制备单克隆抗体的方法、单克隆抗体、药物组合物和诊断试剂

摘要

本发明涉及制备抗细胞和病毒表面抗原单克隆抗体的有效方法。本方法提供仅以相对小量存在的抗原,或仅可得到很小量的抗原或容易丧失其体内构象的抗原。因此,根据本发明的方法包括一系列步骤,包括相对于特异性B－细胞的相对数目其中的来自注射以包括表面抗原物质的哺乳动物的B－细胞被富集的步骤和包括小规模融合技术的步骤。

说明书

本发明涉及制备抗表面抗原单克隆抗体的方法，尤其是仅构成少量的注射于哺乳动物中的总抗原的表面抗原以及容易丧失其体内构象的表面抗原。少量抗原相对于总量抗原的问题在例如，当用于注射哺乳动物的抗原物质源自其它哺乳动物种类时发生。

例如，当需要制备抗T-细胞受体(TCR)特异性决定部分的单克隆抗体时，与上面说明的抗原有关的问题便变得清楚。这种(单克隆)抗体称为抗克隆型(anti-clonotype)抗体因为它们识别一种特定T-细胞克隆T-细胞受体的抗原特异性部分(或克隆型结构)。尽管抗鼠T-细胞受体(TCR)的(鼠)单克隆抗-克隆型抗体仅有零星的报导，但已知的抗人类T-细胞受体的(鼠)单克隆抗-克隆型抗体更少。T-细胞难以培养，造成难以获得和纯化足够量的抗原，即，T-细胞受体蛋白。这反过来造成难以获得免疫应答并也使筛选困难。在抗人类TCR单克隆抗-克隆型抗体可得到的很少几例中的其中一种中，这些问题不会出现因为该抗原存在于Jurkat白血病细胞中(参考文献1)。由于白血病细胞可以无限量地培养，抗原短缺问题不会出现。因此，直到现在还没有得到制备抗罕见和/或很不稳定抗原的单克隆抗体而无需不利地筛选大量杂交瘤克隆的方法。

本发明的目的是提供在上述不利情况下制备抗细胞表面抗原的单克隆抗体的方法，所述的方法显著地减少待筛选的杂交瘤克隆的数目，使根据本发明的方法更为有效或当根据目前工艺水平的方法失败时甚至成功。

为了此目的，根据本发明的方法包括以下步骤

1)以包括细胞表面抗原的物质注射哺乳动物，所述的物质选自i)整个细胞和ii)通过处理整个细胞而获得的膜部分；

2)从所述的哺乳动物脾脏中分离含B-细胞的细胞部分；

3)将该细胞部分与和所述完整细胞有关的细胞的结合载体物质接触而在对所述细胞表面抗原特异的B-细胞中富集步骤2中获得的所述细胞部分，该细胞结合载体相关物质缺乏所述的细胞表面抗原，并且分离结合到相关细胞结合载体物质的B-细胞与在下一步中待用的富集未结合的含有B-细胞的细胞部分；

4)将在前面步骤中获得的富集的含B-细胞的细胞部分进行有限的稀释然后进行克隆扩增；

5)筛选B-细胞克隆并用小规模融合技术使所述的筛选出的B-细胞克隆无限繁殖；和

6)筛选和克隆能产生特异性结合所述细胞表面抗原抗体的杂交瘤，然后从该杂交瘤的上清液中分离包括单克隆抗体的部分。

为了保持说明书和权利要求书易读且易懂的目的，这里的术语细胞不仅用于表示哺乳动物细胞也表示病毒，且尤其是包括膜的病毒。

术语细胞的结合载体物质包括完整或整个细胞(和病毒)、所述完整整个细胞(和病毒)的膜部分，或基本上纯化的表面抗原或其复合物。

如果没有另外特别的说明，术语整个细胞指具有感兴趣表面抗原的细胞。术语相关细胞指这样的细胞：即它们优选地仅在缺乏感兴趣的表面抗原方面不同，或更为具体地它们至少缺乏免疫决定簇，正是由于此抗该决定簇而需要获得单克隆抗体。

令人惊奇的是通过接触分离的含B-细胞的细胞部分与细胞物质，该细胞来自与包括细胞表面抗原的物质被从中获得相同的物种但缺乏细胞表面抗原，证明不使用细胞表面抗原在细胞表面抗原特异性的B-细胞中富集细胞部分是可能的。换句话说，通过接触B-细胞与无关的相关细胞或细胞物质以及去除结合的B-细胞，富集得以完成。

