编码胰岛素受体底物1的突变DNA

摘要

含有编码胰岛素受体底物1(IRS-1)的DNA序列的DNA构建物，该DNA序列含有至少一个核苷酸的突变，或含有该DNA序列含所述突变的片段的DNA构建物。

说明书

本发明涉及编码胰岛素受体底物1的突变DNA，检测胰岛素受体底物1编码基因中突变的方法，以及诊断组合物和用于该方法中的检测试剂盒。

非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)是一种普遍的内分泌疾病，有大量证据有力地表明发病机理中存在遗传因素(1)。对显性NIDDM患者和NIDDM高危个体的研究揭示胰岛素分泌及胰岛素作用的异常(2)。但是，胰岛素和类胰岛素生长因子1(IGF1)的细胞作用中一个或多个位点的遗传缺陷很可能涉及调节胰岛素分泌的组织及产生或提取葡萄糖的胰岛素敏感性肝组织和肝外组织的生化途径。

虽然在常与皮肤病微黑棘皮症或卵巢雄激素过多症相关的严重胰岛素耐性综合症中已报导了二十种以上的突变(17)，但胰岛素受体分子中的突变并不能解释NIDDM普通形式的遗传病因学。

晚期发作NIDDM的普通形式是一种异型疾病，其中至少有两种主要缺陷贡献于表型的病理生理学：胰岛素耐性和胰岛素不足(2)。NIDDM很可能还是一种多基因病，这就意味着不同类病人将在各种基因、在该疾病遗传成分的聚集中表现不同。NIDDM患者后代中糖尿病的高累积性危险(30-50％)和单卵性双胎中的高共患率(70-100％)都突出了该疾病的遗传病因学显著性(1)。

胰岛素通过与其四聚浆膜受体的α-亚单位结合来启动其细胞效应。这样就激活了β-亚单位中的激酶，然后后者催化β亚单位特异酪氨酸残基的分子间自磷酸化，进而刺激受体对胰岛素作用联级中其它蛋白底物的酪氨酸激酶活性。

最近，对胰岛素受体激酶的第一个内源性底物(称为胰岛素受体底物1，缩写为IRS-1)进行了克隆和测序(4-6)。此互补DNA序列编码相对分子量为165和185KD的胞浆亲水蛋白(27，28)，它含有多个磷酸化位点。除作为胰岛素受体激酶的底物外，IGF1受体激酶活化后IRS-1也被磷酸化(16)。

在表达少数胰岛素受体的细胞中很难检测到IRS-1，但在表达高水平受体的细胞中易于检测，在表达生物信号化缺陷之突变受体的细胞中不易检测到(27，28)。IRS-1是一种含20个酪氨酸磷酸化共有序列的独特分子，其中6个出现在YMXM(Tyr-Met-X-Met)基元中。胰岛素刺激IRS-1分子中YMXM基元酪氨酸磷酸化后，磷酸化的IRS-1结合磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)，这提示IRS-1作为一种多位“船坞”蛋白与信号蛋白结合，从而将受体激酶与胰岛素敏感性转运蛋白和酶结合(7-15)。PI3-激酶由至少两个亚单位组成，包括一个110KDa的催化亚单位和一个85KDa的调节蛋白，后者含有通过与各种蛋白中磷酸酪氨酸残基结合介导蛋白—蛋白间互相作用的2个src同源性功能区(src homology 2 do-mains)(7-15)。有趣的是，已证明胰岛素引起IRS-1和PI-3激酶通过IRS-1的磷酸化YMXM基元和PI-3激酶85KDa调节亚单位的2个src同源性功能区发生相互作用。而且，IRS-1的过度表达加强胰岛素刺激的细胞中PI3-激酶的活化，而且酪氨酰磷酸化IRS-1或含有磷酸化YMXM基元的合成肽在体外激活PI3-激酶。除作为胰岛素受体激酶底物外，IRS-1还在IGF1受体激酶活化后被磷酸化(16)。因此，已表明IRS-1通过结合并调节含2个src同源性功能区的酶，可在选择并区别胰岛素和IGF1效应与其它酪氨酸激酶的效应中，在向多个细胞内途径的信号传递产生差异和扩大中起关键作用(7-16)。

根据本发明，令人惊异地发现许多NIDDM患者在IRS-1的编码基因中带有突变。现认为一种或多种此突变可涉及NIDDM的病因学或与之相关，这些突变的存在因而可用于诊断NIDDM并还可能用于诊断由胰岛素耐性引起的其它疾病。

因此，本发明涉及包含编码胰岛素受体底物1(IRS-1)之DNA序列的DNA构建物，该DNA序列含有至少一个核苷酸的突变，或该DNA构建物包括该DNA序列含所述突变的片段。

现认为IRS-1基因的突变可指示对发展NIDDM或其它疾病具有显著性的异常。例如，突变可造成IRS-1中氨基酸的取代，从而引起IRS-1的三级结构改变。这种改变可干扰胰岛素或IGF-1受体激酶与调节细胞代谢和生长的一种或多种细胞内蛋白的正常相互作用。这些蛋白一般具有2个src同源性功能区，包括磷脂酰肌醇3-激酶、GRB-2和SHPTP-2(参见M.F.White等，Exp.Clin.En-docrinol、101，Suppl，2.1993，p.98-99，特别是图1)。该突变也可干扰基因的转录或翻译，或干扰IRS-1转录本的稳定性。或者，该突变可与造成疾病的突变相关(即遗传连锁)。

另一方面，本发明涉及含有本发明DNA构建物并能够表达其中至少一个氨基酸被取代的IRS-1的活系统。该活系统可包括含有适当信号转导途径的细胞或多细胞生物，该活系统可用于筛选对该系统中胰岛素或IGF-1刺激的信号转导有效应的物质。

再一方面，本发明涉及检测IRS-1编码基因中是否存在某突变的方法，该方法包括从受检者获取生物样品，并分析样品的至少一个核苷酸突变。基于现今的认识，本发明方法可用于诊断受检者患NIDDM及由胰岛素耐性产生的其它疾病(如男性样肥胖、原发性高血压、异常脂质血或动脉粥样硬化)的素质。生物样品例如可取自血液、血清、血浆或组织。本发明还涉及用于该方法的诊断组合物和检测试剂盒。

具体讲，本发明涉及包括一种DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列编码IRS-1并含有引起IRS-1蛋白序列中至少一个氨基酸取代的突变。该突变例如可位于这样的位点，此处的氨基酸取代干扰通过IRS-1的信号转导，因为这种突变很可能与疾病病因学有关。这种DNA序列的一个实例是包含IRS-1基因第972密码子第1位G到A突变的序列。

该突变导致第972位甘氨酸被精氨酸取代。IRS-1基因变异可导致发生NIDDM的分子机制现在还不清楚。但与甘氨酸相比，精氨酸分子大得多并具有阳离子侧链，pKa高至12.5。IRS-1中，972密码子位于两个YMXM基元之间。虽然甘氨酸被精氨酸取代可引起的IRS-1三级结构变化还不清楚，但认为IRS-1突变体的立体和静电变化干扰胰岛素和IGF-1介导的IRS-1相邻YMXM基元的磷酸化与具有两个src同源性功能区的信号传递蛋白间的正常相互作用。或者，该突变可为与该基因或另一基因中另一突变相关的标记，所述另一突变是疾病病因学中实际涉及的突变。在805密码子第三位(A到G)和第894密码子第三位(G到C)的沉默突变也是如此。

临床研究表明，与葡萄糖耐性对照相比，NIDDM患者总体上具有向周围组织的胰岛素耐性葡萄糖分布。但是NIDDM的甘氨酸⁹⁷²-突变携带者与突变阴性的糖尿病患者相比，其胰岛素耐性水平没有差别。另外在三个突变阳性非糖尿病人之中两个身上测定了外周组织对胰岛素的敏感性，结果证明胰岛素敏感性值在正常范围内。相反，所有突变携带者与相应的非携带者相比，胰岛素和C-肽的空腹血浆浓度显著低下。结合考虑可比的外周组织胰岛素敏感性和低下的循环β-细胞分泌产物的基础水平，可能指示胰腺β-细胞功能障碍。

在一优选实施方案中，本发明的DNA构建物包含序列表SEQID No：1中所示DNA序列，或所述DNA序列的含有SEQ ID NO：1的3494位核苷酸G到A之突变的片段。

根据应用目的不同DNA构建物的长度变化很大。用作杂交目的的寡核苷酸探针时，该DNA片段可短至17个核苷酸。为了如上所述在活系统中表达，该DNA构建物一般包含编码IRS-1的全长DNA序列。

在IRS-1编码DNA序列中含有突变的本发明DNA构建物可适当地来自基因组DNA或cDNA，例如通过制备基因组DNA或cD-NA文库、按标准技术用合成寡核苷酸探针杂交筛选编码IRS-1之全部或部分的DNA序列而获得(参见Sambrook等，Molecularcloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989)。所用探针应是对突变特异性的。或者，野生型IRS-1的编码DNA序列可通过定点诱变进行修饰，其中使用含该突变的合成寡核苷酸按熟知的步骤进行同源重组。该DNA序列还可通过使用特异引物的聚合酶链反应而制得，例如US 4,683,202或Saiki等Science 239，1988，pp.487-491中所述。

本发明的DNA构建物还可按已有的标准方法用合成方法制备，例如Beaucage和Caruthers在Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1869中描述的磷二酰胺法，或Matthes等在EMBO Journal 3(1984)，801-805中描述的方法。按照磷二酰胺法，如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸、纯化、退火并连接。该方法优选用于制备IRS-1编码DNA序列的片段。

