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染色体21基因标记,组合物及其使用方法

摘要

本发明提供了编码人EHOC-1蛋白的分离的核酸以及其所编码的分离的受体蛋白。另外还提供了含有本发明核酸的载体,与核酸进行杂交的探针,用其转化的宿主细胞,其反义寡核苷酸及含其的组合物,特异连接于本发明多肽的抗体及含抗体组合物,以及表达本发明蛋白的转基因非人哺乳动物。

著录项

  • 公开/公告号CN1166837A

    专利类型发明专利

  • 公开/公告日1997-12-03

    原文格式PDF

  • 申请/专利权人 塞达斯-西奈医疗中心;

    申请/专利号CN95196064.4

  • 发明设计人 朱利·R·考伦伯格;山川和弘;

    申请日1995-11-08

  • 分类号C07K14/47;C12N15/12;C12Q1/68;C12N15/11;C12N5/10;C07K16/18;A61K48/00;

  • 代理机构中原信达知识产权代理有限责任公司;

  • 代理人王达佐

  • 地址 美国加利福尼亚州

  • 入库时间 2023-12-17 12:56:30

法律信息

  • 法律状态公告日

    法律状态信息

    法律状态

  • 2006-01-04

    专利权的终止未缴年费专利权终止

    专利权的终止未缴年费专利权终止

  • 2003-12-17

    授权

    授权

  • 1998-02-11

    实质审查请求的生效

    实质审查请求的生效

  • 1997-12-03

    公开

    公开

说明书

                本发明背景技术

在分子遗传学上人们一项主要的工作是作人基因组的图谱。人基因组图谱化一般包括使用一些方法,例如原位荧光杂交(FISH),体细胞杂交分析或随机克隆指纹法,对基因组的DNA片断在它们的染色体上进行排序。相应于标记的多态位点的DNA片断可通过基因连锁分析进行排序。多态位点之间的距离可用减数分裂的重组频率进行估算。但是,由于在分子水平分辨率低并且重组频率与物理距离并不线性相关,使用这些方法并不能轻易地得到基于估算距离的高分辨率的图谱。

各种障碍,例如难以获得高信息量的标记以及缺乏平均分布于染色体上的识别标志,因而是当前已知基因图谱的主要缺陷。大多数的图谱标记是由DNA杂交法分析的限制片断长度多态(RFLPs)。虽然基于这些标记的图谱已在一些疾病的主要图谱描绘中起到了很大作用,但它们在一些应用中仍显不足,这些应用包括罕见单因子疾病的图谱描述,精确适于基因识别的连锁图距,对于导致复杂性状的位点的图谱描绘。

基因连锁图谱是应用于人体生物学研究的一项重要技术,尤其是对于疾病分子基础的描述。实际上,研究人遗传疾病的最常用的方法之一是克隆基于染色体位置的相应基因。因此,基因连锁图谱可以加速对于与单基因疾病有关的基因及与多因子病症有关的基因的识别及图谱制作,并且基因连锁图谱对于载体探测及遗传病症的产前诊断也有用。详细的连锁图谱也是作基于克隆的物理图谱及对整个染色体的DNA排序的先决条件。

人染色体21是作大规模人基因组图谱尝试的一个范例。作为最小的人染色体,染色体21具有大约50兆(Mb)的DNA。在估计存在于染色体21上的2000个基因中人们已知的不足1%。由于其对家族的阿耳茨海默氏病(FAD)、Doun氏综合症(DS),肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)及Finnish进行性肌阵挛性癫痫的明显作用,染色体的高分辨图谱有着特别的吸引力。基于与外围着丝粒的遗传连锁,导致FAD的基因缺陷已在染色体21上定位。编码与阿耳茨海默氏相关的淀粉样β蛋白(APP)的前体的基因也已图谱定位于染色体21上,所述淀粉样β蛋白是阿耳茨海默氏病(AD)的老年噬斑和脑血管的淀粉样沉淀的主要成分。

作出这样一个大跨度图谱需要对克隆基因片断中的界标进行识别和定位。当对于克隆片断的尺寸有足够的界标时,就形成了相邻单位图谱(contigs),并且同时界标被排序。目前,YAC,或酵母人工染色体,被用于作大部分人基因组图谱。YAC允许克隆的片断≥约500Kb。于是,在YAC文库的运用中已遇到了一些困难。例如,在各种YAC文库中,一部分克隆由共克隆事件形成,即将不相关的DNA片断包含到一个单克隆中。高百分比的YAC克隆,特别是具有高分子量插人片断的克隆,是嵌合的。嵌合克隆图谱定位于染色体的多个位点并且因此妨碍了作图谱及分析的过程。另一个YAC克隆所特有的问题是由不能克隆或不稳定因而容易重排和缺失的DNA链段造成的。

细菌人工染色体(BAC)为YAC系统提供了一个选择。BAC减轻了YAC的最困难的方面,例如高比率嵌合和克隆不稳定性。BAC基于E.Coli单拷贝质粒F因子并能够对尺寸大于300Kb的DNA片断进行可靠增殖。BAC具有一些物理性能,这些性能使得BAC适于作物理图谱,包括易于操纵和无嵌合。无嵌合和增殖大的外来插入DNA的能力使得BAC成为染色体漫步和产生相邻物理图谱的最佳候选者。

对染色体21进行分子描述的需要直接来自于与几种人遗传疾病的联系。包含此染色体的相邻单位图谱(contigs)可以加速关于这些疾病原因的识别。实际上,一旦被遗传连锁和细胞遗传分析所定位,详细的图谱为基因组区段提供了及时的信息,包括任何病理位点。

因此,有必要对染色体21位点上的大量基因进行识别,定性和作图谱,这样可促进将高分辨染色体图谱尽快转换成生物学上,医学上和诊断上的应用。本发明满足了这种需求并且还提供了有关的方便。

                本发明概述

本发明提供了编码人EHOC-1蛋白的分离核酸及其所编码的分离的受体蛋白。另外还提供了含有本发明核酸的载体,与核酸进行杂交的探针,用其转化的宿主细胞,其反义寡核苷酸及含其组合物,特异连接于本发明多肽的抗体及含抗体组合物以及表达本发明蛋白的转基因的非人哺乳动物。

                附图简述

图1显示了HPE1的共有区的物理图谱。

图2显示了与HPE1共有区相关的EPM1共有区的物理图谱。YAC克隆,BAC克隆和EHOC-1的位置由密集的条纹块指明。

图3A显示的区域中,EHOC-1与转膜蛋白具有同源性。区域1代表与大鼠钠通道蛋白III相重叠的34个氨基酸中29.4%的同一性。区域2代表与沙门氏菌typhimurin的磷酸甘油酸传递系统调节蛋白相重叠的103个氨基酸中20.4%的同一性。图3代表与Arabidopsis thaliana的由焦磷酸提供能量的液泡膜质子泵相重叠的55个氨基酸中29.1%的同一性。区域4代表与Saccharanyces cerevisiae的类肌球蛋白相重叠的30个氨基酸中24.0%的同一性。区域5代表与兔心肌ryanodine受体相重叠的39个氨基酸中17.9%的同一性。区域6代表与大鼠心肌钠通道蛋白α亚基相重叠的62个氨基酸中21.0%的同一性。区域7代表与大鼠肾架肌钠通道蛋白α亚基相重叠的27个氨基酸中40.7%的同一性。区域8代表与营养不良素(dystrophin)富含半胱氨酸区相重叠的33个氨基酸中30.3%的同一性。

图3B表示通过连锁不平衡研究计算出的距EPM1座位的遗传距离的比较(Lehesjoki等人,Hum.Mol.Genet.),2:1229-1234(1993))。

图4表示剪切变异体的推断位置及编码EHOC-1多肽的cDNA的不同同型的Poly(A)+附着位点。

                本发明详述

进行性肌阵挛癫痫(PMEs)是一个不均一的疾病群,其特征为肌阵挛,癫痫发作进行性神经病学上的衰退包括共济失调和痴呆,Berkovic等人,New Engl.J.Med.,315:296-305(1986)。Unverricht-Lundborg型的PME(EPM1)在芬兰和地中海地区是惯常具有血亲关系的常染色体退化病症,在芬兰它的发病率至少为1∶20,000。遗传连锁分析表明EPM1的座位在染色体21q22.3上,Malafosse等人,Lancet,339:1080-1080(1992),并且将也是PME的一个成员的拉福拉病排除出该地区,Lehesjoki等人,神经学(Neurology),32:1545-1150(1992)。连锁不平衡分析使之可能将代表区域缩小为300kb,跨距PFKL,D21S25和D21S154的位点,Lehesjoki等人,人类分子遗传学(Hum.Mol.Genet.),2:1229-1234(1993);Lehesjoki等人,人类遗传学(Human Genetics),93:668-674(1994)。

通过连锁不稳定分析将自动免疫的多腺疾病型I(APECED)图谱定位于染色体21q22.3,Aaltonen,J.等人,自然遗传学(Nature Genet.)8:83-87(1994)。APECED是一种常染色体退化病症,它会引起各种组合的甲状腺旁腺体、肾上腺皮层、性腺胰脏β细胞、甲状腺以及胃壁细胞衰竭。APECED的附带病症包括脱发、白斑、肝炎、慢性粘膜皮肤念珠菌病、牙釉质和指甲的营养不良及角膜病。APECED通常在儿童时期就表现出来,但组织的特异病状可在整个成年期出现。APECED座位图谱定位于D21S49和D21S171的500kb之内。

全前脑病(Holoprosencephaly)的特征是受损伤的胚胎前脑分裂和不完全的脑中部发痛,后者表现为大范围的脸中部畸形,包括独眼、头部发育不全的猴头畸胎、颌前骨的发育不全、距离不足以及单个上颌中间门齿。最常见的相关的染色体异常包括dup(3p)、del(79)、染色体13的缺失、13三体性、18三体性以及三倍体(Munke,美国医学遗传学杂志(AM J Med Genet),34:237-245(1989))。其病原学是不均一的,它可以包括染色体2、3、7、13、18和21的非整倍性。为了将HPE1的代表区域缩小,通过原位荧光杂交和定量Southern印迹剂量分析法,在两个HP病人中表现出的特征为21(q22.3)缺失。对于较少的缺失,D21S25,D21S154,D21S171及D21S44的区域被缺失掉,而D21S42和D21S49的区域则不。结合这些数据与先前无全前脑病(holopresencephaly)表型的21q22.3(D21S112-ter)缺失的报告,表明导致全前脑病(holoprosencephaly)的区域跨度包含PFKL和ITGB2(CD18)的区域。已发表了四个具染色体21异常的全前脑病(holoprosencephaly)的病例。Estabrooks等人描述了染色体21(q22.3)的微量缺失(Estabrooks等人,美国医学遗传学杂志(AM J Med Genet)36:306-309(1990)),推测该区域是全前脑病(holoprosencephaly)(HPE1)的一个座位。

在本说明书中描述了关于该EPM1-APECED-HPE1代表区域的BAC(细菌人工染色体)相邻图谱(Contig),(Shizuya等人,美国自然学术科学进展(Proc.Natl.Acad.Sci),89:8794-8797)的建立以及使用直接cDNA选择技术从该相邻图谱中分离新基因。

为了分离导致这些疾病的基因,使用Uni-Zap XR(Stratagene,LaJolla,CA)从一14周21三体性胎脑建立了一个cDNA之库。95%以上的克隆具有范围为1-4kb(平均2kb)的插入基因。另外,对于21q22.3区域的BAC(细菌人工染色体)应用了一直接的cDNA选择方法。

将Sau3AI接头连接于从-21三体性胎脑合成的cDNA上。在用Sau3A进行消化后,将第2对接头连接到cDNA上,该cDNA接着与包含代表区域的生物系标记的BAC DNA进行杂交。cDNA/BAC DNA杂交分子被捕捉到涂有磁珠的链霉亲和素上,洗去非特异性的cDNA,然后将特异性杂交的cDNA洗脱出并随后用PCR进行扩增。经过两次选择PCR产品进行亚克隆并进行分析。Southern印迹分析表明30个片断中的21个(70%)生原始BAC所特有的带。用这些片断作为探针,可将cDNAs 3kb,4kb和5kb)从文库中分离出来,5kb cDNA亚克隆(EHOC-1)图谱定位于D21S25的邻近区,并且与其它转膜基因表现出同源性。这些基因的位置图谱定位于全前脑病(holoprosencephaly),EPM1和APECED所在的共有区域。

对5kb cDNA的DNA序列分析显示一条3570bp的完整的编码序列,它所揭示的氨基酸序列与其它转膜蛋白包括三钠通道蛋白具有同源性(SEQ ID No:1-2,图3)。