因此，制备抗次要细胞表面抗原的单克隆抗体是可能的，即使所述的细胞表面抗原构型不稳定。

欧洲专利EP0488470和基于此欧洲专利的参考文献3描述了一种方法，其中I)哺乳动物注射以抗原，II)分离含有B-细胞的部分，III)筛选抗原特异性B-细胞，IV)将富集的部分进行克隆扩增且在V)筛选B-细胞克隆并用小规模融合技术使其无限繁殖以后VI)筛选和克隆杂交瘤接着分离包括单克隆抗体的部分。在步骤III中，通过将其结合于涂布抗原的塑料表面或通过与抗原涂布的顺磁(paramagnetic)小珠形成玫瑰花环(rosetting)而筛选B-细胞。非特异性B-细胞通过洗涤去除。因此，除了其它的差异外，此方法依赖于充分的可用性和抗原的使用(筛选期间用2μg/ml抗原以抗原涂布平板)，相反本发明解决了这种情况的问题，即可得到很有限量的抗原且甚至高度不纯。

优选的实施方案特征在于以表面抗原注射的哺乳动物是与表面抗原来源其中的哺乳动物物种不同的物种。

当存在许多种能诱导免疫应答的抗原时根据本发明的方法很适于制备单克隆抗体。

尤其当表面抗原具有恒定区和可变区，其中至少部分所述的可变区限定了所述表面抗原的特异性决定部分时，此情况存在。

根据优选的实施方案包括受体分子的物质用作包括细胞表面抗原的物质。

根据本发明的方法尤其适用于制备抗受体分子特异性决定部分的单克隆抗体。受体分子的特异性决定部分仅是受体分子的次要部分，受体本身是细胞表面上所有分子和因此抗原的次要组成部分。

根据本发明优选的靶子为T-细胞克隆，T-细胞克隆用于制备包括受体分子的物质。

T-细胞可用作整个细胞，或用于制备其膜部分。因此，在前一种情况下，术语制备，在这里，可能涉及仅仅分离T-细胞或重悬于不同的培养基。

根据优选的实施例步骤1的膜部分通过机械处理整个细胞而获得，并且包括细胞表面抗原的物质在缺乏佐剂时注射于哺乳动物。

两种措施有助于防止表面抗原体内构象的丧失。

此外，富集的含有B-细胞的细胞部分优选通过将该细胞部分与选自以下物质的含有结合载体细胞表面抗原的物质接触而进一步富集(步骤3)：j)整个细胞jj)获自所述的整个细胞的膜部分以及jjj)基本上纯化的细胞表面抗原，并且随后分离未结合到所述结合载体物质上的B-细胞与结合到该结合载体物质上的B-细胞，结合到该结合载体物质上的B-细胞包括进-步富集的细胞部分。

此进一步富集可命名为阳性筛选技术，特异性筛选特异的B-细胞。因此，虽然几乎得不到任何抗原，进一步富集可被完成。

根据优选的实施例顺磁小珠优先用作载体。

在富集过程中顺磁小珠的使用有利于分离想要的和不想要的B-细胞。

在筛选过程中不重要量的抗原也出现问题。根据优选的实施方案，在步骤5和6中至少一个步骤中的筛选用凝集分析进行，其中B-细胞克隆的上清液与涂布有抗体的载体接触，该抗体能够结合用于步骤1的注射哺乳动物物种的抗体和具有细胞表面抗原的整个细胞，并且检测凝集。

简单地混合B-细胞培养上清液、整个细胞和用能结合用于步骤1的哺乳动物物种抗体的抗体涂布的载体允许非常灵敏且快速地对合适克隆的检测而无需洗涤。

与整个细胞有关的但缺乏表面抗原的整个细胞可优选用作对照。

这允许丢弃假阳性克隆，并通过避免多余的小规模融合而节省时间。

根据本发明方法的优选实施方案，在步骤5中筛选出的B-细胞克隆与骨髓瘤细胞混合并进行微量-电融合(mini-electrofusion)。

微量-电融合允许很少量(如，数百个)细胞的有效融合。

本发明也涉及药物组合物，其中包括根据本发明制备的并与适当的赋形剂混合的单克隆抗体。

此外本发明涉及与T-细胞受体克隆型结构起反应的单克隆抗体。

这种单克隆抗体可用于诊断目的以及用于药物组合物的制备。

更具体地说T-细胞受体是与自身-免疫疾病，且尤其是类风湿性关节炎有关的T-细胞受体。

优选地单克隆抗体与HCgp-39反应性T-细胞克隆的T-细胞受体，且尤其与T-细胞克隆H.243(ECACC保藏号96103122)的T-细胞受体起反应。

合适单克隆抗体的具体实例为那些通过选自以下杂交瘤而产生的单克隆抗体，包括TCR69(ECACC保藏号，96103118)，TCR70(ECACC保藏号96103119)，TCR72(ECACC保藏号96103120)以及TCR83(ECACC保藏号96103121)。

