细菌菌株和包含它们的药物组合物以及该菌株在预防和治疗疾病上的用途

摘要

本发明提供了具有下列特性的细菌菌株：(a)低于50％的7α-脱羟基酶活性，和(b)低于50％的胆汁酸去缀合活性；也提供了保持活性(a)和(b)的所述菌株的后代、突变体和衍生物；还提供了包含一种或多种这样的菌株的药物组合物和所述菌株在预防和治疗与胆汁酸改变的代谢有关的或由胆汁酸改变的代谢引起的疾病上的用途。

说明书

本发明涉及细菌菌株和包含它们的药物组合物以及该菌株在预防和治疗与胆汁酸改变的代谢有关的或由这种代谢引起的疾病上的用途。

肝胆汁是具有电解质组合的类似血浆的有色等张液体。胆汁的主要组分包括水(82％)，胆汁酸(12％)，卵磷脂和其它磷脂(4％)，以及未酯化的胆甾醇(0.7％)。其它成分包括缀合胆红素，蛋白质，电解质，粘液以及药物肝转化的最后产物，激素，等等。在基本条件下，胆汁的肝脏产生量是大约500-1000毫升/天。

主要的胆汁酸胆酸(CA)以及鹅胆酸(CDCA)从肝脏的胆甾醇合成，与甘氨酸以及牛磺酸缀合，并且被排泄到胆汁中。次要的胆汁酸，包括脱氧胆酸(DCA)和石胆酸(LA)，在结肠中作为主要的胆汁酸的细菌代谢物形成。其它胆汁酸，称为第三胆汁酸(例如：熊去氧胆酸-UDCA)在肠中随甾醇环上羟基的酶促差向异构化形成。

在正常的胆汁中，甘氨酸对牛磺酸缀合物的比是大约2∶1，而在胆汁阻塞患者中经常发现硫酸盐和胆汁酸的葡糖苷酸缀合物的增加的浓度。

肠微生物系统把胆汁酸转变成为不同的代谢物。这些生物转化包括在胆汁酸和牛磺酸或甘氨酸之间的键的水解，形成未缀合或自由的胆汁酸和牛磺酸或甘氨酸。因此未缀合的胆汁酸使得可以发生C3，C7，和C12位置上的羟基的氧化和在7α和7β位置上的脱羟基化。后一转化导致次要的胆汁酸DCA与LA的形成。主要的胆汁酸(脱缀合的但不是转化的)以及次要的胆汁酸被从肠腔再吸收并进入肝门血流。然后被肝胆囊摄取，与甘氨酸或牛磺酸缀合，并再分泌到胆汁(肠肝循环)中。

通常，胆汁酸池每日循环大约5至10次。所述池的肠吸收有大约95％的效率，因此，胆汁酸的粪便排出在0.3至0.6克/天的范围内。粪便排出被每日合成等值补偿。

因此，在胆汁中存在的胆汁酸池的组合是肝脏和微生物系统酶之间的复合相互作用产生的结果。

去缀合活性是许多细菌(需氧菌以及厌氧菌)共有的特征，但是在专性厌氧细菌中特别普通，所说细菌例如，拟杆菌属、真细菌界、梭状芽胞杆菌属、双歧杆菌属等等。细菌的大多数是抗甘氨酸和牛磺酸缀合物两者活性的；然而，它们中的一些有一定程度的特异性，取决于结合的氨基酸，以及结合至甾类化合物核上的氢氧化物的数量。由细菌水解酶的作用产生的游离胆汁酸可以由羟基类固醇脱氢酶(steroidodehydrogenase)氧化C3，C7和C12位置上存在的羟基。

对胆汁酸的代谢紊乱的兴趣来自假设胆汁酸和/或其代谢物涉及一些肝-胆汁和胃肠疾病的致病机理中：所说疾病是胆汁消化不良症，胆结石，急性和慢性肝病，结肠的炎症性疾病，等等。

在文献中胆汁酸疏水性与去垢性相关非常常见；次要的胆汁酸比主要的胆汁酸有更大的疏水性，脱羟基胆酸(DCA)比胆酸(CA)是实际上的更好的去垢剂。因此，在胆汁中DCA增加的浓度可以涉及：a)胆甾醇分泌的增加，具有增加的饱和指数；b)对肝脏细胞的细胞毒素作用。