插入DNA构建物的重组表达载体可以是能方便地进行重组DNA操作的任何载体。载体的选择常取决于其所要引入的宿主细胞。例如，该载体可为自主复制型载体，即以染色体外单位存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如为质粒。或者，也可以是这样的载体：当将其引入宿主细胞时与宿主细胞基因组整合并随着其所整合的染色体一起复制(例如病毒载体)。

在此载体中，编码IRS-1的突变DNA序列应与适当的启动子序列有效地连结。启动子可为在所选宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，可来自与宿主细胞同源或异源之蛋白的编码基因。引导IRS-1突变编码DNA在哺乳动物细胞中转录的适当启动子，例如为SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell Biol.1(1981)，851-864)、MT-1(金属硫蛋白基)启动子(Palmiter等，Science 272(1983)，809-814)或腺病毒2主要晚期启动子。

编码IRS-1的突变DNA序列还可与适当终止子有效地连结，如人生长激素终止子(Palmiter等，同上)。载体还可包含诸如聚腺苷化信号序列(如来自SV40或腺病毒5Elb区)、转录增强子序列(如SV40增强子)和翻译增强子序列(如编码腺病毒VA RNA的序列)之类的元件。

重组表达载体可进一步包含能使载体在有关宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列的一个实例是SV40的复制起始区。该载体还可含有可选择标记，例如其产物补充宿主细胞中某一缺陷的基因，如二氢叶酸还原酶(DHFR)的编码基因，或提供对某一药物抗性的基因，如抗新霉素、潮霉素或氨甲喋呤。

用于分别连接IRS-1的编码DNA序列、启动子和终止子的方法，和将它们插入含复制所需息信的适当载体中的方法都是本领域技术人员熟知的(参见，如Sambrook等，同上)。

另一方面，本发明涉及含至少一个氨基酸取代的IRS-1变体，尤其是在特定位点含至少一个氨基酸取代的变体，其中所述取代干扰通过IRS-1的信号转导，或其包含所述取代的片段。这种变体的实例是其中甘氨酸⁹⁷²被精氨酸取代的变体，或其含有所述取代的片段，如具有序列表SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的变体，或其含有Arg⁹⁷²的片段。

向其中引入本发明DNA构建物的活系统为能够产生IRS-1并具有适当信号转导途径的细胞。该细胞优选为真核细胞，如脊椎动物细胞，如爪蟾卵母细胞或哺乳动物细胞，尤其是哺乳动物细胞。适当哺乳动物细胞系的实例为COS(ATCC CRL 1650)、BHK(ATCC CRL1632，ATCC CCL 10)、CHL(ATCC CCL39)或CHO(ATCC CCL61)细胞系。转染哺乳动物细胞和表达引入细胞中的DNA序列的方法描述在下列文献中，如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol，159(1982)，601-621；Southern和Berg.J.Mol.Appl.Genet.1(1982)，327-341；Loyter等，Proc.Natl.Acad，Sci，USA 79(1982)，422-426；Wigler等，Cell 14(1978)，725；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7(1981)，603，Graham和Van der Eb，Virology52(1973)，456，和Neumann等，EMBO J，1(1982)，841-845。

然后编码IRS-1的突变DNA序列通过在适当的营养培养基中在有利于IRS-1编码DNA序列表达的条件下培养上述细胞进行表达。用于培养细胞的培养基可为适于哺乳动物细胞生长的任何常规培养基，如含适当补充物质的含血清或不含血清的培养基。适当的培养基可从供应商得到或可按照公开出版的资料制备(如AmericanType Culture Collection的目录)。

本发明的活系统还可包括转基因动物。转基因动物是在其基因组中引入了异源DNA序列的动物。具体讲，转基因动物是转基因的非人哺乳动物，一般具有适当信号转导途径的哺乳动物。该哺乳动物一般为啮齿类，如大鼠或小鼠。编码IRS-1的突变DNA序列可按以前描述的用于该目的的方法之一引入转基因动物中。简言之，可将要引入的DNA序列注射到受精卵或胚胎细胞中，然后再按标准方法将受精卵或胚胎细胞植入雌性哺乳动物体内，结果形成其胚细胞和/或体细胞中含有突变DNA序列的转基因哺乳动物。关于产生转基因哺乳动物的方法的更详细描述见B.Hogan等Manipulating theMouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork。该突变DNA序列还可通过用含此DNA序列的逆转录病毒转染受精卵而引入动物，参见R.Jaenisch，Proc.Natl.Acad.Sci.USA73，1976，pp.1260-1264。制备转基因动物的另一方法描述在Gor-don和Ruddle的Mothods Enzmol 101，1983，pp.411-432中。

在检测IRS-1基因中是否存在某突变的本发明方法的一种具体实施方案中，从受检者采取生物样品，从样品中分离DNA(尤其是基因组DNA，用在突变位点酶切DNA的限制性内切酶消化，检测IRS-1编码基因中该位点的DNA剪切。消化后，形成的DNA片段可在琼脂糖凝胶上进行电泳。将胶上的DNA印在硝基纤维素滤膜上并与放射标记的探针杂交。该探针可方便地含有跨越该突变的IRS-1基因的DNA片段(基本按照E.M.Southern的方法，J.Mol.Biol.98，1975，pp.503，如B.J.Conner等在Proc.Natl Acad.Sci USA，80，1983，pp.278-282中所述)。

在该实施方案的一变异方案中，从样品中分离的DNA在用限制性内切酶消化之前可进行扩增。可通过使用基于跨突变位点的IRS-1适当序列的寡核苷酸引物进行聚合酶链反应(PCR)，这样进行适当的扩增，基本按Saiki等Science 230，1985，pp1350-1354所述方法。扩增后，扩增的DNA用适当限制性内切酶消化并进行琼脂糖凝胶电泳。对所得限制性酶切图进行分析，例如用溴化乙锭染色，在紫外线下可见凝胶色带。作为对照，可对编码IRS-1的野生型DNA(即不含突变)进行相同步骤，对比限制性酶切图。

在本发明的方法中，优选分析样品中位于特定位点的突变，该位点的氨基酸取代干扰通过IRS-1的信号转导。这种突变的一个具体实例是IRS-1编码基因中第972密码子第一位G到A的突变。该突变在编码IRS-1的突变DNA序列中造成一个新的限制性内切酶酶切位点：

                5’-CCA/TGG-3’

                3’-GGT/ACC-3’

适当限制性内切酶的一个实例是BstNI。

本发明方法的另一具体实施方案是采用U.Landegren等在Sci-ence 241，1988，pp.1077-1080中描述的方法，该方法涉及互补靶DNA分子上相邻寡核苷酸的连接。如果核苷酸碱基正确配对，两个寡核苷酸交叉处将发生连接。

在本发明方法的又一具体实施方案中，从样品中分离的DNA可用相当于IRS-1编码基因之链节的寡核苷酸进行扩增。然后可通过与一标记的寡核苷酸探针杂交分析扩增的DNA，该探针包括相当于至少部分IRS-1编码基因的DNA序列，并含有至少一个核苷酸的突变，该突变相当于要检测IRS-1编码基因中是否存在的那种突变。作为对照，扩增的DNA还可与这样的标记寡核苷酸探针杂交，该探针含相当于至少部分IRS-1野生型编码基因的DNA序列。该方法已由例如Dilella等在Lancet，1，1988，pp.497-499中描述过。可用于本发明的另一基于PCR的方法是由R.Saiki等Nature 324，1986，163-166，或D.Y.Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1989，pp.2757-2760描述的等位基因特异性PCR方法，该方法使用对IRS-1基因中突变特异的引物。

检测DNA中突变的其它方法见U.landegren，GATA 9，1992，pp.3-8中的综述。现今优选的检测突变方法是基本如Orita等Proc.Natl Acad.Sci.USA 86，1989，pp.2766-2770，或Orita等，Genomics5，1989，pp.874-879描述的单链构象多态性(SSCP)分析。

标记探针的标记物优先选自酶，有色物或荧光物质，或放射性同位素。

可用作标记物的酶例如有过氧化物酶(如辣根过氧化物酶)、磷酸酶(如酸性或碱性磷酸酶)、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-葡糖苷酶、蛋白酶、丙酮酸脱羧酶、酯酶、虫荧光素酶等。

酶本身并不能被检测，必须与底物结合以催化反应，终产物可以被检测。可用于本发明方法的底物例如包括过氧化氢/四甲基联苯胺或氯萘酚或邻二苯胺或3-(对羟苯基)丙酸或鲁米诺，磷酸羟基吲哚酯、磷酸对硝基苯酯、半乳糖硝基苯基甙、4-甲基umbelliferyl-D-半乳糖吡喃糖甙、或荧光素。

或者，标记物可包含有色或荧光物质，包括金颗粒、有色或荧光乳胶颗粒、染料颗粒、荧光黄、藻红素或藻青素。在一尤其优选的具体实施方案中，用放射性同位素标记探针。可用于本发明目的放射性同位素可选自I-125、I-131、In-111、H-3、P-32、C-14或S-25。这些同位素发射的放射活性可在β-或γ-计数器中或用液闪照像机按本身已知的方法测定。

