通过2-(羧乙硫基)乙酰-7-ADCA和3-(羧甲硫基)丙酰-7-ADCA有效生产7-ADCA的方法

摘要

改进了使用表达扩环酶和酰基转移酶的产黄青霉转化菌株、通过2-(羧乙硫基)乙酰-7-ADCA和3-(羧甲硫基)丙酰-7-ADCA制备和回收7-氨基去乙酸头孢烷酸(7-ADCA)的全面有效的方法。

说明书

本发明涉及制备和回收7—氨基去乙酸头孢烷酸(7—ADCA)的生物合成方法。

β—内酰胺抗生素构成最重要的一类抗生素化合物，并具有悠久的临床应用历史。这类抗生素中，突出的有青霉素和头孢菌素。这些化合物分别由丝状真菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和产黄枝顶孢(Acremonium chrysogenum)天然产生。

经过经典的菌种改进技术，使产黄青霉和产黄枝顶孢的抗生素生产水平比过去几十年大大提高了。随着对产生青霉素和头孢菌素的生物合成途径的了解增多和重组DNA技术的出现，现在有了改进生产菌株和将这些化合物体内衍生化的新工具。

β—内酰胺生物合成中涉及的大部分酶已得以鉴定，对其相应基因已进行了克隆，如见Ingolia和Queener的Med.Res.Rev.9(1989)，245—264(生物合成途径和酶)，及Aharonowitz，Cohen和Martin的Ann.Rev.Microbiol.46(1992)，461—495(基因克隆)。

产黄青霉中青霉素生物合成的头两步是：三种氨基酸L—5—氨基—5—羧基戊酸(L—α—氨基己二酸)(A)、L—半胱氨酸(C)和L—缬氨酸(V)缩合成三肽LLD—ACV，然后该三肽环化形成异青霉素N。该化合物含有典型的β—内酰胺结构。第三步涉及通过酰基转移酶(AT)的作用以疏水侧链交换L—5—氨基—5—羧基戊酸的亲水侧链。在生产青霉素G的工业方法中，选择的侧链是苯基乙酸(PA)。EP—A—0532341中公开了己二酸(5—羧基戊酸)原料的应用。掺入该底物导致产生了具有5—羧基戊酰侧链的青霉素衍生物，即5—羧基戊酰—6—氨基青霉烷酸。这种掺入是由于已证明酰基转移酶具有宽的底物特异性(Behrens等，J.Biol.Chem.175(1948)，751—809；Cole，Process.Biochem.1(1966)，334—338，Ballio等，Nature 185(1960)，97—99)。如EP—A—0448180中所述，由AT介导的酶促交换反应发生在一种细胞器—微体中。

头孢菌素比青霉素贵得多。一个原因是一些头孢菌素(如cephalexin)是由青霉素经若干步化学转化而制得的。另一个原因是迄今只能发酵出具有D—5—氨基—5—羧基戊酰侧链的头孢菌素。在此方面迄今最重要的起始物头孢菌素C在任何pH下都非常易溶于水，这就意味着使用麻烦而又昂贵的柱技术进行费时费钱的分离工艺。这样获得的头孢菌素C须经若干化学和酶促转化才能转变为治疗用头孢菌素。

中间体7—ADCA现今是青霉素G经化学衍生而产生。产生7—ADCA需要的化学步骤涉及5—元青霉素环结构扩环成为6—元的头孢菌素环结构。但来自丝状细菌带棒链霉菌(StreptomycesClavuligerus)的扩环酶可以进行这种环扩张。当被引入产黄青霉中时，它能将青霉素环结构转变为头孢菌素环结构，如Cantwell等在Proc.R.Soc.Lond.B.248(1992)，283—289；及EP—A—0532341和EP—A—0540210中所述。已对扩环酶从生化和功能方面进行了充分表征(EP—A—0366354)，也对其相应的基因进行了表征。已描述了cefE基因(EP—A—0233715)和DNA序列的物理图谱，及cefE在产黄青霉中的转化研究。