正如上所述，本发明也涉及适用于类风湿性关节炎治疗的药物组合物，包括根据本发明的单克隆抗体并与适当的赋形剂混合。

最后本发明涉及选自用根据本发明方法制备的单克隆抗体和根据本发明的单克隆抗体的单克隆抗体的诊断用途。包括抗体的诊断试剂也是本发明的实施方案。

现在对本发明将参照下面的实施例作进一步详细解释，所述的实施例显示出完成用于制备对人类T-细胞受体克隆型特异的鼠单克隆抗体的本发明的最佳模式。

附图说明

图1：由抗H.243的MAb免疫沉淀的H.243 T-细胞表面分子的鉴定。SDS/PAGE在非还原条件(2、3和4道)或还原条件(5、6和7道)下于10％凝胶中完成。1道：10KD梯子标记；2道和5道：对照MAb；3道和6道：TCR83；4道和7道：抗-CD3，OKT3。

图2：抗克隆型MAb在Western印迹中识别TCRαβ。H.243的免疫沉淀TCR/CD3复合物在非还原条件下于10％SDS-PAGE凝胶中分离并随后转移至PVDF膜上。将该膜与MAb温育且最后通过用结合碱性磷酸酶的羊抗鼠Ig第二抗体检测结合的MAb。1道：10KD梯子标记，2道：TCR64，3道：TCR66，4道：TCR69，5道：TCR70，6道：TCR72，7道：TCR73，8道：TCR76，9道：TCR78，10道：TCR79，11道：TCR83，12道：对照MAb，13道：培养基对照。

图3：固定的抗-TCR MAb刺激人类T-细胞克隆H.243的增殖。由抗H.243的MAb诱导的增殖(TCR64到TCR83)与所示的对照MAb以及与为抗其它TCR的抗克隆型MAb的TCR44作比较。每个值代表每5分钟一式四份培养物的平均计数+/-标准差。

图4：与抗TCRMAb的预温育抑制或阻止人类T-细胞克隆H.243的抗原-驱动的增殖。a)抗H.243MAb的抑制(TCR64到TCR83)与所示的对照MAb和与为抗其它TCR的抗克隆型MAb的TCR44作比较。每个值代表每5分钟一式四份培养物的平均计数+/-标准差。b)强抑制MAb的剂量反应曲线；TCR64(开放圆圈)，TCR70(封闭三角形)，TCR78(开放正方形)，TCR83(封闭正方形)和对照MAb1(封闭圆圈)。每个值代表每5分钟一式三份培养物的平均计数。

图5：抗克隆型MAb在人类Th1-克隆H.243中诱导无反应性。固定的抗克隆型MAb或对照MAb1与H.243T细胞温育过液。从无反应性刺激物中去除细胞后，给予细胞逐渐增加浓度肽和DRB1^*0401匹配的APC的完全刺激。增殖通过³H-胸腺嘧啶掺入来测算。每个值代表每5分钟一式三份培养物的平均计数+/-标准差。

图6

无反应性H.243T细胞抑制反应性(non-anergic)H.243T细胞的应答。

固定的TCR76或对照MAb1与H.243T细胞温育过夜。然后，两种T-细胞群体以逐渐增加浓度的肽(或PHA)和APC以每孔2×10⁴个T细胞用于增殖分析。此外，与TCR76温育而得到的各种量的无反应性细胞与和MAb1温育而得到的2×10⁴个反应性细胞混合并进行增殖分析。A/N：无反应性细胞对反应性细胞的比值；1＝2×10⁴个细胞。增殖通过³H-胸腺嘧啶的掺入而测算。每个值代表一式三份培养物每5分钟的平均计数+标准差。

实施例

材料和方法

试剂

培养基：DMEM/HAM氏F12(Gibco目录号32500)补充以2500mg/l碳酸氢钠，2.3mg/l2-巯基乙醇，55mg/l丙酮酸钠，1.22mg/l乙醇胺，360mg/l，L-谷氨酰胺，4.5×10^-4mg/l亚硒酸钠，62.5mg/l青霉素钠和62.5mg/l硫酸链霉素(streptomycin sulphate)。在融合实验中，培养基进一步补充以13.61mg/l次黄嘌呤和3.83mg/l胸腺嘧啶。此培养基称为DMEM/HAM氏F12/HT。杂交瘤的筛选在补充以1％(V/V)的人类膀胱癌细胞系T24(T24CM)含IL-6上清和0.4μM氨基蝶呤的DMEM/HAM氏F12/HT中完成。

融合培养基：280mM肌醇，0.1mM醋酸钙，0.5mM醋酸镁和1mM组氨酸；电阻率：1.11·10⁴Ω.cm。成分溶于Milli-Q水中且随后的电导率以Milli-Q水或含1mM醋酸钙和5mM醋酸镁的溶液调至90μS/cm。