本发明还涉及用于本发明方法的、检测IRS-1编码基因中是否存在某突变的检测试剂盒，该试剂盒包括：

(a)在突变位点切割DNA的限制性内切酶，

(b)相当于至少部分IRS-1野生型编码基因的第一DNA序列，和/或

(c)相当于至少部分IRS-1编码基因并含有至少一个核苷酸突变的第二DNA序列，所述突变相当于要检测IRS-1编码基因中是否存在的突变。

第一DNA序列例如可从来自健康受检者的编码IRS-1的基因组DNA或CDNA获得。

第二DNA序列可方便地为本发明的DNA构建物。

本发明还涉及用于本发明方法的、检测IRS-1编码基因中是否存在某突变的检测试剂盒，该试剂盒包括：

(a)扩增DNA的工具，和

(b)包含相当于至少部分IRS-1编码基因的DNA序列并含有至少一个核苷酸突变的标记寡核苷酸探针，该突变相当于要检测IRS-1编码基因中是否存在的突变。

扩增DNA(一般为从生物样品中分离的基因组DNA)的适宜工具包括，如寡核苷酸引物、适宜缓冲液和热稳定性DNA聚合酶。

在下列实施例中进一步说明本发明，但无意于限制权利要求中的本发明范围。附图的简要说明

图1表示用单链构象多态性(SSCP)技术对人胰岛素受体底物1(IRS-1基因)的核苷酸3338-3600的突变筛选。如“方法”中所述用特异寡核苷酸引物从基因组DNA PCR-扩增该片段，用³²P标记并进行非变性凝胶电泳。放射自显影图显示单链DNA(ssDNA)以及双链DNA(ds DNA)的迁移图。第3泳道显示甘氨酸⁹⁷²突变杂合(He)个体的迁移图。泳道1和2显示相应野生型(wt)的迁移图。

图2表示IRS-1 3338-3600bp片段一部分的直接核苷酸测序。在非编码链上进行测序(见表3)。上图表示野生型序列，而下图表示杂合个体的核苷酸序列，其编码链中3494位核苷酸如箭头所示存在单一碱基取代(G→A)(见表3)。在密码子⁹⁷²中的这一碱基取代造成甘氨酸被精氨酸取代。

实施例1

对象

实验中包括共86名NIDDM病人和76名对照对象。所有研究参加者为不相关的丹麦高加索人，他们的临床特征示于表1和2中。对照对象具有正常空腹血浆葡萄糖水平，没有已知糖尿病的家族史。从就诊于Steno糖尿病中心院外病人中连续不加选择地征募国家糖尿病资料组(National Diabetces Data Group)(18)所定义的NIDDM病人。所有NIDDM病人用饮食、口服低血糖药或两者结合治疗。研究参加者经临床或标准实验室检查评价没有人患肝或肾病，没有人服用任何已知影响胰腺β-细胞功能或能量代谢的其它任何药物。参与前已对所有志愿者仔细解释了研究目的和风险，并得到了他们的明确同意。本实验得到地方哥本哈根道德委员会的许可，符合赫尔辛基宣言。正常血糖—高胰岛素血夹实验(Clamp)

用正常血糖—高  胰岛素夹实验检查NIDDM病人和19各葡萄糖耐受性健康对照对象。实验在过夜禁食10小时后于08：00至15：00间空腹进行。每个夹实验包括2小时基础阶段，然后是4小时高胰岛素血葡萄糖夹实验。以前已详细描述过夹实验的技术(19)。为了估计外周葡萄糖总吸收，在研究期间一直灌注(3-³H)葡萄糖。以启动(25-μci)和连续(0.25-μCi/min)方式在对照对象中注入(3-³H)葡萄糖，而在NIDDM对象中，启动量随着空腹血浆葡萄糖浓度增加而成比例增加；标记葡萄糖的连续注入与对照组相同(0.25μCi/min)。通过连续注入2mU胰岛素/kg/分(Actrapid，Novo Nordisk，丹表)进行夹实验，以可变速度注入20％葡萄糖来维持血糖正常，通过以5-10分钟间隔检测血浆葡萄糖水平确定输入速度。用Steele’s非稳态等式(20)从(3-³H)葡萄糖的血浆浓度和血浆葡萄糖计算总的葡萄糖处理速度。在这些计算中，假定葡萄糖分布体积为200ml/kg体重，池分数为0.65。在最高稳态血浆胰岛素水平，此时假定肝的葡萄糖生产为零，葡萄糖输入速度用于计算葡萄糖处理速度。用尿中葡萄糖损失校正总的外周葡萄糖吸收。基因组DNA的制备和扩增

通过蛋白激酶K消化然后用酚提取在Applied Biosystems 341核酸纯化系统上从来自全血的人白细胞核分离基因组DNA。用0.3μg基因组DNA进行第一次50μlPCR反应。实验条件是：10mM Tris-HCl(pH9.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、0.1％Triton X-100、0.2mMdNTP’s、0.2μM每种寡核苷酸引物和1.25 U Taq DNA聚合酶(Promega，Medison Wisconsin)。人IRS-1基因的特异寡核苷酸引物(4)(20-25bp，在3’端有2个G或2个C)在Applied Biosystems 394DNA/RNA合成仪(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)上合成，在NAB-10柱(Pharmacia P-L Biochemicals Inc，Milwaukee，Wiscon-sin)上洗脱，不用进一步纯化直接使用。

用于聚合酶链反应的DNA引物的核苷酸序列如下：

1.      553  5′GCTCAGCGTTGGTGGTGGCGGTGG3′     577

2.      783  3′CGACGAAGTTGTAGTTGTTCGCCCG5′    807

3.      727  5′GAAGTGGCGGCACAAGTCGAGCGC3′     756

4.      999  3′CGAGGCCGGAACCACTCCGACC5′      1020

5.      924  5′ACCGTGCTAAGGGCCACCACGACG3′     947

6.     1180  3′CCTCCGTCGCCGGCACCACGA5′       1200

7.     1128  5′TCTACCGCCTTTGCCTGACCAGC3′     1150

8.     1392  3′CGGTCAGGAGCAGGTTGACG5′        1411

9.     1337  5′ACCATCCTGGAGGCCATGCGG3′       1357

10.    1598  3′GGTCGGAGCCACCTGCCGTCGGGA5′    1621

11.    1545  5′CAGGCTCCTTCCGTGTCCGCG3′       1565

12.    1807  3′GGGTGCCGCTAGATCACGAAG5′       1827

13.    1757  5′CTGTCGTCCAGTAGCACCAGTGG3′     1779

14.    2007  3′GGGACTGGCGGGGGTTGCCAG5′       2037

15.    1953  5′GCGGTGAGGAGGAGCTAAGC3′        1932

16.    2200  3′GGGCAGGGTCAGGAGTCACCG5′       2230

17.    2151  5′AGAGAACTCACTCGGCAGGC3′        2170

18.    2401  3′GGTGTGCCTACTACCGATGTACGG5′    2424

19.    2352  5′ACCCCTTGGAGCGTCGGGGG3′        2371

20.    2600  3′GGACTGAATCCTCCACCGGGGTCG5′    2623

21.    2546  5′CAGAGAGTGGACCCCAATGG3′        2566

22.    2800  3′CCTGAGGTTGTGGTCGTCGG5′        2819

23.    2712  5′TCTTGCCTCACCCCAAACCC3′        3150

24.    2964  3′CGAGACCAGCGGAAGAGATA5′        2983

25.    2918   5′GAGCCGGAGGAGGGTGCCCG3′       2938

26.    3180   3′GGTTCCGGTCGTGGAATGGA5′       3199

27.    3131   5′CAGACCAATAGCCGCCTGGC3′       3150

28.    3392   3′CCGTGACTCCTCATGTACTT5′       3411

29.    3339   5′CTTCTGTCAGGTGTCCATCC3′       3358

30.    3582   3′CGATGCACCTGTGGAGCGGT5′       3601

31.    3532   5′GGGCAGTGCCCAGCAGCCGG3′       3541

32.    3743   3′CGACGGGTGAGCAGGGACGACC5′     3764

33.    3687   5′CCTCAGCAGCCTCTGCTTCC3′       3712

34.    3950   3′CGTCGTCATCCCCCGCCACC5′       3969

35.    3900   5′CCACACCCAGTGCCACCCGG3′       3919

36.    4141   3′CCTGAAGTTTGTCACGGGAG5′       4160

37.    4067   5′GAGCCAGCCAAACTGTGTGG3′       4086

38.    4320   3′CCTGTAGTGTCGTCCAGCAA5′       4339

在混合物上涂以40μl矿油，在95℃起始变性3分钟后，将样品进行35个扩增循环：60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟及94℃变性1分钟。在这些初级PCR反应中，扩增了800-900bp的片段。以1μl1∶10稀释的初级PCR产物作为模板进行二级PCR反应。扩增条件如上所述，只是要加入(α-³²P)dCTP(Amersham International，Buck-inghamshire，UK)。在二级PCR中扩增的每个片段具有280-285bp的大小。

单链构象多态性(SSCP)分析

在初级突变筛选中，对来自19名胰岛素耐性NIDDM病人和5名对照对象的基因组DNA进行整个IRS-1编码区的SSCP分析(按Orita等，Genomics 5，1989，pp.874-879描述的方法)(表1)。在每例中，将2μl二级PCR产物与8μl测序终止溶液合并。加样一μl不加热以鉴定双链产物，94℃加热5分钟后向分别含1％或5％甘油的90mM Tris一硼酸、2.5mM EDTA中的38×31×0.03cm 5％聚丙烯酰胺凝胶(49∶1，丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)的相同孔中加样2μl。每个病人的SSCP分析在2种不同实验条件下进行：将凝胶、缓冲液和电泳仪在4℃放置过夜后，在1％甘油存在下以35W恒压于4℃进行电泳4-5小时；在5％甘油存在下以65W恒压于25℃进行2-3小时(21)。将凝胶转移到3MM滤纸上，用塑料覆盖物覆盖，用增感屏于-80℃放射自显影2-10小时。该凝胶含有两个具有已知质粒突变和相应野生型片段的泳道作为对照。在我们的实验室中，检测已知质粒突变(单一碱基取代、小插入、或小缺失)的能力为80-90％(22)。