因此，胆汁酸模式的定性的修正可能是一个决定性的因素，尤其在治疗以上提及的病理状态中。

这样，仍然需要有效的细菌菌株或者组合物，它们通过降低7α-脱羟基酶活性，同时降低去缀合，可以用于治疗和/或预防与胆汁酸代谢紊乱相关的疾病。

还没有发现任何细菌菌株能够以这样的方式定性修饰胆汁酸模式。

因此，本发明的一个目的是提供细菌新菌株，特别是革兰氏-阳性细菌，其在治疗和/或预防与胆汁酸代谢紊乱有关的或由胆汁酸代谢紊乱引起的疾病上有用。

本发明的另一个目的是提供包含一种或多种这样的细菌菌株并且在治疗和/或预防与胆汁酸代谢紊乱有关的或由胆汁酸代谢紊乱引起的疾病上有用的药物组合物。

以上目的和其它目的将在以下详尽描述期间变得更明显，它们由发明人达到了，发明人已发现具有降低的7α-脱羟基酶(dehydroxylase)活性或无该活性和降低的使胆汁酸去缀合(deconjugate)能力或无该能力的细菌菌株。这与原先已知的相反。因此，本发明提供了这些菌株在以有用的方式修饰胆酸以预防或治疗与胆汁酸代谢紊乱有关的或由胆汁酸代谢紊乱引起的疾病上的用途。

这样，在第一实施方案中，本发明提供了细菌新菌株，它们具有低于50％，优选地低于25％的7α-脱羟基酶活性，以及低于50％，优选地低于25％的缀合胆汁酸去缀合(deconjugation)活性。

根据本发明的菌株的本质特征在权利要求1中限定；具有所说特征的特定菌株在从属权利要求2至11中限定。

本发明也提供了用于预防和/或治疗与胆汁酸改变的代谢有关的或由胆汁酸改变的代谢引起的疾病的药物组合物，所说的组合物包含根据本发明的至少一种细菌菌株。根据本发明的组合物的本质特征在权利要求12中限定；所说组合物的特定实施方案在从属权利要求13至25中限定。

此外，本发明提供了根据本发明的至少一种细菌菌株在制备所说的药物组合物上的用途。所说用途的本质特征在权利要求26中限定，特定的实施方案在从属权利要求27至36中限定。

在本发明的上下文中，与胆汁酸代谢紊乱有关的或由胆汁酸代谢紊乱引起的疾病包括肝脏疾病消化道疾病，如失明环综合症，胆结石，肝硬化，慢性肝病，急性肝病，囊性纤维变性，肝内胆汁阻塞，肠内炎症性疾病，colonpathies，吸收障碍。该药物组合物也可以用于预防妇女在怀孕或尔后期间出现胆结石和用于进行减肥或吃规定的饮食的受治疗者。

细菌菌株的7α-脱羟基酶活性应低于低于50％，优选地应低于25％。所说的7α-脱羟基酶活性值是由以下实施例1描述的方法测定的那些。具体地说，于37℃在添加有2毫克/毫升甘氨胆酸(GCA)或2毫克/毫升牛磺胆酸(TCA)的15毫升特定的培养基中培养所研究的菌株的10⁷个细胞48小时，然后测定产生的7α-脱羟基化的产物的量。由下式计算7α-脱羟基酶活性的百分比值：

                                         培养48小时后

                                                GCA或TCA的质量基于上述，待施用的细菌菌株还应具有低于50％，优选地低于25％的缀合胆汁酸去缀合活性。通过用与描述的测定7α-脱羟基酶活性的培养方法相同的方法，接着测定所形成的脱缀合产物的量来测定脱缀合能力。用下式计算脱缀合活性：

                                                 培养48小时后

                                                 GCA或TCA的质量

本发明的细菌菌株可以肠道施用。优选地，本发明的细菌菌株口头施用。

虽然可以施用单一细菌菌株，但施用按照本发明的两种或多种细菌的混合物也是可能的。

虽然施用的细菌的确切的剂量随着患者的状况和体重、被治疗的具体的疾病以及被施用的菌株的性质而变化，但经施用10³到10¹³个细菌菌株细胞/克可以获得理想的结果。为获得本发明的好的效果，以在患者肠中置入其重要量的量和浓度施用是优选的。因此所说菌株以含有10³到10¹³个细菌菌株细胞/克(优选地是10⁸到10¹²个细菌菌株细胞/克)的组合物施用，并且所说组合物以使患者在治疗时在1到365天(优选地是在3到60天)期限内接着1克到20克菌株/天(优选地是1克到20克菌株/天)的用药方式施用或者在预防时根据经验的用药方式是优选的。所说细菌菌株可以以任何适合于肠内施用的形式施用，如胶囊，片剂，或口服的液体或者肠内施用的液体。