细胞培养

T-细胞克隆H.243源自类风湿性关节炎的病人。此Th1样的T-细胞克隆识别DRB1^*0401(属于MHC II类)中人类软骨gp-39(HCgp-39)的表位RSFTLASSETGVG(SEQIDNO：1)。此克隆的TCR特征为Vα8和Vβ9阳性。细胞常规培养于补充以10％FCS、20U/mlIL-2，5U/ml IL-4的DMEM/HAM氏F12中并且以抗原和组织相容抗原呈递细胞(APC)或以植物凝集素(PHA)和喂养细胞周期性地重新刺激。为了增殖分析胎牛血清(FCS)以正常的人类血清(NHS)代替。

T-细胞溶胞产物的制备和以TCR/CD3复合物负载小珠

重新刺激后10到14天，T-细胞以PBS洗并通过将它们以10⁸细胞/ml的浓度于根据Oettgen等(参考文献2)的提取缓冲液(10mM三乙醇胺，150mM NaCl，1mM Na²EDTA，1％毛地黄皂苷，100μg/ml亮抑蛋白酶肽，10μg/ml抑蛋白酶肽，1μg/ml胃酶抑制剂，1mM Pefabloc^AEBSF以及1，8mg/ml碘乙胺pH7.8)中温育(30分钟，0℃)而溶解。温和的清洁剂毛地黄皂苷允许提取完整的TCR/CR3复合物。核和细胞碎片通过16,000g4℃离心15分钟而去除且上清分装保存于-20℃直到用于B-细胞的筛选或免疫沉淀。

为了筛选特异性B-细胞，顺磁小珠以TCR/CD3复合物负载。

简言之，100μl羊抗鼠Ig偶联的顺磁小珠(SAM-小珠；Dynabeads110.02)与具有0.1％BSA的PBS中的22μg抗-CD3，OKT3温育(过夜，4℃)。以PBS/BSA洗小珠以后，加入相当于1.4×10⁸个细胞的T-细胞溶胞产物和相同体积(1.4ml)具有1％正常鼠血清的PBS-BSA。加入后者是防止B-细胞与小珠上的游离SAM结合位点结合。小珠悬液于4℃温育2到4小时并在使用前以PBS/BSA洗。

免疫

6周龄的雌性BALB/C小鼠以3-7周的间隔以5×10⁶个整个T-细胞(发明)或以相当于5×10⁷个细胞的TCR/CD3复合物负载的顺磁小珠(对照实验)免疫。使用不同的施用途径如表I所示。在使用佐剂的实例(对照实验)中，第一次注射以弗氏完全佐剂完成，随后的注射以弗氏不完全佐剂完成并且最后的加强没用佐剂完成。

抗-克隆型MAb的产生

6周龄的雌性BALB/C小鼠以3到7周的间隔腹膜内注射4次，每次用5×10⁶个PBS中的静息T-细胞。最后一次注射5天后，杀死小鼠并如前述(参考文献23，24)制备去除红细胞和单核细胞的脾细胞群体。这得到富含B-细胞的细胞部分，但相对于根据本发明步骤2的其它非特异性B-细胞来说并没有得到对所述细胞表面抗原特异的B-细胞的富集。

为了从这些脾细胞群体中预清除与人类CD3或TCRαβ恒定区反应的B-细胞，约3×10⁷个细胞与20μl以无关T-细胞克隆(Vα3·Vβ14阳性T-细胞克隆，SCRO.08A，但任何其它无关T-细胞将Vα3·Vβ14阴性(will do))TCR/CD3复合物负载的SAM小珠温育2次。然后，TCR可变区特异的B-细胞通过将得到的细胞悬液与以感兴趣T-细胞克隆(H.243)的TRR/CD3复合物负载的SAM小珠温育而筛选。每次温育于补充以10％小牛血清(Hyclone)和0.2％正常鼠血清的DMEM/HAM氏F12中室温进行90分钟。在这些温育期间，悬液每5分钟细心地弄匀，最后一次温育以后，小珠以DMEM/HAM氏F12，10％的小牛血清细心地洗5次并重悬于相同的培养基。

通过克隆扩增和前述的微量-电融合(23)，产生单克隆抗体的杂交瘤从这些筛选的B-细胞中产生。简言之，筛选的B-细胞与T-细胞上清(TSN)及50,000照射(2500拉德)的EL-4B5-细胞以终体积200μl补充以10％FCS的DMEM/HAM氏F12在96孔的平底的组织培养板中混合。在第8天，用感兴趣的T-细胞克隆或无关的T-细胞克隆按下述一步T-细胞凝集分析方法检测上清。产生有识别能力MAb的B-细胞培养物用于微量-电融合步骤。将这些B-细胞培养物的内容物与106NS-1骨髓瘤细胞(25)混合并通过以DMEM/HAM氏F12/HT洗而去除血清。然后，细胞以链霉蛋白酶溶液处理3分钟且随后用融合培养基洗。电融合通过以下方法于50μl融合小室中完成，包括30S、2MHz、400V/cm的交流电场接着进行10μs，3KV/cm矩形强场脉冲以及再次30S、2MHz、400V/cm的交流电场。最后，融合小室中的内容物转移至20ml选择培养基中并涂布于96孔微滴定平板上。融合8天后，检查培养物中杂交瘤的生长并再次以一步T-细胞凝集分析法筛选。