单链DNA的合成和直接核苷酸测序

用生物素标记的寡核苷酸引物和链霉亲和素包衣的磁珠(可从Dynal AS，Oslo，Norway购得)产生可测序的单链DNA。用醋酸铵和异丙醇沉淀产物并重悬于适当体积的水中。用AutoRead测序试剂盒(Pharmacia，Uppsala，Sweden)和荧光-dATP的测序在自动激光荧光DNA测序仪(Pharmacia，Uppsala，瑞典)上进行分析。PCR产物的直接限制酶消化

在15μl反应液中进行限制酶消化，反应液中含有10μl沉淀的二级PCR产物、1.5μl 10×NE缓冲液2、100μg/ml牛血清白蛋白和10U限制酶Bst N1(New England Biolabs Inc.，Beverley，MA)。在4.5％高分辨琼脂凝胶上分析这些片段，用溴化乙锭染色后便可见。cDNA的合成

局部麻醉下从股外肌取出经皮肌肉活组织样品(约500mg)。从肌肉样品中去除血液及结缔和脂肪组织，30秒内冷冻在液氮中，于-80℃储存至用于实验。从肌样中按以前描述的方法(23)分离总RNA。在含下列物质的25μl体积中合成cDNA：1μg总RNA，0.2mM三磷酸脱氧核苷，40u RNasin(Promega，Madison，Wisconsin)，0.625μgOligo(dT)₁₈，400U Moloney鼠白血病病毒逆转录酶(Life TechnologiesInc.，Grand Island，NY)，50mM Tris-HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl₂和10mM DTT。反应于37℃进行1小时，然后于95℃孵育10分钟将酶失活。按基因组DNA的方法对cDNA进行SSCP。其它分析

10小时禁食过夜后，于早晨从所有研究参与者采取血浆以分析化学量。用己糖激酶方法测定双份血浆葡萄糖。按已有方法(24)测定血浆中的含氚葡萄糖。用HPLC方法测定HbA_1C(正常范围4.1-6.4％)。用放射免疫分析(25，26)分析血浆胰岛素和C-肽水平。

统计分析

在正文和表中的数据以平均值±SE的形式给出。为了进行比较，对不成对数据应用Mann-Whitney检验。

IRS-1基因中突变的初级筛选

利用来自19名NIDDM病人和5名对照的基因组DNA，在19个重叠片段(每个含250-285bp)中分析了IRS-1基因的整个编码区。与相应的对照对象相比，NIDDM病人组血胰岛素过多(P＜0.02)并具有胰岛素刺激向周围组织的葡萄糖分布减小的特征(P＜0.0001)(表1)。SSCP扫描显示3种不同的异常迁移图。接下来的核苷酸测序揭示第805密码子处的一种多态性(GCA→GCG丙氨酸))。这种单一碱基取代不会产生任何氨基酸序列的变化，19名NIDDM中4人是这一取代的杂合体。在第894密码子处检测到另一沉默突变(CCG→CCC(脯氨酸))。19名NIDDM病人中仅一人是这种核苷酸碱基变异的杂合体。但在972密码子处，SSCP分析表明19名NIDDM病人中三人是突变杂合体，该突变中甘氨酸(GGG)被精氨酸(AGG)取代(图1和2)。通过两条DNA链的测序和用限制酶Bst NI对PCR产物的直接酶消化证实了这一突变，通过这一核苷酸取代造成了BstNI的限制性酶切位点(未显示数据)。经初级SSCP扫描，5名对照对象未显示多态性迹象。972甘氨酸突变位于IRS-I基因中两个Tyr-Met-X-Met基元之间(表3)。随后，在从血细胞分离的基因组DNA上初步鉴定的972密码子突变由cDNA的研究得以证实，cDNA由从骨骼肌活组织样品分离的总RNA合成。甘氨酸972突变的二级筛选

用SSCP分子扫描和初级PCR产物的特异酶消化进一步检查了67名NIDDM病人(表2)和76名键康对照对象的甘氨酸⁹⁷²突变的发生率。67名NIDDM病人中7人是该突变的杂合体。另外，76名键康志愿者中3人也是密码子⁹⁷²突变的杂合携带者。所有三名突变阳性对照对象都对口服葡萄糖刺激具有正常的葡萄糖反应(未给出数据)。

带有甘氨酸⁹⁷²突变之个体的临床特征化

表1显示对三名甘氨酸⁹⁷²突变阳性的葡萄糖耐性对照进行临床研究所得结果。对三名突变携带者中的两名进行胰岛素—葡萄糖夹实验，这些个体的葡萄糖处理速度在19名突变阴性对照对象的范围内。但有趣的是葡萄糖耐性突变携带者还有一特征是：与从突变阴性键康对照所得平均值相比，其空腹血浆胰岛素(降低33-46％)和C-肽(降低25-40％)值较低。

表2综合了与IRS-1基因中甘氨酸⁹⁷²突变阴性的76名NID-DM病人相比，作为该突变杂合携带者的10名NIDDM病人的表型特征。在年龄、已知糖尿病持续时间、体质指数(body mass index)、空腹血浆葡萄糖水平、HbA_1C、基础葡萄糖处理速度或胰岛素刺激的葡萄糖处理速度方面都没有明显区别。但与突变阴性糖尿病对象相比，甘氨酸⁹⁷²突变阳性糖尿病患者的胰岛素和C-肽空腹血浆水平分别减低44％(P＜0.05)和37％(P＜0.02)。

实施例2

研究了383名不相关的健康高加索年青人(15-32岁)的随机样品，以确定甘氨酸⁹⁷²突变是否造成胰岛素耐性。用Bergman’s最小模型结合甲苯磺丁脲静脉注射葡萄糖)估测所有个体的胰岛素敏感性，用SSCP扫描法(如实施例1中所述)和基因组DNA的限制酶分析(如实施例1中所述)测定甘氨酸972突变的发生率。发现35个对象带有该突变。

体质指数(BMI)大于25kg/m²(n＝10，BMI＝28.4±0.9kg/m²)(平均值±标准差)的甘氨酸⁹⁷²突变携带者比相同BMI的非携带者(n＝99，BMI＝28.1±0.3kg/m²)的胰岛素敏感性低2倍，C-肽的空腹血清水平显著地高。而在BMI低于25kg/m²的对象中，该突变的携带者和非携带者之间所测定的变量都没有区别。在调节VO₂max、BMI、性别和年龄差异的多变量分析中，在肥胖对象组中甘氨酸⁹⁷²突变的存在与胰岛素敏感性负相关(P＜0.04)，与空腹血清C-肽(p＜0.09)、空腹血清甘油三酯(P＜0.02)和血清总胆固醇(P＜0.03)正相关。

研究结果表明：青年肥胖者中甘氨酸⁹⁷²突变与整体胰岛素耐性和血脂异常有关。

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表1、通过IRS-1基因的初级SSCP扫描检查的19名NIDDM病人的表型特征化：与未检测到IRS-1突变的19名匹配对照和3名由精氨酸取代甘氨酸⁹⁷²的葡萄糖耐性对照相比较

                                                   血浆      血浆   血浆

      N                                HbA_1C                                   M-值      M-值

                        体质指数

      (女：   年龄                     (％)        葡萄糖    胰岛素  C-肽     (基础)   (胰岛素)

                         (kg/m²)

      男)     (岁)                                  (mM)      (pM)    (nM)NIDDM均值      6/13     54         29           7.9          10.4      95       0.92     88       330±SE               2          1            0.5          0.9       13       0.09     3        30

对照(非突变携带者)均值      7/12     50         28           5.4^*        5.5^*     60+     0.67§        77+      484^*±SE               2          1            0.1          0.1       6        0.04     2        30

对照(突变携带者)No.1      F        50         27           4.7          5.1       32       0.40     71       461No.2      M        64         23           5.6          6.0       40       0.51     78       389No.3      M        66         23           6.0          5.9       34       0.42     ND       ND葡萄糖、胰岛素和C-肽的血浆水平在早晨空腹状态测定。M-值是早晨空腹状态(基础)时和正常血糖及高胰岛素血夹实验后4小时(胰岛素)的葡萄糖处理速度(mg/m²/min)，其中夹实验最后30分钟内稳态血浆胰岛素浓度对NIDDM病人为1165±71pM，对非甘氨酸972突变携带者对照为1034±56pM。在3各葡萄糖耐性突变携带者中，稳态血浆胰岛素水平分别为786pM(对象no 1)和1008pM(对象no.2)。ND＝未测定。*P＜10^-4vs.NIDDM；+p＜0.02vs.NID-DM；§p＜0.03vs.NIDDM。

表2、10名IRS-1基因中携带甘氨酸⁹⁷²→精氨酸突变的NIDDM病人的特征：与不携带该突变的NIDDM病人比较

                                      +突变            -突变N(女/男)

                                       3/7             30/46年龄(岁)                                   52±2           54±1体质指数(kg/m²)                           29±2           30±1已知糖尿病持续时间(年)                     5±1            4±1HbA_1C(％)                                 8.6±0.6        8.0±0.2血浆葡萄糖(mM)                             12.4±1.1       11.7±0.5血浆胰岛素(pM)                             53±10          94±8^*血浆C-肽(nM)                               0.49±0.06      0.78±0.05+M-值(基础)                                 86±5           91±3M-值(胰岛素)                               286±29         265±16表中数值为均值±SE。葡萄糖、胰岛素和C-肽的血浆浓度在早晨空腹状态测定。M值为早晨空腹状态(基础)和正常血糖及高胰岛素血夹实验后4小时(胰岛素)的葡萄糖处理速度(mg/m²/min)，其中夹实验的最后30分钟内的稳态血浆胰岛素浓度对携带甘氨酸⁹⁷²突变的NIDDM病人为980±57pM，对非携带者的NIDDM病人为1153±34pM。*P＜0.05；+P＜0.02。

