经修饰的抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素及应用

摘要

本发明提供了一种生物素——结合的经修饰的抗生物素蛋白类型分子,其中生物素结合位点的必需酪氨酸残基被修饰,其修饰方式使其pKa与相应的非修饰抗生物素蛋白类型分子中的没有被修饰的酪氨酸残基的pKa相比被降低。修饰作用是用诸如硝基、卤素、偶氮和氨基在相对于酪酸残基的羟基的一个或两个邻位取代而进行的。该经修饰的抗生物素蛋白类型分子可用于抗生物素蛋白生物素技术的所有应用中。

说明书

本发明涉及一种抗生物素蛋白类型的分子，它在结合位点的酪氨酸残基被修饰，已知该酪氨酸残基对与生物素的结合起着关键作用。这种被修饰的抗生物素蛋白在特定条件下仍可与生物素或生物素化的配体结合，但在改变这些条件后，如高pH值或与生物素竞争，已结合的生物素部分或生物素化的配体即被除去。本发明因而提供了一种用于抗生物素蛋白-生物素技术的可逆形式的抗生物素蛋白，从而“校正”用于不同目的，即用于需要破坏抗生物素蛋白-生物素复合体的高变性条件下，抗生物素蛋白的一个重要缺陷。这些需要解离抗生素蛋白-生物素复合体的剧烈条件通常使生物素化的组分的生物活性不可逆地丧失，从而使其在随后的使用中不稳定。

抗生物素蛋白(来源于卵白)和抗生蛋白链菌素(来源于Streptomyces avidinii)是两种相关的蛋白质，它们与生物素的结合具有相似的解离常数，约为10^-15M(Green，1975)。除与生物素结合外，它们的许多物理性质十分相似。例如，它们都是由四个非共价连接的相同的亚基形成，每一个亚基具有一个单一的生物素结合位点。亚基的Mr值也非常接近。而且，这两种蛋白质序列中的几个小片段是保守的，特别是两个Trp-Lys(色氨酸-赖氨酸)片段存在于大约相同的位点(Argarana et al.，1986)。我们以前曾证实(Gitlin etal.，1987，1988a)两种蛋白质中一些赖氨酸残基和色氨残基参与了生物素的结合(Gitlin et al.，1988b)。最近证实，抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素两者显示出相同的三维折叠，并且大多数结合位点的残基是相同的或相似的(Weber et al.，1989)。两种蛋白与生物素分子形成的结合位点的几何构型和连键确实非常相似。

虽然具有这些相似性，这两种蛋白之间也存在一些差异。抗生物素蛋白是一种具有二硫键桥的糖蛋白，含有两个甲硫氨酸残基，而抗生蛋白链菌素没有被糖化并缺乏含硫的氨基酸铡链。另一个显著差异是在酪氨酸的含量上。抗生物素蛋白仅有一个酪氨酸残基(Tyr-33)，而抗生蛋白链菌素在22、43、54、60、83和96位含有6个酪氨酸残基。有趣的是，抗生物素蛋白中仅有的酪氨酸残基所处区域含有的序列与抗生蛋白链菌素中的一个酪氨酸残基所处区域的序列相同(在Thr-Gly-Thr-Tyr片段中的Tyr-43)。这一酪氨酸残基在生物素结合位点中占据一个突出的位置，该酪氨酸羟基的化学修饰可导致抗生物素蛋白分子的不可逆失活(Gitlin et al.，1990)。

每一个抗生物素蛋白单体结合一个生物素分子。这种结合的独特特征当然是形成抗生物素蛋白-生物素复合体的强度和特异性。所产生的亲和常数，抗生物素蛋白约为1.6×10¹⁵M^-1，抗生蛋白链菌素约为2.5×10¹³M^-1(Green，1990)，是已知一种蛋白质和一种有机配体中的最高的。这么高的强度使得生物素不能从结合位点逃逸，即使处于各种剧烈条件下，例如，室温下高浓度变性剂的条件下，如6M盐酸胍，3M硫氰酸胍，8M尿素，10％β-巯基乙醇或10％十二烷基硫酸钠。在低pH(1.5)用盐酸胍或在变性剂或洗涤剂的存在时加热(＞70℃)的联合作用下，该蛋白质变性，生物素从遭破坏的结合位点释放出。

抗生物素蛋白识别生物素主要是在其分子的脲基(类似尿素)环部位。抗生物素蛋白的结合部位与该维生素戊酸侧链的含硫环之间的作用强度很低。生物素含羧基侧链与抗生物素蛋白之间相对弱的相互作用意味着前者可被化学修饰并与多种生物活性物质相连，所产生的生物素衍生物或共轭物部分仍可与抗生物素蛋白相互作用。反过来，抗生物素蛋白可与许多其它分子衍生化，即与各种类型的“探针”或报道基团衍生化。

这正是抗生物蛋白-生物素技术的关键点(Wilchek和Bayer，1990)。这样，实验系统中的一种生物活性靶分子可用其生物素化对应物(一种结合物)来“标记”，然后可将该产物与抗生物素蛋白作用，该抗生物素蛋白是与适当的探针衍生物化的或共轭化的。

在抗生物素蛋白-生物素技术中卵白抗生物素蛋白的使用有时由于高碱性(pI～10.5)和抗生物素蛋白分子上糖部分的存在而受到限制，它可导致非特异性或不期望的反应发生。近年来。细菌蛋白质，抗生蛋白链菌素，在抗生物素蛋白-生物素技术的许多应用中很大程度上取代了卵白抗生物素蛋白。然而，抗生蛋白链菌素的缺点(成本高和不依赖生物素的细胞结合)使人们对将卵白抗生物素蛋白作为抗生物素蛋白-生物素技术的标准用品重新有了兴趣。为了这一目的，已制备出了相对于天然蛋白质(和以前的它的衍生物)以及抗生蛋白链菌素的具有改良分子特性的经修饰的抗生物素蛋白，例如N-酰基抗生物素蛋白，如，N-甲酰，N-乙酰和N-琥珀酰抗生物素蛋白。这些抗生物素蛋白的衍生物降低了该蛋白质的电荷，但它们都是通过与抗生物素蛋白的赖氨酸进行共价连接而制备的。而该游离氨基的封闭阻止了随后的其它类型的共轭物的制备(即蛋白质-蛋白质共轭物，如抗生物素蛋白标记的酶)，这通常是通过用双功能基试剂(如，戊二醛)与赖氨酸残基进行交联而制备的。