T-细胞凝集分析

抗-T-细胞抗体杂交瘤培养物的筛选和MAb与其它T-细胞交叉反应性的测定用一步凝集分析法完成。用半面积的微滴定平板将50μl的杂交瘤上清混合以20μl小珠/细胞悬液，含有2×10⁵个具有共价结合羊-抗-鼠Ig的顺磁小珠以及于DMEM/HAM氏F12中5×10⁴个感兴趣的T-细胞。于37℃温育2到3小时后，在显微镜下通过寻找细胞和小珠的聚集而检查凝集。

免疫沉淀和Western印迹

重新刺激10到14天后，洗T-细胞并以生物素标记细胞表面蛋白。简言之，T-细胞以5×10⁶个细胞/毫升的浓度与0.5mg/mlImmunoPure^硫代-NHS-生物素于PBS中室温下温育30分钟。随后，再次洗细胞并按上述溶解。用于免疫沉淀实验之前，通过与SAM-顺磁小珠温育预清除细胞溶胞产物一次。免疫沉淀通过将相当于10⁷个细胞的预清除溶胞产物与15μl以MAb(1ml杂交瘤上清)预负载的SAM-顺磁小珠温育而完成。然后，免疫沉淀物以PBS洗三次，于上样缓冲液中煮沸并在还原条件或非还原条件下，用Laemmli(参考5)和Mini-protean II系统(伯乐)于10％凝胶中进行SDS-PAGE。免疫印迹用PVDF膜根据Towbin等(参考文献6)而完成。非特异性结合位点通过将膜与补充以0.5％吐温20的PBS中的5％脱脂牛奶温育加以封闭。洗完后，印迹以PBS，0.5％吐温20，1％BSA，1％正常羊血清中的抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶室温1小时加以检测。最后，印迹以BCIP和NBT作为生色底物而显色。为了Western印迹研究，顺磁SAM-小珠按上述用OKT3作为免疫沉淀抗体和正常T-细胞溶胞产物以TCR/CD3复合物负载。在还原或非还原条件下于10％PAA-凝胶上的SDS-PAGE后，印迹与2.5ml杂交瘤上清温育。结合的抗体用碱性磷酸酶结合的羊抗-鼠Ig和BCIP/NBT按上述加以检测。

抗体介导的T-细胞增殖

平底微滴定孔涂布以PBS中40μg/ml的100μl羊抗-鼠Ig(过液，室温)。洗一次孔且然后与PBS中2μg/ml浓度的100μlMAb温育2小时。过量的游离MAb通过洗而去除并且加入补充以10％NHS的200μl DMEM/HAM氏F12中的2.5×10⁴个静息T-细胞。37℃温育2天后，细胞以0.5μCi[³H]-胸腺嘧啶脉冲标记并再温育16到18个小时。最后，细胞收获至玻璃纤维滤膜(glass fibre filters)且[³H]-胸腺嘧啶的掺入在Matrix 96^TM(Packard)上通过β计数加以检测。每个变量以一式四份加以检测。

抗体介导的抗原诱导增殖的抑制

平底微滴定孔接种以20μl杂交瘤上清，于补充以10％NHS的150μlDMEM/HAM氏F12中2×10⁴个静息T-细胞和1×10⁵组织相容MNC。37℃温育3小时以后，向培养物中加入50μl肽RSFTLASSETGVG。培养物再次于37℃温育2天且[³H]-胸腺嘧啶的掺入按上述加以检测。每个变量以一式四份加以检测。

用克隆型特异的Mab对无反应性的诱导

24孔培养板涂布以PBS中40μg/ml的1ml羊抗-鼠Ig(过夜，室温)。洗一次孔且然后与PBS中2μg/ml浓度的1mlMAb温育2小时，过量的游离MAb通过洗而去除且加入于2mlDMEM/HAM氏F12，10％NHS中的洗过的2×10⁶个静息T-细胞。其中需要的环孢菌素A(Sandoz，Bazel瑞士)，rIL-2，环己酰亚胺(Sigma，圣路易斯，MO，美国)或HLA-DRBl^*0401匹配的APC(3000拉德照射)在培养起始时加入。温育过夜后，平板于冰上冷却且T细胞通过吸管(pipetting)重悬。细胞以完全培养基洗1次并按下述用于T-细胞增殖分析，细胞因子分析和FACS分析。

T细胞抗原特异性的增殖反应于平底微孔培养物中检测，培养物中含有2×10⁴个T细胞，1×10⁵HLA-DRB1^*0401匹配的，照射的(3000拉德)的PBMC以及于200μlDMEM/HAM氏F12，10％NHS中的各种抗原浓度。37℃温育2天后，细胞以0.5μCi[³H]-胸腺嘧啶脉冲标记并再次温育16-18小时。最后，细胞收获至玻璃纤维滤膜上且[³H]-胸腺嘧啶的掺入于Matrjx 96上(Packard，Meriden，CT美国)通过气体闪烁加以检测。每个变量以-式三份加以检测。