表3

已公开的人胰岛素受体底物1(IRS-1)的部分核苷酸(3392-3562)和氨基酸(938-994)序列。甘氨酸到精氨酸的突变位于第972密码子(用黑体表示)。两个YMXM基元下划线，该基元是带有2个src同源性功能区的胰岛素信号转移蛋白的推定识别位点。bp3392编码    5′-GGCACTGAGGAGTACATGAAGATGGACCTGGGGCCGGGCCGGAGGGCAGCCTGGCAG非编码  3′-CCGTGACTCCTCATGTACTTCTACCTGGACCCCGGCCCGGCCTCCCGTCGGACCGTC aa938      GlyThrGluGluTyrMetLysMetAspLeuGlyPrcGlyArgArgAlaAlaTrpGln

                                                   A

        GAGAGCACTGGGGTCGAGATGGGCAGACTGGGCCCTGCACCTCCCGGGGCTGCTAGC

        CTCTCGTGACCCCAGCTCTACCCGTCTGACCCGGGACGTGGAGGGCCCCGACGATCG

                                                   Arg

        GluSerThrGlyValGluMetGlyArgLeuGlyProAlaProProGlyAlaAlaSer

                                                   972

        ATTTGCAGGCCTACCCGGGCAGTGCCCAGCAGCCGGGGTGACTACATCACCATGCAG-3′3562

        TAAACGTCCGGATGGGCCCGTCACGGGTCGTCGGCCCCACTGATGTACTGGTACGTC-5′

        IleCysArgProThrArgAlaValProSerSerArgGlyAspTyrMetThrMetGln994

                               序列表(1)一般信息：

(i)申请人：

    (A)名称：Novo Nordisk A/S

    (B)街道：Novo Alle

    (C)城市：Bagsvaerd

    (E)国家：丹表

    (F)邮政编码(ILP)：2880

    (G)电话：+454444 8888

    (H)传真：+45 4449 3256

    (I)电传：37304

(ii)发明题目：编码胰岛素受体底物1的突变DNA

(iii)序列数：2

(iv)计算机可读形式：

    (A)媒价类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#.25(EPO)

(2)SEQ ID NO：1的信息：

    (i)序列特征：

        (A)长度：6152个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(iii)假拟：无

(vi)起始来源：    

    (A)生物：Homo sapiens

(ix)特性：

    (A)名称/关链词：CDS

    (B)位置：581..4309

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：TGGTATTTGG GCGGCTGGTG GCGGCGGGGA CTGTTGGAGG GTGGGAGGAG GCGAAGGAGG    60AGGGAGAACC CCGTGCAACG TTGGGACTTG GCAACCCGCC TCCCCCTGCC CAAGGATATT    120TAATTTGCCT CGGGAATCGC TGCTTCCAGA GGGGAACTCA GGAGGGAAGG GGGCGCGCGC    180TCCTGGAGGG GCACCGCAGG GACCCCCGAC TGTCGCCTCC CTGTGCCGGA CTCCAGCCGG   240GGCGACGAGA GATGCATCTT CGCTCCTTCC TGGTGGCGGC GGCGGCTGAG AGGAGACTTG   300GCTCTCGGAG GATCGGGGCT GCCCTCACCC CGGACGCACT GCCTCCCCGC CGGGCGTGAA   360GCGCCCGAAA ACTCCGGTCG GGCTCTCTCC TGGGCTCAGC AGCTGCGTCC TCCTTCAGCT   420GCCCCTCCCC GCGCGGGGGG CGGCGTGGAT TTCAGAGTCG GGGTTTCTGC TGCCTCCAGC   480CCTGTTTGCA TGTGCCGGGC CGCGGCGAGG AGCCTCCGCC CCCCACCCGG TTGTTTTTGG   540GAGCCTCCCT CTGCTCAGCG TTGGTGGTGG CGGTGGCAGC ATG GCG AGC CCT CCG     595

                                        Met Ala Ser Pro Pro

                                          1               5GAG AGC GAT GGC TTC TCG GAC GTG CGC AAG GTG GGC TAC CTG CGC AAA     643Glu Ser Asp Gly Phe Ser Asp Val Arg Lys Val Gly Tyr Leu Arg Lys

             10                  15                  20CCC AAG AGC ATG CAC AAA CGC TTC TTC GTA CTG CGC GCG GCC AGC GAG     691Pro Lys Ser Met His Lys Arg Phe Phe Val Leu Arg Ala Ala Ser Glu

         25                  30                  35GCT GGG GGC CCG GCG CGC CTC GAG TAC TAC GAG AAC GAG AAG AAG TGG     739Ala Gly Gly Pro Ala Arg Leu Glu Tyr Tyr Glu Asn Glu Lys Lys Trp

     40                  45                  50CGG CAC AAG TCG AGC GCC CCC AAA CGC TCG ATC CCC CTT GAG AGC TGC     787Arg His Lys Ser Ser Ala Pro Lys Arg Ser Ile Pro Leu Glu Ser Cys

 55                  60                  65TTC AAC ATC AAC AAG CGG GCT GAC TCC AAG AAC AAG CAC CTG GTG GCT     835Phe Asn Ile Asn Lys Arg Ala Asp Ser Lys Asn Lys His Leu Val Ala 70                  75                  80                  85CTC TAC ACC CGG GAC GAG CAC TTT GCC ATC GCG GCG GAC ACC GAG GCC     883Leu Tyr Thr Arg Asp Glu His Phe Ala Ile Ala Ala Asp Ser Glu Ala

             90                  95                 100GAG CAA GAC AGC TGG TAC CAG GCT CTC CTA CAG CTG CAC AAC CGT GCT     931Glu Gln Asp Ser Trp Tyr Gln Ala Leu Leu Gln Leu His Asn Arg Ala

        105                 110                 115AAG GGC CAC CAC GAC GGA GCT GCG GCC CTC GGG GCG GGA GGT GGT GGT     979Lys Gly His His Asp Gly Ala Ala Ala Leu Gly Ala Gly Gly Gly Gly

    120                 125                 130GGG GGC AGC TGC AGC GGC AGC TCC GGC CTT GGT GAG GCT GGG GAG GAC    1027Gly Gly Ser Cys Ser Gly Ser Ser Gly Leu Gly Glu Ala Gly Glu Asp

135                 140                 145TTG AGC TAC GGT GAC GTG CCC CCA GGA CCC GCA TTC AAA GAG GTC TGG    1075Leu Ser Tyr Gly Asp Val Pro Pro Gly Pro Ala Phe Lys Glu Val Trp150                 155                 160                 165CAA GTG ATC CTG AAG CCC AAG GGC CTG GGT CAG ACA AAG AAC CTG ATT     1123Gln Val Ile Leu Lys Pro Lys Gly Leu Gly Gln Thr Lys Asn Leu Ile

            170                 175                 180GGT ATC TAC CGC CTT TGC CTG ACC AGC AAG ACC ATC AGC TTC GTG AAG     1171Gly Ile Tyr Arg Leu Cys Leu Thr Ser Lys Thr Ile Ser Phe Val Lys

        185                 190                 195CTG AAC TCG GAG GCA GCG GCC GTG GTG CTG CAG CTG ATG AAC ATC AGG     1219Leu Asn Ser Glu Ala Ala Ala Val Val Leu Gln Leu Met Asn Ile Arg

    200                 205                 210CGC TGT GGC CAC TCG GAA AAC TTC TTC TTC ATC GAG GTG GGC CGT TCT     1267Arg Cys Gly His Ser Glu Asn Phe Phe Phe Ile Glu Val Gly Arg Ser

215                 220                 225GCC GTG ACG GGG GGG GGG GAG TTC TGG ATG CAG GTG GAT GAC TCT GTG     1315Ala Val Thr Gly Pro Gly Glu Phe Trp Met Gln Val Asp Asp Ser Val230                 235                 240                 245GTG GCC CAG AAC ATG CAC GAG ACC ATC CTG GAG GCC ATG CCG GCC ATG     1363Val Ala Gln Asn Met His Glu Thr Ile Leu Glu Ala Met Arg Ala Met

            250                 255                 260AGC GAT GAG TTC CGC CCT CGC AGC AAG AGC CAG TCC TCG TCC AAC TGC     1411Ser Asp Glu Phe Arg Pro Arg Ser Lys Ser Gln Ser Ser Ser Asn Cys

        265                 270                 275TCT AAC CCC ATC AGC GTC CCC CTG CGC CGG CAC CAT CTC AAC AAT CCC     1459Ser Asn Pro Ile Ser Val Pro Leu Arg Arg His His Leu Asn Asn Pro

    280                 285                 290CCG CCC AGC CAG GTG GGG CTG ACC CGC CGA TCA CGC ACT GAG AGC ATC     1507Pro Pro Ser Gln Val Gly Leu Thr Arg Arg Ser Arg Thr Glu Ser Ile

295                 300                 305ACC GCC ACC TCC CCG GCC AGC ATG GTG GGC GGG AAG CCA GGC TCC TTC     1555Thr Ala Thr Ser Pro Ala Ser Met Val Gly Gly Lys Pro Gly Ser Phe310                 315                 320                 325CGT GTC CGC GCC TCC AGT GAC GGC GAA GGC ACC ATG TCC CGC CCA GCC     1603Arg Val Arg Ala Ser Ser Asp Gly Glu Gly Thr Met Ser Arg Pro Ala