通过使用包含PFKL,D21S25,D21S154和CD18的序列标记位点的PCR筛选将5个BAC克隆从总的人基因组DNA BAC文库中分离出来(Shizuya等人,美国自然学术科学进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),89:8794-8797(1992))。具有这些BAC克隆和YAC克隆的HPE1-EPM1-APECED共有区的物理图谱表示于图1和图2中。BAC-1(230kb)和BAC-2(210kb)对D21S25是阳性的。BAC-3(170kb)对D21S25和PFKL是阳性的。对EcoRI消化的BAC DNA的琼脂糖凝胶电泳和Southern印迹分析表明这三种BAC是相互重叠的。BAC-4与BAC-3是等同的。BAC-5(100kb)对CD18是阳性的。

直接的cDNA选择作用于横跨共有区的5个BACDNA(其中四个相互重叠)。对亚克隆DNA的EcoRI消化表明10%的克隆是嵌合的。非嵌合克隆的插入基因的平均尺寸为400bp。通过使用EcoRI-消化的BACDNA Southern印迹分析了40个所选cDNA的非嵌合亚克隆。28个克隆(70%)在BAC印迹上显现单一信号,6个克隆(15%)显现重复性,另外6个克隆(15%)在这些印迹上不显示任何信号。使用这些亚克隆的插入基因DNA作为探针,筛选出21三体性胎脑cDNA文库。三个含Poly(A)+尾的重叠的cDNA(3kb,4kb5kb)被分离出并被指定为EHOC-1。

这三个重叠的EHOC-1 cDNA亚克隆用于Southern印迹分析,该分析使用EcoRI-消化的BAC DNA印迹。只有BAC-1显示单一复带信号,表明这些cDNA源自BAC-1。信号带的同一尺寸表明这些克隆相互重叠。对EHOC-1 5kb cDNA克隆的完整序列的分析和对3kb和4kb克隆的部分序列分析表明3kb克隆的全部序列和4kb克隆的部分序列均包含于5kb克隆中。可是4kb克隆的3′末端不同于5kb克隆的末端,这表明了EHOC-1 cDNA的剪切变异体的存在。对全部9条人cDNA克隆(2.7kb-7.2kb)的进一步特征描述中,交替剪切和/或多poly(A)+连接位点很明显(见图4)。

例如,SEQ ID NO:4包含3′端未翻译的EHOC-1 cDNA的附加1801个核苷酸,它延伸(以EHOC-1 mRNA/cDNA的某些同型)恰至SEQID No:1的核苷酸5107之后。除了开始于紧邻SEQ ID No:1的核苷酸5107之后的Poly(A)+连接位点外,另外六个Poly(A)+连接位点得以阐明。这六个连接位点出现在SEQ ID No:4上相应于核苷酸:10,310,1149,1155,1798和1801的核苷酸位置上(参见图4,分别为克隆CDF7,CEH181/cDF4,cEH30,cEH33,cEH38,以及cEH21/cEH25)。

使用5kb EHOC-1 cDNA插入基因的Northern印迹分析在多个成人组织上(心脏,大脑,胎盘,肺,肝脏,骨架肌肉,肾脏,胰脏)显示三个转录本(5.3kb,7.5kb和8kb)。使用来自EHOC-1 5KB cDNA亚克隆的插人基因作为探针在来自正常人体的淋巴细胞中进行荧光原位杂交。在染色体21q22.3上可看见离散信号从而证明了座位的存在。

使用人和鼠大脑组织对人和鼠EHOC-1 cDNA克隆的组织原位杂交分析表明EHOC-1被普遍表达,但突出表现在神经细胞中。海马的配位基脑回和成年鼠的小脑中的蒲肯野氏细胞都是显示相当高的信号的组织。由于在EPM1病人中蒲肯野氏细胞的显著丧失,EHOC-1在蒲肯野氏细胞中的强烈表达增加了该基因作为进行性肌阵挛癫痫病因的代表性。

5kb cDNA的完整序列显示了3570bp(1190个氨基酸;SEQ ID No:2)的开放阅读框架。起始密码子ATG位于一个完好的共有序列内,Kozak,M.,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),196:947-950(1987);Kizak,M.,核苷酸研究(Nuc.Acid Res.),15:8125-8148(1987)。用登记于Genbank/EMBL的基因对该开放阅读框架的氨基酸序列的同源性研究表明该基因产物与包括三种钠通道蛋白(图3)多种转膜蛋白是同源的。

用一个约5kb的人EHOC-1 cDNA克隆(cDF9)作为探针筛选鼠胎脑cDNA文库(Stratagene,La Jolla,CA)。两个同源cDNA克隆被分离出并被标为cM01(3.5kb)和cM06(3.0kb)。cM06克隆已被部分排序并列于SEQ ID No:6中。SEQ ID No:6列出的229个碱基对序列编码鼠EHOC-1蛋白的一个片断并且它与SEQ ID No:1的核苷酸1913-2141的人EHOC-1 cDNA具有75.4%的同源性。

已知人的一些神经紊乱是由钠通道(Ptacek等人,细胞(Cell),67:1021-1027(1991);Rojas等人,自然(Nature)354:387-389(1991);McClatchey等人,细胞(Cell),68:769-774(1992);Ptacek等人,神经元(Neuron),8:891-897(1992)),钙通道(Ptacek等人,细胞(Cell),II:863-868(1994);Jurkut-Rott等人,人类分子遗传学(Hum.Mo1.Genet.),3:1415-1419(1994)),以及钾通道(Browne等人,自然遗传学(Nature Genet),8:136-140(1994))的突变引起的。通过使用BLAST计算机程序(Altschal,S.J.,等人,分子生物学杂志(J.Mol.Brol.),215:403-410(1947)),发现在356<->401 a.a.处有一个fibronectin区(CxV.....YxC)。分析还表明基元(Sxxx(I,L)E)出现在462,670,708,716,730和1078。进一步在各种蛋白质databases中寻找该基元,发现它出现三次或更多次的情形非常少。该基元存在于,例如,大鼠软骨特异蛋白聚糖核蛋白,肌球蛋白,果绳sevenless(4拷贝),果蝇Prospero(4拷贝),以及果蝇Serendipity(3拷贝)。后三个是发育中的突变体。Sevenless基因导致胀缺陷,Prospero基因导致轴突路径寻找缺陷。而Serendipity基因导致细胞构成缺陷。因此,假定轴突路径缺陷与EHOC-1的表型相关联是合理的。起始于777的区域与多药物抗性基因和果蝇rutabaga基因具有一些同源性。rutabaga基因与果蝇感知相关。

因此,本发明提供了分离的核酸,该核酸编码一个新的EHOC-1蛋白,这些核酸来自于人染色体21,特别是在座位q23.2,该座位是引起PME,HPE1及APECED的突变的位点。由该基因编码的蛋白质具有多种转膜区。对EHOC-1的约5kb cDNA克隆的分析表明cDF9由多于23个外显子组成。

术语“核酸”(也称作聚核苷酸)包括RNA以及单链和双链的DNA和cDNA。如本文所用的,词语“分离的”意指核酸表现一种在自然界不发生形式的核酸。分离编码EHOC-1多肽的核酸的一种措施是使用本领域技术人员熟知的方法,用自然的或人工设计的DNA探针去探哺乳类的基因组文库。从EHOC-1基因得到的DNA探针对于该目的特别有用。编码EHOC-1多肽的DNA和cDNA分子可用来从人、哺乳类或其它动物源获得互补基因组的DNA,cDNA和RNA,或者通过筛选cDNA或基因组文库,用来分离相关cDNA或基因组克隆,所用的方法将在下面详细描述。核酸的实例有编码EHOC-1多肽的RNA,cDNA或分离的基因组DNA。这些核酸具有与SEQ ID No:1或SEQ ID No:6所显示的基本相同的编码序列。本发明还包括不同于SEQ ID No:1或SEQ IDNo:6显示的核酸,而是具有相同的表型,即那些编码一种与SEQ ID No:2所列的氨基酸序列基本相同的蛋白质的全部或某片断的核酸。

表型相似的核酸也称作“核酸的功能等同物”。如本发明所用的,短误“核酸的功能等同物”包括的核酸的特征是轻微的或不重要的序列变化,从而它们与在此公开的核酸以基本相同的方式作用而产生相同的蛋白质产品。特别是,核酸的功能等同物编码多肽,该多肽与在此公开的相同或者具有保守氨基酸变化。例如,保守变化包括用一个非极性残基替换一个非极性残基,或者用一个带同种电荷的残基替换一个类似的带电残基。这些变化包括那些被熟练技术人员认为基本上不改变蛋白质三级结构的那些表现。

另外还提供了编码EHOC-1多肽的核酸,根据遗传密码的简并性,该核酸并不需要在特异杂交条件下与本发明核酸进行杂交。编码本发明多肽的优选核酸由编码与SEQ ID No:2所列的基本相同的氨基酸序列的核苷酸组成。可选择地编码本发明多肽的优选核酸在高度严格条件下与SEQ ID No:1或SEQ ID No:6所列的核酸序列的几乎全部序列,或其大部分(即,典型地至少15-30个核苷酸)进行杂交。

这里所用的杂交的严性指的是使多核苷酸杂交稳定的条件。如本领域技术人员所知,杂交的稳定性是钠离子浓度及温度的函数。(参见,例如,Sambrook等人,分子克隆:实验室手册第二版,(MolecularCloning:A Latoratory Manual)2d Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory1989);在此引入作为参考)。

另外也提供了由本发明核酸编码的分离的肽,多肽和/或蛋白质,该蛋白质是EHOC-1多肽。EHOC-1多肽组成一条长度上约为1190个氨基酸的蛋白质。编码人EHOC-1多肽的完整的氨基酸序列列于SEQ IDNo:2。另外,SEQ ID No:6列出了编码鼠EHOC-1蛋白片断的一条229个碱基对的鼠cDNA序列。

如本文所用的,术语“分离的”指的是无细胞成分和/或通常与在体外环境中的天然物相关的污染物的蛋白质分子。本发明多肽和/或蛋白包括任何天然的等位变异体,以及其重组形式。EHOC-1多肽可用本领域技术人员熟知的多种方法进行分离。对于本发明蛋白质的分离和纯化的可用的方法包括,沉降、凝胶过滤、离子交换、反相和亲和层析。其它熟知的方法描述于Deutscher等人,蛋白质纯化指导:酶学方法(Guideto Protein Purification:Methods in Enzymology,Vol.182,AcademicPress,1990),该文献在本文中引作参考。可选择地,本发明分离的多肽可用所述的熟知的重组方法得到,例如,Sambrook等人,同上,1989中。

制备本发明多肽的一个实例是在合适的宿主细胞,例如细菌细胞、酵母细胞、两栖动物细胞(即,卵母细胞)、或者哺乳动物细胞中,使用本领域熟知的方法表达编码EHOC-1的核酸,并且再次运用熟知的方法收获所表达的多肽。可将本发明的多肽直接从用表达载体进行转化的细胞中分离出来,这将在下面详细描述。本发明多肽、生物活性片断以及功能等同物也能用化学合成的方法进行生产。如这里所用的,“生物活性片断”指的是SEQ ID No:2中的氨基到序列所代表的多肽的某部分,它可装配成一个由乙酰胆碱激活的Ca2+可透过的阳离子通道。使用应用生物系统公司(Applied Biosystems,Inc.Model 430A or 4301A)的430A型或431A型自动肽合成机(加拿大,福斯特城),利用制造商提供的化学知识,可以生产合成多肽。

如本文所用的,术语“EHOC-1”指的是自然纯化或重组表达生产(即,分离的或基本纯)的蛋白质,该蛋白质含有可预示潜在的转膜区的高度疏水区,它与多种转膜蛋白具有同源性,所述转膜蛋白包括钠通道蛋白、钙通道蛋白以及钾通道蛋白,这些蛋白包括由原始转录的可选择剪切产生的、由mRNA编码的变异体,所述转膜蛋白还进一步包含保留一或多个前述性能的片断。如本文所用的,短语“功能多肽”指的是,例如,配体的连接引起了EHOC-1蛋白质的转录活化。更特别地,一个“功能发明多肽”的兴奋剂激活可诱使蛋白质产生信号。

使用以下短语对本发明核酸、多肽或蛋白质进行修饰:“重组表达/生产”、“分离的”或“基本上纯的”,指的是用这种方式被人工生产出的,并且从它们的天然体外细胞环境中分离出来的核酸、肽、多肽或蛋白质。人的这种干涉的结果是本发明的重组核酸、多肽以及蛋白质具有相应的自然产生的蛋白质所不具备的用途,例如对选择性药物或化合物的识别。

