产生旋光性氨基酸的方法

摘要

本发明公开了一种生产旋光氨基酸的方法，该方法包括经微生物作用将含氨基的化合物(例如，链烷二胺和富马酸的混合物转化为旋光氨基酸。该方法有效地在普通温度和普通压力的温和条件下从廉价起始原料即，富马酸和氨基化合物中工业化产生旋光氨基酸。

说明书

本发明涉及一种经微生物作用从富马酸和含氨基的化合物中产生旋光性氨基酸的方法。除了作为药物或农用化学品的重要中间体外，由于其捕集重金属的特定性质和可归因于旋光性的特性，例如，对生物降解的敏感性，旋光氨基酸还被预期有效用于例如螯合剂和去污剂的组分。

由下述式(I)表示的氨基酸旋光异构体混合物可以容易地用有机合成技术从各种胺类和马来酸或富马酸合成。但是在用有机化合成方法合成旋光氨基酸时，必需使用旋光天冬氨酸或其类似物作为起始原料。例如，已报道可通过有机合成技术用马来酸和各种二胺生产二氨基亚烷基-N，N’-二琥珀酸(disuccinic acid)，即一种具有两个不对称碳原子的化合物，其旋光异构体的混合物(参见美国专利US3,158,635)，还可以通过有机合成技术从L-天冬氨酸和二溴乙烷中合成其一个旋光异构体(参见John A.Neal.etal.，Inorganic Chem.，，7 2405(1968)。然而，低费用生产这些旋光异构体以提供适于普通用途的这些化合物是困难的。

S，S-亚乙基二胺-N，N′-二琥珀酸是微生物产生的一种二氨基亚烷基-N，N′-二琥珀酸。这种用作磷脂酶C特异性抑制剂的酸是从放线菌MG 417-CF17菌株培养液中分离并鉴定的(参见T.Nishikioriet al.，J.Antibioties，37，426(1984))。但是，这种使用放线菌的方法具有非常低的产生效率，并不适于工业化生产。

对产生由式(I)表示的旋光氨基酸的广泛研究的结果，发明人发现旋光氨基酸特别是S，S-二氨基亚烷基-N，N′-二琥珀酸和R，S-二氨基亚烷基-N，N′-二琥珀酸可以通过采用微生物的催化作用从廉价的起始原料即富马酸和含氨基的化合物中有效地产生。基于这个发现而完成了本发明。

由此，本发明提供了一种生产由式(I)表示的旋光氨基酸的方法：该方法包括用具有裂合酶活性的微生物，它可以是经过处理的，来处理式(II)所表示的含氨基的化合物与富马酸的混合物。其中R₁和R₂可以相同或者不同，各自表示氢原子(R₁和R₂不能同时为氢原子)、氨基取代的或羧基取代的烷基(优选C₁-C₄烷基)、氨基取代的环烷基(优选C₃-C₆环烷基)或者表示氨基取代的芳基；R₃和R₄与R₁和R₂相同或者各自代表一个具有将R₁和R₂上的至少一个氨基和琥珀酸连接结构的基团。

式(I)表示的旋光氨基酸优选的化合物是由式(III)表示的化合物：其中R₅代表亚烷基、环亚烷基或亚苯基，优选为亚烷基。

在由式(II)表示的含氨基的化合物中，优选R₁和R₂其中至少一个为氨基取代的烷基，氨基取代的环烷基或氨基取代的芳基，更优选的化合物是由式(IV)表示的化合物：

         H₂N-R₅-NH₂          (IV)其中R₅代表亚烷基、环亚烷基或亚苯基，优选为亚烷基。

尽管迄今还没有阐明本发明方法中的反应机制，但是，反应被认为是通过与由天冬氨酸脱氨酶、精氨琥珀酸脱氨酶或类似物(它们普遍存在于微生物细胞中)催化的反应相类似的机制而进行。

由式(II)表示的含有氨基的化合物(此后称作氨基)的例子包括单胺例如甘氨酸、亚氨基二乙酸、3-氨基丙酸、3，3′-亚氨基二丙酸、具有1-6个碳原子的链烷-或环烷二胺例如、乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺和环己二胺、亚苯基二胺例如，1，3-亚苯基二胺和1，4-亚苯基二胺以及多胺例如，三亚乙基四胺，四亚乙基五胺和五亚乙基六胺。