            330                 335                 340TCG GTG GAC GGC AGC CCT GTG AGT CCC AGC ACC AAC AGA ACC CAC GCC     1651Ser Val Asp Gly Ser Pro Val Ser Pro Ser Thr Asn Arg Thr His Ala

        345                 350                 355CAC CGG CAT CGG GGC AGG GCC CGG CTG CAC CCC CCG CTC AAC CAC AGC     1699His Arg His Arg Gly Arg Ala Arg Leu His Pro Pro Leu Asn His Ser

    360                 365                 370CGC TCC ATC CCC ATG CCG GCT TCC CGC TGC TCC CGT TCG GCC ACC AGC     1747Arg Ser Ile Pro Met Pro Ala Ser Arg Cys Ser Arg Ser Ala Thr Ser

375                 380                 385CCG GTC AGT CTG TCG TCC AGT AGC ACC AGT GGC CAT GGC TCC ACC TCG     1795Pro Val Ser Leu Ser Ser Ser Ser Thr Ser Gly His Gly Ser Thr Ser390                 395                 400                 405GAT TGT CTC TTC CCA CGG CGA TCT AGT GCT TCG GTG TCT GGT TCC CCC     1843Asp Cys Leu Phe Pro Arg Arg Ser Ser Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro

            410                 415                 420AGC GAT GGC GGT TTC ATC TCC TCG GAT GAG TAT GGC TCC AGT CCC TGC     1891Ser Asp Gly Gly Phe Ile Ser Ser Asp Glu Tyr Gly Ser Ser Pro Cys

        425                 430                 435GAT TTC CGG AGT TCC TTC CGC AGT GTC ACT CCG GAT TCC CTG GGC CAC     1939Asp Phe Arg Ser Ser Phe Arg Ser Val Thr Pro Asp Ser Leu Gly His

    440                 445                 450ACC CCA CCA GCC CGC GGT GAG GAG GAG CTA AGC AAC TAT ATC TGC ATG     1987Thr Pro Pro Ala Arg Gly Glu Glu Glu Leu Ser Asn Tyr Ile Cys Met

455                 460                 465GGT GGC AAG GGG CCC TCC ACC CTG ACC GCC CCC AAC GGT CAC TAC ATT     2035Gly Gly Lys Gly Pro Ser Thr Leu Thr Ala Pro Asn Gly His Tyr Ile470                 475                 480                 485TTG TCT CGG GGT GGC AAT GGC CAC CGC TGC ACC CCA GGA ACA GGC TTG     2083Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gly His Arg Cys Thr Pro Gly Thr Gly Leu

            490                 495                 500GGC ACG AGT CCA GCC TTG GCT GGG GAT GAA GCA GCC AGT GCT GCA GAT     2131Gly Thr Ser Pro Ala Leu Ala gly Asp Glu Ala Ala Ser Ala Ala Asp

        505                 510                 515CTG GAT AAT CGG TTC CGA AAG AGA ACT CAC TCG GCA GGC ACA TCC CCT     2179Leu Asp Asn Arg Phe Arg Lys Arg Thr His Ser Ala Gly Thr Ser Pro

    520                 525                 530ACC ATT ACC CAC CAG AAG ACC CCG TCC CAG TCC TCA GTG GCT TCC ATT     2227Thr Ile Thr His Gln Lys Thr Pro Ser Gln Ser Ser Val Ala Ser Ile

535                 540                 545GAG GAG TAC ACA GAG ATG ATG CCT GCC TAC CCA CCA GGA GGT GGC AGT     2275Glu Glu Tyr Thr Glu Met Met Pro Ala Tyr Pro Pro Gly Gly Gly Ser550                 555                 560                 565GGA GGC CGA CTG CCG GGA CAC AGG CAC TCC GCC TTC GTG CCC ACC CGC     2323Gly Gly Arg Leu Pro Gly His Arg His Ser Ala Phe Val Pro Thr Arg

            570                 575                 580TCC TAC CCA GAG GAG GGT CTG GAA ATG CAC CCC TTG GAG CGT CGG GGG     2371Ser Tyr Pro Glu Glu Gly Leu Glu Met His Pro Leu Glu Arg Arg Gly

        585                 590                 595GGG CAC CAC CGC CCA GAC AGC TCC ACC CTC CAC ACG GAT GAT GGC TAC     2419Gly His His Arg Pro Asp Ser Ser Thr Leu His Thr Asp Asp Gly Tyr

    600                 605                 610ATG CCC ATG TCC CCA GGG GTG GCC CCA GTG CCC AGT GGC CGA AAG GGC    2467Met Pro Met Ser Pro Gly Val Ala Pro Val Pro Ser Gly Arg Lys Gly

615                 620                 625AGT GGA GAC TAT ATG CCC ATG AGC CCC AAG AGC GTA TCT GCC CCA CAG    2515Ser Gly Asp Tyr Met Pro Met Ser Pro Lys Ser Val Ser Ala Pro Gln630                 635                 640                 645CAG ATC ATC AAT CCC ATC AGA CGC CAT CCC CAG AGA GTG GAC CCC AAT    2563Gln Ile Ile Asn Pro Ile Arg Arg His Pro Gln Arg Val Asp Pro Asn

            650                 655                 660GGC TAC ATG ATG ATG TCC CCC AGC GGT GGC TGC TCT CCT GAC ATT GGA    2611Gly Tyr Met Met Met Ser Pro Ser Gly Gly Cys Ser Pro Asp Ile Gly

        665                 670                 675GGT GGC CCC AGC AGC AGC AGC AGC AGC AGC AAC GCC GTC CCT TCC GGG    2659Gly Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ala Val Pro Ser Gly

    680                 685                 690ACC AGC TAT GGA AAG CTG TGG ACA AAC GGG GTA GGG GGC CAC CAC TCT    2707Thr Ser Tyr Gly Lys Leu Trp Thr Asn Gly Val Gly Gly His His Ser

695                 700                 705CAT GTC TTG CCT CAC CCC AAA CCC CCA GTG GAG AGC AGC GGT GGT AAG    2755His Val Leu Pro His Pro Lys Pro Pro Val Glu Ser Ser Gly Gly Lys710                 715                 720                 725CTC TTA CCT TGC ACA GGT GAC TAC ATG AAC ATG TCA CCA GTG GGG GAC    2803Leu Leu Pro Cys Thr Gly Asp Tyr Met Asn Met Ser Pro Val Gly Asp

            730                 735                 740TCC ACC ACC AGC AGC CCC TCC GAC TGC TAC TAC GGC CCT GAG GAC CCC    2851Ser Asn Thr Ser Ser Pro Ser Asp Cys Tyr Tyr Gly Pro Glu Asp Pro

        745                 750                 755CAG CAC AAG CCA GTC CTC TGG TAC TAC TCA TTG CCA AGA TCC TTT AAG    2899Gln His Lys Pro Val Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Pro Arg Ser Phe Lys

    760                 765                 770CAC ACC CAG CGC CCC GGG GAG CCG GAG GAG GGT GCC CCG CAT CAG CAC    2947His Thr Gln Arg Pro Gly Glu Pro Glu Glu Gly Ala Arg His Gln His

775                 780                 785CTC CGC CTT TCC ACT AGC TCT GGT GGC CTT CTC TAT GCT GCA ACA GCA    2995Leu Arg Leu Ser Thr Ser Ser Gly Gly Leu Leu Tyr Ala Ala Thr Ala790                 795                 800                 805GAT GAT TCT TCC TCT TCC ACC AGC AGC GAC AGC CTG GGT CCC GGA TAC    3043Asp Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Asp Ser Leu Gly Gly Gly Tyr

            810                 815                 820TGC GGG GCT AGG CTG GAG CCC AGC CTT CCA CAT CCC CAC CAT CAG GTT    3091Cys Gly Ala Arg Leu Glu Pro Ser Leu Pro His Pro His His Gln Val

        825                 830                 835CTG CAG CCC CAT CTG CCT CGA AAG GTG GAC ACA GCT GCT CAG ACC AAT      3139Leu Gln Pro His Leu Pro Arg Lys Val Asp Thr Ala Ala Gln Thr Asn

    840                 845                 850AGC CGC CTG GCC CGG CCC ACG AGG CTG TCC CTG GGG GAT CCC AAG GCC      3187Ser Arg Leu Ala Arg Pro Thr Arg Leu Ser Leu Gly Asp Pro Lys Ala

855                 860                 865AGC ACC TTA CCT CGG GCC CGA GAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CCC TTG      3235Ser Thr Leu Pro Arg Ala Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Leu870                 875                 880                 885CTG CAC CCT CCA GAG CCC AAG AGC CCG GGG GAA TAT GTC AAT AAT GAA      3283Leu His Pro Pro Glu Pro Lys Ser Pro Gly Glu Tyr Val Asn Ile Glu

            890                 895                 900TTT GGG AGT GAT CAG TCT GGC TAC TTG TCT GGC CCG GTG GCT TTC CAC      3331Phe Gly Ser Asp Gln Ser Gly Tyr Leu Ser Gly Pro Val Ala Phe His

        905                 910                 915AGC TCA CCT TCT GTC AGG TGT CCA TCC CAG CTC CAG CCA GCT CCC AGA      3379Ser Ser Pro Ser Val Arg Cys Pro Ser Gln Leu Gln Pro Ala Pro Arg

    920                 925                 930GAG GAA GAG ACT GGC ACT GAG GAG TAC ATG AAG ATG GAC CTG GGG CCG      3427Glu Glu Glu Thr Gly Thr Glu Glu Tyr Met Lys Met Asp Leu Gly Pro