适当扩环酶的另一来源是丝状细菌Nocardia lactamdurans(早期称为Streptomyces lactamdurans)。已描述了酶的生化特征和基因的DNA序列(分别见Cortes等，J.Gen.Mierobiol.133(1987)，3165—3174；及Coque等，Mol.Gen.Genet.236(1993)，453—458)。

更具体地讲，EP—A—0532341描述了扩环酶结合5—羧基戊酰侧链作为原料在产黄青霉中的应用，5—羧基戊酰侧链用作产黄青霉中酰基转移酶的底物。这导致形成5—羧基戊酰—6—APA，后者通过引入产黄青霉株中的扩环酶产生5—羧基戊酰—7—ADCA。最后，建议去除5—羧基戊酰侧链生成终产物7—ADCA。专利申请EP—A—0540210描述了制备7—ACA的相似方法，包括将ADCA环的3—甲基侧链转变为ACA的3—乙酰氧甲基侧链的额外步骤。但上述专利申请没有提供经济有效的方法，因为首先没有认识到扩环酶在细胞中及时表达与酰基转移酶的表达同时进行的问题。

而本发明提供一种生产7—ADCA的有效方法，其中扩环酶和酰基转移酶同时表达。

另外，本发明描述了新侧链前体3’—羧甲硫基丙酸的应用。该前体通过产黄青霉被非常有效地引入到相应的青霉素中，后者接下来在扩环酶的作用下扩环。

而且，迄今还没有关于脱乙酰化前从发醇液中回收7—ADCA衍生物的有效方法的描述。本发明提供一种回收7—ADCA衍生物的有效的溶剂萃取步骤。

通过本发明，提供了一种真正有效的全面的7—ADCA制备方法，其包括迄今为止在现有技术中没有公开也没有提示的反应步骤。

通过应用本发明和类似于EP—A—0540210中的类似描述，还可以用这种有效全面的方法制备7—ACA。附图的简要说明：

图1：质粒pMcTNE的功能图。

图2：质粒pMcTSE的功能图。

图3：质粒pMcTNde的功能图。

图4：质粒pGNETA的功能图。

图5：质粒pGSETA的功能图。

图6：质粒pANETA的功能图。

图7：质粒pASETA的功能图。

图8：与PCR产物1序列(上线)并行的Nocardia lactamduranscefE的DNA序列(Coque等，同上)(下线)。序列表的简要说明：

SEQ ID No.1—13：用于构建带棒链霉菌和Nocardia lactamduranscefE基因的产黄青霉表达盒的寡核苷酸。

SEQ ID No.14：Nocardia lactamdurans cefE的DNA序列(Coque等，见上)。

因此本发明提供一种制备和回收7—氨基去乙酸头孢烷酸(7—ADCA)的方法，包括：

a)在丝状真菌表达信号序列的转录和翻译调控下，用扩环基因转化产黄青霉菌株；

b)在培养基中发酵所述菌株并向所述培养基中加入3’—羧甲硫基丙酸或其盐或酯，它们适于产生2—(羧乙硫基)乙酰—和3—(羧甲硫基)丙酰—6—氨基青霉烷酸(2—(羧乙硫基)乙酰—6—APA和3—(羧甲硫基)丙酰—6—APA)，这些6—APA衍生物就地扩环形成2—(羧乙硫基)—乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA；

c)从发酵液中回收2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA；

d)将所述2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA脱乙酰化；及

e)回收结晶的7—ADCA。

e)步优选为一过滤步骤。

扩环酶的表达优选在各个AT基因控制元件的转录和翻译调控下进行，使所述两种酶的表达同时进行。

优选在低于约4.5的pH下用一种和水不混溶的有机溶剂萃取发酵液滤液，从发酵液中回收2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA，再在pH4—10间用水将其反萃取。另外，还提供了包含扩环酶编码DNA的重组DNA载体，其中扩环酶之编码DNA与产黄青霉AT基因或A.nidulans gpdA基因的转录和翻译控制元件有效地连接，以及用此载体转化的宿主细胞。

本发明涉及在产黄青霉中应用功能性基因构建物以体内扩张青霉素环结构，并结合应用生物合成酶的新底物，以形成头孢菌素生物合成中的关键中间体—7—氨基去乙酸头孢烷酸，或7—ADCA—的衍生物。该衍生物具有充许进行有效溶剂萃取的化学组成，从而提供一种在经济效益上有吸引力的回收方法。

