中国株单纯疱疹病毒胸苷激酶基因及其应用

摘要

本发明通过PCR方法克隆出高活性的中国株单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(TKc)基因，并测定了其DNA序列，构建了含该基因的逆转录病毒重组表达载体pLTKcSN，并完成了PA317(PLTKcSN)包装细胞株的建立。还应用该包装细胞及其产生的“假型”病毒与GCV配合来治疗恶性肿瘤，在体外的细胞实验及体内的动物试验中，表现其对肿瘤细胞具有杀灭和抑制作用。

说明书

本发明属于分子生物学的基因治疗范畴。是通过PCR方法克隆出中国株单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(TKc)，然后将该目的基因装入真核表达载体，在真核水平上检测其活性，挑选最高活性的克隆，进行DNA序列测定。此类真核重组表达载体用以产生“假型”病毒及该类“假型”病毒可应用于恶性肿瘤基因治疗。

神经胶质瘤是最常见的恶性原发性脑肿瘤。目前的治疗方法主要是外科手术、放疗及化疗，疗效极差，术后复发率是100％，被认为是不可医治的。而近年来，应用TK基因转移的方法治疗脑肿瘤的研究则取得了令人鼓舞的结果。

依据一种对人体无毒或极低毒性的药物前体经相关酶代谢毒性的产物作用，为肿瘤基因治疗提出了病毒介导的酶-药物前体治疗方案。单纯疱疹病毒胸苷激酶具有催化一些核苷类似物如Ganciclovir(GCV)等磷酸化。这些磷酸化的产物可明显地抑制细胞DNA的合成，从而使细胞死亡。正是基于这一原理，利用正常脑组织细胞基本上不分裂，脑肿瘤细胞则分裂活跃，而逆转录病毒只能感染和整合到分裂的细胞中去的特点，加上使用核磁共振监测下的脑肿瘤颅内定位注射的方法，将产生“假型”病毒的包装细胞(小鼠成纤维细胞)直接注入肿瘤，或采用脑肿瘤手术后给予包装细胞，然后，一周后给GCV，使肿瘤细胞被GCV杀死，同时也导致注入的产生“假型”病毒的包装细胞“自杀”，而正常脑组织则不受损害。这充分显示了此类生物基因治疗的优越性，即治疗的高度选择性、特异性和极小的毒副作用。

1980年Steven L.Mc Knight测定了单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因的全序列并确定了其开放读框(Steven L.Mc Knight，Nucleic Acids Research，8(24)，5949-5964，1980)。该基因编码区长1128个核苷酸，编码376个氨基酸，基因中没有插入序列，其mRNA的5′端有107个核苷酸的非翻译区。

90年代以来已不断有应用TK基因治疗脑胶质瘤的体外细胞实验、体内动物实验的研究报告(Martuza等，The New Biologist，3(6)，608-6121991；Culver等，Science，256(12)，1550-1557，1992)。1992年，美国NIH及FDA批准了Oldfield EH等用逆转录病毒介导的HSVI TK基因转移联合应用药物GCV治疗脑肿瘤的临床方案(Oldfield EH，Ram Z.等，Human Gene Therapy，4(1)，36-69，1993)，在临床上试用并获近期疗效。可以预见，应用TK基因转移配合GCV治疗恶性肿瘤有很好的前景。

本发明目的是以中国株HSV1的基因组DNA为模板，通过PCR方法克隆出中国株单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因，测定其DNA核苷酸序列，构建含胸苷激酶基因的真核重组表达载体及转导入包装细胞，用作恶性肿瘤基因治疗用途。

本发明以中国株HSV1的基因组DNA为模板，通过PCR方法克隆出中国株单纯疱疹病毒1型的胸苷激酶基因，定名为TKc基因，测定其序列，并完成其逆转录病毒重组表达载体pLTKcSN及其包装细胞株的建立。并且，还应用该包装细胞株及其分泌的″假型″病毒来治疗恶性肿瘤，在体外的细胞实验及体内的动物试验中，观察其对肿瘤细胞杀灭和抑制作用。