935                 940                 945GGC CGG AGG GCA GCC TGG CAG GAG AGC ACT GGG GTC GAG ATG GGC AGA      3475Gly Arg Arg Ala Ala Trp Gln Glu Ser Thr Gly Val Glu Met Gly Arg950                 955                 960                 965CTG GGC CCT GCA CCT CCC AGG GCT GCT AGC ATT TGG AGG CCT ACC CGG      3523Leu Gly Pro Ala Pro Pro Arg Ala Ala Ser Ile Cys Arg Pro Thr Arg

            970                 975                 980GCA GTG CCC AGC AGC CGG GGT GAC TAC ATG ACC ATG CAG ATG AGT TGT      3571Ala Val Pro Ser Ser Arg Gly Asp Tyr Met Thr Met Gln Met Ser Cys

        985                 990                 995CCC CGT CAG AGC TAC GTG GAC ACC TCG CCA GCT GCC CCT GTA AGC TAT      3619Pro Arg Gln Ser Tyr Val Asp Thr Ser Pro Ala Ala Pro Val Ser Tyr

    1000                1005                1010GCT GAC ATG CGA ACA GGC ATT GCT GCA GAG GAG GTG AGC CTG CCC AGG      3667Ala Asp Met Arg Thr Gly Ile Ala Ala Glu Glu Val Ser Leu Pro Arg

1015                1020                1025GCC ACC ATG GCT GCT GCC TCC TCA TCC TCA GCA GCC TCT GCT TCC CCG      3715Ala Thr Met Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ala Ser Pro1030                1035                1040                1045ACT GGG CCT CAA GGG GCA GCA GAG CTG GCT GCC CAC TCG TCC CTG CTG      3763Thr Gly Pro Gln Gly Ala Ala Glu Leu Ala Ala His Ser Ser Leu Leu 

            1050                1055                1060GGG GGC CCA CAA GGA CCT GGG GGC ATG AGC GCC TTC ACC CGG GTG AAC     3811Gly Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Met Ser Ala Phe Thr Arg Val Asn

        1065                1070                1075CTC AGT CCT AAC CGC AAC CAG AGT GCC AAA GTG ATC CGT GCA GAC CCA     3859Leu Ser Pro Asn Arg Asn Gln Ser Ala Lys Val Ile Arg Ala Asp Pro

    1080                1085                1090CAA GGG TGC CGG CGG AGG CAT AGC TCC GAG ACT TTC TCC TCA ACA CCC     3907Gln Gly Cys Arg Arg Arg His Ser Ser Glu Thr Phe Ser Ser Thr Pro

1095                1100                1105AGT GCC ACC CGG GTG GGC AAC ACA GTG CCC TTT GGA GCG GGG GCA GCA     3955Ser Ala Thr Arg Val Gly Asn Thr Val Pro Phe Gly Ala Gly Ala Ala1110                1115                1120                1125GTA GGG GGC GGT GGC GGT AGC AGC AGC AGC AGC GAG GAT GTG AAA CGC     4003Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Val Lys Arg

            1130                1135                1140CAC AGC TCT GCT TCC TTT GAG AAT GTG TGG CTG AGG CCT GGG GAG CTT     4051His Ser Ser Ala Ser Phe Glu Asn Val Trp Leu Arg Pro Gly Gly Leu

        1145                1150                1155GGG GGA GCC CCC AAG GAG CCA GCC AAA CTG TGT GGG GCT GCT GGG GGT     4099Gly Gly Ala Pro Lys Glu Pro Ala Lys Leu Cys Gly Ala Ala Gly Gly

    1160                1165                1170TTG GAG AAT GGT CTT AAC TAC ATA GAC CTG GAT TTG GTC AAG GAC TTC     4147Leu Glu Asn Gly Leu Asn Tyr Ile Asp Leu Asp Leu Val Lys Asp Phe

1175                1180                1185AAA CAG TGC CCT CAG GAG TGC ACC CCT GAA CCG CAG CCT CCC CCA CCC     4195Lys Gln Cys Pro Gln Glu Cys Thr Pro Glu Pro Gln Pro Pro Pro Pro1190                1195                1200                1205CCA CCC CCT CAT CAA CCC CTG GGC AGC GGT GAG AGC AGC TCC ACC CGC     4243Pro Pro Pro His Gln Pro Leu Gly Ser Gly Glu Ser Ser Ser Thr Arg

            1210                1215                1220CGC TCA AGT GAG GAT TTA AGC GCC TAT GCC AGC ATC AGT TTC CAG AAG     4291Arg Ser Ser Glu Asp Leu Ser Ala Tyr Ala Ser Ile Ser Phe Gln Lys

        1225                1230                1235CAG CCA GAG GAC CGT CAG TAGCTCAACT GGACATCACA GCAGGTCGTT            4339Gln Pro Glu Asp Arg Gln

    1240TCATGGTGAC AAAGTCAGAA GACAAAACTG CTTTTAACCT TGTCCTTGAA TTCTGTTCTT   4399CGCCTCTGCC CCTTCCTGTT CTTTCCCACT GCTTCCTCAG GGAGAATGCA CTTACATTCT   4459CAGGGCATAC AAGATGCTCA CCCACACTGA CATTGGCAGA GAGTCAAACA AACATGTAGG   4519AGCAGCCACA GGAGGGCTTT TTCGTTTGAG GAATTCCCAA GTGAAGTAGT TACTGCAGTA   4579TTTTTAAACA TATATCCTAT GCCAGTTCTG CGTTTTGTAG AGTTCCTCCG TAAGAAGCTT  4639GATTTGTTTG TTGAAGTTTT CTTTTCACTA TATATTTAGG TCAGCCCCTG GAAGGACAGT  4699TCTACAAAAA ATACCCGTTA ACACAGGGGC TAAACCCTTC CTTATCTTAA ACTATCTTAA  4759TAGTTTCTGG GAGCCCTTAA GGGTGATCTT ATCAAGTTGT TCTCTGTACT TTTGTTCTGT  4819GATTTCATAA TACTAGGGCA ACATAAACAG CAGCGGGAAG CATTGATTTC TATTCATCCT  4879GCCCTAAAAA GATCAGGAGT AAGAGCTTTT TAGAAATATG TATTTAGAGA GAAGTACCTA  4939TCTATTTTGT GATCTCTCAA GAAAGTAATT ATGGGTGACG TTCTCCTTTT GTTCATGTAC  4999CAGGATTTGT GAAATATTAT TCACACAACC GACCCACCAT CCCACGGGCC TGGCCTCTCT  5059TGTACAGGAT ATGCAGGAAA CTCTGTATGT GTCTGGGACC CATTATTAAG AGTTATGGGA  5119GTTCATCCTA GGATGTCTGC CTTATAGTTA TCTCTTCTTC TTGCACTGAG AGATTACAGA  5179TATCATTTGG GGGCTACTAT ATATCTTCTG TAAAATTACT TTTATTTGTT GAAGAAGAAT  5239GCATACTAAG TCAGGAACAT GCCTTAATTT GTTTTGTTTT GCAATTGAGT AGAAGGGCTA  5299AACTGTATCC CTCCACTTTT AGGGTTATTT GCCTGTGTGC CTTTAAGTTC AAAAGTAGAC  5359ACCACAGTAA ATGCTGAAAG TTGGCTTTAG GTCTTCTGTG GCTAATGCCG TATTAAAAAT  5419GAAAAACATT TGTGGTAGAA ATTAGCCTGC CCTTCGTTCT GTTGATCCTG TTTTCTGGTG  5479GTCATAATTG TGGGTAGAAG AGAGTACAGT TTGCAAATAA TGTGATGAGT TGGCAATGCA  5539GAAGTTTCCA GCATTTGGAA ACACTTTACT CTGACAAACT GATTATCTTG TGAATTTTAT  5599CTATGCTCCA CAGAATGAGC TTTTAAAAGC ACTGATTTTT CTTAATTTGT GTCCATTCAT  5659AAGAAATTAA TCTGTGCCCT GGTTTCCTAT TGACAGGTAT TTATTTATCA TGTGTTCATA  5719GTCTTCTTAA TTCTGTTTCC AATATTTGAT CCATATAATT CTCTATTTTA TAAAGCAAGA  5779AAAAGGTATA TAAACACTCA AATGAAGATT TTGGGTGATG TGTTACAAAA AGCATTTATT  5839TGATCAGTAT TTACTTCAAC ATTTATTTTC ATCATTCACT AGAAGAAAGA TTTAATTGTG  5899TATATCAACA TCAGTAGTAC AAATCTTGTT ATATCAAATG ATGTTTTTGG GAGTTCAGAA  5959TCCCTCAACA CTTTAAGCAT TTGTATTATA AAGTGCCTCA TTGGTAAAAT AATGAGAATT  6019TGAAGAAAAC CAGCCCAGCA GAACTAAAAT TTTGGTTTTA AAGGAGATAA AGAGAATAAG  6079TTTTTCTTAC TTGTCATCTT AATTTGTTTA GGTTTCTTTT TATAGAGTAG AATAAATGAT  6139GTTTGCTCTG AAG                                                     6152(2)SEQ ID NO：2的信息：  (i)序列特征：

(A)长度：1243个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ala Ser Pro Pro Glu Ser Asp Gly Phe Ser Asp Val Arg Lys Val  1               5                  10                  15Gly Tyr Leu Arg Lys Pro Lys Ser Met His Lys Arg Phe Phe Val Leu

         20                  25                  30Arg Ala Ala Ser Glu Ala Gly Gly Pro Ala Arg Leu Glu Tyr Tyr Glu