一种更为有用和有效的对赖氨酸修饰的替代方法是对精氨酸的修饰。这种情况下，蛋白质的pI值被有效地降低，并且赖氨酸仍可用于随后的交联。以这种方式修饰的两种不同的抗生物蛋白衍生物可通过商业途径获得。一种是ExtrAvidin^，可以各种功能性衍生的或共轭的形式购自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。另一种NeutraLite Avidine^TM(一种Belovo Chemicals，Bastogne，Belgium的产品)，它是额外修饰的，并可大量购得。

虽然卵白抗生物素蛋白pI值的降低解决了其中的一个问题，寡聚糖残基的存在仍成为非特异性(不依赖生物素)相互作用的主要原因，这限制了它的应用。将卵白抗生物素蛋白回复成为抗生物素蛋白-生物素技术的标准用品有赖于糖基的去除。

从糖蛋白上去除糖基的可能性非常有限。通过化学方法或酶方法可能做到这一点。目前可以使用的化学方法，如使用HF或高碘酸盐氧化，或者是破坏性大或者是效率低下。公知的酶方法，使用N-聚糖酶(Tarentino et al.，1984)，通常非常昂贵并且当使用常规方法时对于抗生物素蛋白不十分有效。最终，一种可行的去糖基化的方法建立了起来，所得产物随后通过精氨酸进行了化学改性，这种产品的商标为NewtraLite Avidin^TM(Belovo Chemicals)。

虽然有了这些改进，抗生物素蛋白-生物素技术的一些应用中的一个主要问题是这一结合不具有可逆性，并且在不使抗生物素蛋白变性或不使通过生物素桥已相连的生物材料被破坏或失活的情况下，难于在过程结束后分离到抗生素蛋白和生物素部分。或者，从抗生物素柱中除去被破坏或失活的材料将是有利的(特别是对工业上的使用来说)，从而重新组成柱以便于生物素化组分的新样品的吸附。

本发明的一个目的是提供经修饰的抗生物素蛋白，它仍可与生物素结合并与应用使用抗生物素蛋白-生物素技术的方法中，其中方法的可逆性是必需的或是有利的。

在模型肽和蛋白质中使用四硝基甲烷对酪氨酸残基的硝化作用已有描述(Riordan et al.，1966；Sokolovsky et al.，1967)。在本发明人的一项前期工作中(Gitlin et al.，1989)，通过用四硝基甲烷(TNM)对溶解于9M尿素中的卵白抗生物素蛋白进行硝化作用而制备出了抗生物素蛋白的酪氨酸硝化衍生物。所产生的硝化-抗生物素蛋白是无活性的，即它不与生物素结合，这是由于硝化作用是以抗生物素蛋白的变性形式进行的(在尿素存在下)。由此制备的硝化-抗生物素蛋白完全无法用于抗生物素蛋白-生物素技术。

已制备出了¹²⁵I-标记的抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素以用于分析用途。每一抗生物素蛋白亚基上的单一的酪氨酸残基不是可很容易地进行碘化。抗生物素蛋白通过引入3-(对-羟苯基)丙酰基而使其具有对碘化作用的敏感性(氯胺T方法)，从而制备出含有所述基团的¹²⁵I-标记的抗生物蛋白。¹²⁵I-标记的Bolton-Hunter试剂也可用于标记抗生物素蛋白(Finn和Hofmann，1985)。用碘化方法(iodogenmethod)将抗生蛋白链菌素用Na¹²⁵I碘化制备出了¹²⁵I-抗生蛋白链菌素(Suter et al.，1988)。没有标记的碘化的抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素截止目前尚未见报道。

用模型肽和蛋白质，如核糖核酸酶A，将酪氨酸残基进行氮化或胺化已有报道(Gorecki et al.，1971；Sokolovsky et al.，1967)。

本发明涉及生物素-结合的经修饰的抗生物素蛋白-类型的分子，它选自下列分子组：(i)天然卵白抗生物素蛋白；(ii)重组抗生物素蛋白；(iii)抗生物素蛋白的去糖基化形式；(iv)细菌的抗生蛋白链菌素；(v)重组抗生蛋白链菌素；(vi)截断的抗生蛋白链菌素；和(vii)在必需的酪氨酸残基之外的位点被修饰的(i)-(vi)中的衍生物，其特征为，在所说生物素-结合的经修饰的抗生物素蛋白类型的分子中，在生物素-结合位点的该必需酪氨酸残基的修饰方式使其pKa与相应的没有修饰的抗生物素类型分子中没有被修饰的酪氨酸残基的pKa相比被降低。

本发明的经修饰的抗生物素蛋白类型分子在该抗生物素蛋白类型分子的必需酪氨酸残基上具有一个或多个亲电性和/或亲核性基团，并且可用其中经修饰的酪氨酸为下式的化合物来表示：

其中，X₁和X₂各自是一个选自硝基，卤素，NR₁R₂和-N＝NR₃的原子团，其中R₁和R₂各自选自氢、C₁-C₈烷基和C₁-C₆羧酰基，和R₃是被酸基取代的芳香基。

在本发明的一个优选实施方案中，该抗生物素蛋白类型分子是在酪氨酸残基上通过加入一个或多个亲电基团而被修饰的。例如，抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素可通过酪氨酸残基的硝化或卤素化，优选碘化，而被修饰，如图1所示(X₁或X₂为NO₂或卤素，优选I)，从而将生物素-结合位点的酪氨酸残基的pKa从10.5-12.5降至6.5-8.5，优选降至约7.0。