(1)中国株HSV1 TKc基因的克隆及重组克隆载体pSKTKc的构建

从中国株HSV1-17分离DNA，以其为模板，设计上游引物为5′AAAGTTAACTGGCGTGAAACTCCCGCACC 3′(含HpaI切点)，下游引物为5′AAACTCGAGGTATTGTCTCCTTCCGTGTT 3′(含XhoI切点)。设置反应条件为94℃变性45秒，45℃退火45秒，72℃延伸2分钟，进行25个循环，再设置反应条件为94℃变性45秒，55℃退火45秒，延伸2分钟，进行10个循环。以上述条件，进行PCR，得中国HSV1的TKc基因产物为1.25kb，电泳鉴定结果见图1。将PCR扩增的TKc DNA电泳分离，玻璃粉回收、纯化，用HpaI和XhoI双酶酶切，然后在T4DNA连接酶的作用下，构建SK(-)-TKc的重组克隆载体，定名为pSKTKc，见图2。经XL1Blue菌转化后，从插入片段正确的克隆中，挑出5个相应的克隆pSKTKc1-5，扩增后以EcoRI及XhoI酶切，分离纯化其片段，其酶切电泳鉴定见图3。

(2)中国株HSV 1 TKc基因的逆转录病毒重组表达载体pLTKcSN的构建

本发明构建的逆转录病毒载体pLSN，是用pDOL中的Neo基因取代pLSHD的HD基因。首先，将pDOL先用EcoRI酶切，然后补平，再用BamHI酶切，分离出Neo基因片段；同时，将PLSHD先用HindIII酶切，然后补平，再用BamHI酶切，制备好带切点的载体，在T4连接酶的作用下，将Neo基因定向克隆至该带切点的载体，构建含Neo基因的逆转录病毒载体，定名为pLSN，见图4。

将上述构建的逆转录病毒载体pLSN经EcoRI和XhoI双酶酶切，然后，将上述来自于5个pSKTKc1-5的TKc片段，分别定向克隆至pLSN载体中，得到5个含TKc基因的逆转录病毒重组表达载体，分别定名为pLTKc1SN，pLTKc2SN，pLTKc3SN，pLTKc4SN，pLTKc5SN。在大肠杆菌XL1Blue中转化获得转化株，经酶切鉴定证明构建正确。结果如图5，图6。

(3)PA317(pLTKcSN)包装细胞株的建立及活性鉴定

上述5个含TKc基因的逆转录病毒的重组表达载体，分别用磷酸钙方法转染PA317细胞，经G418筛选，获得了200个以上克隆。每个重组表达载体各挑选20个以上G418抗性细胞克隆，分别于96孔板中培养。待细胞达到1×10⁴后，将上清液分别加入另一块用96孔板培养NIH3T3细胞的孔内，以含病毒上清液取代NIH3T3细胞培液。经2天培养后加入GCV10微克/孔，5天后观察结果。可以看到细胞发生不同程度的形态变化以及死亡和脱落。挑出其上清液对NIH3T3细胞具有最大作用的相应含TKc1包装细胞株进行扩增。扩增后即得含pLTKc1SN的包装细胞株，以序号为1的pLTKc1SN的包装细胞株定名为PA317(pLTKcSN)包装细胞株。该逆转录病毒包装细胞株已于1995年6月5日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.C95015。

表一显示部分挑出的产生TKc基因“假型”病毒的包装细胞株，用GCV 1、10、30微克加入后对NIH3T3细胞的杀伤作用。可以看出，PA317(pLTKc1-5SN)包装细胞株在1μg、10μg、30μg GCV作用下可产生显著的杀伤效应，其中，PA317(pLTKc1SN)包装细胞的杀伤效应最明显，与原来用pOPF HSV 1分离的TK基因(F.G.Grosv eld等，Nucleic AcidsResearch，10(21)6715-6732，1982)包装细胞株相比，同样具有很高的活性。经NIH3T3抗G418分析，病毒滴度为2×10⁶cfu/ml。