产黄青霉的转化原则上可用不同的DNA转移技术如PEG—Ca介导的原生质体摄入、电穿孔或基因枪技术，及转化子选择来完成。例如，见Van den Hondel en Punt在Applied Molecular Genetics of Fungi(Peberdy，Laten，Ogden，Bennett，eds)中的“对丝状真菌的基因转移和载体发展”一文，Cambridge University Press(1991)。已描述了显性和非显性选择标记的应用(Van den Hondel，同上)。已描述了同源性(产黄青霉衍生的)和异源性(非产黄青霉衍生的)选择标记。

在存在或不存在载体序列时、与非选择性DNA物理连接或不连接的不同转化子选择标记(同源或异源)在转化子选择中的应用是熟知的。

优选使用同源性选择标记选择产黄青霉的转化子，以限制引入产黄青霉中外源DNA的量。最优选使用显性选择标记，它可以从转化株中选择性去除，如A.nidulans或其它丝状真菌的amdS基因(欧洲专利申请No.94201896.1)。这些产黄青霉转化子选择标记的优选特征在方法和产品的注册中非常有利，因为在此方法中不涉及任何抗生素抗性标记或不会向环境中引入抗生素抗性标记。

在最优选的实施方案中，可从菌株中选择性去除的amdS选择性标记使得可以利用同一显性选择重复进行几轮转化。表达扩环酶的产黄青霉新菌株的这种无选择标记特性，对工业菌株改进工程中高产菌株的迅速发展是关键性的。

按此方法，由扩环酶介导的扩环反应被引入产黄青霉中并在其中表达，例如在菌株Wisconsin 54—1255中。该扩环反应还可以在提高了β—内酰胺产率的产黄青霉变体中进行。很明显，此时应对培养基条件稍做调整以得到有效的生长。

另外，将cefE基因置于各个丝状真菌基因控制元件的转录和翻译控制之下，优选在来自产黄青霉酰基转移酶(AT)基因控制元件的控制之下，从而使其在最佳时间范围内表达，与酰基转移的自身的作用同步。这些措施对青霉素分子上扩环反应的效力是关键的。

除扩环酶和酰基转移酶编码基因的同时表达外，扩环酶部分与微体(酰基转移酶的细胞内位置)中的酰基转移酶的细胞内共定位可能对开发经济的生产工艺是有利的。这些优选实施方案在减少青霉素付产物的量方面起很大作用，7—ADCA终产物中的这些付产物是注册当局不允许的。

总之，本发明描述了按照同时表达的方法，引入产黄青霉中的扩环酶活性如何影响青霉素环的扩环。

按照本发明，通过加入3’—羧甲硫基丙酸或其盐或酯，在产黄青霉中产生3—内酰胺中间体2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA。适当的盐例如为钠盐或钾盐。通过简单的溶剂萃取从培养液中回收相同产物，例如以下方法：

过滤发酵液，向滤液中加入与水不混溶的有机溶剂。调节pH以从水层中萃取头孢菌素。pH范围必须低于4.5；优选在4到1之间，更优选在2到1之间。这样就将头孢菌素与发酵液中存在的许多其它杂质分离。优选使用小体积有机溶剂，得到头孢菌素浓溶液，以使体积流速减小。第二种可能性是在pH4或更低时萃取整个发酵液。优选使用与水不混溶的有机溶剂在pH4—1之间萃取发酵液。

可以使用不影响头孢菌素分子的任何溶剂。适当的溶剂例如为乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、醇如丁醇等。优选使用1—丁醇或异丁醇。

然后在pH10，优选在6—9下用水反萃取头孢菌素。再次大大减小终体积。在0—50℃，优选室温下进行回收。

这样得到的头孢菌素水溶液用适当的酶处理，以除去2—(羧乙硫基)—乙酰和3—(羧甲硫基)丙酰侧链，得到目标产物7—ADCA。

优选使用固定化酶以能够重复使用该酶。EP—A—022262中广泛描述了这种颗粒的制备方法和酶的固定化方法。水溶液的pH值例如为4—9，此时头孢菌素的降解反应最小，而所希望的酶转化此时是最优化的。因此，向头孢菌素水溶液中加入酶的同时保持pH在此适当的水平，例如通过加入无机碱如氢氧化钾溶液，或应用阳离子交换树脂。当反应完成后过滤除去固定化酶。另一可能性是在固定床或流化床柱中应用固定化酶，或在溶液中使用酶并通过膜过滤除去产物。然后，在与水不混溶的有机溶剂存在下酸化反应混合物。