抗生物素蛋白类型分子中的酪氨酸残基的这种修饰包含有酪氨酸环上的邻位(与羟基相邻)加上一个或多个亲电基团。作为经修饰的抗生物素蛋白的这种类型的一个例子，使用了四硝基甲烷(TNM)对酪氨酸残基进行硝化。已对所产生的含有硝基酪氨酸的抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素(下文分别称作“硝基抗生物素”和“硝基抗生蛋白链菌素”)进行了深入研究，以寻找释放生物素半分子或生物素化的配体，如生物素化的抗体、酶、核酸分子或细胞的相对温和的条件。

在本发明中，抗生物素蛋白的硝化是在非变性条件下进行的，并且所产生的硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白链菌素在pH4时显示出可与生物素化的配体有效和紧密地结合。当pH值上升至8时，生物素化的配体仍保留在柱上。然而，当pH值上升至10时，生物素化的配体即被释放出来。或者，在低pH值条件下(如在pH4至8的范围中)，生物素化的配体可通过用游离生物素交换而释放。硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白链菌素的这些特性提供了适用于多种用途的抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素的类型。按照本发明的方法，这些材料已被用于生物素化配体与硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白链菌素结合和随后释放的几个实施例中，其中硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白链菌素被固定于琼脂糖树脂上；也被用于生物素化配体与硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白链菌素的结合和释放的另一些实施例中，其中硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白链菌素被吸附于微量滴定板上。

本发明的另一个实施方案涉及卤素化的，优选无标记碘化抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。通过氯胺T方法对抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素中的酪氨酸残基用KI进行碘化，产生一和/或二碘酪氨酸-抗生物素蛋白或-抗生蛋白链菌素，均显示出是抗生物素蛋白的有效可逆形式。

本发明的又一个实施方案涉及在必需的酪氨酸残基处被一个或多个选自NR₁R₂和-N＝NR₃的亲核基团修饰的抗生物素蛋白类型分子。

在本发明的偶氮衍生物中，即为其中X₁和/或X₂是-N＝NR₃，R₃是芳基，优选碳环芳基，最优选苯基，它们被一个选自羧基和一个诸如磷酸、胂酸或磺酸的无机酸残基所取代。

根据本发明的偶氮衍生物是从相应的对-氨基衍生物，如对-氨苯基胂酸，邻氨基苯甲酸，对-氨基苯甲酸，对氨基苯磺酸和对-氨基磷酸，通过用NaNO₂的重氮化作用以及所产生的重氮盐与所选择的抗生物素蛋白类型分子的反应而制备的。

在本发明的氨基衍生物中，即是其中X₁和/或X₂是NR₁R₂，R₁和R₂各自选自H，烷基和酰基。该烷基优选为一个C₁-C₈的直链或支链烷基，如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，己基，辛基。该酰基优选为一个C₁-C₆羧酸酰基，如乙酰基，丙酰基，丁酰基(butiryl)，琥珀酰基，或苄氧羰基。

本发明的氨基衍生物可通过用连二亚硫酸钠Na₂S₂O₄还原相应的偶氮衍生物或通过用Na₂S₂O₄还原相应的硝基衍生物来制备，并且如果需要，该氨基可用标准方法进一步烷基化或酰基化。

本发明的经修饰的抗生物蛋白类型的分子可用于抗生物素蛋白-生物素技术的许多方面。

附图简要说明

图1示出制备本发明的酪基酸修饰的抗生物素-类型分子的反应图，并且显示了它在使用抗生物素蛋白-生物素技术的可逆方法中的应用。

图2显示了作为四硝基甲烷(TNM)浓度(mM)函数的抗生物素蛋白的硝化水平(％)，如实施例1(i)所述。

图3显示了pH值对生物素化的牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖-硝基-抗生物素蛋白树脂相结合的效应，如实施例2(i)所述。

图4显示了pH值对生物素化的碱性磷酸酶与含有吸附的硝基-抗生物素蛋白的微量滴定板相结合的效应，如果实施例2(ii)所述。

图5显示了抗生物素蛋白(实心圆)和硝基抗生物素蛋白(空心圆)的生物素结合活性相比较的结果，如实施例2(iii)所述。

图6显示了pH-诱导的生物素化BSA从琼脂糖-硝基-抗生物素蛋白树脂的释放，如实施例3(i)所述。

图7显示了pH-诱导的生物素化BSA从琼脂糖-硝基-抗生蛋白链菌素树脂的释放，如实施例3(ii)所述。

图8显示了通过与游离的生物素的竞争，生物素化BSA从琼脂糖-硝基-抗生物素蛋白的释放，如实施例3(iii)所述。

图9显示生物素-诱导的作为pH值函数的生物素化BSA的洗脱，如实施例3(iv)所述。游离生物素被溶解于不同pH值的缓冲液中，范围为从4到10。将没有生物素的pH10时的洗脱作为对照。

图10显示生物素从硝基-抗生物素蛋白的生物素封闭位点的释放，如实施例4所述。

图11A-B显示了生物素化BSA从硝基-抗生物素蛋白-琼脂糖柱重复上样和洗脱的结果，如实施例5所述。图11A显示了生物素化BSA同一种样品在含有琼脂糖-硝基-抗生物素蛋白树脂的柱上的连续上样(在pH4使用缓冲液A)和洗脱(在pH10使用缓冲液C)。图11B显示了洗脱出的级分的累积每周期具有基本上相同的蛋白质结合和洗脱水平。

图12显示了在从全兔血清进行免疫球蛋白纯化后生物素化蛋白质A从含有琼脂糖-硝基-抗生物素蛋白树脂的释放，如实施例6所述。

图13显示了从图12柱所得样品的SDS-PAGE图：泳道A，全兔血清(上样的级分)；泳道B，柱洗脱液；泳道C，用缓冲液A，pH4的峰洗脱液；泳道D，用缓冲液C，pH10的峰洗脱液；泳道E，兔免疫球蛋白的商品制备物；泳道F，生物素化蛋白质A标准物。

