胞株SMMC7721)中，若甲胎蛋白不产生，则该表达调控列亦无活性。这些结果表明，ATrAFP基因表达调控序列具有很好的在肝癌细胞表达的专一性及较强活性。

                 ATrAFP基因表达调控序列的专一性和活性。

    细胞类型甲胎蛋白表达^(注1)ATrAFP活性^(注2)原代培养人成纤维细胞人宫颈癌细胞株：Hela大鼠肝细胞株：BRL-3A原代培养大鼠肝细胞人肝细胞株：L-02大鼠肝癌细胞株：CBRH7919人肝癌细胞株：SMMC7721人肝癌细胞株：HepG2原代培养人肝癌细胞：LTNM4＜20ng/ml＜20ng/ml＜20ng/ml＜20ng/ml＜20ng/ml＜20ng/ml＜20ng/ml775ng/ml1489ng/ml背景值(＜0.2％)背景值(＜0.2％)背景值(＜0.2％)背景值(＜0.2％)背景值(＜0.2％)背景值(＜0.2％)背景值(＜0.2％)157.3％56.5％

注1：正常人甲胎蛋白表达量＜20ng/ml。

注2：该实验以不含基因表达调控序列的CAT基因表达质粒pCAT-Basic作为阴性对照，以含SV40启动子的CAT基因表达质粒pCAT-Control作为阳性对照(作为100％活性)。以表达β-半乳糖苷酶基因的质粒CMVβ作为内参照。