结果

免疫

用佐剂的免疫(对照实验)没有产生任何含有能区分H.243和无关T-细胞(表1：免疫组II、III和IV)的抗体的血清。组V的血清滴度低(在凝集分析中为1∶100)，相反那些组I和II的血清滴度高得多(1∶1200)。

抗克隆型Mab的产生

用组I的脾细胞与无关T-细胞克隆，这里为H.258的TCR/CD3复合物负载的顺磁小珠温育得到许多玫瑰花环形细胞，表明成功地去除了许多CD3-和TCRαβ-反应性B-细胞。当无-玫瑰花环形成的细胞以相同T-细胞克隆无关的TCR/CD3-复合物进行再次预清除时，几乎没能观察到任何玫瑰花环形细胞。

与感兴趣T-细胞克隆的顺磁小珠温育以后，显微镜检查没能见到玫瑰花环形成。如果是特异性B-细胞的预期频率，这不足为怪。经有限稀释和克隆扩增36B-细胞以后发现上清凝集H.243而不凝集无关的T-细胞克隆H.258(表II)。有些B-细胞上清能凝集两种克隆，表明它们逃避了预清除程序。

此外，从表II中推断特异性B-细胞培养物的主要部分是非克隆型的因为不与任何T-细胞起反应的B-细胞也生长出来。然而，这不是一个问题因为经微量-电融合后，这些非特异性B-细胞的杂交瘤可筛选出来。将特异性B-细胞培养物中的18个进行微量-电融合。有些融合得不到T-细胞特异性的杂交瘤并且另外一些不能被克隆成稳定的细胞系。最终从18个微量-电融合中的11个中获得了稳定的杂交瘤。这11个MAb被进一步表征。这些MAb的同型抗原列于表III。

MAb的特异性

为了进一步研究MAb的特异性，进行免疫沉淀和T-细胞凝集检测以及Western印迹。

在非还原和变性条件下的SDS/PAGE表明所有的MAb能够在T-细胞克隆H.243的毛地黄皂苷溶胞产物中沉淀出约85KD的主要带和21KD的次要带。这分别与TCRαβ-复合物和CD3链ε/δ的分子量相一致。在还原条件下85KD的带解离成40和50KD的两条带，其分别与TCRα-和β-链的分子量相一致。其中一个抗H.243特异性MAb的免疫印迹与作为阳性对照的OKT3和作为阴性对照的无关MAb一起显示于图1。

表III显示MAb与6个Vβ9阳性T-细胞克隆，2个Vα8阳性T-细胞克隆和8个具有不同Vα和Vβ其它的T-细胞克隆的交叉反应性。抗体TCR74应被看作Vβ9特异性的因为其凝集所有Vβ9阳性T-细胞而不凝集其它细胞。其它的TCR抗体仅与H.243反应因此很可能这些抗体抗H.243的抗原结合部分因为与Vα8，Vβ9、TCRαβ恒定区、CD3和其它常见T-细胞表面分子的反应被排除。图2显示来自杂交瘤克隆TCR64、TCR66、TCR69、TCR70、TCR73以及TCR76MAb的抗体能够染色非还原的Western印迹上的TCR(85KD带)。图顶部的非特异性深色带源自免疫沉淀的抗体SAM和OKT3。在还原条件下的Western印迹中获得了与抗克隆型MAb没有染色的情况(结果未显示)，表明MAb识别由完整TCRαβ复合体形成的构象表位。

MAb诱导的T-细胞增殖

为了研究MAb是否能诱导H.243T-细胞的增殖，MAb固定于平底微滴定平板上并与T-细胞一起温育。虽然MAb之间具有很大的差异，图2显示它们中所有能够诱导H.243细胞的增殖。类似于抗-CD3(OKT3)的增殖以TCR64、TCR66、TCR70、TCR76和TCR79而获得。以为别的TCR抗-克隆型MAb的TCR44没有获得增殖。

MAb介导的抗原-诱导T-细胞增殖的抑制

此外研究了是否MAb组能够抑制抗原-驱动的H.243T-细胞的增殖。在此实验中，MAb与T-细胞和APC预温育且3小时后，以不同浓度的肽脉冲处理(pulsed)。图4显示了TCR64、TCR70、TCR76、TCR78和TCR83强烈地抑制抗原-驱动的增殖。以TCR83观察到多达98％的抑制。剂量反应曲线显示最大的抑制可用少至100ng/ml的TCR64、TCR70和TCR83而获得。TCR78有效性减少约10倍。抑制模式不依赖于是否加入最佳适度以下或饱和浓度的肽(结果未显示)。抗其它TCR(TCR44)的抗克隆型MAb没显示出任何的抑制。