典型地，根据本发明的细菌菌株可以在诊断为代谢紊乱后施用。然而，在胆汁胆石的预防的情况之下，菌株也可以在受治疗者被确定为属于风险群(例如开始怀孕或开始进行减肥或吃规定的饮食)时施用。也可以在在患者的胆囊摘除之后施用本发明的菌株。

在一更为优选的实施方案中，当所治疗的疾病是肝硬化时，提供了共同施用乳果糖。合适地，乳果糖以100毫克到100克/天，优选地是1克到20克/天的量施用。

在另一个更为优选的实施方案中，提供了共同施用基于胆汁酸的制剂，如熊去氧胆酸或牛磺牛磺熊去氧胆酸。合适地，熊去氧胆酸或牛磺熊去氧胆酸以10毫克到3000毫克/天，优选地是50毫克到800毫克/天的量施用。

优选地，本发明的药物组合物包含的细菌菌株的浓度是10³至10¹³个细胞/克，优选地是10⁸至10¹²个细胞/克。药学上可接受的的载体可以是适合于肠内施用，并且与细菌菌株相容的任何载体，如右旋糖，碳酸钙，以及不同的添加物质，如淀粉，明胶，维生素，抗氧化剂，染料或改善味道的物质。

本发明的组合物也可以包含一个可有可无的药物组分，其与所使用的细菌相容，并能增强存在的有效成分的活性。抗胆碱能药物，抗组胺剂，肾上腺素能剂，抗溃疡剂，抗酸剂，antidiarroic和-抗炎症性药物，镇静剂，退热剂，利胆剂、抗风湿剂，止痛药物，利尿剂，防腐剂，抗脂血症剂，保肝药物以及在胃肠能动性上有活性的药物(例如trimebutine)可以是本文所提及的药物。

当治疗肝硬化时，更为优选的是药物组合物进一步包含乳果糖。合适地，组合物包含100毫克到100克/天，优选地是1克到20克/天的乳果糖。当治疗肝硬化和慢性肝炎时，药物组合物包含基于胆汁酸的制剂(如熊去氧胆酸或牛磺熊去氧胆酸)是优选的。合适地，组合物包含10至3,000毫克/天的这样的胆汁酸制剂，优选地是50至800毫克/天的熊去氧胆酸或牛磺熊去氧胆酸。

随着下列例证性实施方案的描述，本发明的其它特征会变得明显，这些实施方案用来说明本发明但不用来限制本发明。

实施例实施例1

试验了下列种：嗜热链球菌，屎链球菌，保加利亚乳杆菌，胚牙乳杆菌，婴儿双歧杆菌。在特定的营养培养基(15毫升)中重复培养各菌株(10⁷CFU)；＂CFU＂指＂菌落＂形成单位。

不同种所使用的培养基表婴儿双歧杆菌：MRS+0.5％葡萄糖(在稀释成20％无菌溶液灭菌之后添加)嗜热链球菌：  M17所有其它菌株：MRS

MRS培养基组成：     (克/升)

   通用胨              10.0克

   肉膏                5.0克

   酵母膏              5.0克

   磷酸氢钾            2.0克

   吐温80              1.0克

   二碱价柠檬酸铵      2.0克

   醋酸钠              5.0克

   硫酸镁              0.1克

   硫酸锰              0.05克

   制备：以50克/升溶解到蒸馏水中，在121℃灭菌15分钟-25℃时pH值6.5+-0.1。

M17培养基(Merck)的组成：   (克/升)

   大豆粉胨                   5.0克

   肉胨                       2.5克

   酪蛋白胨                   2.5克

   酵母膏                     2.5克

   肉膏                       5.0克

   乳糖                       5.0克

   抗坏血酸                   0.5克

   β-甘油磷酸钠              19.0克

   磷酸镁                     0.25克

   制备：以42.5克/升溶解到蒸馏水中，在121℃灭菌15分钟-25℃时pH值7.2+-0.1。

在厌氧条件下培养婴儿双歧杆菌，由于已知它是厌氧细菌。于37℃的培养24小时后，向每根试管添加相对于30毫克量的胆汁盐以获得2毫克/毫升的最终浓度。所使用的胆汁酸是：从西格马化学公司获得的甘氨胆酸(GCA)和牛磺胆酸(TCA)。各胆汁酸单独地添加至每一系列的细菌培养物中。