从上述结果可以看出，将含TKc基因的逆转录病毒重组表达载体转导入包装细胞PA317后得到的PA317(pLTKcSN)包装细胞株，能产生高滴度的含TKc基因的″假型″逆转录病毒，该病毒具有极高的感染肿瘤细胞的能力，且在GCV配合作用下，能高效率杀伤和抑制肿瘤细胞，从杀伤肿瘤细胞的能力也就相应反映出所含的TKc基因具有高活性。

本发明通过PCR方法从中国株单纯疱疹病毒1型克隆出TKc基因，运用DNA重组技术，将TKc基因克隆至SK(-)载体中，得到5个重组克隆载体pSKTKc1-5，再从这些重组克隆载体中分离相应的TKc片断，完成其相应的逆转录病毒重组表达载体pLTKc1-5SN及其包装细胞株的建立。通过GCV介导的细胞毒性来确定具有TKc活性的PA317(pLTKcSN)包装细胞株。此种筛选方法可在真核细胞水平来确定基因活性。

本发明的克隆、筛选高活性TKc基因方法适用于全部以中国株单纯疱疹病毒1型基因组DNA为模板，经PCR法克隆的胸苷激酶基因，而且所克隆出的胸苷激酶基因DNA序列与本发明所提供的TKc基因DNA序列同源率不小于50％。

(4)TKc基因DNA序列测定

根据上述活性的PA317(pLTKc1SN)包装细胞株产生最显著的杀伤效应，选择序号为1的TKc进行DNA序列测定，中国株HSV 1 TKc基因的DNA序列测定表明，具有6处碱基突变，有2个氨基酸不同于pOPFHSV 1 TK(F.G.Grosv eld等，Nucleic Acids Research，10(21)6715-6732，1982)的序列。其中，第16个核苷酸由G→T，第528个核苷酸由G→A，第774个核苷酸由C→T，第778个核苷酸由G→A，第1065个核苷酸由C→A，第1083个核苷酸由A→C；第6个氨基酸由甘氨酸置换为半胱氨酸，第260个氨基酸由甘氨酸置换为精氨酸。这种现象符合不同地区病毒株的自然变异和多态性，但它仍保持了胸苷激酶的高活性。

(5)体内外肿瘤治疗试验

在此基础上，本发明运用PA317(pLTKcSN)包装细胞株配合GCV摹拟临床过程来治疗实体肿瘤，取得了一定效果。依据有关PA317(pLTKcSN)包装细胞株配合GCV治疗脑瘤的体内、体外实验表明，该系统对恶性肿瘤尤其实体肿瘤(包括神经胶质瘤、恶性肝细胞瘤等)有明显杀伤作用。所以，TKc除了通过上述逆转录病毒载体外，还可以通过腺病毒载体等病毒载体系统或非病毒载体系统如多聚赖氨酸、各种类型脂质体以及以多肽-多聚赖氨酸为介导的载体等，配合GCV给药，在临床上治疗恶性肿瘤。这些肿瘤可以包括是脑瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、淋巴癌等。

本发明所克隆的高活性中国株单纯疱疹病毒1型胸苷激酶TKc基因，通过真核表达载体系统(逆转录病毒载体)使该基因获得了高表达。活性分析结果显示，本发明所克隆的TKc基因，导入PA317细胞后，能产生高滴度的″假型″病毒，在GCV配合作用下，能产生高效率杀伤和抑制细胞作用，从这种细胞毒作用相应反映出该TKc基因具有高活性。同时，该TKc基因还具有以下特点：1.本发明采用PCR方法克隆的TKc基因全长1.25kb，包含了该基因的全部有用序列，使该目的基因保留在最短的有效长度，而文献报道的TK基因至少要在1.9kb以上。这样，就保证了TKc基因最高效的表达，因为在任何表达载体上，理论上，目的基因越短，其表达效率越高。2.TKc基因还具有所谓的“旁观者效应”，即当TKc基因导入肿瘤细胞，可以使之对某些核苷类似物药物如GCV的敏感性大大增加，而对正常细胞的毒性很低，在表达TKc基因的肿瘤细胞周围的TKc阴性的肿瘤细胞也被杀死，这种现象在恶性肿瘤的基因治疗中有非常重要的意义。