适当的酶例如衍生自假单胞菌SY77，该微生物在62、177、178和179位的一个或多个位点有突变。还可以使用衍生自其它假单胞微生物的酶，优选假单胞SE83，它在相应于假单胞菌SY77中62、177、178和179位的一个或多个位点上有或无突变。

调节pH至0.1到1.5后，分离各层，调节水层pH至2到5。然后过滤出结晶的7—ADCA。

脱酰化还可以按本领域已知的化学方法进行，例如通过在低于10℃的温度下加入五氯化磷，然后于室温或更低温度下加入异丁醇形成偕氯代亚胺侧链。

提供以下实施例用于说明，但不限制本发明。实施例1

链霉菌和诺卡氏菌的cefE基因在产黄青霉中的表达a.基因克隆和基因转化的一般程序

基因克隆程序中所用的通用技术用于本申请。这些技术包括聚合酶链反应(PCR)、合成寡核苷酸的合成、DNA的核苷酸序列分析、DNA的酶连接和限制性酶切、大肠杆菌载体亚克隆、转化和转化子选择、DNA的分离和纯化、通过Southern印迹分析和³²p标记的探针表征DNA及通过随机引物³²P标记DNA。这些技术是本领域中非常熟悉的，在许多文献中有充分的描述。例如见Sambrooke等的Molecu-lar Cloning，a laboratory Manual，Cold Spring Harbor，U.S.A.(1989)，Innes等的PCR protocols，a Guide to Methods and Applications，Academic Press(1990)，及McPherson等的PCR，a Practical Approach，IRL Press(1991)。

用于转化丝状真菌和选择转化子的一般程序包括制备真菌原生质体、DNA转移和原生质体再生条件、纯化和表征转化子。这些程序都是本领已知的并有充分的文献描述：Finkelstein和Ball(编)，Biotechnology of Filamentous Fungi，technology and products，Butterworth—Heinemann(1992)；Bennett和Lasure(编)，More Gene Manipulationin Fungi，Academic Press(1991)；Turner，Biotechnology(Puhler编)，第二次全面修正版，VCH(1992)。

Bennett和Lasure(同上)和Finkelstein及Ball(同上)对基因克隆和基因转化技术在产黄青霉中的更具体应用有充分的描述。

—用市售的DNA合成仪(Applied Biosystems，CA，U.S.A)按制造商的说明合成DNA寡核苷酸。

—用市售的自动PCR仪(Perkin Elmer，U.S.A)和Ultma DNA聚合酶(Perkin Elmer)按制造商的说明进行PCR。

—使用hGC PCR方法(Duton等，Nucleic Acids Res.21，(No.12)(1993)2953—2954)以能够扩增N.lactamdurans和带棒链霉菌染色体DNA的cefE编码区。

—限制酶和其它DNA修饰酶购自BRL(MD，U.S.A)并按制备商的说明使用之。

—大肠杆菌载体pBluescript^得自Stratagene(CA，U.S.A)。

—所用的其它化学品均为分析纯，得自各种供应商。

—基于序列特异性荧光标记的检测，用自动DNA序列分析仪(Applied Biosystems)按制造商的说明进行DNA核苷酸序列分析。b.微生物的培养

带棒链霉菌ATCC 27064生长在胰蛋白酶大豆培养液(Difco)中。该菌株的染色体DNA用于分离cefE基因(Kovaceuic等，J.Bacte-riol.(1984)，754—760)。

Norcadia lactamdurans ATCC 27382也生长在胰蛋白酶大豆培养液(Difco)中。该菌株的染色体DNA用于分离cefE基因(Coque等，同上)。