在培养48小时之后，2分钟内添加异丙醇3毫升。然后在400rpm下离心15分钟，并收集上清液(5毫升)。上清液在-30℃下冷藏直到被分析。由HPLC(高效液态色谱)测定缀合胆汁盐存在的百分比，其中采用装配有检测器二极管排列模式(Diode array mod)1000和Spherisorb5μmODS2C18反向柱，流动相由甲醇/缓冲磷酸盐(20mMol)(在水/乙腈/水(150∶60∶20∶20，体积比)中，pH值2.5)组成，流速0.85毫升/分钟，检测波长为205nm。在氮气下干燥的100微升待试样品用100微升流动相抽提，所述流动相包含浓度为2毫克/毫升的内标7α-OH-12α-OH-二羟基-58-胆烷酸(Calbiochem美国)。

与细菌培养物一起培养的胆汁酸的回收百分比由检测的胆汁酸的面积(GCA或TCA)与内标的面积的比计算。当在培养48小时后的细菌培养物中发现缀合胆汁酸的数量低于50％时，在二氧化硅60凝胶板上进行薄层色谱(TLC)，以检测CA和DCA的存在，用环己烷/异丙醇/醋酸为流动相(30∶10∶1，体积比)。在每一平板上上样20微升酒精提取物，20微升CA和DCA的溶液，20微升CA，以及20微升DCA。平板在室温展开后用硫酸处理并加热到145℃，直到出现有色斑点。

去缀合实验的结果(表I)说明，用GCA试验的16个菌株中的5个能够完全使添加至培养物中的胆汁酸去缀合，如以前文献中报道的和所有研究者广泛知道的。令人惊奇地是，十种菌株对能使GCA去缀合但不完全，范围从9％至90％(表I)。在需氧和厌氧细菌之间没有任何区别。两种菌株，嗜热链球菌YS52和婴儿双歧杆菌Bi6对GCA没有任何去缀合活性。此外，菌株YS52不进攻胆汁酸-牛磺酸键。

16个试验的菌株中仅有一个能使TCA全部去缀合：婴儿双歧杆菌Bi6。

脱羟基作用实验的结果(表II)说明16个菌株中仅有一个能使GCA完全脱羟基。6个菌株一点也无脱羟基活性：YS25；SF2；SF4；LA3；LA10；Bi6。其它的菌株能使GCA对脱羟基但不完全，范围从9％至90％。对TCA而言，7个菌株根本不能使其脱羟基：YS52；SF3；LA3；LA10；LB1；LB7；LB77。1个菌株使TCA完全脱羟基；其它菌株以一定的百分比使TCA脱羟基。

                          表I

在培养48小时之后由细菌培养物产生的GCA和TCA去缀合百分比细菌                    保藏号     GCA％    TCA％嗜热链球菌YS46          I-1668     9        9嗜热链球菌YS48          I-1669     17       11嗜热链球菌YS52          I-1670     0        0屎链球菌SF2                        100      3屎链球菌SF3             I-1671     27       0屎链球菌SF4                        100      12保加利亚乳杆菌LA3                  100      80保加利亚乳杆菌LA10                 100      95胚牙乳杆菌LB1           I-1664     9        0胚牙乳杆菌LB3           I-1665     20       12胚牙乳杆菌LB7           I-1666     14       0胚牙乳杆菌LB77          I-1667     20       0婴儿双歧杆菌Bi2                    80       15婴儿双歧杆菌Bi3                    90       10婴儿双歧杆菌Bi4                    100      26婴儿双歧杆菌Bi6                    0        100

                          表II

在培养48小时之后由细菌培养物产生的GCA和TCA脱羟基百分比细菌                    保藏号     GCA％    TCA％嗜热链球菌YS46          I-1668     9        9嗜热链球菌YS48          I-1669     17       11嗜热链球菌YS52          I-1670     0        0屎链球菌SF2                        0        3屎链球菌SF3             I-1671     27       0屎链球菌SF4                        0        12保加利亚乳杆菌LA3                  0        0保加利亚乳杆菌LA10                 0        0胚牙乳杆菌LB1           I-1664     9        0胚牙乳杆菌LB3           I-1665     20       12胚牙乳杆菌LB7           I-1666     14       0胚牙乳杆菌LB77          I-1667     20       0婴儿双歧杆菌Bi2                    80       15婴儿双歧杆菌Bi3                    90       10婴儿双歧杆菌Bi4                    100      26婴儿双歧杆菌Bi6                    0        100这些菌株已以下列保藏号保藏在CNCM-国立微生物保藏中心-InstitutPasteur嗜热链球菌YS46    I-1668嗜热链球菌YS48    I-1669嗜热链球菌YS52    I-1670屎链球菌SF3       I-1671胚牙乳杆菌LB1     I-1664胚牙乳杆菌LB3     I-1665胚牙乳杆菌LB7     I-1666胚牙乳杆菌LB77    I-1667