表一.五种PA317(pLTKcSN)包装细胞株所介导GCV细胞毒性的比较GCV浓度      0μg/ml    1μg/ml         10μg/ml       30μg/ml包装细胞株   *细胞数  *细胞数(**％)   *细胞数(**％)  *细胞数(**％)PA317       7.9×10²    90.3(98.9)     24.3(99.7)     7.7(99.9)(pLTKc1SN)PA317       9.0×10²    389.3(94.7)    219.0(97.0)    107.3(98.5)(pLTKc2SN)PA317       7.3×10²    158.7(98.2)    56.3(99.4)     14.3(99.9)(pLTKc3SN)PA317       9.8×10²    158.3(94.7)    56.3(99.4)     14.3(99.9)(pLTKc4SN)PA317       2.3×10²    229.4(90.1)    115.3(95.0)    3.2(99.9)(pLTKc5SN)***PA317    9.8×10³    154.7(98.4)    39.3(99.6)    18.7(99.5)(pLTKSN)*GCV处理后的NIH3T3细胞存活数**GCV杀伤NIH3T3细胞的百分率***pOPF HSV1分离的TK基因的pLTKSN的包装细胞株表二.GCV对转TKc基因及未转TKc基因脑胶质瘤细胞体外杀伤效果的比较

                          GCV浓度(μg/ml)细胞种类   0.0001   0.001  0.01  0.1  1.0  10.0  100.0

                        胶质瘤细胞存活率(％)C6          100      96    100   99   99    95    83C6TKc       100      94    60    21   4.4   0.7   0.5U87         100      97    95    82   71    57    28U87TKc      98       73    26    6.3  4.4   0     0U251        100      100   96    88   78    74    50u251TKc     100      68    48    8.5  6.4   0.5   0.5表三.PA317(pLTKcSN)包装细胞株配合GCV对大鼠体内脑瘤的治疗效果

 组别         实验动物数          脑肿瘤

                         完全消失    部分缩小  无效果注射PA317(pLTKcSN)   9           3        2        4及给药GCV实验组未注射未给药对照组   6           0        0        6

附图说明：

图1.PCR扩增中国株HSV1-17的TKc基因的电泳鉴定。

1为λ_HindIII的分子量标准

2为λ_{EcoR I+Hind III}的分子量标准

3为pCR扩增中国株HSV1-17的TKc基因产物，大小为1.25Kb。

图2.重组克隆载体pSKTKc的构建。

图3.重组克隆载体pSKTKc的酶切电泳鉴定。

1为λ_Hind III的分子量标准

2-6分别为pSKTKc1-5的EcoR I、Xho I的双酶酶切

7为λ_{EcoR I+Hind III}的分子量标准。图4.逆转录病毒表达载体pLSN的构建。图5.逆转录病毒重组表达载体pLTKcSN的构建。图6.逆转录病毒重组表达载体pLTKcSN的酶切电泳鉴定。

1为λ_Hind III的分子量标准

2-6分别为pSKTKc1-5的EcoR I、Xho I的双酶酶切

7为λ_{EcoRI+Hind III}的分子量标准。

图7.中国TKc基因的序列测定。

本发明通过以下实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1中国株HSV 1 TKc基因的克隆及重组克隆载体pSKTKc的构建

从中国株HSV1-17分离DNA，以其为模板，设计上游引物为5′AAAGTTAACTGGCGTGAAACTCCCGCACC 3′(含HpaI切点)，下游引物为5′AAACTCGAGGTATTGTCTCCTTCCGTGTT 3′(含XhoI切点)。

PCR反应混合物中各组份含量为：

双重去离子水                  29.5微升

10X缓冲液                     10微升

四种dNTP混合物(每种           16微升

浓度为1.25毫摩尔浓度)

上游引物(100皮摩尔)                        2.5微升

下游引物(100皮摩尔)                        2.5微升

模板pNA(HSV1 17基因组DNA)(1微克)           39微升

TaqDNA聚合酶(Perkin-Elmer Centus公司产品)  0.5微升

                                         (5单位/微升)