可由本发明获得的式(I)表示的有代表性的旋光氨基酸包括下列化合物的S，S-或R，S-异构体：二氨基亚烷基-、亚苯基二胺-或二氨基环烷-N，N′-二琥珀酸，例如，乙二胺-N，N′-二琥珀酸、1，3-丙二胺-N，N′-二琥珀酸、2-甲基-1，3-丙二胺-N，N′-二琥珀酸、1，2-环己二胺-N，N′-二琥珀酸、1，3-环己二胺-N，N′-二琥珀酸和1，4-环己二胺-N，N′-二琥珀酸，1，3-亚苯基二胺二琥珀酸，1，4-亚苯基二胺二琥珀酸，还包括下列化合物的S或R异构体：天冬氨酸-N-单乙酸，天冬氨酸-N，N-二乙酸，天冬氨酸-N-单丙酸，天冬氨酸-N-2-丙酸和天冬氨酸-N-2-戊二酸。

用于本发明的微生物包括，例如，属于Burkholderia、节杆菌属(Arthrobacter)、副球菌属(Paracoccus)、哈夫尼菌属(Hafnia)、Acidovorax、Sphingomonas、Brevundimonas、假单胞菌属和埃希氏杆菌属中任一属的微生物。其特定的例子包括Burkholderia SP.KK-5(FERM BP-5412)、Barkholderia SPKK-9(FERM BP-5413)、节杆菌属sp.kk-3(FERM BP-5414)、副球菌属SP.KK-6(FERM BP-5415)、Hafnia alvei ATCC 9760、Acidovorax SP.TN-51(FERM BP-5416)、Sphingomonas SP.TN-28(FERM BP-5419)、Brevundimonas SP.TN-30(FERM BP-5417)、假单胞菌属SP.TN-131(FERM BP-5418)和大肠杆菌(Escherichia coli)JM 109(ATCC 53323)。这些微生物中，菌株ATCC 9760和ATCC 53323是已知的且从美国典型培养物保藏中心(ATCC)容易获得。其它微生物是本发明从土壤中分离的，分别按上所述的保藏号保藏在日本国际贸易和工业部工业科学技术局生物技术工业研究所。其细菌学性质叙述于下。细菌学性质：

                菌株KK-5        菌株KK-9形态                  杆状            杆状革兰氏染色             -               -孢子                   -               -移动性                 +               +鞭毛              数个极生鞭毛    数个极生鞭毛对游离氧的需求        需氧            需氧氧化酶                 +               +过氧化氢酶             +               +OF试验                 0               0荧光色素的形成         -               -醌系统                Q-8             Q-8硝酸盐还原             -               +吲哚形成               -               -葡萄糖发酵             -               -精氨酸二水解酶         -               -(dihydrolase)脲分解              -            -七叶苷分解          -            -明胶液化            -            -PNPG                +            -从木糖形成酸        +            +利用情况葡萄糖              +            +L-阿拉伯糖          +            +D-甘露糖            +            +D-甘露醇            +            +麦芽糖              -            -葡萄糖酸钾          +            +正癸酸              +            +己二酸              -            -dl-苹果酸           +            +柠檬酸              +            -乙酸苯酯            +            +

                   菌株KK-3形态                   多形杆状革兰氏染色                +孢子                      -移动性                    -对游离氧的需求                需氧氧化酶                        -过氧化氢酶                    +菌落颜色                      无特征颜色耐酸性                        -杆菌-球菌循环                 +围绕菌落延伸                  无细胞壁二氨基酸                赖氨酸乙醇酰试验                    -(乙酰型)细胞壁阿拉伯半乳聚糖聚合物    -(从全细胞的酸水解产物

                          估计)醌系统                        MK-9(H₂)，8(H₂)DNA的GC含量(mol％)            65(HPLC方法)