     35                  40                  45Asn Glu Lys Lys Trp Arg His Lys Ser Ser Ala Pro Lys Arg Ser Ile

 50                  55                  60Pro Leu Glu Ser Cys Phe Asn Ile Asn Lys Arg Ala Asp Ser Lys Asn 65                  70                  75                  80Lys His Leu Val Ala Leu Tyr Thr Arg Asp Glu His Phe Ala Ile Ala

             85                  90                  95Ala Asp Ser Glu Ala Glu Gln Asp Ser Trp Tyr Gln Ala Leu Leu Gln

        100                 105                 110Leu His Asn Arg Ala Lys Gly His His Asp Gly Ala Ala Ala Leu Gly

    115                 120                 125Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ser Gly Ser Ser Gly Leu Gly

130                 135                 140Glu Ala Gly Glu Asp Leu Ser Tyr Gly Asp Val Pro Pro Gly Pro Ala145                 150                 155                 160Phe Lys Glu Val Trp Gln Val Ile Leu Lys Pro Lys Gly Leu Gly Gln

            165                 170                 175Thr Lys Asn Leu Ile Gly Ile Tyr Arg Leu Cys Leu Thr Ser Lys Thr

        180                 185                 190Ile Ser Phe Val Lys Leu Asn Ser Glu Ala Ala Ala Val Val Leu Gln

    195                 200                 205Leu Met Asn Ile Arg Arg Cys Gly His Ser Glu Asn Phe Phe Phe Ile

210                 215                 220Glu Val Gly Arg Ser Ala Val Thr Gly Pro Gly Glu Phe Trp Met Gln225                 230                 235                 240Val Asp Asp Ser Val Val Ala Gln Asn Met His Glu Thr Ile Leu Glu

            245                 250                 255Ala Met Arg Ala Met Ser Asp Glu Phe Arg Pro Arg Ser Lys Ser Gln

        260                 265                 270Ser Ser Ser Asn Cys Ser Asn Pro Ile Ser Val Pro Leu Arg Arg His

    275                 280                 285His Leu Asn Asn Pro Pro Pro Ser Gln Val Gly Leu Thr Arg Arg Ser

290                 295                 300Arg Thr Glu Ser Ile Thr Ala Thr Ser Pro Ala Ser Met Val Gly Gly305                 310                 315                 320Lys Pro Gly Ser Phe Arg Val Arg Ala Ser Ser Asp Gly Glu Gly Thr

            325                 330                 335Met Ser Arg Pro Ala Ser Val Asp Gly Ser Pro Val Ser Pro Ser Thr

        340                 345                 350Asn Arg Thr His Ala His Arg His Arg Gly Arg Ala Arg Leu His Pro

    355                 360                 365Pro Leu Asn His Ser Arg Ser Ile Pro Met Pro Ala Ser Arg Cys Ser

370                 375                 380Arg Ser Ala Thr Ser Pro Val Ser Leu Ser Ser Ser Ser Thr Ser Gly385                 390                 395                 400His Gly Ser Thr Ser Asp Cys Leu Phe Pro Arg Arg Ser Ser Ala Ser

            405                 410                 415Val Ser Gly Ser Pro Ser Asp Gly Gly Phe Ile Ser Ser Asp Glu Tyr

        420                 425                 430Gly Ser Ser Pro Cys Asp Phe Arg Ser Ser Phe Arg Ser Val Thr Pro

    435                 440                 445Asp Ser Leu Gly His Thr Pro Pro Ala Arg Gly Glu Glu Ile Leu Ser

450                 455                 460Asn Tyr Ile Cys Met Gly Gly Lys Gly Pro Ser Thr Leu Thr Ala Pro465                 470                 475                 480Asn Gly His Tyr Ile Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gly His Arg Cys Thr

            485                 490                 495Pro Gly Thr Gly Leu Gly Thr Ser Pro Ala Leu Ala Gly Asp Glu Ala

        500                 505                 510Ala Ser Ala Ala Asp Leu Asp Asn Arg Phe Arg Lys Arg Thr His Ser

    515                  520                 525Ala Gly Thr Ser Pro Thr Ile Thr His Gln Lys Thr Pro Ser Gln Ser

530                 535                 540Ser Val Ala Ser Ile Glu Glu Tyr Thr Glu Met Met Pro Ala Tyr Pro545                 550                 555                 560Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Leu Pro Gly His Arg His Ser Ala

            565                 570                 575Phe Val Pro Thr Arg Ser Tyr Pro Glu Glu Gly Leu Glu Met His Pro

        580                 585                 590Leu Glu Arg Arg Gly Gly His His Arg Pro Asp Ser Ser Thr Leu His

    595                 600                 605Thr Asp Asp Gly Tyr Met Pro Met Ser Pro Gly Val Ala Pro Val Pro

610                 615                 620Ser Gly Arg Lys Gly Ser Gly Asp Tyr Met Pro Met Ser Pro Lys Ser625                 630                 635                 640Val Ser Ala Pro Gln Gln Ile Ile Asn Pro Ile Arg Arg His Pro Gln

            645                 650                 655Arg Val Asp Pro Asn Gly Tyr Met Met Met Ser Pro Ser Gly Gly Cys

        660                 665                 670Ser Pro Asp Ile Gly Gly Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn

    675                 680                 685Ala Val Pro Ser Gly Thr Ser Tyr Gly Lys Leu Trp Thr Asn Gly Val

690                 695                 700Gly Gly His His Ser His Val Leu Pro His Pro Lys Pro Pro Val Glu705                 710                 715                 720Ser Ser Gly Gly Lys Leu Leu Pro Cys Thr Gly Asp Tyr Met Asn Met

            725                 730                 735Ser Pro Val Gly Asp Ser Asn Thr Ser Ser Pro Ser Asp Cys Tyr Tyr

        740                 745                 750Gly Pro Glu Asp Pro Gln His Lys Pro Val Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu

    755                 760                 765Pro Arg Ser Phe Lys His Thr Gln Arg Pro Gly Glu Pro Glu Glu Gly

770                 775                 780Ala Arg His Gln His Leu Arg Leu Ser Thr Ser Ser Gly Gly Leu Leu785                 790                 795                 800Tyr Ala Ala Thr Ala Asp Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Asp Ser

            805                 810                 815Leu Gly Gly Gly Tyr Cys Gly Ala Arg Leu Glu Pro Ser Leu Pro His

        820                 825                 830Pro His His Gln Val Leu Gln Pro His Leu Pro Arg Lys Val Asp Thr

    835                 840                 845Ala Ala Gln Thr Asn Ser Arg Leu Ala Arg Pro Thr Arg Leu Ser Leu

850                 855                 860Gly Asp Pro Lys Ala Ser Thr Leu Pro Arg Ala Arg Glu Gln Gln Gln865                 870                 875                 880Gln Gln Gln Pro Leu Leu His Pro Pro Glu Pro Lys Ser Pro Gly Glu

            885                 890                 895Tyr Val Asn Ile Glu Phe Gly Ser Asp Gln Ser Gly Tyr Leu Ser Gly

        900                 905                 910Pro Val Ala Phe His Ser Ser Pro Ser Val Arg Cys Pro Ser Gln Leu

    915                 920                 925Gln Pro Ala Pro Arg Glu Glu Glu Thr Gly Thr Glu Glu Tyr Met Lys

930                 935                 940Met Asp Leu Gly Pro Gly Arg Arg Ala Ala Trp Gln Glu Ser Thr Gly945                 950                 955                 960Val Glu Met Gly Arg Leu Gly Pro Ala Pro Pro Arg Ala Ala Ser Ile

            965                 970                 975Cys Arg Pro Thr Arg Ala Val Pro Ser Ser Arg Gly Asp Tyr Met Thr

        980                 985                 990Met Gln Met Ser Cys Pro Arg Gln Ser Tyr Val Asp Thr Ser Pro Ala

    995                 1000                1005Ala Pro Val Ser Tyr Ala Asp Met Arg Thr Gly Ile Ala Ala Glu Glu

1010                1015                1020Val Ser Leu Pro Arg Ala Thr Met Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ala1025                1030                1035                1040Ala Ser Ala Ser Pro Thr Gly Pro Gln Gly Ala Ala Glu Leu Ala Ala

            1045                1050                1055His Ser Ser Leu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Met Ser Ala

        1060                1065                1070Phe Thr Arg Val Asn Leu Ser Pro Asn Arg Asn Gln Ser Ala Lys Val

    1075                1080                1085Ile Arg Ala Asp Pro Gln Gly Cys Arg Arg Arg His Ser Ser Glu Thr

1090                1095                1100Phe Ser Ser Thr Pro Ser Ala Thr Arg Val Gly Asn Thr Val Pro Phe1105                1110                1115                1120Gly Ala Gly Ala Ala Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser

            1125                1130                1135Glu Asp Val Lys Arg His Ser Ser Ala Ser Phe Glu Asn Val Trp Leu

        1140                1145                1150Arg Pro Gly Glu Leu Gly Gly Ala Pro Lys Glu Pro Ala Lys Leu Cys

    1155                1160                1165Gly Ala Ala Gly Gly Leu Glu Asn Gly Leu Asn Tyr Ile Asp Leu Asp

1170                1175                1180Leu Val Lys Asp Phe Lys Gln Cys Pro Gln Glu Cys Thr Pro Glu Pro1185                1190                1195                1200Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Gln Pro Leu Gly Ser Gly Glu

            1205                1210                1215Ser Ser Ser Thr Arg Arg Ser Ser Glu Asp Leu Ser Ala Tyr Ala Ser

        1220                1225                1230Ile Ser Phe Gln Lys Gln Pro Glu Asp Arg Gln

    1235                1240