反应按如下程序进行：第1-25个循环条件为94℃(45秒)，45℃(45秒)，72℃(2分钟)；第25-35个循环条件为94℃(1分钟)，55℃(1分钟)，72℃(2分钟)。

以上述条件，进行PCR，其产物为1.25kb，结果见图1。将PCR扩增的TKc DNA电泳分离，玻璃粉回收、纯化，用HpaI和XhoI双酶酶切，(Hpa I，XhoI为美国Stratagene公司产品)，内切酶消化的反应条件参照提供该酶的公司使用说明书提示的条件进行。

克隆载体SK(-)经EcoRV和Xho I消化后，再经CIAP(小牛肠衣膜碱性磷酸酶，购自Promega公司)处理，反应条件按照提供该酶的公司提示的反立条件进行。经上述处理PCR产物(TKc DNA片段)及克隆载体SK(-)分别经酚，氯仿等体积各抽提一次，再经等体积氯仿抽提一次。加入1/10倍体积的3N NaAC(pH5.2)及2.5倍体积的无水乙醇于-20℃情况下过夜沉淀出目的TKc DNA片段及克隆载体SK(-)。各以10μ1 10mM Tris·HCl(pH8.0)溶液溶解所得的沉淀，各取1μl经琼脂糖凝胶电泳鉴定出插入片段(PCR产物，即TKc基因)和克隆载体SK(-)的质量数值。依据插入DNA片段与克隆载体的摩尔数之比为2∶1，插入DNA片段为50ng至100ng左右计算出所需克隆载体及插入DNA片段的体积。依前述沉淀核酸的方法共沉淀克隆载体及插入DNA片段于同一1.5ml离心管中。加入7微升双重去离子水溶解沉淀，再加入2微升5×连接酶缓冲液和1微升T4连接酶(1个单位/微升，连接酶由Boehringer-Mannheim公司提供)于16℃保温12小时。

按标准的分子生物方法制备工程菌XL1-Blue(由发明人工作室提供该菌株)的感受态细胞。以2μl上述连接反应混合物加到100μl感受态细胞中，按标准的分子生物学方法转化感受态大肠杆菌XL1-Blue。得到相应抗性的单克隆菌落后，挑选5个单克隆菌落于相应抗性培养基中于37℃振摇12小时后，以标准分子生物学方法抽提质粒。以内切酶EcoRI和Xho I消化所得的质粒，经琼脂糖凝胶电泳鉴定出目的DNA条带出现，提示得到5个重组克隆载体质粒SK(-)-TKc的重组体，定名为pSKTKc1-5，见图2，图3。

实施例2逆转录病毒载体pLSN的构建及含Tkc基因逆转录病毒重组表达载体pLTKcSN的构建

本发明构建的逆转录病毒载体pLSN，是用pDOL中的Neo基因取代pLSHD的HD基因，质粒DNA pLSHD是由美国A.D.Miller教授提供。首先，将pDOL先用EcoRI酶切，然后Klenow酶16℃保温2小时；再用BamHI酶切，通过电泳分离出Neo基因片段；同时，将pLSHD先用HindIII酶切，然后Klenow酶16℃保温2小时，再用BamHI酶切，通过电泳分离制备好带切点的载体，将分离的Neo基因片段和载体，经酚，氯仿等体积各抽提一次，再经等体积氯仿抽提一次。加入1/10倍体积的3N NaAC(pH5.2)及2.5倍体积的无水乙醇于-20℃情况下过夜沉淀出目的DNA片段及载体。各以10μl 10mM Tris·HCl(pH8.0)溶液溶解所得的沉淀，各取1μl经琼脂糖凝胶电泳鉴定出插入片段(Neo基因片段)和载体的质量数值。依据插入DNA片段与克隆载体的摩尔数之比为2∶1，插入DNA片段为50ng至100ng左右计算出所需克隆载体及插入DNA片段的体积。依前述沉淀核酸的方法共沉淀克隆载体及插入DNA片段于同一1.5ml离心管中。加入7微升双重去离子水溶解沉淀，再加入2微升5×连接酶缓冲液和1微升T4连接酶(1个单位/微升，连接酶由Boehringer-Mannheim公司提供)于16℃保温12小时。