                          菌株KK-6形态                          球形的或短的杆状革兰氏染色                    -孢子                          -移动性                        -对游离氧的需求                需氧氧化酶                        +过氧化氢酶                    +OF试验                        -菌落颜色                      无特征颜色PHB积累                        +脱硝化作用                     -硝酸盐还原                     +亚硝酸盐还源                   -醌系统                         Q-10DNA的GC含量(mol％)             64(HPLC方法)

                           菌株TN-51形态                           杆状革兰氏染色                     -孢子                           -移动性                         +鞭毛                           单个极生鞭毛对游离氧的需求                 需氧氧化酶                         +过氧化氢酶                     +OF试验                         0菌落颜色                       无特征颜色PHB积累                        +在40℃的生长                   -原儿茶酸盐(protocatechuate)    变形(meta form)裂解类胡萝卜色素                   -葡萄糖同化                     +利用氢的能力          -醌系统                Q-8

                  菌株TN-28形态                  杆状革兰氏染色            -孢子                  -移动性                +鞭毛                  单个极生鞭毛对游离氧需求          需氧氧化酶                +过氧化氢酶            +OF试验                -菌落颜色              黄荧光色素的形成        -醌系统                Q-10硝酸盐还原            -吲哚形成              -葡萄糖发酵            -精氨酸二水解酶        -脲分解                -七叶苷分解            +明胶液化              -PNPG                  -利用情况

葡萄糖                +

L-阿拉伯糖            -

D-甘露糖              +

D-甘露醇              -

N-乙酰基葡糖胺        +

麦芽糖                +

葡萄糖酸钾            -

正癸酸                -

dl-苹果酸             +

柠檬酸钠              -

乙酸苯酯              -

                  菌株TN-30形态                     杆状革兰色染色                -移动性                    +鞭毛                  单个极生鞭毛对氧的需求               需氧氧化酶                    +过氧化氢酶                +OF试验                    -菌落颜色              无特征颜色荧光色素的形成            -PHB积累                          +营养缺陷                        阳性醌系统                          Q-10硝酸盐还原                       +吲哚形成                         -葡萄糖发酵                       -精氨酸二水解酶                   -脲分解                           -七叶苷分解                       -明胶液化                         -PNPG                             -利用情况

葡萄糖                       -

L-阿拉伯糖                   -

D-甘露糖                     -

D-甘露醇                     -

N-乙酰基-D-葡糖胺            -

麦芽糖                       -

葡萄糖酸钾                   +

正癸酸                       -

己二酸                       +

dl-苹果酸                    -

酒石酸钠                     +

乙酸苯酯                     -

               菌株TN-131形态                  杆状革兰色染色             -孢子                   -移动性                 +鞭毛              单个极生鞭毛对游离氧的需求        需氧氧化酶                 +过氧化氢酶             +OF试验                 -菌落颜色               黄荧光色素形成           +醌系统                Q-9硝酸盐还原             +吲哚形成               -葡萄糖发酵             -精氨酸二水解酶         -脲分解                 -七叶苷分解             -明胶液化               -PNPG                   -利用情况

葡萄糖             -

L-阿拉伯糖         -

D-甘露糖             -

D-甘露醇             -

N-乙酰基-D-葡糖胺    -

麦芽糖               -

葡萄糖酸钾           -

正癸酸               +

己二酸               -

dl-苹果酸            +

酒石酸钠             +

乙酸苯酯             -

基于上述细菌学性质，按照Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology，Vol.1(1984)和Bergeyss Manualof Determinative Bacteriology，9th ed.(1994)分类的结果是：菌株KK-5和KK-9各被鉴定为属于Burkholderia的微生物；菌株TN-51为属于Acidovorax的微生物；菌侏TN-131为属于假单胞菌属的微生物。按照Bergey′s Manual of Systematie Bacteriology，Vol.2(1986)分类的结果是：菌株KK-3被鉴定为属于节杆菌属的微生物。按照Bergey′s manual of Systematic Bacterioloqy，Vol.1(1984)分类的结果是：菌侏KK-6被鉴定为属于球菌属的微生物。按照Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，9thed.(1994)和Microbiol.Immunol.，34，99(1990)分类的结果是：菌侏TN-28被鉴定为属于Sphingomonas的微生物。另外，按照Bergey′sManual of Determinative Bacteriology，9th ed.(1994)和Int.J.Syst.Bacteriol.，44，499(1994)分类的结果是：菌株TN-30被鉴定为属于Brevundimonas的微生物。