图14显示了pH值对生物素化辣根过氧化物酶从含有吸附的碘化抗生物素蛋白的微量滴定板上释放的效应，如实施例7所述。

本文所用术语“抗生物素类型分子”是指天然卵白糖蛋白抗生物素蛋白、抗生物素蛋白的去糖基形式、由选择的链霉菌属菌株(如Streptomyces avidinii)产生的细菌抗生蛋白链菌素、截短的抗生蛋白链菌素、重组抗生物素蛋白和重组抗生蛋白链菌素，以及天然的、去糖基化的和重组抗生物素蛋白的衍生物和天然的、重组的和截短的抗生蛋白链菌素的衍生物，这些衍生物是在必需酪氨酸之外被修饰的，例如，N-酰基抗生物素蛋白，如N-乙酰、N-邻苯二甲酰和N-琥珀酰抗生物素蛋白，以及商品ExtrAvidin^TM和NeutraliteAvidin^TM。

所有类型的抗生物素类型分子均包括在本发明的范围内，包括天然的和重组的抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素以及衍生分子，如非糖基化的抗生物素蛋白，N-酰基抗生物素蛋白和截短的抗生蛋白链菌素。这些材料的一部分可通过商业途径获得，如天然抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素，非糖基化的抗生物素蛋白，N-酰基抗生物素蛋白和截短的抗生蛋白链菌素，或可通过公知的方法制备(参见Green，1990，制备抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素；Hiller et al.，1990，制备非糖基化的抗生物素蛋白；Bayer et al.，1990，制备抗生蛋白链菌素和截短的抗生蛋白链菌素)。重组抗生物素蛋白和重组抗生蛋白链菌素可通过标准的重组DNA技术来制备，如Chandra和Gray，1990描述的制备重组抗生物素蛋白的方法，和Argarana et al.，1986描述的制备重组抗生蛋白链菌素的方法。

在抗生物素蛋白-生物素技术的应用方法中，可与本发明的修饰过的抗生物素蛋白使用的“生物素化配体”是所需配体的生物素化形式，所需配体有例如蛋白质，如抗体、酶、植物凝血素、或碳氢化合物以及糖结合物，如糖蛋白、神经节苷脂、肝素、寡聚糖、或核酸，即DNA和RNA，或噬菌体、病毒、细菌和其它细胞，其中所说配体是与生物素或与其同系物、类似物或衍生物共价连接的。多种生物素化配体是可通过商业途径获得或可通过标准方法(参见，如，Bayer和Wilchek，1992a)制备。

本发明的经修饰的抗生物素类型分子(主要为在结合位点酪氨酸残基(见图1)的一个或两个邻位修饰过的抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素的衍生物)适于用作与生物素半分子的可逆相互作用，从而提供了用于抗生素蛋白-生物素技术的新工具。

这些经修饰抗生物素蛋白类型分子在温和的条件下允许从固定化的邻-苯酚-修饰的抗生物素蛋白类型分子上或从溶液中的包括经修饰的抗生物素蛋白以及生物素化配体的可溶性复合物上除去游离的生物素和/或生物素化配体，如生物素化的酶或其它生物素化的生物活性材料。这种温和条件可由过量浓度的生物素、高pH值，如pH10，相对低的非变性浓度的尿素、胍或硫氰酸盐，热和/或它们的组合而组成。在一优选实施方案中，生物素或生物素化半分子从固定的经修饰的抗生物素蛋白上的除去是通过变化pH值，如将pH值提高到10，来进行的。在另一个优选实施方案中，这一除去是通过加入过量的生物素，如，0.6mM生物素的溶液通过经修饰的抗生物素蛋白柱以替代生物素化的组分而进行的。

本发明的经修饰的抗生物素蛋白-类型分子适用于抗生物素蛋白-生物素技术的任一方法中，尤其适用于其中抗生物素蛋白-生物素结合的可逆性是有利的方法中。例如，用于亲和层析中以除去亲和配体的可逆性固定化柱；除去固定化酶从而提供一种可逆性酶反应物；破裂含有通过抗生物素蛋白桥而交联的生物素化材料的溶液中的可溶性生物复合物；制备高亲和性噬菌体文库；用于细胞分离，从而便于存活或完整细胞与识别组分或配体(如抗体)一起从树脂的释放，或通过断裂抗生物素蛋白桥而抵消这种细胞的凝集。

本发明也涉及与固相载体或基质相连的本发明的经修饰的抗生物素类型分子。现有技术中所用的任一种固相载体都是适用的，例如，但不限于，树脂，微量滴定板，玻璃珠，磁珠等。抗生物素蛋白与固相载体的连接可以是共价连接，也可以是非共价连接，并可用标准方法完成。在一优选实施方案中，该经修饰的抗生物素蛋白类型分子被固定于树脂上，优选琼脂糖上，并且这样获得的琼脂糖-硝基抗生物素蛋白亲和树脂可被倒入柱中以用于分离程序(Bayer和Wilchek，1992b)。在本说明书中，术语“抗生物素蛋白-琼脂糖柱”表示含有固定于琼脂糖树脂上的本发明的经修饰的抗生物素类型分子的柱。这种柱特别适用于分离程序。

在本发明的另一个实施方案中，该经修饰的抗生物素类型分子被连接于微量滴定板上。

在公知的亲和层析方法中(它是所有亲和方法的原型)，一种结合配体，如一种抗体或受体，被连接到固相支持物上，例如琼脂糖上。这可通过将所说配体生物素化，并随后通过抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素桥固定在琼脂糖上而完成。然后将所得到的抗生物素蛋白琼脂糖柱用作分离和纯化可与所说生物素化配体相互作用的材料的工具。在很多情况下，将该生物素化配体从抗生物素蛋白琼脂糖柱中分离出来将是有利的，或者是回收该配体本身(它可能是稀有的或贵重的)，或者将柱重新构成以用于其它目的。这可通过使用一个含有本发明的经修饰的抗生物素蛋白类型分子来完成，该抗生物素蛋白类型分子可固定生物素化配体，并最终可通过加入碱溶液(如缓冲液C，pH10)或加入过量的生物素(如任一pH值下0.6mM)从柱中除去。然后可将一种新类型的生物素化配体或者将又一批同一种生物素化配体加入到该重新构成的抗生物素蛋白柱中。