具有“基本的序列同源性”的序列指的是与本发明核酸具有至少约75%,优选约80%,更优选约90%的同一性的核苷酸序列;以及与本发明多肽一般具有至少75%,优选约85%,更优选约95%的同一性的氨基酸序列。但是,人们还发现,含有少于以上描述的同源性水平的多肽或核酸也包含在本发明的范围之内,所述多肽或核酸以剪切变异体或被保守氨基酸取代或被简并密码子取代进行修饰的形态出现。

本发明提供了有效连接于RNA转录的启动子的分离的聚核苷酸,以及其它调节序列。如本文所用的,短语“有效连接”指的是聚核苷酸与核苷酸的调节和效应物序列例如起动子,增强子,转录及翻译的中止位点,以及其它信号序列的功能关系。例如,聚核苷酸和起动子的有效连接指的是聚核苷酸和起动子之间物理和功能关系,通过一个特异识别并连接于启动子的聚合酶DNA的转录从起动子开始,这样,启动子引导RNA从聚核苷酸的转录。

启动子区域包括特异的序列,这些序列足以使RNA聚合酶进行识别,连接和转录起始。另外,启动子区域还包括调节RNA聚合酶的识别、连接以及转录起始活性的序列。这些序列可以是顺式作用或应答于反式作用的因子。根据调节的性质,启动子可以是组成的或被调节的。启动子的实例有SP6、T4、T7、SV40早期启动子、细胞肥大病毒(CMV)启动子、鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)类固醇-可诱导启动子、莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)启动子,等等。

含有启动子以及可以与聚核苷酸有效连接的克隆位点的载体在本领域已被熟知。这样的载体可以在体内或体外进行RNA的转录,并且它们可从Stratagene(LA Jolla,CA)和Promega Biotech(Madison,WI)等处购得。为了优化表达和/或体内转录,有必要移走、加上或改变克隆的5′端和/或3′端未被翻译部分,从而消除多余的、潜在不适宜选择翻译起始密码子或其它可能在转录或翻译水平上干涉或降低表达的序列。可选择地,共有核糖体连接位点可被插人到紧邻启动密码子的5′端以加速表达。(参见,例如,Kazak,生物化学杂志(J.Biol.Chem.),266:19867(1991))。同样地,编码同样的氨基酸的可选择密码子,为了加速转录,可被取代用于编码EHOC-1聚核苷酸的序列从而加速转录(例如,可优选采纳宿主细胞的密码子可以减少富含G-C区域的存在,等等)。

另外也提供了包含本发明核酸的载体。载体的实例有病毒,例如棒状病毒(baculoviruses)和逆病毒,噬菌体,粘粒,质粒以及其它常用于本领域的重组载体。使用本领域熟知的方法将聚核苷酸插入到载体基因组内。例如,在适宜的条件下,将插入基因和载体DNA与一限制酶进行接触,从而在每个分子上产生互补末端使得它们可互相配对,并且在连接酶的作用下可连接到一起。可选择地,可将合成的核苷酸接头连接到限制性聚核苷酸的末端。这些合成的接头包含相应于载体DNA中特定限制位点的核酸序列。另外,含有终端密码子和适宜限制位点的寡核苷酸可进行连接用于插入载体,所述载体含有,例如,下列部分或全部:选择性标记基因,例如为了在哺乳动物细胞中选择稳定和瞬间转染子的新霉素基因;来自高中平转录的人CMV的速发早期基因的增强子/启动子序列;转录终止和为mRNA稳定性的来自SV40的RNA处理信号;SV40复制的多形瘤起点和进行适当游离基因复制的ColE1;多变的多种克隆位点;用于有义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子。其它方法在本领域是熟知的并可采用的。

另外还提供了包含编码EHOC-1多肽的核酸的载体,适宜于在细菌细胞、酵母细胞、两栖动物细胞(即,卵母细胞),哺乳动物细胞以及其它动物细胞中表达。另外载体还含有调节因子,这些调节因子对于细菌、酵母、两栖动物、哺乳动物或动物细胞中的核酸的表达是必需的,所述细胞相对于编码EHOC-1多肽的核酸进行定位以允许其表达。

本发明所用的,“表达”指的是核酸转录成mRNA并且翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果核酸来自基因组DNA,当选择适宜的真核细胞作为宿主时,表达可以包括mRNA的剪切。表达所需的调节因子包括连接RNA聚合酶的启动子序列以及为了与核糖体连接的转录起始序列。例如,细菌表达载体包括启动子如1ac启动子以及用于转录起始的SD(Shine-Dalgarno)序列和起动密码子AUG(Sambrook等人,同前)。同样地,真核表达载体包括异源或同源的启动子,所述启动子用于RNA聚合酶II、下游加A信号、起始密码子AUG、以及用于与核糖体分离的终止密码子。这些载体可从市场购得,或用本领域熟知的方法所描述的序列进行装配,例如,以上所述建立常用载体的方法。表达载体对于生产表达本发明多肽的细胞是有用的。

本发明提供了重组表达EHOC-1多肽的转化的宿主细胞。转化宿主细胞的一实例是哺乳动物细胞,该细胞包含适于在哺乳动物中表达的质粒。质粒包含编码EHOC-1多肽的核酸以及表达本发明蛋白必需的调节元素。许多哺乳动物细胞可用作宿主细胞,包含,例如,鼠成纤维细胞NIH3T3、CHO细胞、HeLa细胞、Ltk-细胞等。如上所述的表达质粒通过本领域熟知的方法能用来转染哺乳动物细胞,所述方法如磷酸钙沉降、DEAE-葡聚糖、电穿孔、微量注射或lipofection。

在真核细胞表面重组表达的EHOC-1多肽包含至少一个EHOC-1多肽,或可以包含由宿主细胞编码的肽和/或由异源核酸编码的亚基的混合物。

本发明提供了包含核苷酸序列的核酸探针,所述核苷酸序列能与包含于编码EHOC-1多肽的核酸中的序列进行特异杂交,此序列例如可以是包含于SEQ ID No:1或SEQ ID No:6所列的核苷酸序列的编码序列。所本文所用的,“探针”是具一核苷酸序列的单链DNA或RNA,所述核苷酸序列包括至少15个列于SEQ ID No:1或SEQ ID No:6序列中的相邻碱基。建立探针的优选区包括编码序列的5′端和/或3′端、ORF中的序列、预测编码转膜区的序列、预测编码细胞质环的序列、信号序列、配体连接位点,等等。cDNA克隆的全部或片断也可用作探测和分离相关基因的探针。当片断用作探针时,优选地,cDNA序列可来自cDNA的羧基末端的编码部分,更优选地,cDNA序列可包括cDNA序列的预测转膜区的编码部分。使用,例如,Kyte和Doolittle的方法,分子生物学期刊(J.Mol.Biol.),157:105(1982),基于对推断的氨基酸序列的水疗法分析可预测转膜区域。

在另一实施方案中,EHOC-1基因组DNA被设想用作诊断探针。例如,已经发现G(鸟嘌呤)向A(腺嘌呤)的转变发生在基因组内显子序列,该序列在EHOC-1基因中外显子7上游的约22对碱基对处。人们设想这种G到A的基因组转变在PNE病人中是纯合的。这样,人们设想在相应于SEQ ID No:5的核苷酸94的基因组核苷酸位置上的突变与PME疾病有关。SEQ ID No:5的核苷酸117-263基因外区序列对应于SEQ ID No:1的核苷酸1176-1322。这样,能够探测SEQ ID No:5的核苷酸94的这种转化的来自SEQ ID No:5的探针被设想用于本发明。

本发明所用的短语“特异杂交”指的是多核苷酸识别核酸序列的能力,所述核酸是互补的,并通过互补碱基对之间的氢键形成双螺旋的区段。核酸探针技术对本领域熟练技术人员是熟知的,所述技术人员可清楚认识到这些探针在长度上可变化很大,并可用可探测试剂,例如放射性同位素、荧光染料,等等,很容易进行探针的探测。本发明探针对于探测编码EHOC-1多肽的核酸的存在很有用。例如,探针可用于原位杂交来对在其中进行本发明基因表达的生物组织进行定位。另外,通过使用对基因组的或cDNA文库的同源筛选,或者通过本领域技术人员熟知的扩增技术,与编码EHOC-1多肽的核苷酸序列的核酸互补的合成寡核苷酸作为探针可用于探测本发明基因、与它们相关的mRNA,或者用于分离相关基因。

另外也提供了具有一序列的反义寡核苷酸,所述序列能与编码EHOC-1多肽的mRNA的任何部分特异连接从而防止mRNA的翻译。反义寡核苷酸可以具有能与编码EHOC-1多肽的cDNA序列的任何部分特异连接的序列。本发明所用的术语“特异连接”指的是核酸序列的识别互补核酸序列的能力以及通过互补碱基对之间氢键的形成而形成双螺旋区段的能力。反义寡核苷酸的一个实例是包含核苷酸的化学类似物的反义寡核苷酸。

本发明也提供了包含一定量的如上所述的反义寡核苷酸和能够通过细胞膜的可接受的疏水载体,所述反义寡核苷酸通过透过细胞膜并与编码EHOC-1多肽的mRNA特异连接阻止翻译而有效降低EHOC-1多肽的表达。能够透过细胞膜的可接受疏水载体包含与特异选择的细胞类型的受体相连接的结构,因而所述载体可被选择的细胞类型所吸收。所述结构可以是已知的结合于细胞型特定受体的蛋白质的某部分。

反义寡核苷酸组合物对于抑制编码本发明多肽的mRNA的翻译很有用。合成的寡核苷酸,或其它反义化学结构被设计用于与编码EHOC-1多肽的mRNA连接并抑制mRNA的翻译,从而作为组合物它们抑制组织样品或受试对象中与EHOC-1相关的基因的表达。

本发明提供了通过利用合成的反义寡核苷酸组合物(此后称作SAOC)调整EHOC-1多肽的表达水平的方法,所述SAOC抑制编码这些多肽的mRNA的翻译。构建合成寡核苷酸,或设计用来识别并选择地与mRNA连接的其它反义化学结构与SEQ ID No:1或SEQ ID No:6所示的核苷酸序列的某些部位互补。为了通过注射给药于受体,在血液中或在实验室细胞培养条件下,将SAOC设计为稳定的。SAOC设计为根据SAOC的物理和化学性能能够透过细胞膜从而进入细胞质,所述性能使得SAOC能够透过细胞膜,例如,通过设计小的、疏水的SAOC化学结构,或者根据细胞中的能识别和将SAOC运输到细胞中特定的运输系统。另外,通过使SAOC成为可被特异的细胞吸收机制识别的靶目标,SAOC可被设计为仅仅给药于某些选择的细胞群,所述机制只在选择的细胞群中连接和吸收SAOC。例如,SAOC可被设计为与仅发现于如上所述某一细胞类型的受体连接。SAOC也被设计为识别或选择性连接于目标mRNA序列,所述序列对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:6所示的序列中包含的序列。SAOC设计为通过连接和诱导mRNA的降解使目标mRNA序列失活,所述mRNA的降解可通过,例如,核糖核酸酶I消化,或通过干涉翻译调节因子或核糖体抑制mRNA目标序列的翻译,或包含其它化学结构,例如内剪子序列或者降解或化学修饰目标mRNA的反应化学基团。当定向作用于mRNA靶时SAOC显示以上性能(见Cohen等人,尖端技术(TIPS),10:435(1989)以及Weintraub,美国科学(Sci.American),January(1990),pP.40;两者在此都引作参考)。

本发明还提供了包含可接受的载体和单独或相互结合的任意分离的、纯化的EHOC-1多肽,其活化片断,或纯化、成熟的蛋白质和其活化片断的组合物。这些多肽或蛋白质可重组获得,化学合成或从天然原料纯化得到。本发明所用的术语“可接受的载体”包含任意标准的药物学上的载体,例如磷酸盐缓冲的盐溶液、水和乳化液例如油/水或水/油乳化液,以及各种类型的润湿剂。

另外还提供了具有与本发明的EHOC-1多肽特异反应性的抗体。抗体的活性片断包含在“抗体”的定义中。

可通过本领域已知的方法,利用本发明的多肽、蛋白质或它的某些部分作为抗原生产本发明的抗体。例如,通过本领域熟知的方法可生产多克隆和单克隆抗体,所述方法可如Harlow和Lane,抗体:实验室手册(Antibodies:A laboratory Manual),(Cold Spring Harbor Laboratory 1988)中所述,在此引入作为参考。本发明多肽可用作免疫原来产生这样的抗体。可选择地,可制备合成肽(使用市场上可获得的合成剂)并用作免疫原。可用本领域熟知的方法进行氨基酸序列分析从而确定是否它们编码相应多肽的疏水或亲水区。变化的抗体例如嵌合的、人化的、CDR-嫁接的或双功能的抗体也可用本领域熟知的方法进行生产。这些抗体也能通过所述的杂交瘤、化学合成或重组方法进行生产,所说的方法描述于,例如,上述的Sambrook等人和Harlow和lane的文献之中。反肽和反融合的蛋白质抗体都可被利用。(参见,例如,Bahouth等人,药学科学动向(Trends Pharmacol.Sci.),12:338(1991);Ausubel等人,分子生物学的流行规则(Current Protocols in Molecular Biology),(John Wileyand Sam,NY 1989),在此引入作为参考)。