下列菌株保藏在Centro Ricerche Sitia-Yomo S.p.A.-Strada perMerlino，3-ZELO BUON PERSICO(米兰)-意大利，并可从该保藏单位获得，各菌株由以下指出的识别号区别：屎链球菌SF2                    SF2屎链球菌SF4                    SF4保加利亚乳杆菌LA3              LA3保加利亚乳杆菌LA10             LA10婴儿双歧杆菌Bi2                Bi2婴儿双歧杆菌Bi3                Bi3婴儿双歧杆菌Bi4                Bi4婴儿双歧杆菌Bi6                Bi6

这些结果显示我们试验的菌株的大多数具有使胆汁酸去缀合的低的能力，并且有菌株一点也不去缀合。这一观察是惊人的，因为还没有已知乳酸细菌使胆汁盐去缀合。而且，明显的是，菌株的酶对结合到侧链上的特异性胆汁酸是选择性的。在这种研究中，最清楚的例子是婴儿双歧杆菌，这一菌株不能使甘氨酸-缀合胆汁酸去缀合，但是能使牛磺酸-缀合的胆汁酸完全去缀合。一些其它菌株(LB1，LB7，LB77，SF3)不能使TCA去缀合，但在一定程度上能使GCA去缀合。

总之，已发现了去缀合和脱羟基能力弱的或没有能力的菌株。实施例2

三个健康自愿者在用每克包含1×10¹¹个嗜热链球菌YS52细胞的lactobacilli制剂处理(每天6克，共28天)后，试验他们的胆汁酸含量。在开始处理之前和12小时饥饿后，将管插入受试者中，在用蓝肽刺激后，收集胆汁，于-80℃冷冻。用回波描记术估价胆囊收缩，由Rx(荧光透视法)检查所述管子在十二指肠的第二个部分中的位置。

在4周治疗之后，对受试者第二次插管，并收集胆汁。试验以前描述的一些胆汁酸在胆汁样品中的含量。结果在表III中示出。

                       表III胆汁酸                 病人#1    病人#2    病人#3

                   前  后    前  后    前后Glychenodeoxycholic    32  15    22  15    2812Glycodeoxycholic       6   5     9   2     43Glycourscdeoxycholic   1   5     1   7     14牛磺胆酸               9   26    15  25    1221脱氧牛磺胆酸           1   3     5   8     39注：(胆汁酸按亲水能力顺序列出，其与去垢性成反向关系)牛磺胆酸牛磺脱氧胆酸GlycourscdeoxycholicGlycadeoxycholicGlychenodeoxycholic

这一实验证实实施例1中所示的结果，如果施用本发明的目标菌株，则对一种主要的胆汁酸有较低的去缀合作用。所获得的结果是在肠肝循环中更长地保持主要的胆汁酸。

胆汁酸的性质在表III的注释中指出。因此，按照这些结果，施用选择的细菌菌株可以降低胆汁酸的去垢性，从而降低细胞溶解活性。实施例3

用包含嗜热链球菌YS46和YS48(两种菌株)、保加利亚乳杆菌LB1，LB7和LB77(三种菌株)处理14个慢性肝炎患者。对于制备包含各菌株的重量的相同分数的混合物而言，在与其它的混合之前，使各菌株达每克150×10⁹个细胞的浓度。每天施用6克所说的混合物，共28天。肝脏酶在处理前和处理后测量，结果示于表IV中。

                           表IV

用细菌混合物处理对肝脏酶天冬氨酸氨基移转酶(AST；SGOT)

          和丙氨酸氨基转移酶(ALT；SGPT)的影响

病人                   AST(SGOT)           ALT(SGPT)

                       前     后           前     后

#1                     92     59           102    46

#2                     89     67           96     42

#3                     174    86           97     39

#4                     121    91           102    66

#5                     116    81           111    55

#6                     156    87           94     76

#7                     163    66           69     37

#8                     78     64           122    57

#9                     109    39           87     86

#10                    166    70           102    48

#11                    56     24           118    62

#12                    131    83           96     79

#13                    137    86           94     74

#14                    84     87           144    114

平均                   119    71           102    63

标准偏差               36     19           17     21

配对数据的t试验        P＜0,001            P＜0,001