按标准的分子生物方法制备工程菌XL1-Blue(由发明人工作室提供该菌株)的感受态细胞。以2μl上述连接反应混合物加到100μl感受态细胞中，按标准的分子生物学方法转化感受态大肠杆菌XL1-Blue。得到相应抗性的单克隆菌落后，挑选单克隆菌落于相应抗性培养基中于37℃振摇12小时后，以标准分子生物学方法抽提质粒。这样构建含Neo基因的逆转录病毒载体，定名为pLSN，见图4。

逆转录病毒重组表达载体pLTKcSN的构建过程基本与构建重组克隆载体pSKTKc相同。不同之处是将克隆表达载体SK(-)换成pLSN。预先将上述构建的逆转录病毒载体pLSN经EcoRI和XhoI双酶酶切，然后，将上述来自于pSKTKc1-5的TKc片段，分别定向克隆至pLSN载体中，得到5个含TKc基因的逆转录病毒重组表达载体，分别定名为pLTKclSN，pLTKc2SN，pLTKc3SN，pLTKc4SN，pLTKc5SN。在大肠杆菌X11Blue中转化获得转化株，经酶切鉴定证明构建正确。结果如图5，图6。

实施例3产生Tkc″假型″病毒的PA317(pLTKcSN)包装细胞株的建立

上述5个重组表达载体pLTKc1-5SN，分别用磷酸钙方法转染PA317细胞，经浓度为1mg/ml G418(一种新霉素类似物，购自GIBCO公司)的筛选，获得了200个以上克隆。每个重组表达载体pLTKc1-5SN各挑选20个以上G418抗性细胞克隆，分别于96孔板中培养。待细胞达到1×10⁴后，将上清液分别加入另一块培养NIH3T3细胞的96孔板的孔内，以含病毒上清液取代NIH3T3细胞培液。经2天培养后加入GCV10微克/孔，5天后观察结果。可以看到NIH3T3细胞发生不同程度的形态变化及死亡和脱落。挑出其上清液对NIH3T3细胞具有最大细胞毒性作用的相应PA317(pLTKcSN)包装细胞株进行扩增。

上述筛选方法，可以选出活性的PA317(pLTKc1-5SN)包装细胞株。表一显示部分挑出的产生TKc“假型”病毒的包装细胞株，用GCV1、10、30微克加入后对NIH3T3细胞的杀伤作用。在1μg/ml水平，PA317(pLTKc 1SN)、PA317(pLTKc3SN)包装细胞株与原来用pOPF HSV1分离的TK基因的组建的pLTKSN的包装细胞株相比，可产生同样的显著的杀伤效应；在10μg/ml水平，PA317(pLTKc1SN)、PA317(pLTKc4SN)包装细胞株与原来用pOPF HSV1分离的TK基因的组建的pLTKSN的包装细胞株相比，可产生同样的显著的杀伤效应；在30μg/ml水平，所有的PA317(pLTKc1-5SN)包装细胞株与原来用pOPF HSV1分离的TK基因的组建的pLTKSN的包装细胞株相比，可产生同样的显著的杀伤效应性。其中，PA317(pLTKc1SN)包装细胞株与原来用pOPF HSV1分离的TK基因的组建的pLTKSN的包装细胞株相比在各种GCV浓度下，均可产生同样的显著的杀伤效应性，因而，同样具有很高的活性。

实施例4TKc基因的DNA序列测定

鉴于产生TKc″假型″病毒并具有介导高活性的PA317(pLTKcSN)包装细胞株是由pLTKc₁SN逆转录病毒重组表达载体所转导和构建的，因此，本发明选择该病毒载体中的TKc₁基因进行DNA序列测定。在已构建好的重组克隆载体pSKTKc1基础上，利用该重组克隆质粒双链DNA为测序反应的模板，用美国U.S.B.公司测序试剂盒，放射性同位素采用³⁵S标记的dATP，测序操作过程为先制备好聚丙烯酰胺凝胶电泳用凝胶，然后进行测序反应；最后进行电泳，放射自显影。具体详细步骤参照U.S.B.公司产品使用说明进行。