本发明的抗体也可用于分离本发明的多肽。另外,这些抗体在探测本发明多肽的存在、以及染色体定位和结构及功能区的分析上很有用。探测EHOC-1多肽在细胞表面的存在的方法包含将该细胞与特异连接于EHOC-1多肽的抗体进行接触,所述的条件允许抗体与多肽的连接、探测与细胞相连的抗体的存在,从而探测细胞表面本发明多肽的存在。关于该多肽的探测,抗体可用于体外诊断或体内显影方法。

对于在样品中对目标多肽进行体外探测有用的免疫的步骤包括利用可探测抗体的免疫分析。该免疫分析包括,例如,ELISA,Pandex显微荧光测定分析、凝集作用分析、流动血细胞计数、血清诊断分析和免疫组织化学染色步骤,所述方法均为本领域熟知的方法。抗体可通过本领域熟知的各种方法探测。例如,可将一可探测标记直接或间接连接到抗体上。有用的标记包括,例如,放射性核苷酸、酶、荧光原、色(系)原以及化学发光标记。

另外,本发明抗体可用于调节活动物体内、人体内、或生化组织或从中分离的流体内的EHOC-1多肽的活性。因此,含有载体及一定数量具对EHOC-1多肽特异性的抗体的组合物对于阻断自然发生的配体与本发明多肽的连接是有效的。引向EHOC-1多肽分子的抗原决定基的单克隆抗体也可用于该目的,所述EHOC-1多肽分子存在于细胞表面,并且具有的氨基酸序列与SEQ ID No:2所示的EHOC-1多肽的细胞表面抗原决定基的氨基酸序列基本相同。

本发明还提供了能够表达编码EHOC-1多肽的核酸的转基因非人哺乳动物。另外也提供了能够表达编码发生突变的EHOC-1多肽的核酸的转基因非人哺乳动物,所述多肽已不能表现正常活性,即,不能表达天然的EHOC-1。本发明也提供了具有染色体组的转基因非人哺乳动物,该基因组包含与编码EHOC-1多肽的核酸互补的反义核酸,所述EHOC-1多肽被安置成可被转录成与编码EHOC-1多肽的mRNA互补的反义mRNA,所述多肽和其杂交从而减少了其翻译。核酸可另外包含可诱导启动子和/或组织特异性调节因子,从而表达可被诱导,或被限制于特异的细胞类型。核酸的实例是具有与SEQ ID No:1或SEQ ID No:16所示的编码序列基本相同的编码序列的DNA或cDNA。非人转基因哺乳动物的实例是转基因鼠。组织特异性决定因子的实例是金属疏基组氨酸三甲基内盐(metallothionein)启动子和L7启动子。

通过培育转基因动物可建立阐述EHOC-1多肽的生理和行为规则的动物模型系统,在这些转基因动物中利用了一些技术改变了EHOC-1多肽的表达。这些技术的实例包括通过微量注射、反病毒感染或本领域技术人员熟知的其它方法,将正常的或突变的编码EHOC-1多肽的核酸插入到适宜受精的胚胎中,从而产生转基因动物。(参见,例如,Hogan等人,(Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual)对鼠胚胎的操作:实验室手册,(Cold Spring Harbor Laboratory,1986)。另一种技术,在转基因动物中具有天然基因座位的突变或正常基因的同源重组,可用于改变表达的调节或EHOC-1多肽的结构(参见,Capecchi等人,科学(Science),244:1288(1989);Zimmer等人,自然(Nature),338:150(1989);在本文引入作为参考)。同源重组技术在本领域是熟知的。同源重组用重组或突变基因代替天然(内源)基因,从而生产出一种动物,该动物不能表达天然(内源)的蛋白质组却能表达,例如,能导致EHOC-1多肽变化的表达的突变蛋白质。相对于同源重组,微量注射将基因加入到宿主基因组内,而不移走宿主基因。微量注射可生产一种既能表达内源又能表达外源EHOC-1蛋白质的转基因动物。可诱导启动子可连接到核酸的编码区从而提供了一种调节转基因表达的方法。组织特异性调节因子可连接到编码区从而可允许转基因的组织特异性表达。转基因动物模型系统以于体内筛选化合物进行特异配体的识别很有用,所述特异配体即兴奋剂或拮抗剂,它们能激活或抑制蛋白质反应。

本发明核酸、寡核苷酸(包括反义的)、含其载体、转化的宿主细胞、多肽以及它们的组合,以及本发明的抗体,都可用于体外筛选化合物从而确定某化合物对于本发明多肽的作用是潜在的兴奋剂或是拮抗剂。这些体外筛选分析提供了关于本发明多肽的功能和活性的信息,这些信息能有利于对能与一或多种多肽、肽或蛋白质进行特异性相互作用的化合物的识别和设计。

按照本发明的另一实施方案,提供了识别与EHOC-1多肽连接的化合物的方法。本发明蛋白质可用于竞争性结合的分析。这样的分析可提供对大量化合物的快速筛选从而确定哪些化合物,若有的话,能与EHOC-1蛋白质连接。随后,可对进行连接的蛋白质进行更详细的分析,从而进一步确定是否这些化合物以对本发明蛋白质的调节器、兴奋剂或拮抗剂进行作用。

在本发明的另一实施方案中,提供了一种生物分析法用以识别调节本发明多肽的活性的化合物。按照该方法,将本发明多肽与一“未知”或试验物质进行接触(当测试拮抗剂的活性时需要报告基因结构的存在),在与“未知”或试验物质进行接触之后,监测多肽的活性,而那些引起报告基因结构被表达的物质被识别制作为EHOC-1多肽的功能配体。

按照本发明另一实施方案,可将重组表达本发明多肽的转化的宿主细胞与一试验化合物进行接触,并且通过将试验化合物存在是否时EHOC-1调节的反应(经过报告基因表达)的比较,或将试验细胞或对照细胞(即,不能表达EHOC-1多肽的细胞)与化合物存在时的反应进行比较从而评价其调节效果。

本发明中所用的,对本发明多肽的“活性调节”的化合物或信号指的是这样的化合物或信号,它们能改变EHOC-1多肽的活性从而使得本发明多肽的活性在该化合物或信号存在与不存在时不同。特别地,这样的化合物或信号包括兴奋剂或拮抗剂。兴奋剂包括能激活EHOC-1蛋白质表达的化合物或信号。可选择地,拮抗剂包括干涉EHOC-1蛋白质表达的化合物或信号。典型地,拮抗剂的效果被看作对兴奋剂诱导的蛋白质激活的阻抑。拮抗剂包括竞争性和非竞争性拮抗剂。竞争性的拮抗剂(或竞争性封闭剂)与特异于兴奋剂结合的位点进行作用或相接近。非竞争性拮抗剂或封闭剂通过与兴奋剂作用位点以外的位点相互作用使得多肽的作用失效。

如本领域技术人员所知的,识别调节EHOC-1活性的化合物的分析方法通常需要对一对照物进行比较。一类“对照物”是细胞或培养物,它们与经化合物处理的试验细胞或试验培养的经过基本相同的处理,其特征是“对照”细胞或培养物并不作用于化合物。例如,在使用电压钳电生理步骤的方法中,仅通过改变浸浴细胞的外部溶液,同样的细胞可在化合物存在或不存在的情况下进行测试。另一类“对照”细胞或培养物可以是与转染细胞相同的细胞或培养物,除了“对照”细胞或培养物并不表达天然蛋白质之外。因此,在相同的反应条件下,将转染细胞对化合物的反应与“对照”细胞或化合物对同样化合物的反应(或无反应)进行比较。

在本发明的另一实施方案中,可通过将多肽与有效量的至少一种由上述生物分析法识别出的化合物进行接触,来调节EHOC-1多肽的活化。

参考以下非限制性的实施例对本发明进行较详细的描述。

                实施例1

        BAC相邻单位图谱(Contig)的建立

对全部人基因组DNA的BAC文库的建立描述于Shizuya等人的,美国自然学术科学进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),89:8794-8797(1992)。由PCR使用STSs PFKL,D21s25,D21S154,CD18)对BAC克隆进行筛选。这些BAC克隆的座位由原位荧光杂交进行确认。在用NotI消化DNA之后跑脉冲电场凝胶电泳可测定BAC克隆的插入尺寸。

                       实施例2

                   直接的cDNA选择

除去一些修正外,直接选择步骤与Morgan等人的,核酸研究(Nucleic Acid Res.),20:5173-5179(1992)中描述的相同。使用TRIregion TM(Molecular Research Center,Inc.)将全部RMA从14周21三体性胎脑中分离出。使用Poly(A)Quick mRNA分离试剂盒(STRATAGENE)对Poly(A)+进行分离。用1μg寡聚(dT)15或0.1μg任意的六聚体,从5μg的21三体性胎脑Poly(A)+RNA中利用SuperScriptTM Choice System(GIBCO BRL)合成双链的cDNA。全部的合成反应用Gene Cleen II试剂盒(BI0101,Inc.)进行纯化,然后进行激酶化。将Sau3AI连接物与cDNA进行连接,所述cDNA随后用Sau3AI进行消化。反应用Gene Clean进行纯化。将MboI连接剂连接到cDNA上并且反应用Gene Clean进行纯化(Morgan等人,核酸研究20:5173-5179(1992))。使用MboI连接剂的一条单链(5 ′CCTGATGCTCGAGTGAATTC3′)(SEQ ID No:3)作为引物由PCR对从合成的产物进行扩增。PCR的循环条件是在100μl的1×PCR缓冲剂(Promega)、3mM MgCl2、5.0单位的Taq聚合酶(Promega)、2μM引物及0.2mMdNTP中进行40个循环的94℃/15秒、60℃/23秒、72℃/2分钟。

使用QIAGEN质粒制备5个BAC DNA(总共2.5μg)并用Nick翻译试剂盒(Nick Translation Kit)和生物素-16-dUTP(BoehringerManneheim)进行标记。在100μl杂交缓冲剂(750mM NaCl,50mMNaPO4(PH7-2)、5mMEDTA,5×Denhardt′s,0.05%SDS和50%甲酰胺)在42℃下作用2小时,将3μg热变性的PCR扩增的cDNA与3μg热变性的COT1 DNA(BRL)进行退火。预杂交后,加入1.2μg热变性生物素标记的BAC DNA并在42℃下保温16小时。cDNA-BACDNA杂化物用乙醇进行沉降并溶于60μl 10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA中。加入40μl 5MNaCl后,将DNA与磁珠(DynabeadsM-280,Dynal)在25℃下保温1小时,进行轻微的转动以使DNA与磁珠接触。通过移液于400μ12×SSC中,放入磁容器(MPC-ETM,Dynal)中30分钟并除去上清物,将磁珠清洗两次。在0.2xSSC中,68℃下维持10分钟再进行4次清洗,每次清洗都将小珠转移到新管中。在80℃将cDNA在100μl蒸馏水中洗脱10分钟,并时常进行混合。洗脱的cDNA如上所述用PCR进行扩增。使用磁珠两次重复选择步骤后,将扩增的cDNA用EcoRI进行消化并亚克隆于pBluescript II中。

                    实施例3

                Southern印迹分析

DNA的凝胶电泳在1×TBE中的0.8%的球脂糖凝胶上进行。按照制造商的说明将核酸转移到NybonelN+尼龙膜(Amersham)上。使用RadPrime Labeling System(BRL)将探针进行标记。在50%甲酰胺、5×SSPE、5×Denhardt′s 0.1%SDS、100μg/ml变性的鲑精DNA中在42℃下维持16小时进行杂交。过滤物在1xSSC、0.1%SDS中清洗一次,室温下进行20分钟,以及在0.1×SSC、0.1%SDS中清洗两次,65℃进行20分钟。印迹显露于X射线胶片(Kodak,X-OMAT-AR)上。

                      实施例4

                   cDNA文库筛选

利用产生单向cDNA文库的ZAP-cDNA合成试剂盒(STRATAGENE)建立21三体性胎脑cDNA文库。简单而言,利用具有5-甲基dCTP的杂交寡聚(dT)-XhoI接头引物从5μg21三体性胎脑poly(A)+RNA中合成双链cDNA。将EcoRT接头连接到cDNA上,该cDNA随后被EcoRI和XhoI消化,然后被克隆入UNI-ZAP XR载体内。使用Gigapack IIGold包装提取物将文库进行包装。初始文库的效价为1.1×106p.f.u./包装。文库扩增一次。蓝白颜色分析表明99%的克隆具有插入基因。插入基因的平均尺寸为1.9kb,这是从14个克隆中计算得出的。