抗-克隆型MAb诱导人类T-细胞克隆H.243对随后以抗原和APC刺激的无应答性

在缺乏协同刺激时已知T-细胞受体的占用诱导无反应性。以前我们发现固定于H.243的抗克隆型MAb可有功能地激发此克隆的TCR。因此，研究是否相同的抗体可诱导无反应性是有趣的。为此，10个不同的抗-克隆型MAb固定于24孔平板上并与H.243细胞温育过夜以产生无反应性刺激。然后，从平板移走T细胞并检测是否它们能对逐渐增加浓度的由照射的、DRB1^*0401-匹配的APC呈递的HCgp-39^262-277(SEQIDNO：3)作出应答。图5显示此应答被10个MAb中的8个完全抵消而与对照MAb1温育的H.243细胞仍然对APC呈递的肽应答良好。在更高的肽浓度时与TCR69和TCR83温育的T细胞应答显著减少但没有被完全抵消。

无反应性细胞抑制反应性细胞的应答

是否无反应性H.243细胞能够抑制反应性H.243细胞的应答也被研究。无反应性由TCR76诱导且反应性细胞获自与对照MAb1的温育。随后，增殖分析以肽HCgp-39^261-275(SEQ ID NO：2)完成，使用了不同的T-细胞群体即每孔2×10⁴个无反应性T细胞，每孔2×10⁴个反应性T细胞或每孔递减浓度的无反应性T细胞(4×10⁴，2×10⁴，1×10⁴和0.5×10⁴)和每孔2×10⁴个反应性T细胞的混合物。通过加入无反应性细胞，反应性细胞的应答以剂量相关的方式显著减少(图6)。用1μg/ml的抗原浓度获得了约90％增殖的减少且无反应性对反应性细胞的比为2∶1。以更高的抗原浓度观察到较少的增殖减少(5μg/ml时72％且25μg/ml时39％)。因此此实施例显示产生抗人类T-细胞受体的抗-克隆型单克隆抗体是可能的。此实验得到10个杂交瘤，其中的4个保藏于ECACC(Salisbury，UK)，如表III所示。此战略不需大量的T-细胞或足量的纯化TCR。根据本发明的方法是冗长重组方法有吸引力的替代，其中于同系小鼠细胞中表达的可溶性TCR被产生用于免疫步骤中。因此，与构象稳定性有关的可能问题也得以避免。因为在抗体诱导的T-细胞增殖检测和抗体介导的对抗原-驱动T-细胞增殖抑制(观察到达98％的抑制)的检测中单克隆抗体显示出不同的应答，这表明在相同的克隆型结构上识别到不同的表位。

如果被交联，所有的抗-克隆型单克隆抗体能够诱导H.243T-细胞的增殖。

已证明小量固定的抗-克隆型MAb可在自主反应(autoreactive)克隆中诱导无反应性。无反应性刺激以后，当重新刺激时由于缺乏IL-2基因的转录，T细胞未能增殖。此外，发现了下降的IFNg产量。

无反应性细胞的FACS分析表明无反应性不是TCR下行调节或缺乏游离TCR的结果。在共培养实验中，发现无反应性T细胞抑制相同克隆反应性细胞的应答。此旁观者(bystander)抑制导致90％的扩增抑制。该数据证明了克隆型-特异的抗体在体外的无反应能力。这种MAb可用于诱导和维持类风湿性关节炎中抗原-特异性T-细胞的耐受性。

在通过注射偶联至顺磁小珠上相当纯的TCR/CD3免疫复合物而免疫的小鼠(表I；免疫组IV)血清中，小鼠血清测得对用于免疫的特异性T-细胞比无关T-细胞更为阳性。然而，获得产生抗-克隆型单克隆抗体的杂交瘤是不可能的。尽管在从小量整个T-细胞免疫小鼠的血清中没有能证明感兴趣T-细胞对无关T-细胞的特异性，根据本发明的方法产生了能产生抗-克隆型单克隆抗体的杂交瘤。

不用说抗原结合片段可由根据本发明的单克隆抗体，例如用木瓜蛋白酶制成。单克隆抗体或其抗原结合片段也可被标记以利于它们的检测且本发明的范围包括所有这些形式。

也不用说用于去除非-特异性B-细胞的无关细胞优选与带有细胞表面抗原的细胞非常相象。

表I：免疫接种程序表和血清的特征描述

  免疫   组  抗原  佐剂  途径  凝集/FACS  T细胞1^*  T细胞2^*  (免疫)(无关)  增殖  诱导  Ag驱动  增殖的  抑制#  West  印迹  I  T细胞  无  ip(5x)  +++  +++  -  ++  -  II  T细胞；  TCR/CD3  有  ip；im；im；ip  +++  +++  -  ++  -  -  III  TCR/CD3  有  ip；im；im；im；ip  -  -  +/-  -  -  IV  TCR/CD3  有  sc；sc；sc；ip  -  -  +  -  -  V  TCR/CD3  无  is(5x)  +  +/-  +  -  -  正常小鼠血清  -  -  -  -  -