该抗生物素蛋白-生物素系统已通过多种方法应用于分离细胞。一种方法是使用可识别细胞表面分子(如表面抗原)的生物素化配体(如抗体)。该生物素化配体可通过抗生物素蛋白或抗生物蛋白链菌素桥被结合于柱上或其它类型的基质上，如磁珠上。或者，将一种混合细胞群体的悬浮液用生物素化配体处理，在溶液中使用抗生物素蛋白可将携带相互作用表面分子的细胞凝集。通常，这一方法用于简单地从混合细胞群体中选择地除去一种给定的细胞群体。一旦通过抗生物素蛋白被结合到基质上或被凝集，可保持细胞完整性或存活性的方式难以将所产生的亲和相互作用(即生物素化配体和表面分子之间，以及抗生物素蛋白和生物素之间)断裂。例如，抗体和抗原之间相互作用的断裂常常需要可破坏大部分细胞的条件，如低pH值。然而可回收到非-相互作用的细胞。为回收到被结合细胞群体，可使用一种含有本发明的经修饰的抗生物素蛋白类型分子的柱，并且可使用一种含有生物素的溶液(例如在等渗条件下，如0.15M NaCl，pH7中的0.6mM生物素，或在一种适当的组织培养基中的过量浓度的生物素)从柱中释放细胞，或者使用同一种含有生物素的溶液将凝集的细胞打散。

固定化酶已大量应用于食品、制药和化学工业(Katchalsky-Katzir，1993)。应用于酶反应器系统的固定化酶的问题之一是酶或其基质会逐渐老化。例如，酶被公认为是敏感的蛋白质，它通常具有一定的半衰期，最终它们会由于使用或由于贮存而失话。对于工业应用来说，当被结合的酶变废以后，最好固定化基质仍可被再次使用。因而通过加入碱溶液(如缓冲液C，pH10)或通过加入过量的生物素(如任何pH值下0.6mM)而除去失活的生物素化酶可重新构成一种酶反应器，该反应器包括一种结合于一种柱上的生物素化酶，该柱含有本发明的经修饰的抗生物素蛋白类型分子。然后可将新的一批生物素化酶加入到该重新构成的经修饰的抗生物素蛋白柱上。

同样，可将细胞固定于经修饰的抗生物素蛋白柱上，并用于基于细胞的反应器系统。这种细胞可通过使用含有生物素的溶液(例如，等渗条件下(如0.15M NaCl，pH7)0.6mM，或在一种适当组织培养基中的这种过量浓度的生物素)而被除去，从而重新构成该经修饰的抗生物素蛋白柱。

在噬菌体文库技术中，将一种结合配体(如，抗体，受体)连接于固相载体上，如微量滴定板上。这通常是通过将所说配体生物素化，并随后通过抗生蛋白链菌素桥将其固定在板上而完成的。然后加入丝状噬菌体(如M13)，这些噬菌体含有可与固定化的配体相互作用的表面肽，从而被结合至板上。非特异性结合的噬菌体可通过用中性的洗涤剂，如Tween 20(非离子型表面活性剂的商品名)，冲洗而被除去。通常随后通过降低pH值将结合的噬菌体从板上释放出来。pH值降低可断裂固定化配体和噬菌体上表面肽之间的相互作用。这一方法的潜在问题之一是一些唑菌体可仍凭借非常高的亲和作用而结合在板上。特别由于它们对生物素化配体高的亲和力，这些噬菌体可能是所需的噬菌体。因而，通过使用本发明的经修饰的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素也通过加入碱性溶液(如缓冲液C，pH10)或通过加入过量的生物素(如任一pH值下的0.6mM)，高亲和性的噬菌体即可与生物素化配体一起从微量滴定板上释放下来。然后，该回收的结合于噬菌体上的高亲和肽可通过随后的细菌感染，和通过建立噬菌体文库的方法而被富集(参见，例如，Scott，1992)。

基因富集和DNA分离可按照已知的方法(参见Wilchek和Bayer，1988)将生物素化DNA与本发明的经修饰的抗生物素蛋白类型分子或经修饰的抗生物素蛋白柱相复合而完成。过去，为了将生物素化DNA从复合物中游离出来，曾使用蛋白水解酶，例如蛋白酶K，来消化抗生物素蛋白。使用本发明的经修饰的抗生物素蛋白类型分子，可使用碱溶液(如缓冲液C，pH10)或通过加入过量的生物素(如0.6mM，任一pH值)来释放生物素化的DNA。

生物感应器是由一个具有特异性的生物感应器件和一个可将一个生物事件转换成一个可被进一步处理和定量的反应的转导功能(即电化学的、光学的、热量的或声的)组成。生物配体可以是催化性的(如酶、细菌细胞、组织)或非催化性的(如抗体、受体、DNA)。这种检测器依赖于相互作用组分之一在感应表面上的固定，由此产生的完整生物感应器的元件非常昂贵。过去，曾将抗生物素蛋白-生物素系统用作将这种配体固定到生物感应器上的一般方法。用本发明的经修饰的抗生物素蛋白替代天然抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的可能性提供了一种可逆类型的生物感应器，这样可节省费用并且便于使用。这样，生物素化配体可通过经修饰的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素固定在生物感应器上，当需要时，可使用碱溶液(如缓冲液C，pH10)或通过加入过量的生物素(如在任一所需pH值、离子强度等条件下，0.6mM)将生物素化配体游离。然后，生物感应器的该经修饰的抗生物素蛋白类型分子可被重新装上同一种或不同种的生物素化配体。