使用选择的cDNA片断可进行21三体性胎脑cDNA文库的筛选。将噬菌体平铺成平均密度为每175cm21×105的平板。使用双层尼龙膜(Hybond-N+;Amersham)可移取20层板上的噬菌斑(2×106个噬菌体)。将杂交膜在65℃清洗至0.2×SSC、0.1×SDS的最终严谨性。将过滤物暴露于X射线胶片过夜。为了进行进一步分析,通过M13介导的切割术将噬菌体亚克隆进质粒载体pBluescript II SK(-)。

                        实施例5

                   Northern印迹分析

通过用XhoI和EcoRI进行消化将cDNA插入基因从载体上切除。在使用随机引发方法进行标记后,使用多组织Northern印迹法(MultipleTissne Northern Blot)(Clontech)将片断用作探针进行Northern杂交。

                          实施例6

                          中期制备

使用BrdU块制备染色体,美国学术科学进展(Zabel等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA),80:6936(1983))进行了一些修饰。简言之,人外围淋巴细胞在RPMI 1640(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)中37℃下生长72小时,所述RPMI 1640用L-谷氨酰胺(2mM)、15%的小牛胎血清、青霉素(100IU/ml)、链霉素(0.05mg/ml)及0.02%植物凝血素进行补充。通过加入5-溴-脱氧尿苷(0.8mg/ml将细胞封闭在5-噬菌体中16小时。将细胞用HBSS(Hanks Balanced Salt Solution)(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)清洗一次以除去同步剂,并且通过在用2.5μg/ml胸腺嘧啶脱氧核苷进行补充的培养基中培养多于5个或6个小时以释放细胞。收获培养物是通过加入0.1μg/ml的乙酰甲基秋水仙碱10分钟,接着在37℃下加入0.075MKCl低温溶液15分钟,再用甲醇和乙酸3∶1的混合物进行固定1-5分钟。

                         实施例7

                    高质量染色体的制备

为了制备高质量的染色体,制备中期涂布时可将一滴悬浮液滴到一块乙醇清毒过的载玻片上,均匀涤布,完全去除细胞质。将载玻片放到装满热水的容器上方,视环境湿度放置20-60秒。可以先在相差显微镜下检查几块载玻片以确定最佳条件。为了得到最好的结果,在原位杂交前将载玻片在室温下老化至少2-3周。在老化后最好将载玻片贮存于-70℃下。在变性前一天,将载玻片从-70℃下取出并在4℃下存放过夜。将载玻片在室温下存放1-2个小时,然后在55-60℃下烘焙2个小时,然后在70%甲酰胺(在66-70℃)中进行变性。为得到最好的结果,所载玻片在66℃下进行变性。

                       实施例8

           用于图谱化小DNA探针的探针片断尺寸

由切口移位标记的探针的片断尺寸优选为约100-200bp,并且探针DNA在杂交混合物中的浓度优选范围为20-40ng/μl(即,200-400ng/载玻片)。该浓度能增加非特异性连接,但通常将会产生好的信号/噪声比。为了减少重复序列的非特异性背景杂交,可将少量的CotI DNA与cDNA探针一起使用(即,1-3μg的CotI与200-400ng的探针DNA)。

                     实施例9

                探针的生物系标记

通过切口移位用生物素-14-dATP进行DNA探针的标记。未引入的核苷酸用层析(葡聚糖凝胶G-50)进行分离。所有DNA探针的平均片断尺寸约在200bp,范围是100-600bp,这是由未变性的琼脂糖凝胶建立的。

                       实例10

                      原位杂交

为了得到具有小的DNA探针的单拷贝序列的特异性杂交,对Lichter等人在科学(Science)247:64-69(1990)中所描述的FISH方法进行了修正。对于在使用前已制作了一年以上的载玻片,RNA酶处理是不必要的。必要时,RNA酶处理包括将100μg/ml RNA酶在37℃下放在载玻片上20分钟,然后经过70%、90%及100%冷的乙醇系列进行变性。载玻片的变性是在67-70℃,70%甲酰胺/2xSSC(0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠)中处理1-2分钟(新的染色体制剂需要较少的时间)。将含有生物素标记的探针及3μg Cot1 DNA和7μg超声波处理过的鲑精DNA(探针与Cot1 DNA的比例是1∶15-30;总的DNA浓度为1μg/ml)的杂交缓冲液放置到每块载玻片上。盖上盖玻片并用橡胶粘合剂进行密封,接下来在37℃下在一润湿过的箱中培养过夜。

                    实施例11

              免疫荧光法探测探针信号

杂交过夜后,载玻片在44℃50%的甲酰胺(V/V)/2xSSC中进行清洗(4×5分钟),然后在50-60℃2XSSC中清洗(3×5分钟)。对于小探针(插入尺寸<1.5kb)清洗时间要短些(3×2分钟)。为了增加较小探针产生的荧光信号的强度,有必要减少后杂交清洗(2XSSC,在45-50℃)的严谨条件为了进行封闭,载玻片在含有3%牛血清蛋白(BSA)和0.1%吐温20的100μl的4XSSC中在37℃下培养10-20分钟。在45℃2XSSC/0.1%吐温20中进行清洗3个5分钟后,通过在37℃加入生物系标记的山羊抗-抗生物素蛋白抗体层(5μg/ml)将杂交信息扩增30分钟。在减少免疫学上非特异连接的扩增步骤前将载玻片在5%山羊血清/2XSSC/3%BSA/0.1%吐温20中预培养10-20分钟。清洗后,另一层FITC-抗生物素蛋白加入到前述的载玻片上。加了增加杂交信息的强度,若必要的话可再进行一次扩增。然后在45℃下将载玻片在2XSSC/0.1%吐温20中清洗3次然后让其自行排水即可。

                     实施例12

                     染色体R-带

为了同时观察到染色体带和荧光信号,将染料色霉素A3和远端霉素A用作复染剂(Schweizer,染色体(Chromosoma),58:307-324(1976);Schweizer,人类遗传学(Hum.Genet),69:300-303(1985))。紧接着上次探测,在染色前将载玻片在McIlavane′s缓冲液(pH8.5-9.0,Schweizer等人,同上,用蒸馏水稀释成1∶1)中清洗。随后,在室温下黑暗中将100μl色霉素A3(0.5mg/ml,在McIlavane′s缓冲液中,pH8.5-9.0)在载玻片上放置10分钟~1小时。所需的染色时间取决于载玻片的新鲜程度;较新的载玻片需要较长的染色时间,而老化的载玻片则需10分钟。在第一轮染色后,在1/2McIlavane′s缓冲液中将载玻片清洗1分钟并去掉多余的液体。接着进行第二轮染色,将50μl的0.1mg/ml远端霉素A放到载玻片上,在室温下培养1~2分钟,接着同上所述进行清洗。

如果使用具有较小插入基因(例如,为了产生细微信息)的DNA探针,载玻片可用一薄层含有在磷酸缓冲液中的对苯二胺的进行装片(Johnson等人,(J.Immunol.Methods)免疫方法期刊43:34p-350(1981)).

要得到最大的带分辨及最小的褪色可进行两轮的色霉素A3和远端霉素A染色。另外,在探测步骤后马上进行载玻片染色可得到最佳的带结果,但对于小探针时间不得迟于2-3天。在染色后马上于显微镜下观察载玻片效果最好,但对于小探针(1.0kb-2.5kb)不得迟于3天,而对于较大探针(>2.5-3kb)则不迟于1-2周。在荧光显微镜下观察载玻片之前只需进行轻度的复染。实际上,该基带技术的优点是若必要的话,在杂交后可在任意点进行复染步骤从而使染色体更加明亮。而且,在捕捉到图象后,使用计算系统,可以对带型进行选择性的漂白从而可以更清晰地观察到FITC杂交信号。

                       实施例13

                  显微镜检术及摄影术

用Zeiss Axiophot 100或Axiovert 135荧光显微镜(Zeiss,Inc.,Thornwood,NY)对载玻片进行观察。通过使用400-490nm的带通过激发剂、460nm三色性光及470nm光栅(Zeiss filter set#0.5)可将FITC和色霉素A3进行激发。杂交的区段显现为明亮的绿-蓝或明亮的黄-绿色斑,而其它的染色体带则呈暗绿色。Kodak Techmicsl Pan(ASA100)胶片可用于制作黑白照片。彩色图象由CCD冷却的相机(PhotometricsCH250,Photometrics Ltd.,Tuscon,AZ)进行拍摄,所述相机使用BDS(Biological Detection Systems,Pittsburgh,PA)显影软件。

尽管参考某些优选的实施方案已对本发明进行了详细描述,应该理解为在所描述和所要求的范围和精神之内可以有修正和变化。

                         序列表(1)一般信息:   (i)申请人:朱利R. 科伦伯格

          山川和弘   (ii)发明名称:一种新型染色体21基因标记,

             组合物及其使用方法   (iii)序列数:6(2)SEQ ID No:1的信息:   (i)序列特征:

   (A)长度:5107对碱基

   (B)类型:核酸

   (C)链型:双

   (D)拓扑学:线性   (ii)分子类型:cDNA   (ix)特征:

   (A)名称/关键词:CDS

   (B)位置:138..3710

   (D)其它信息:/产物=“EHOC-1”   (xi)序列描述:SEQ ID No:1:GCGGCGCAAC CGGCTCCGGA GCTGCCTGGC GCGGCCGGGC GGGCGGCGCC GCTCAGGCTC    60GGGCTCCGGC TGGGCCCGGC GCGGCCTCGG GGCTGCCCAT GGGGCGCGGG GGGCCGGGCC   120GGTGACGCCG GACGCCC ATG GAC GCC TCT GAG GAG CCG CTG CCG CCG GTG      170

               Met Asp Ala Ser Glu Glu Pro Leu Pro Pro Val

                 1               5                  10ATC TAC ACC ATG GAG AAC AAG CCC ATC GTC ACC TGT GCT GGA GAT CAG     218Ile Tyr Thr Met Glu Asn Lys Pro Ile Val Thr Cys Ala Gly Asp Gln

         15                  20                  25AAT TTA TTT ACC TCT GTT TAT CCA ACG CTC TCT CAG CAG CTT CCA AGA     266Asn Leu Phe Thr Ser Val Tyr Pro Thr Leu Ser Gln Gln Leu Pro Arg

     30                  35                  40GAA CCA ATG GAA TGG AGA AGG TCC TAT GGC CGG GCT CCG AAG ATG ATT     314Glu Pro Met Glu Trp Arg Arg Ser Tyr Gly Arg Ala Pro Lys Met Ile

 45                  50                  55CAC CTA GAG TCT AAC TTT GTT CAA TTC AAA GAG GAG CTG CTG CCC AAA     362His Leu Glu Ser Asn Phe Val Gln Phe Lys Glu Glu Leu Leu Pro Lys 60                  65                  70                  75GAA GGA AAC AAA GCT CTG CTC ACG TTT CCC TTC CTC CAT ATT TAC TGG     410Glu Gly Asn Lys Ala Leu Leu Thr Phe Pro Phe Leu His Ile Tyr Trp

             80                  85                  90ACA GAG TGC TGT GAT ACC GAA GTG TAT AAA GCT ACA GTA AAA GAT GAC     458Thr Glu Cys Cys Asp Thr Glu Val Tyr Lys Ala Thr Val Lys Asp Asp

         95                 100                 105CTC ACC AAG TGG CAG AAT GTT CTG AAG GCT CAT AGC TCT GTG GAC TGG     506Leu Thr Lys Trp Gln Asn Val Leu Lys Ala His Ser Ser Val Asp Trp

    110                 115                 120TTA ATA GTG ATA GTT GAA AAT GAT GCC AAG AAA AAA AAC AAA ACC AAC     554Leu Ile Val Ile Val Glu Asn Asp Ala Lys Lys Lys Asn Lys Thr Asn

125                 130                 135ATC CTT CCC CGA ACC TCT ATT GTG GAC AAA ATA AGA AAT GAT TTT TGT     602Ile Leu Pro Arg Thr Ser Ile Val Asp Lys Ile Arg Asn Asp Phe Cys140                 145                 150                 155AAT AAA CAG AGT GAC AGG TGT GTT GTG CTC TCC GAC CCC TTG AAG GAC     650Asn Lys Gln Ser Asp Arg Cys Val Val Leu Ser Asp Pro Leu Lys Asp

            160                 165                 170TCT TCT CGA ACT CAG GAA TCC TGG AAT GCC TTC CTG ACC AAA CTC AGG     698Ser Ser Arg Thr Gln Glu Ser Trp Asn Ala Phe Leu Thr Lys Leu Arg