接下来说明本发明的实施方案。

用于本发明的微生物的培养基不受特别的限制，合成和天然培养基，只要它含有合适的可同化的碳源、氮源和无机盐、少量有机营养物等，均可使用。优选在培养前将氨基酸例如乙二胺二琥珀酸、乙二胺单琥珀酸，天冬氨酸、谷氨酸或组氨酸加入到培养基中，因为这样可产生具有高催化活性的细胞。培养条件依使用的菌株和培养基变化。但一般来说，可在PH从4到10的培养基中，优选从6到9，在通气条件下培养1至10天，且培养温度从20到45℃，优选从25到35℃，直到达到最大活性。

产生由式(I)表示的旋光氨基酸其反应按下述方法进行：将任一上述菌株的细胞或者经处理所述细胞所获得的物质(例如，干细胞、破碎细胞、粗的或纯化的酶，或者固定化的细胞或酶)与式II表示的氨基化合物的富马酸的混合物在水或缓冲溶液，例如，磷酸缓冲剂、碳酸缓冲剂或硼酸缓冲剂中接触。

一般来说，反应在温度从0到50℃，优选从5到35℃，且PH从5到11，优选从6到10下进行。虽然富马酸和由式(II)表示的氨基化合物的浓度随着所用的反应温度和PH而发生变化，但是，它们各自的浓度可以在从0.1％到饱和浓度的范围内。微生物或类似物其用量一般基于底物的量是干菌株细胞量的0.01到5.0％(重量)。反应可以分批或连续进行。

为了在反应完成后从反应混合物中分离所需的氨基酸，可以使用如，除去微生物、浓缩和结晶的公知方法。

以下将结合特定的实施例更详细地说明本发明。本领域技术人员都会认识到本发明是不会由此而受到限定的。除非有其它说明所有百分比均为重量百分比。

                    实施例1(1)培养：

从斜面培养基上取出Burkholderia SP.KK-5和Burkholderia SP.KK-9各一铂接种环的量，接种到下列培养基中。这些菌株在30℃下振动培养3天。

培养基(PH7，100ml)组成

葡萄糖                        0.2g

酵母膏                        0.1g

聚蛋白胨(Polypeptone)         0.05g

磷酸缓冲剂                    25mM

乙二胺单琥珀酸                0.2g

金属盐混合物溶液^*            0.5ml

*金属盐混合物溶液(100ml)：硫酸钠56g；

氯化镁六水合物8g；氯化钙0.8g；硫酸锰四水合物0.6g；氯化铁六水合物0.12g硫酸锌0.06g。(2)产生反应：

从每一培养物中取出20ml置入离心管中，将离心管中的培养物在10,000rpm和5℃下离心5分钟，分离的细胞用50mM pH为7.5的磷酸缓冲剂洗涤两次。将每一菌株的细胞悬浮于5ml的含有200mM富马酸和200mM乙二胺且pH为7.5的50mM磷酸缓冲剂中。在30℃振动下进行反应24小时。

完成反应后，用以下步骤测定由此形成的包含在反应混合物中的乙二胺二琥珀酸(EDDS)；在15,000rpm和5℃下离心反应混合物5分钟以除去细胞，用液相色谱(柱：WAKOSiL 5C8(Wako PureChemical Industries，Ltd.，Japan)；洗脱剂：含有10mM氢氧化四正丁基铵和0.4mMCuSO₄的pH为2的50mM磷酸)分析所得的上清液。用旋光拆分柱(MCI GEL；CRS 10W(Mitsubishi ChemicalIndustries Ltd.，Japan)测定反应产物的旋光纯度。

用T.Nishikiori et al.J.Antibiotics，37，426(1984)中所述的方法，其中使用了离子交换树脂，分离和纯化反应产物。用NMR光谱法和质谱法分析所获得的晶体以确定反应产物的化学结构。(3)结果：