本发明也提供了一种在使用抗生物素蛋白-生物素技术的方法中回收抗生物素蛋白柱或生物素的方法，包括：(i)将一种生物素化配体固定于含有连接在树脂上的本发明经修饰的抗生物蛋白类型分子的柱上；(ii)进行与这样固定的生物素化配体所需的反应或分离步骤；(iii)通过改变条件将该生物素化配体从固定的经修饰的抗生物素蛋白柱上除去；和(iv)回收该生物素化配体和/或该经修饰的抗生物素蛋白柱供以后使用。生物素化配体可通过提高pH值、加热、加入过量浓度的生物素、或低浓度的尿素、胍或硫氰酸酯、和/或它们的组合，从从固定化的经修饰的抗生物素蛋白柱上除去。在优选的实施方案中，生物素化配体是通过将pH值提高到10，或通过加入0.6mM的生物素而从固定化的经修饰的抗生物素蛋白柱上除去。

本发明将通过下文非限定性实施例进行描述。

                  实施例材料和方法

(i)材料。卵白抗生物素蛋白是由STC实验室(Winnipeg，canada)或由Belovo Chemicals(Bastogne，Belgium)提供的。抗生蛋白链菌素是从Streptomyces avidinii培养过滤物中使用改良的亚氨基生物素—琼脂糖柱按照前述方法(Bayer et al.，1990)纯化而来，琼脂糖4B CL来自Parmacia(Uppsala，Sweden)。四硝基甲烷来自Fluka。蛋白质A和牛血清白蛋白(BSA)来自Sigma Chemical Co.(St.louis，MO，USA)

(ii)缓冲液：缓冲液A：50mM柠檬酸盐-磷酸盐，pH3-6；缓冲液B：50mM Tris-HCl，pH7-9；和缓冲液C：50mM碳酸钠-HCl，pH10。

(iii)生物素化程序。将实施例中使用的蛋白质和酶通过常规生物素化方法，使用前述的(Bayer和Wilchek，1990)生物素基琥珀酰亚氨酯(biotinyl N-hydroxysuccinimide ester，BNHS)进行生物素化。

(iv)抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素在琼脂糖上的固定是通过如前文所述的溴化氰方法(Kohn和Wilchek，1984)进行的。

(v)酶测试。

(a)辣根过氧化物酶活性：过氧化物酶活性是用2，2′连氮基-二(3-乙苯基-噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)作为底物确定的。底物溶液中包括每10ml缓冲液A中2.5mg底物，pH5，其中加入10μl30％过氧化氢。在420nm处测定颜色的形成。

(b)碱性磷酸酶活性是使用对硝基苯磷酸作为底物测定的。底物溶液包括溶解于10ml含有0.5mM MgCl₂的1M二羟乙基胺(pHg.8)缓冲液中的10mg底物。在410nm处测定颜色的形成。

(vi)蛋白质。蛋白质是通过Bradford方法，使用抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素(如果合适的话)或BSA作为标准来测定的。

实施例1    硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白链菌素的制备以及它们在琼脂糖上的固定。

(i)硝基抗生物素蛋白的制备。将卵白抗生物素蛋白的样品(在1ml 50mM Tris-缓冲液中5mg，pH8或以上)用不同浓度的四硝基甲烷(TNM)(0.5-5μl对应于约5-50mM)，在23℃处理30分钟。将样品透析过夜，一次相对于1M NaCl，两次相对于双蒸水。样品中被修饰的酪氨酸的量用氨基酸分析方法测定。如图2所示，在修饰条件下，用大于20mM的试剂，达到了修饰的最高水平(约70％)，即平均抗生物素蛋白四聚体四个亚单位中的约三个好象被修饰。在下面实验中，所使用的硝基抗生物素蛋白是使用2μl制备的。

(ii)硝基抗生蛋白链菌素的制备。由于抗生蛋白链菌素中每一亚单位中酪氨酸残基数目较多，抗生蛋白链菌素(每1ml缓冲液2.5mg)是用高水平的四硝基甲烷(6μl相应于约50mM)来进行硝化作用的。

(iii)固定于琼脂糖上的硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白链菌素的制备。

(a)琼脂糖4B CL的溴化氰活化。将40g流干的琼脂糖4B CL先用水冲洗，然后用30％乙酮(v/v)，最后用60％乙酮(v/v)冲洗。将该树脂重新悬浮于6ml 60％乙酮中并冷却至0-4℃。在磁搅拌器搅拌的同时加入6ml CNBr溶液(10g/100ml乙酮)，然后在1-2分钟的时间内逐滴加入同样体积的三乙胺(TEA)溶液(15.2g/100ml乙酮)。将该活化的树脂过滤并用0.1M碳酸氢钠洗涤。

(b)固定于琼脂糖上。硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白链菌素与活化的琼脂糖4B CL的结合是在4℃，在0.1M碳酸氢盐溶液中反应16小时完成的。

(iv)抗生物素蛋白-琼脂糖和抗生蛋白链菌素-琼脂糖树脂的硝化。将按照上文(iii)(b)中所述，但使用的是没有修饰的抗生物素蛋白，而制备的4ml抗生物素蛋白-琼脂糖树脂(1.4mg抗生物素蛋白/ml琼脂糖)的一个样品用50mM Tris-缓冲液pH8洗涤，并在23℃用6μl TNM处理50分钟。将该硝化-修饰的树脂先用1M NaCl，然后用双蒸水，最后用PBS洗涤。

实施例2  生物素化的蛋白质与硝基抗生物素蛋白的结合

(i)生物素化蛋白质与硝基抗生物素蛋白的结合是用几种方式进行测试的。在一个实验中，硝基抗生物素蛋白是通过实施例1

(iii)中的溴化氰方法被固定在琼脂糖上。使用了约0.5mg的抗生物素蛋白，并将缓冲液A、B或C(100μl)中的生物素化BSA的样品加样至100μl的硝基抗生物素蛋白琼脂糖树脂上。将流出的级分进行蛋白检测。在不同pH值时结合的白分率是通过从加样至树脂上的蛋白质量减去流出的级分中的蛋白质的量来确定的。如图3所示，最适结合发生于pH4。在较高pH(5和8之间)时观察到结合水平的平台。在pN8以上时，结合急剧下降，并且在pH10时只有微量结合。