中国HSV I TKc基因的DNA序列测定表明，具有6处碱基改变，有2个氨基酸不同于pOPF HSV 1 TK的序列(Steven L.McKnight.NucleicAcids Research.8(24)，5949-5964，1980)。其中，第16核苷酸由G→T，第528核苷酸由G→A，第774核苷酸由C→T，第778核苷酸由G→A，第1065核苷酸由C→A，第1083核苷酸由A→C。经电脑分析推断：第6氨基酸由甘氨酸置换为半胱氨酸，第260氨基酸由甘氨酸置换为精氨酸(见图7)。这种现象符合不同地区病毒株的自然变异和多态性。

实施例5 PA317(pLTKcSN)包装细胞株配合GCV对神经胶质瘤的细胞毒作用的体外细胞试验

应用含GCV 1mg/ml G418完全培养液连续培养PA317(pLTKcSN)包装细胞一周后，更换无G418完全培养液传代，待细胞融合满瓶，取其上清液，0.45μm微孔滤膜过滤一次，按量直接加入对数生长期的胶质瘤细胞(C6、U87、U251)培养瓶中。

胶质瘤细胞C6、U87、U251，在感染前24小时更新传代，确定细胞数2.0×10⁶瓶，感染后弃原培养液，汉克氏液(Hank′s)洗2遍，加入浓度为12μg/ml多聚甲溴化物(Polybrene)1.5ml，37℃5％CO₂条件下处理一小时后，倒去液体；再加入1.0ml含6.0μg/ml多聚甲溴化物的病毒上清，以上述条件培养2小时，然后加入含相同浓度多聚甲溴化物的等体积无血清改良细胞培养液(DMEM)，过夜培养。次日再加入等量含血清完全培养液培养至48小时，将满瓶细胞均分3瓶，按每瓶加入1mg/ml G418完全培养液5ml进行筛选。筛选期每隔48-72小时更新含相同剂量G418培养液一次。10-14天时计数细胞克隆，以后按常规方法在G418培养液中传代扩增抗性细胞，这样可以得到TKc阳性的胶质瘤细胞C6TKc、U87TKc、U251TKc。

将上述的TKc阳性的胶质瘤细胞C6TKc、U87TKc、U251TKc，加入不同的GCV，观察三天，三天后，GCV对胶质瘤细胞和TKc阳性的胶质瘤细胞的抑制和杀灭效果，见表二。

结果表明，GCV对TKc阳性的胶质瘤细胞C6TKc、U87TKc、U251TKc有明显抑制和杀灭效果，而对未转入TKc基因的胶质瘤细胞C6、U87、U251未见明显影响。其中，GCV有效杀伤细胞浓度在10^-2-10²μg/ml范围。

实施例6 PA317(pLTKcSN)包装细胞株配合GCV对神经胶质瘤的细胞毒作用的体内动物试验

选用SD大鼠，2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，注射剂量为0.04g/kg。应用大鼠脑立体定向仪将细胞接种右尾状核部(冠状线前0.5mm，中线旁3.0mm，皮层深5.0mm)。细胞悬液以自动微量注射器限速注入脑内1.0ml/分钟，完成注射后留针5分钟。

大鼠颅内选接种1.0×10⁵个C6细胞，三天后于原位注射PA317(pLTKcSN)包装细胞株，细胞量为1.0×10⁶。注射包装细胞株五天后行GCV治疗。体内GCV给药方法和剂量如下：50mg/kg，一日一次，腹腔注射，连续14天。注射效果见表三。

可以看出，GCV治疗结束后，实验组9只大鼠，肿瘤消失3例(33.3％)，肿瘤缩小2例(22.2％)，余4例无效果(44.4％)，总有效率为55.5％。肿瘤消失的大鼠已经存活超过60天。