                              菌    株

                 Burkholderia   Burkholderia

                   SP.KK-5        SP.KK-9产生的EDDS的量(mM)        40             53旋光特性                 S，S           S，S旋光纯度(％ee)            97             97

                    实施例2(1)培养和产生反应：

从斜面肉汤琼脂培养基上取出一铂接种环量的节杆菌属SP.KK-3，接种到含100ml实施例1所示培养基的500ml锥形瓶中。于30℃下振荡培养该菌株3天。收集该菌株的细胞，洗涤，并在与实施例1相同的条件下进行产生反应。用与实施例1相同的方法测定产生的EDDS的量和其旋光纯度。(2)结果：

                    菌    株

                 节杆菌属SP.KK-3产生的EDDS的量(mM)         57旋光特性                  S，S旋光纯度(％ee)             97

                    实施例3(1)培养和产生反应：

培养副球菌属SP.KK-6，用与实施例1相同的方式进行被培养菌株细胞的产生反应。用与实施例1相同的方法测定产生的EDDS的量和其旋光纯度。(2)结果：

                    菌    株

                 副球菌属SP.KK-6产生的EDDS的量(mM)         63旋光特性                  S，S旋光纯度(％ee)                 72

                    实施例4(1)培养和产生反应：

培养Burkholderia SP.KK-5，用与实施例1相同的方式收集被培养菌株的细胞，并进行产生反应。在产生反应中，分别用200mM 1，3-丙二胺，200mM 1，3-苯二胺和200mM 1，4-苯二胺替代200mM的乙二胺。以化学合成的产物为内标物用与实施例1相同的液相色谱测定每种反应产物的量。在用实施例1中所述的T.Nishikiori等提出的方法分离并纯化反应产物后，用NMR光谱法确证每一反应产物的化学结构。(2)结果：

 二胺             产物          数量(mM)1，3-丙二胺    1，3-丙二胺二琥珀酸    431，3-苯二胺    1，3-苯二胺二琥珀酸    331，4-苯二胺    1，4-苯二胺二琥珀酸    61

                    实施例5(1)培养和产生反应

培养副球菌属SP.KK-6，用与实施例1相同的方式收集被培养菌株的细胞，并进行产生反应。在产生反应中，分别使用200mM 1，3-苯二胺和200mM 1，4-苯二胺以替代200mM乙二胺。用与实施例4相同的方式测定或确证各反应产物的量和其化学结构。(2)结果：

 二胺              产物         数量(mM)1，3-苯二胺    1，3-苯二胺二琥珀酸    251，4-苯二胺    1，4-苯二胺二琥珀酸    48

                    实施例6(1)培养和产生反应：

用Meth.Enzymol，Vol.XIII，pp354-361(1969)中所述的方法(1％酵母膏，1％非生物性悬浮物(tripton)、0.5％磷酸氢二钾；30℃静置培养48小时)培养Hafnia alveiATCC 9760。收集被培养菌株的细胞，并进行产生反应。用与实施例1相同的方法测定产生的EDDS的量和其旋光纯度。(2)结果：

                       菌    株

                 Hafnia alvei ATCC9760产生的EDDS的量(mM)            10旋光特性                     R，S旋光纯度(％ee)                99

                    实施例7(1)使用酶的产生反应：

除了使用每5ml反应混合物中5mg浓度的由SIGMA Co.制造且得自Hafnia alvei ATCC 9760的L-天冬酶(L-天冬酶氨溶菌产物；EC 4.3.1.1)外，用与实施例1相同的方法进行产生反应(2)结果：

                              酶

                    L-天冬酶氨溶菌产物；得自

                Hafnia alvei ATCC9760r EC4.3.1.1产生的EDDS的量(mM)                50旋光特性                         R，S旋光纯度(％ee)                    99

                    实施例8(1)培养和产生反应：

培养Acidovorax SP.TN-51，用与实施例1相同的方法进行被培养菌株细胞的产生反应。用与实施例1相同的方法测定产生的EDDS的量和其旋光纯度。(2)结果：