(ii)使用生物素化碱性磷酸酶在一微量滴定板测试中获得了相似的结合(图4)。在这一实验中，按照实施例1(i)制备的硝基抗生物素蛋白被吸附于微量滴定板上(1μg硝基抗生物素蛋白/100μl磷酸盐缓冲液(PBS)/孔)，该板被1％BSA封闭，并用不同pH的缓冲液A、B和C中的生物素化碱性磷酸酶加样(37μg/0.1ml缓冲液/孔)。将板洗涤，被结合的酶级分是按照上文方法v(b)所述，使用对-硝基苯磷酸盐作为底物通过产色的酶检测来确定的。

(iii)使用相似的微量滴定板酶检测方法，将硝基抗生物素蛋白的结合活性与天然(没有修饰)的抗生物素蛋白的结合活性进行了比较。在用抗生物素蛋白或硝基抗生物素蛋白涂敷的微量滴定板上(1μg/100μl PBS/孔)加上不同浓度(150μl缓冲液A中10ng和1μg之间)的生物素化辣根过氧化物酶，在实验测定的最适pH(即pH4)结合。将板洗涤，辣根过氧化物酶活性是按照上文方法v(a)的描述，使用ABTS作为底物测定的。如图5所示，在这些条件下，没有修饰的抗生物素蛋白和硝基抗生物素蛋白的生物素结合性能非常接近。

实施例3  生物素化蛋白质从硝基抗生物素蛋白的释放。

(i)为确定生物素从硝基抗生物素蛋白柱上释放的优选条件，将生物素化BSA(1.5mg/150ul缓冲液A，pH4)加样至按照实施例1(iv)的含有硝基抗生物素蛋白-琼脂糖树脂的柱上。用逐渐增高pH的缓冲液A、B和C洗涤被结合的材料，监测流出级分中的蛋白质浓度。从图6可以看出，从该树脂上释放生物素化蛋白质需用碱性溶液(缓冲液C，pH10)。

(ii)使用相同的方法，但仅用缓冲液C，pH10洗涤，使用按照实施例1(iii)的方法将硝基抗生蛋白链菌素连接到琼脂糖上而制备的硝基抗生蛋白链菌素柱得到了相似的结果。

(iii)在一相似的实验中，探讨了用游离生物素竞争从根据实施例1(iv)制备的含有硝基-抗生物素蛋白琼脂糖的柱上释放生物素化BSA的方法。将生物素化BSA(1.5mg/150μl缓冲液A，pH4)加样至一个2ml硝基抗生物素蛋白-琼脂糖柱上。将含有0.6mM生物素的缓冲液A，pH4通过该柱，监测蛋白质浓度。如图8所示，大部分的生物素-BSA可通过使用含0.6mM生物素的缓冲液A，pH4，而被释放出来。对生物素-BSA的这种生物素-诱导的洗脱作为pH值的函数进行了研究，使用的是缓冲液A、B或C，pH值从4到10。

(iv)在相同条件下，用按照实施例1(iv)的方法制备的硝基抗生物素蛋白-琼脂糖树脂进行了相似的实验，只是游离的生物素被溶解于从4到10范围内的不同pH值缓冲液中。如图9所示，游离生物素在被测试的整个pH范围内都是一种有效的洗脱剂。将pH10时没有生物素的洗脱作为对照。

实施例4  非修饰生物素-结合位点的封闭

由于在所述条件下仅获得结合-位点酪氨酸的部分修饰，非修饰位点会给硝基抗生物素蛋白随后的使用带来问题。这样，将按照实施例1(i)制备的含有不同硝基-酪氨酸水平的(见图2)的硝基抗生物素蛋白样品涂敷于微量滴定板的孔中(1μg/100μl PBS/孔)。将相似浓度的天然卵白抗生物蛋白用作对照。将孔用1％BSA封闭，并用缓冲液A，pH4中0.6mM生物素的过量游离生物素将被吸附的蛋白质样品选择性封闭。占据被修饰结合位点的生物素可用上文实施例3所述的碱性溶液(缓冲液C，pH10)释放。封闭和碱处理后，该部分硝基化的抗生物素蛋白样品的生物素结合能力用生物素化过氧化物酶系统(上文方法v(a))，通过在微量滴定板中的酶检测来确定。如图10所示，发现结合与修饰程度成比例，在约60％修饰时结合值最大。

实施例5  硝基抗生物素蛋白柱的重复使用

对实施例1(iii)中的含有琼脂糖-硝基-抗生物素蛋白树脂的稳定性通过生物素化蛋白质的重复加样和洗脱进行测试。将生物素化BSA的同一种样品(300μg/1ml缓冲液A，pH4)加样到一个0.75ml琼脂糖-硝基-抗生物素蛋白柱上。用缓冲液A，pH4洗涤该柱，并用缓冲液C，pH10洗脱。将该步骤再重复三次，用Bradford试验监测级分的蛋白质(图11A)。如图11B所示，洗脱出的级分的累积显示出在硝基抗生物素蛋白柱上结合了和从它释放出了基本相同水平的生物素化蛋白质。

实施例6  用生物素-蛋白质A/硝基-抗生物素蛋白柱纯化IgG

对硝基抗生物素蛋白柱作为通用的亲和树脂的性能进行检测。在这一方法中，将生物素化蛋白质A连接于琼脂糖上并倒入柱中。将该柱用作直接从全兔血清中纯化免疫球蛋白的免疫亲和柱，并随后将生物素化蛋白质A从柱中释放出来。向一个含有按照实施例1(iv)方法制备的0.5mg硝基抗生物素蛋白/ml琼脂糖的柱中加入存在于4ml缓冲液A、pH4的1.8mg蛋白A。将全兔血清(0.5ml，用0.1M缓冲液B，pH8稀释4倍)加样到柱上。用同一种缓冲液洗涤柱，然后用10mM浓度的同一种缓冲液洗涤。被结合的免疫球蛋白是用缓冲液A，pH4，从柱中释放的。随后用50mM缓冲液C，pH10去除生物素化蛋白质A。结果示于图12。然后通过SDS-PAGE检测各个峰，显示出为期望蛋白质的基本上纯净的级分(图13)。该纯化的免疫球蛋白显示出与通过商业途径获得的相当级分的样品纯度相当。并且通过碱处理从柱中洗脱出的生物素基蛋白质A具有相似的纯度。