        175                 180                 185ACA TTG CTT CTT ATG TCT TTT ACC AAA AAC CTA GGC AAG TTT GAG GAT     746Thr Leu Leu Leu Met Ser Phe Thr Lys Asn Leu Gly Lys Phe Glu Asp

   190                  195                 200GAC ATG AGA ACC TTG AGG GAG AAG AGG ACT GAG CCA GGC TGG AGC TTT     794Asp Met Arg Thr Leu Arg Glu Lys Arg Thr Glu Pro Gly Trp Ser Phe

205                 210                 215TGT GAA TAT TTC ATG GTT CAG GAG GAG CTT GCC TTT GTT TTC GAG ATG     842Cys Glu Tyr Phe Met Val Gln Glu Glu Leu Ala Phe Val Phe Glu Met220                 225                 230                 235CTG CAG CAG TTC GAG GAC GCC CTG GTG CAG TAC GAC GAA CTG GAC GCC     890Leu Gln Gln Phe Glu Asp Ala Leu Val Gln Tyr Asp Glu Leu Asp Ala

            240                 245                 250CTC TTC TCT CAG TAT GTG GTC AAC TTC GGG GCC GGG GAT GGT GCC AAC    938Leu Phe Ser Gln Tyr Val Val Asn Phe Gly Ala Gly Asp Gly Ala Asn

        255                 260                 265TGG CTG ACT TTT TTC TGC CAG CCA GTG AAG AGC TGG AAC GGA TTG ATC    986Trp Leu Thr Phe Phe Cys Gln Pro Val Lys Ser Trp Asn Gly Leu Ile

    270                 275                 280CTC CGA AAA CCC ATA GAT ATG GAG AAG CGG GAA TCG ATC CAG AGG CGA   1034Leu Arg Lys Pro Ile Asp Met Glu Lys Arg Glu Ser Ile Gln Arg Arg

285                 290                 295GAA GCC ACC CTG TTA GAT CTG CGC AGT TAC CTG TTC TCT CGC CAG TGC   1082Glu Ala Thr Leu Leu Asp Leu Arg Ser Tyr Leu Phe Ser Arg Gln Cys300                 305                 310                 315ACC TTG CTG CTC TTC CTG CAG AGG CCG TGG GAG GTG GCC CAG CGC GCC   1130Thr Leu Leu Leu Phe Leu Gln Arg Pro Trp Glu Val Ala Gln Arg Ala

            320                 325                 330CTA GAG CTG CTG CAC AAC TGC GTG CAG GAA CTG AAG CTC TTA GAA GTC   1178Leu Glu Leu Leu His Asn Cys Val Gln Glu Leu Lys Leu Leu Glu Val

        335                 340                 345TCT GTC CCA CCT GGT GCT CTG GAC TGC TGG GTG TTT CTG AGC TGT CTG   1226Ser Val Pro Pro Gly Ala Leu Asp Cys Trp Val Phe Leu Ser Cys Leu

    350                 355                  360GAG GTG TTG CAG AGG ATA GAA GGC TGC TGT GAC CGG GCA CAG ATC GAC   1274Glu Val Leu Gln Arg Ile Glu Gly Cys Cys Asp Arg Ala Gln Ile Asp

365                 370                 375TCA AAC ATT GCC CAC ACT GTG GGG CTA TGG AGC TAT GCC ACA GAA AAG   1322Ser Asn Ile Ala His Thr Val Gly Leu Trp Ser Tyr Ala Thr Glu Lys380                 385                 390                 395TTA AAG TCC TTG GGC TAT CTA TGT GGA CTT GTG TCA GAG AAA GGA CCT   1370Leu Lys Ser Leu Gly Tyr Leu Cys Gly Leu Val Ser Glu Lys Gly Pro

            400                 405                 410AAC TCA GAA GAT CTC AAC AGG ACA GTT GAC CTT TTG GCA GGT TTG GGA   1418Asn Ser Glu Asp Leu Asn Arg Thr Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Gly

        415                 420                425GCT GAG CGA CCA GAA ACA GCC AAC ACA GCT CAG AGT CCT TAT AAG AAA   1466Ala Glu Arg Pro Glu Thr Ala Asn Thr Ala Gln Ser Pro Tyr Lys Lys

    430                 435                 440CTG AAA GAA GCA TTA TCG TCA GTG GAA GCT TTT GAA AAA CAC TAC TTA   1514Leu Lys Glu Ala Leu Ser Ser Val Glu Ala Phe Glu Lys His Tyr Leu

445                 450                 455GAT TTG TCC CAT GCC ACC ATT GAA ATG TAT ACA AGC ATT GGG AGG ATT   1562Asp Leu Ser His Ala Thr Ile Glu Met Tyr Thr Ser Ile Gly Arg Ile460                 465                 470                 475CGA TCT GCT AAG TTT GTT GGA AAA GAT CTG GCA GAG TTT TAC ATG AGG   1610Arg Ser Ala Lys Phe Val Gly Lys Asp Leu Ala Glu Phe Tyr Met Arg

            480                 485                 490AAA AAG GCT CCA CAA AAG GCA GAA ATC TAT CTT CAA GGA GCA CTG AAA   1658Lys Lys Ala Pro Gln Lys Ala Glu Ile Tyr Leu Gln Gly Ala Leu Lys

        495                 500                 505AAC TAC CTG GCT GAG GGC TGG GCA CTC CCC ATC ACA CAC ACA AGG AAG   1706Asn Tyr Leu Ala Glu Gly Trp Ala Leu Pro Ile Thr His Thr Arg Lys

    510                 515                 520CAG CTG GCC GAA TGT CAA AAG CAC CTT GGA CAA ATT GAA AAC TAC CTG   1754Gln Leu Ala Glu Cys Gln Lys His Leu Gly Gln Ile Glu Asn Tyr Leu

525                 530                 535CAG ACC AGC AGC CTC TTA GCC AGT GAC CAC CAC CTC ACT GAA GAG GAG   1802Gln Thr Ser Ser Leu Leu Ala Ser Asp His His Leu Thr Glu Glu Glu540                 545                 550                 555CGC AAG CAC TTC TGC CAG GAG ATA CTT GAC TTT GCC AGC CAG CCG TCA   1850Arg Lys His Phe Cys Gln Glu Ile Leu Asp Phe Ala Ser Gln Pro Ser

            560                 565                 570GAC AGC CCA GGT CAT AAG ATA GTG CTA CCC ATG CAT TCC TTT GCA CAA   1898Asp Ser Pro Gly His Lys Ile Val Leu Pro Met His Ser Phe Ala Gln

        575                 580                 585CTG CGA GAT CTC CAT TTT GAT CCC TCC AAT GCC GTG GTC CAC GTG GGC   1946Leu Arg Asp Leu His Phe Asp Pro Ser Asn Ala Val Val His Val Gly

    590                 595                 600GGC GTT TTG TGC GTT GAG ATA ACC ATG TAC AGC CAG ATG CCT GTG CCT   1994Gly Val Leu Cys Val Glu Ile Thr Met Tyr Ser Gln Met Pro Val Pro

605                 610                 615GTT CAC GTG GAG CAG ATT GTG GTC AAT GTC CAC TTC AGC ATT GAG AAA   2042Val His Val Glu Gln Ile Val Val Asn Val His Phe Ser Ile Glu Lys620                 625                 630                 635AAC AGC TAC CGG AAG ACT GCG GAG TGG CTT ACC AAG CAC AAG ACG TCC   2090Asn Ser Tyr Arg Lys Thr Ala Glu Trp Leu Thr Lys His Lys Thr Ser

            640                 645                 650AAT GGG ATC ATT AAC TTT CCA CCC GAG ACC GCA CCT TTC CCT GTA TCC   2138Asn Gly Ile Ile Asn Phe Pro Pro Glu Thr Ala Pro Phe Pro Val Ser

        655                 660                 665CAA AAC AGT TTG CCC GCG CTG GAG TTG TAT GAA ATG TTT GAG AGA AGC   2186Gln Asn Ser Leu Pro Ala Leu Glu Leu Tyr Glu Met Phe Glu Arg Ser

    670                 675                 680CCA TCT GAT AAC TCC TTG AAC ACG ACT GGG ATT ATC TGC AGA AAC GTC   2234Pro Ser Asp Asn Ser Leu Asn Thr Thr Gly Ile Ile Cys Arg Asn Val

685                 690                 695CAC ATG CTC CTG AGA AGG CAG GAG AGC AGC TCC TCT CTA GAG ATG CCC   2282His Met Leu Leu Arg Arg Gln Glu Ser Ser Ser Ser Leu Glu Met Pro700                 705                 710                 715TCA GGG GTG GCT CTG GAG GAG GGT GCC CAC GTG CTG AGG TGC AGC CAC   2330Ser Gly Val Ala Leu Glu Glu Gly Ala His Val Leu Arg Cys Ser His

            720                 725                 730GTG ACC CTG GAA CCA GGG GCC AAC CAG ATA ACA TTC AGG ACT CAG GCC   2378Val Thr Leu Glu Pro Gly Ala Asn Gln Ile Thr Phe Arg Thr Gln Ala

        735                 740                 745AAG GAA CCT GGA ACG TAT ACA CTC AGG CAG CTG TGC GCC TCG GTG GGC   2426Lys Glu Pro Gly Thr Tyr Thr Leu Arg Gln Leu Cys Ala Ser Val Gly

    750                 755                 760TCC GTG TGG TTC GTC CTC CCT CAC ATC TAC CCC ATT GTG CAG TAC GAC   2474Ser Val Trp Phe Val Leu Pro His Ile Tyr Pro Ile Val Gln Tyr Asp

 765                770                 775GTG TAC TCA CAG GAG CCC CAG CTG CAC GTG GAG CCG CTG GCT GAT AGC   2522Val Tyr Ser Gln Glu Pro Gln Leu His Val Glu Pro Leu Ala Asp Ser780                 785                 790                 795CTT CTG GCA GGC ATT CCT CAG AGA GTC AAG TTC ACT GTC ACT ACC GGC   2570Leu Leu Ala Gly Ile Pro Gln Arg Val Lys Phe Thr Val Thr Thr Gly

            800                 805                 810CAT GAT ACG ATA AAG AAT GGA GAC AGC CTG CAG CTT AGC AAT GCC GAA   2618His Asp Thr Ile Lys Asn Gly Asp Ser Leu Gln Leu Ser Asn Ala Glu

        815                 820                 825GCC ATG CTC ATC CTG TGC CAG GCG GAG AGC AGG GCT GTG GTC TAC TCC   2666Ala Met Leu Ile Leu Cys Gln Ala Glu Ser Arg Ala Val Val Tyr Ser

    830                 835                 840AAC ACG AGA GAA CAG TCT TCT GAG GCC GCG CTC CGG ATT CAG TCC TCC   2714Asn Thr Arg Glu Gln Ser Ser Glu Ala Ala Leu Arg Ile Gln Ser Ser

845                 850                 855GAC AAG GTC ACG AGC ATC AGT CTG CCT GTT GCG CCT GCG TAC CAC GTG   2762Asp Lys Val Thr Ser Ile Ser Leu Pro Val Ala Pro Ala Tyr His Val860                 865                 870                 875ATC GAA TTT GAA CTG GAA GTT CTC TCT TTA CCT TCA GCC CCA GCA CTC   2810Ile Glu Phe Glu Leu Glu Val Leu Ser Leu Pro Ser Ala Pro Ala Leu

            880                 885                 890GGA GGG GAG AGT GAC ATG CTG GGG ATG GCA GAG CCC CAC AGG AAG CAT   2858Gly Gly Glu Ser Asp Met Leu Gly Met Ala Glu Pro His Arg Lys His

        895                 900                 905AAG GAC AAA CAG AGA ACT GGC CGC TGC ATG GTT ACC ACA GAC CAC AAA   2906Lys Asp Lys Gln Arg Thr Gly Arg Cys Met Val Thr Thr Asp His Lys

    910                 915                 920GTG TCG ATT GAC TGC CCG TGG TCC ATC TAC TCC ACA GTC ATC GCA CTG   2954Val Ser Ile Asp Cys Pro Trp Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ile Ala Leu

925                 930                 935ACC TTC AGC GTA CCC TTC AGG ACC ACA CAC AGC CTC CTG TCC TCA GGA   3002Thr Phe Ser Val Pro Phe Arg Thr Thr His Ser Leu Leu Ser Ser Gly940                 945                 950                 955ACA CGG AAA TAT GTT CAA GTT TGT GTC CAG AAT TTG TCA GAA CTT GAC   3050Thr Arg Lys Tyr Val Gln Val Cys Val Gln Asn Leu Ser Glu Leu Asp