2个BALB/C小鼠组以整个T细胞或结合于顺磁小珠上的TCR/CD3复合物免疫。免疫按所示在佐剂存在或不存在的情况下完成。使用了不同的免疫途径，即：ip＝腹膜内；im＝肌肉内；sc＝皮下；is＝脾内(intrasplenic)。

特征描述小鼠血清在T-细胞凝集分析、FACS-染色以及Western印迹中的结合。功能特征描述以抗体-介导的T-细胞增殖分析和抗体介导的对抗原驱动T-细胞增殖抑制的测定来完成。

^*T细胞1＝用于免疫的T-细胞克隆；T细胞2＝无关的T-细胞克隆。

#+意为T-细胞增殖的抑制。

表II：抗-T细胞的特异性B细胞在EL-4 B-细胞培养物中的生长晕

    接种d的       孔数    涂层密度    具有B-细胞生    长晕的孔数    与H.243    的凝集    与H.258    的凝集    384    x    384    68    40    192    1/6x    171    13    7    192    1/36x    81    3    1

为了筛选抗克隆型特异的B细胞，对28×10⁶个淋巴细胞进行免疫小珠(immunobead)筛选程序。筛选出的B细胞以不同的涂布浓度扩增于EL-4 B细胞培养系统中且于第8天，测定上清液中与感兴趣T细胞(H.243)和无关T细胞(H.258)的凝集抗体。X：未测定的筛选出的细胞数

表III：不同种类T细胞与抗-TCRmAb的凝集

  mAb  同型抗原  与T-细胞的凝集  H.243¹⁾  6个Vβ9阳  性T细胞  2个Vα8阳  性T细胞  8个其它T  细胞  TCR64  IgG2a  +  -  -  -  TCR66  IgGl  +  -  -  -  TCR67  n.d.  +  -  -  -  TCR69  IgGl  +  -  -  -  TCR70  IgG2a  +  -  -  -  TCR72  IgM  +  -  -  -  TCR73  IgGl  +  -  -  -  TCR74  n.d.  +  +  -  -  TCR76  IgG2a  +  -  -  -  TCR78  IgM  +  -  -  -  TCR79  IgGl  +  -  -  -  TCR83  IgM  +  -  -  -  抗-Vβ9  IgG2a  +  +  -  -  抗-αβ  IgG2b  +  +  +  +  对照  mAb  IgGl  -  -  -  -

¹⁾H.243：Vα8在Vβ9阳性中(Vα8enVβ9positive)参考文献1.Moretta，A.，等(1985)抗产生白细胞介素-2的人类白血病T-细胞系个体基因型(idiotype)样结构单克隆抗体的筛选和特征描述。国际癌症杂志36：253-259页。2.Oetgen，H.C等(1986)与鼠T细胞抗原受体有关的T3一样蛋白复合物。自然320：272-275页。3.Steenbakkers，P.G.A.，等(1994)从预筛选的抗原特异性B细胞中有效地产生单克隆抗体。分子生物学报告19，125-134页。4.Steenbakkers，P.G.A.等(1992)一种产生人类和鼠抗体杂交瘤的新方法。免疫学方法杂志152，69-77页。5.Laemmli，U.K.(1970)在噬菌体T4头的装配过程中结构蛋白的切割。自然277：680-685页。6.Towbin，H.等(1979)蛋白从聚丙烯酰胺凝胶向硝酸纤维素膜的电泳转移：方法和一些应用。美国科学院院报76：4350-4354页。缩略语PBS      磷酸盐缓冲盐水BCIP     5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(indoylphospate)对-甲苯胺盐NBT      对-硝基蓝四唑鎓氯化物(p-nitro blue tetrazoliumChloride)BSA      牛血清白蛋白FCS      胎牛血清SAM      羊抗鼠TSN      T-细胞上清液MAb      单克隆抗体(抗体)制造商伯乐，   Richmond，CA，美国Gibco，  Paisley，苏格兰Hyclone，Logan，美国Packard，Meriden，CT，美国

序列表

(1)一般信息：

(I)申请人

(A)名称：Akzo Nobel N.V.

(B)街道：Velperweg76

(C)城市：Arnhem

(E)国家：荷兰

(F)邮编(ZIP)：6824 BM

(G)电话：0412 666379

(H)传真：0412 650592

(ii)发明名称：制备单克隆抗体的方法、单克隆抗体、药物组合物和诊断试剂

(iii)序列数：3

(iv)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBMPC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：13个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1

Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

1                 5                  10

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2

Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

1                 5                  10                  15

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：16个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly Ala Pro1                 5                  10                  15