实施例7  碘化的抗生物素蛋白的制备以及生物素化蛋白质与吸附在微量滴定板上的碘化抗生物素蛋白的结合

(i)碘化抗生物素蛋白的制备。将0.5ml磷酸钠缓冲液，pH7，中的一个2mg抗生物素蛋白的样品用10μl KI溶液(32mg/ml)和200μl的氯胺-T(2mg/ml)处理。在23℃温育30分钟后，在1分钟的期间内加入300μl偏亚硫酸氢钠溶液(2mg/ml)。加入1ml 1％KI溶液进行终止。将该样品相对于双蒸水透析过夜。

(ii)生物素化过氧化物酶与碘化抗生物素蛋白的结合。将碘化抗生物素蛋白吸附到微量滴定板上，将该板用1％BSA溶液封闭，将生物素化辣根过氧化物酶的样品加样至不同pH的缓冲液A、B和C中(37μg/0.1ml缓冲液/孔)。将板冲洗，过氧化物酶活性是按照上文方法v(a)所述，使用ABTS作为底物来测定的。如图14所示，pH5时具有最适结合。

实施例8  偶氮酪氨酸-抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素的制备

将对-阿散酸(对-氨苯基胂酸(100mg)溶解于0.3M HCl(10ml)中，并用NaNO₂(5ml水中35mg)冰浴处理。6分钟后，将该溶液用NaOH把pH调整到5，并立即使用。将0.5ml所产生的偶氮阿散酸(在0.1M硼酸钠缓冲液中2mg，pH8.4)加到抗生物素蛋白溶液中(4.5ml 0.1M硼酸钠缓冲液中5mg，pH8.4)，在室温下反应进行2小时。用分光光度计跟踪反应进程(λmax 342nm)，并将偶氮阿散酸化-衍生的抗生物素蛋白相对于PBS或50mM Tris-缓冲液，pH8透析。

用相似的方法制备偶氮-酪氨酸抗生蛋白链菌素。

用其它的对-氨苯基衍生物，如氨茴酸(邻-氨基苯甲酸)、对-氨基苯甲酸、对-氨基苯磷酸和磺胺酸(对氨基苯磺酸)代替对-阿散酸，可得到相应的偶氮衍生物

实施例9  氨基酪氨酸-抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素的制备。

将硝基-抗生物素蛋白或偶氮酪氨酸-抗生物素蛋白(1ml 50mMTris缓冲液，pH8中2mg)用24倍摩尔过量的Na₂S₂O₄(在4ml同种缓冲液中的1.4mg)处理。在室温下反应进行16小时，用分光光度计验证还原的程度(对于硝基-抗生物素蛋白在λmax 428nm或对于偶氮酪氨酸-抗生物素蛋白在342nm的吸收降低)。将该蛋白质相对于PBS进行透析。

氨基酪氨酸-抗生蛋白链菌素是通过相似的方法，使用1mg硝基抗生蛋白链菌素和相当摩尔过量的Na₂S₂O₄制备的。

参考文献

1.Argarana，C.E.，Kuntz，I.D.，Birken，S.，Axel，R.and Cantor，C.R.(1986)Nucl.

      Acids Res.14，1871.

2.Bayer，E.A.，Ben-Hur，H.and Wilchek，M.(1990)Methods Enzymol.184，80.

3.Bayer，E.A.and Wilchek，M.(1990)Methods Enzymol.184，138.

4.Bayer，E.A.and Wilchek，M.(1992a)Methods in Molec.Biology 10，137.

5.Bayer，E.A and Wilchek，M.(1992b)Methods in Molec.Biology 10，143.

6.Chandra，G.and Gray，G.(1990)Methods Enzymol.184.70.

7.Finn，F.M.and Hofmann，K.H.(1985)Methods Enzymol.109，418.

8 Gitlin，G.，Bayer，E.A.and Wilchek，M.(1987)Biochem.J.242，923.

9.Gitlin，G.，Bayer，E.A.and Wilchek，M.(1988a)Biochem.J.250，291.

10.Gitlin，G.，Bayer，E.A.and Wilchek，M.(1988b)Biochem.J.256，279.

11.Gitlin，G，Khaiy，I.，Bayer，E.A.，Wilchek，M.and Muszkat，K.A.(1989)

        Biochem.J.259，493.

12.Gitlin，G.，Bayer，E.A.and Wilchek，M(1990)Biochem.J.269，527.

13.Gorecki，M.，Wilchek，M.and Patehornik，A.(1971)Biochim.Biophys.Acta

        229，590-595.

14 Green，N.M.(1975)Adv.Protein Chem.29，85.

15.Green，N.M.(1990)Methods Enzymol.184，51.

16.Hiller，Y.，Bayer，E.A.and Wilchek，M.(1990)Methods Enzymol.184，68.

17.Katchalski-Katzir，E.(1993)TIBTECH 11，471.

18.Kohn，J.and Wilchek，M.(1984)Appl.Biochem.Biotechnol.9.285.

19.Riordan，J.F.，Sokolovsky，M.and Vallee，B.L.(1966)J.Am.Chem.Soc.88，

      4104

20.Scott，J.K.(1992)TIBS 17，241.

21.Sokolovsky，M.，Riordan，J.F.and Vallee，B.L.(1967)Biochim.Biophys.Res.

      Conmmunic.27，20-25.

22.Suter，M.，Cazin，Jr.J，Butler，J.E.and Mock，D.M.(1988)J.Immunol.Meth

      113，83

23.Weber.P.C.，Ohlendorf，D.H.，Wendolosky，J.J.and Salemme，F.R.(1989)

      Science 243，85.

24.Wilchek，M.and Bayer，E.A.(1988)Analytical Biochemistry 171.，1.

25.Wilchek，M.and Bayer，E.A.，Eds.(1990)“Avidin-Biotin Technology”，Methods

     in Enzymology，Vol.184，Academic Press，Inc.，San Diego.