                          菌株

                   Acidovorax sp.TN-51产生的EDDS的量(mM)             62旋光特性                      S，S旋光纯度(％ee)                 98

                    实施例9(1)培养和产生反应：

培养Acidovorax SP.TN-51，用与实施例4相同的方法进行被培养的细胞的产生反应。用与实施例4相同的方法测定各反应产物的量和其化学结构。(2)结果：

 二胺              产物         数量(mM)1，3-丙二胺    1，3-丙二胺二琥珀酸    561，3-苯二胺    1，3-苯二胺二琥珀酸    411，4-苯二胺    1，4-苯二胺二琥珀酸    66

                    实施例10(1)培养和产生反应：

培养Sphingomonas SP.TN-28，Brevundimonas SP.TN-30和假单胞菌属SP.TN-131，用与实施例1相同的方法进行每种被培养菌株细胞的产生反应。用与实施例1相同的方法测定产生的EDDS的量和其旋光纯度。(2)结果：

                            菌株

                  Sphingomonas Brevundimonas 假单胞菌属

                    SP.TN-28     SP.TN-30     SP.TN-131产生的EDDS的量(mM)         61           55           68旋光特性                  S，S         S，S         S，S旋光纯度(％ee)             80           92           94

                    实施例11(1)培养和粗酶溶液的制备

培养Sphingomonas SP.TN-28、BrevundimonasSP.TN-30和假单胞菌属SP.TN-131。用与实施例1相同的方法收集每种被培养菌株细胞并洗涤。将每一菌株的细胞悬浮在1.5ml PH为7.5的50mM磷酸缓冲剂中。用超声波处理所述悬浮液30分钟，同时用冰冷却以例破碎细胞。然后将每一种悬浮液在10,000rpm下离心30分钟以得到上清液。(2)产生反应

将每一上清液的0.5ml部分与1.5ml含有200mM富马酸和200mM乙二胺的50mM磷酸缓冲剂(PH7.5)混合。在振荡下进行24小时反应。用与实施例1相同的方法确定反应产物的量和其旋光纯度。(3)结果：

                            菌株

                 Sphingomonas Brevundimonas 假单胞菌属

                   SP.TN-28      SP.TN-30    SP.TN-131产生的EDDS的量(mM)        85            72          93旋光特性                 S，S          S，S        S，S旋光纯度(％ee)            96            98          98

                    实施例12(1)培养和产生反应：

培养Burkholderia SP.KK-5和Acidovorax SP.TN-51，用与实施例1相同的方法收集每种被培养菌株的细胞并进行产生反应。在产生反应中，用200mM 1，3-环己二胺替代200mM乙二胺。使用化学合成的产物作为内标物，在与实施例1相同的条件下经液相色谱法测定所获得的反应产物1，3-环己二胺-N，N′-二琥珀酸。用实施例1中所述的T，Nishikiori等提出的方法分离和纯化该反应产物后，用NMR光谱法确证该反应产物的化学结构。(2)结果

                           菌   株

                 Burkholderia    Acidovorax

                    SP.KK-5         SP.TN-511，3-环己二胺-N，N’-     26             21琥珀酸的量(mM)

                    实施例13(1)培养和产生反应

将大肠杆菌JM109(需要胸腺嘧啶)在含有0.2％乙二胺-N，N′-二琥珀酸的LB培养基(1％蛋白胨、1％酵母膏，0.5％食盐)中于37℃下通气培养3天。收集被培养菌株的细胞，洗涤并进行产生反应。用与实施例1相同的方法测定反应产物的量。(2)结果

                       菌株

                   大肠杆菌JM109产生的EDDS的量(mM)          7旋光特性                   R，S旋光纯度(％ee)              95

本发明提供了一种经微生物作用工业化生产旋光氨基酸的方法，该方法在普通温度和普通压力的温和条件下从廉价的物质即，富马酸和氨基化合物中产生所述氨基酸。

尽管结合其特定的实施方案详细地描述了本发明，但是，对本领域技术人员而言，在不背离其精神和范围的前提下可以作出其中各种变化和修改。