            960                 965                 970TTT CAG CTG TCA GAT AGT TAT CTT GTA GAT ACC GGT GAT AGT ACC GAC   3098Phe Gln Leu Ser Asp Ser Tyr Leu Val Asp Thr Gly Asp Ser Thr Asp

        975                 980                 985CTG CAA CTA GTA CCA CTG AAC ACG CAG TCC CAG CAG CCC ATC TAC AGC   3146Leu Gln Leu Val Pro Leu Asn Thr Gln Ser Gln Gln Pro Ile Tyr Ser

    990                 995                 1000AAG CAG TCG GTG TTC TTC GTC TGG GAA CTC AAG TGG ACA GAA GAG CCT   3194Lys Gln Ser Val Phe Phe Val Trp Glu Leu Lys Trp Thr Glu Glu Pro

1005                1010                1015CCC CCT TCT CTG CAT TGC CGG TTC TCT GTT GGA TTT TCC CCA GCT TCT   3242Pro Pro Ser Leu His Cys Arg Phe Ser Val Gly Phe Ser Pro Ala Ser1020                1025                1030                1035GAG GAA CAG CTG TCT ATC TCC TTA AAG CCG TAT ACT TAT GAA TTT AAA   3290Glu Glu Gln Leu Ser Ile Ser Leu Lys Pro Tyr Thr Tyr Glu Phe Lys

            1040                1045                1050GTG GAA AAT TTT TTT ACA TTA TAC AAC GTG AAG GCT GAG ATC TTT CCC   3338Val Glu Asn Phe Phe Thr Leu Tyr Asn Val Lys Ala Glu Ile Phe Pro

        1055                1060                1065CCT TCG GGA ATG GAG TAT TGC AGA ACA GGC TCC CTC TGC TCC CTG GAG      3386Pro Ser Gly Met Glu Tyr Cys Arg Thr Gly Ser Leu Cys Ser Leu Glu

    1070                1075                1080 GTT TTG ATC ACG AGG CTC TCA GAC CTC TTG GAG GTG GAT AAA GAT GAA      3434Val Leu Ile Thr Arg Leu Ser Asp Leu Leu Glu Val Asp Lys Asp Glu

1085                1090                1095GCA CTG ACT GAA TCT GAT GAG CAT TTT TCG ACA AAG CTT ATG TAT GAA      3482Ala Leu Thr Glu Ser Asp Glu His Phe Ser Thr Lys Leu Met Tyr Glu1100                1105                1110                1115GTT GTC GAC AAC AGT AGC AAC TGG GCA GTG TGT GGG AAA AGC TGC GGT      3530Val Val Asp Asn Ser Ser Asn Trp Ala Val Cys Gly Lys Ser Cys Gly

            1120                1125                1130GTC ATC TCC ATG CCA GTG GCT GCT CGG GCC ACT CAC AGG GTC CAC ATG      3578Val Ile Ser Met Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr His Arg Val His Met

        1135                1140                1145GAA GTG ATG CCG CTC TTC GCC GGG TAT CTC CCC CTG CCC GAC GTC AGG      3626Glu Val Met Pro Leu Phe Ala Gly Tyr Leu Pro Leu Pro Asp Val Arg

    1150                1155                1160CTG TTC AAG TAC CTC CCC CAT CAT TCT GCA CAC TCC TCC CAA CTG GAC      3674Leu Phe Lys Tyr Leu Pro His His Ser Ala His Ser Ser Gln Leu Asp

1165                1170                1175GCT GAC AGC TGG ATA GAA AAC GCA GCC TGT CAG TAGACAAGCA CGGGGACGAC    3727Ala Asp Ser Trp Ile Glu Asn Ala Ala Cys Gln1180                1185                1190CAGCCGGACA GCAGCAGCCT CAAGAGCAGG GGCAGCGTGC ATTCGGCCTG CAGCAGCGAG    3787CACAAAGGCC TACCCATGCC CCGGCTGCAG GCACTGCCGG CCGGCCAGGT CTTCAACTCC    3847AGCTCGGGCA CACAAGTCCT GGTCATCCCC AGCCAAGATG ACCACGTCCT GGAAGTCAGT    3907GTAACATGAC AACGCCAGGG TGAACACACG CCACTTCCCA GCTAGGAGTG CACTTTATGG    3967GACTGTGACT GGACTCTTCC GTTCTGGCTC CAGCCAGACC TTCAGTGGTC CTGCCTGGCC    4027GTGGGGACAT CAGAGAGTGT CATCACGCAG CTGGCCAGCT GAGTTCTGTT GTTGTTTTCA    4087TGCCGCCTGT GATCTCAGAT TCCTGCTTTT CTCACCCCGT CCCCATGCTG GTGTCCGACG    4147CCGCTTACTC AGAGCCCTGG CCTCCCTCCC CCTACCTCAC ACGCTGCTCA TGAAAGTTTC    4207CACCCACGCT GTCTCCACGG AACAGCCTCC GTCTGCTGGC TCTTCGTGGA AGGCCATTTG    4267TCTTTCAGGT AGACACTCAG CAGCCCTCAC GGTCTTAGTG ACGTGTGTGC CTTTCTGGTC    4327ACACAGCTGC CCAGTTTCCT GATCGGGGTG GATTTGTGTC CCCTAAGGGG TAAAACAGCC    4387GTTTACCGCA GATCCTCTCA TACACCCTTC TAGGGGAGGC GGGTGGGGGA GGGAGGGATC    4447ATAACCCCTT CTGTGCCTTG GGATGCCGGA GCTGGGGGAC CTGGAGGCCC ATCAGCCGGA    4507GCCACGTGAA AGGTACTGAA GAAAGCTGAG ACCCGGCTGT GAGGAGCGCC TCAGCGGTGA    4567GGTGGTTTAG GGATAAATGT TTCTGGAACC CTGTGGTCCC CCATAATGTT GATAGATATC    4627ATATGCACTG GGAGTTAAAT ATATTTAATT TAATGATCAT TATATATGTG GGGGTTAATA    4687TGTTGTTTTT CTGTCCCTTT AAAGTCTTTA CATGTAATTG TAGCTGTATA ATCGTTATTT    4747TTCTTTTGCA TCTTAAGTCT TAGAAATTAA GATATTCCAT CGTGAGGATG AGAGAGGTCC    4807TCAGTGTGTT TTTGGTCTGG TTGTAGGGAA GGACTCAAGT CCTGGAATGT CCTCCACTGG     4867TCTACTGAGT TGCAGTCACA CTGTTCCAAT GGATTATTTG CTTTCGGTTG TAAATTTAAT     4927TGTACATATG GTTGATTTAT TATTTTTAAA AATACAGACT AACTGATGTA ATGTTTATGT     4987ATAAGTTGCA CCAAAAATCA AGGACAAAAA TAAGTGTGTT TGTTTTTACA GGTGTGAAAG     5047TCACAGCTTG TAAATAAGTG TTGTATGTAT TAAACCTTTT CCAGTTCTCC AAAGCGATGT     5107

(2)SEQ ID No:2的信息

  (I)序列特征:

    (A)长度:1190个氨基酸

    (B)类型:氨基酸

    (D)拓扑学:线性

(ii)分子类型:蛋白质

(xi)序列描述:SEQ ID No 2:Met Asp Ala Ser Glu Glu Pro Leu Pro Pro Val Ile Tyr Thr Met Glu  1               5                  10                  15Asn Lys Pro Ile Val Thr Cys Ala Gly Asp Gln Asn Leu Phe Thr Ser

         20                  25                  30Val Tyr Pro Thr Leu Ser Gln Gln Leu Pro Arg Glu Pro Met Glu Trp

     35                  40                  45Arg Arg Ser Tyr Gly Arg Ala Pro Lys Met Ile His Leu Glu Ser Asn

 50                  55                  60Phe Val Gln Phe Lys Glu Glu Leu Leu Pro Lys Glu Gly Asn Lys Ala 65                  70                  75                  80Leu Leu Thr Phe Pro Phe Leu His Ile Tyr Trp Thr Glu Cys Cys Asp

             85                  90                  95Thr Glu Val Tyr Lys Ala Thr Val Lys Asp Asp Leu Thr Lys Trp Gln

        100                 105                 110Asn Val Leu Lys Ala His Ser Ser Val Asp Trp Leu Ile Val Ile Val

    115                 120                 125Glu Asn Asp Ala Lys Lys Lys Asn Lys Thr Asn Ile Leu Pro Arg Thr

130                 135                 140Ser Ile Val Asp Lys Ile Arg Asn Asp Phe Cys Asn Lys Gln Ser Asp145                 150                 155                 160Arg Cys Val Val Leu Ser Asp Pro Leu Lys Asp Ser Ser Arg Thr Gln

            165                 170                 175Glu Ser Trp Asn Ala Phe Leu Thr Lys Leu Arg Thr Leu Leu Leu Met

        180                 185                 190Ser Phe Thr Lys Asn Leu Gly Lys Phe Glu Asp Asp Met Arg Thr Leu

    195                 200                 205Arg Glu Lys Arg Thr Glu Pro Gly Trp Ser Phe Cys Glu Tyr Phe Met

210                 215                 220Val Gln Glu Glu Leu Ala Phe Val Phe Glu Met Leu Gln Gln Phe Glu225                 230                 235                 240Asp Ala Leu Val Gln Tyr Asp Glu Leu Asp Ala Leu Phe Ser Gln Tyr

            245                 250                 255Val Val Asn Phe Gly Ala Gly Asp Gly Ala Asn Trp Leu Thr Phe Phe

        260                 265                 270Cys Gln Pro Val Lys Ser Trp Asn Gly Leu Ple Leu Arg Lys Pro Ile

    275                 280                 285Asp Met Glu Lys Arg Glu Ser Ile Gln Arg Arg Glu Ala Thr Leu Leu

290                 295                 300Asp Leu Arg Ser Tyr Leu Phe Ser Arg Gln Cys Thr Leu Leu Leu Phe305                 310                 315                 320Leu Gln Arg Pro Trp Glu Val Ala Gln Arg Ala Leu Glu Leu Leu His

            325                 330                 335Asn Cys Val Gln Glu Leu Lys Leu Leu Glu Val Ser Val Pro Pro Gly

        340                 345                 350Ala Leu Asp Cys Trp Val Phe Leu Ser Cys Leu Glu Val Leu Gln Arg

    355                 360                 365Ile Glu Gly Cys Cys Asp Arg Ala Gln Ile Asp Ser Asn Ile Ala His

370                 375                 380Thr Val Gly Leu Trp Ser Tyr Ala Thr Glu Lys Leu Lys Ser Leu Gly385                 390                 395                 400Tyr Leu Cys Gly Leu Val Ser Glu Lys Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu

            405                 410                 415Asn Arg Thr Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ala Glu Arg Pro Glu

        420                 425                 430Thr Ala Asn Thr Ala Gln Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Ala Leu

    435                 440                 445Ser Ser Val Glu Ala Phe Glu Lys His Tyr Leu Asp Leu Ser His Ala

450                 455                 460Thr Ile Glu Met Tyr Thr Ser Ile Gly Arg Ile Arg Ser Ala Lys Phe465                 470                 475                 480Val Gly Lys Asp Leu Ala Glu Phe Tyr Met Arg Lys Lys Ala Pro Gln

            485                 490                 495Lys Ala Glu Ile Tyr Leu Gln Gly Ala Leu Lys Asn Tyr Leu Ala Glu

        500                 505                 510Gly Trp Ala Leu Pro Ile Thr His Thr Arg Lys Gln Leu Ala Glu Cys

    515                 520                 525Gln Lys His Leu Gly Gln Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Thr Ser Ser Leu

530                 535                 540Leu Ala Ser Asp His His Leu Thr Glu Glu Glu Arg Lys His Phe Cys545                 550                 555                 560Gln Glu Ile Leu Asp Phe Ala Ser Gln Pro Ser Asp Ser Pro Gly His

            565                 570                 575Lys Ile Val Leu Pro Met His Ser Phe Ala Gln Leu Arg Asp Leu His

        580                 585                 590Phe Asp Pro Ser Asn Ala Val Val His Val Gly Gly Val Leu Cys Val

    595                 600                 605Glu Ile Thr Met Tyr Ser Gln Met Pro Val Pro Val His Val Glu Gln

610                 615                 620Ile Val Val Asn Val His Phe Ser Ile Glu Lys Asn Ser Tyr Arg Lys625                 630                 635                 640Thr Ala Glu Trp Leu Thr Lys His Lys Thr Ser Asn Gly Ile Ile Asn

            645                 650                 655Phe Pro Pro Glu Thr Ala Pro Phe Pro Val Ser Gln Asn Ser Leu Pro

        660                 665                 670Ala Leu Glu Leu Tyr Glu Met Phe Glu Arg Ser Pro Ser Asp Asn Ser

    675                 680                 685Leu Asn Thr Thr Gly Ile Ile Cys Arg Asn Val His Met Leu Leu Arg

690                 695                 700Arg Gln Glu Ser Ser Ser Ser Leu Glu Met Pro Ser Gly Val Ala Leu705                 710                 715                 720Glu Glu Gly Ala His Val Leu Arg Cys Ser His Val Thr Leu Glu Pro

            725                 730                 735Gly Ala Asn Gln Ile Thr Phe Arg Thr Gln Ala Lys Glu Pro Gly Thr

        740                 745                 750Tyr Thr Leu Arg Gln Leu Cys Ala Ser Val Gly Ser Val Trp Phe Val

    755                 760                 765Leu Pro His Ile Tyr Pro Ile Val Gln Tyr Asp Val Tyr Ser Gln Glu

770                 775                 780Pro Gln Leu His Val Glu Pro Leu Ala Asp Ser Leu Leu Ala Gly Ile785                 790                 795                 800Pro Gln Arg Val Lys Phe Thr Val Thr Thr Gly His Asp Thr Ile Lys

            805                 810                 815Asn Gly Asp Ser Leu Gln Leu Ser Asn Ala Glu Ala Met Leu Ile Leu

        820                 825                 830Cys Gln Ala Glu Ser Arg Ala Val Val Tyr Ser Asn Thr Arg Glu Gln

    835                 840                 845Ser Ser Glu Ala Ala Leu Arg Ile Gln Ser Ser Asp Lys Val Thr Ser

850                 855                 860Ile Ser Leu Pro Val Ala Pro Ala Tyr His Val Ile Glu Phe Glu Leu865                 870                 875                 880Glu Val Leu Ser Leu Pro Ser Ala Pro Ala Leu Gly Gly Glu Ser Asp

            885                 890                 895Met Leu Gly Met Ala Glu Pro His Arg Lys His Lys Asp Lys Gln Arg

        900                 905                 910Thr Gly Arg Cys Met Val Thr Thr Asp His Lys Val Ser Ile Asp Cys

    915                 920                 925Pro Trp Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ile Ala Leu Thr Phe Ser Val Pro

930                 935                 940Phe Arg Thr Thr His Ser Leu Leu Ser Ser Gly Thr Arg Lys Tyr Val945                 950                 955                 960Gln Val Cys Val Gln Asn Leu Ser Glu Leu Asp Phe Gln Leu Ser Asp

            965                 970                 975Ser Tyr Leu Val Asp Thr Gly Asp Ser Thr Asp Leu Gln Leu Val Pro

        980                 985                 990Leu Asn Thr Gln Ser Gln Gln Pro Ile Tyr Ser Lys Gln Ser Val Phe

    995                 1000                1005Phe Val Trp Glu Leu Lys Trp Thr Glu Glu Pro Pro Pro Ser Leu His

1010                1015                1020Cys Arg Phe Ser Val Gly Phe Ser Pro Ala Ser Glu Glu Gln Leu Ser1025                1030                1035                1040Ile Ser Leu Lys Pro Tyr Thr Tyr Glu Phe Lys Val Glu Asn Phe Phe

            1045                1050                1055Thr Leu Tyr Asn Val Lys Ala Glu Ile Phe Pro Pro Ser Gly Met Glu

        1060                1065                1070Tyr Cys Arg Thr Gly Ser Leu Cys Ser Leu Glu Val Leu Ile Thr Arg

    1075                1080                1085Leu Ser Asp Leu Leu Glu Val Asp Lys Asp Glu Ala Leu Thr Glu Ser

1090                1095                1100Asp Glu His Phe Ser Thr Lys Leu Met Tyr Glu Val Val Asp Asn Ser1105                1110                1115                1120Ser Asn Trp Ala Val Cys G1y Lys Ser Cys Gly Val Ile Ser Met Pro

            1125                1130                1135Val Ala Ala Arg Ala Thr His Arg Val His Met Glu Val Met Pro Leu

        1140                1145                1150Phe Ala Gly Tyr Leu Pro Leu Pro Asp Val Arg Leu Phe Lys Tyr Leu

    1155                1160                1165Pro His His Ser Ala His Ser Ser Gln Leu Asp Ala Asp Ser Trp Ile

1170                1175                1180Glu Asn Ala Ala Cys Gln1185               1190(2)SEQ ID No:3的信息:   (i)序列特征:

   (A)长度:20对碱基

   (B)类型:核苷酸

   (C)链型:单、双链

   (D)拓扑学:线性   (ii)分子类型:DNA(基因组的)   (xi)序列描述:SEQ ID No:3:CCTGATGCTC GAGTGAATTC                                      20(2)SEQ IDNo:4的信息:   (i)序列持征:

   (A)长度:1801对碱基

   (B)类型:核酸

   (C)链型:单、双链

   (D)拓扑学:线性   (ii)分子类型:cDNA   (vii)直接来源:

   (B)克隆:cEH25(EHOC-13′未被翻译的cDNA)   (ix)特征:

   (A)名称/关键词:polyA_位点

   (B)位置:10   (ix)特征:

   (A)名称/关键词:polyA_位点

   (B)位置:310   (ix)特征:

   (A)名称/关键词:polyA_位点

   (B)位置:1149   (ix)特征:

   (A)名称/关键词:polyA_位点

   (B)位置:1155   (ix)特征:

   (A)名称/关键词:polyA_位点

   (B)位置:1798   (ix)特征:

   (A)名称/关键词:polyA_位点

   (B)位置:1801   (xi)序列描述:SEQ ID No:4ATTTTTGTAC ACTTGAAATA GAGTACTCTT AATTTACTGG GCAAATGTGC TTGGAATTGA      60ACTTGACAAG ATTAGCTCAA GCAGATAGAG TCGGGTCCAG CAGTGGGTGG CCCTCGTGTG     120AATCCCCGTG GATGTGCAAG TTGTGGAGAG AAGGAGCACC GGGTTCCTGC CCAGCACTGT     180GCTTGCGGGA GGCGGTGGGG CATGGGAGGA AGGAGGCACA GACCGGGGAA ATATGACAGC     240CGTCATTTCC AGTATTCTCT GTGTTGTCTT TTAGCTCATT CAATAAATAA AGGTGGTGTG     300ATTTTTTTTC CTCCTGTCTT TTTCATTTGT AGAAACTGGA GACGTGTAAA GAGATAAATA     360ATTGGGTAAT TAAACTTTCC AGAAATTTAT CTTCCTCATG TGCAGTTAAC AAACTTGGTC     420AAACTAGTTA GCAAATTAGA ACTTCAGAAT CTAATGATAG TTTAGGGTTT CTAANATAAG     480GTTTNTTATT GTAAANATTG ACGATTGCCC TGCATTTCTA CCAAGTCCTG TGAATAAAGA     540GATGGGAGTT TGATTCCGTC AGAAGAGACT GTAATCCGTG TCGTCAGCCT GGGAGCCTTC     600CCCNGNGTAA TGTAGCTTTC TCTCTTACCT TCTGGAAGAG GGAATGTTTC ATTTATTACT     660GTTGATTTCT TGTATCTGGT TCTACTCCCA GGATGAAATT ATCCAACTAC ATATATATTT     720AGAGGAAGAA AGTGAAGGGG AAATTTAAAA TGTTTACGGC GCTTAATTGC CTGGAAATGA     780AATGAAATCA AATTTATCAG TTTTTTTCCC CCTAATTACC CAAAAGATCT TTTGCAAACT     840ATGTTACATG AATGCTTCTG CCTCTTTAAG ACAAAGAAGA ATGTCACCCA AAATTGTCAT     900TTTTTTCTTA ATGTTCATCA TAAAAGTCCT AAAAAGGGTA ACCGTAATTG GATGTTTATT     960GTTTTTATCT AAAGTAAGGT GTATGTGTTT GAGACAAGCT GGTTTTGTTG ATAAAGAGAT    1020GTTAAATAAT TGTGAAGCCA GATATGCAAT GTGTATCTAA AAAGCAAGGA ATTTGCAGCC    1080GTTTTACAAA TATCTGTGGA ACATGTAAAT ACTGTCAAAT GGAAAATAAA ATAAGTTATA    1140ATTTTTGTGA ATTTCATGGG ATGTCCTATG ATTGGAAAAA TTATAACTCT TCTGATTCTA    1200ATGTGGAAAT TGTATTTAAT CTGAAAATGA CTTTACCTAC AACAGTTCCA TTGTCAGCAC    1260AGCCTAGGAG GGTCAGATTC CGTATTAATT GCTCTTAGTG GAGATGCCAG ATATCCCATA    1320CAGAATTAGC AGAGAAAATA CAGACAGGCT TCTATTCAAA TTTTCTTTAG TGCTTAAAAT    1380TAAGTTTTAA AATGAAATCA GACACTGCAG GTTTGTATAT AAAATGAAAA GCTATACTAC    1440TTTTTATAAA AGGGCAAACT GGGCTGATGT AAATGTTTTA CTTTCAACTG TGTTCTTTAA    1500AATAAATCCT ACCTGGTTTT TAAATTTTAT TTTTCATGAA AATGCTCCTT TCTCTACATT    1560TATTCATCCT ATATACATCA GGCTGTAAGA CCCCCCCCAG TCATCATTAA TACAATGTGT    1620TGGGATTCTG TGACTGGAAA AGGTGACAAG TTGGTGACTT TGACACTGCA GGTATTCCAT    1680TTTCATGGTT TACTATGAAA AGTCATTTTT CATATTATGT AATATATTGT TAGATTAAAA    1740CCATTGTATT AAGACTTTAA AATGTAAGCA TTGTAATTCT GAAAATACAC ATTTTAAGAA    1800G                                                                    1801(2)SEQ ID No:5的信息   (i)序列特征:

   (A)长度:469对碱基

   (B)类型:核酸

   (C)链型:单、双链

   (D)拓扑学:线性   (ii)分子类型:DNA(基因组的)   (vi)最初来源:

   (A)有机体:人   (viii)在基因组中的位置:

   (A)染色体/片断:21q22.3   (ix)特征:

   (A)名称/关键词:mat_肽

   (B)位置:117.263

   (D)其它信息:/产物=“EHOC-1 cDNA的外显子7”   (ix)特征:

   (A)名称/关键词:内显子

   (B)位置:1..116   (ix)特征:

   (A)名称/关键词:外显子

   (B)位置:117.263   (ix)特征:

   (A)名称/关键词:内显子

   (B)位置:264..469   (xi)序列描述:SEQ ID No:5:AGATGAGGTG GCTGCTTGAA GGTGAGGTTT GCACGTTCAA GCTAGAGCAT GTGGGTTTGT      60TCAAGCTAGA GCTGTCCCGG AGCACCCCTC ACACGTTCGC ATTTGCACCC CCACAGGTCT     120CTGTCCCACC TGGTGCTCTG GACTGCTGGG TGTTTCTGAG CTGTCTGGAG GTGTTGCAGA     180GGATAGAAGG CTGCTGTGAC CGGGCACAGA TCGACTCAAA CATTGCCCAC ACTGTGGGGC     240TATGGAGCTA TGCCACAGAA AAGGTGCCTA CCTGCCCAAG TGTGGAATGC TCACGTTGTC     300TCTGCGGCCA TGCCTGGGTG GCGGAGGAAG TCTGCTGTTT GGAGGAGAGG TGTTGCTCAT     360TTAGATCACG ATGCATCCAC TTTAGTGGCC CTAGAAGGTG TCTGGGTGCA GCCAAAGAAG     420TCATAGTTCC CTACCACATG TCGATGTAGT CAGCAGACAG CAAGCACTT                 469(2)SEQ ID No:6的信息:   (i)序列特征:

   (A)长度:229对碱基

   (B)类型:核酸

   (C)链型:单、双链

   (D)拓扑学:线性   (ii)分子类型:cDNA   (vii)直接来源:

   (A)文库:鼠胎脑cDNA

   (B)克隆:cM06   (ix)特征:

   (A)名称/关键词:CDS

   (B)位置:1..229

   (D)其它信息:/产物=“鼠EHOC-1”

      /注意:“该鼠cDNA区与人cDNA具有75.4%的同源性,

      相应于SEQ ID No:1的核苷酸1913-2141”   (xi)序列描述:SEQ ID No:6:TTTTGACCCT CCCAATGCTG TGGTCCATGC GGGTGGTGTN CTGACTGTGG AGATAACGGT      60ATACAGCCAG ATGCCCATCC CTGTCCACNT NGACCAGATT NCTGTCAATG TNCACTTNAG     120CATCGAAAAA AACAACTACC GGAAGACAGC CGNNNNGCTG ACCAAGCACA AGACTTCCAA     180TGGAATCATC ACCTTNNCAG CTGANNNCTC ACTGTTNCCT GCATCTCAG                 229

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