产黄青霉Wisconsin 54—1255(ATCC 28089)生长在YPD完全培养基中(YPD：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。该菌株的染色体DNA用于分离cefE基因表达所需的penDE基因5’和3’调控区。产黄青霉ATCC 28089也用作cefE基因转化试验的宿主。产黄青霉的其它菌株，包括改进了β—内酰胺产率的突变菌株Wisconsin 54—1255也适用。根据所用的转化子选择标记，可使用在pyrG、niaD或facA基因中含有突变的产黄青霉菌株。这些突变菌株可按本领域熟知的方法获得(Cantoral，Bio/Technol.5(1987)，494—497；Gouka等，J.Biotechn.20(1991)，189—200；及Gouka等，Appl.Microbiol.Biotechnol.(1993)，514—519)。

为了产生用于转化的原生质体而进行的产黄青霉的培养也在YPD培养基中进行。

根据所用产黄青霉的具体菌株和应用的转化子选择方法不同，原生质体产生和再生程序可稍有不同。

大肠杆菌WK6(Zell和Fritz，EMBO J.6(1987)，1809—1815)、XLI—Blue(stratagene)和HB101(Boyer和Rlland—Dussoix，J.Mol.Biol.，41(1969)，459；Bolivar和Backman，Messages Enzymol.68(1979)，2040)用标准大肠杆菌培养基(Sambrook，同上)保持并培养。c.CefE表达盒的构建

cefE表达盒列于表I中，其中也列出了这些质粒所用的名称。表I：所构建的cefE表达盒名词：

¹tac＝trp—lac杂合启动子

²gpd＝A.nidulans gpdA基因的5’—末端

³AT＝产黄青霉pen DE基因的3’—末端

⁴AT＝产黄青霉pen DE基因的5’—末端

 质粒启动子    基因微体靶向终止子 pMCTSEpMCTNEpGSEpGNEpGNETApGNEWApANETApANEWApGSETApGSEWApASETApASEWA tac¹tacgpd²gpdgpdgpdAT⁴ATgpdgpdATAT S.cla cefEN.lac cefES.cla cefEN.lac cefEN.lac cefEN.lac cefEN.lac cefEN.lac cefES.cla cefES.cla cefES.cla cefES.Cla cefE+靶Wt+靶Wt+靶Wt+靶Wt FdTFdt--AT³ATATATATATATAT

文献中公开的带棒链霉菌cefE基因(kovacevic，同上)；N.lactamdurans cefE基因(coque，同上)；A.nidulans gpdA基因(Barredo等，Gene 83(1989)，291—300；Diez等，Mol.Gen Genet.218(1989)，575—576)的核苷酸序列用于设计列于表II中的合成寡核苷酸。表II用于构建N.lactamdurans和带棒链霉菌cefE基因的产黄青霉表达盒的寡核苷酸

1.  5′-GCT GAA GGA GCT GAG CAT ATG ACGGAC GCG ACC GTG CCG ACC-3′2.  5′-CCC GGG TCT AGA TCT AGA TCA CCGGGC GGC GGC GGT CTT CCG GAT GTT-3′3.  5′-GAT CAG TGA GAG TTG CAT ATG GACACG ACG GTG CCC ACC TTC AGC CTG-3′../..

4.  5′-CCC GGG TCT AGA TCT AGA CTA TGCCTT GGA TGT GCG GCG GAT GTT-3′5.  5′-GAG CTC TGT GAA TTC ACA GTG ACCGGT GAC TCT TTC-3′6.  5′-GGG AGC CAT ATG GAT GTC TGC TCAAGC GGG GTA GCT-3′7.  5′-AGA ACG GAT TAG TTA GTC TGA ATTCAA CAA GAA CGG CCA GAC-3′8.  5′-GAC AGA GGA TGT GAA GCA TAT GTGCTG CGG GTC GGA AGA TGG-3′9.  5′-ACA TCA ACA TCC GGA AGA CCG CCGCCG CCC GGT GAA GGC TCT TCA TGA-3′10. 5′-GGA CTA GTG TCG ACC CTG TCC ATCCTG AAA GAG TTG-3′11. 5′-ACA TCA ACA TCC GGA AGA CCG CCGCCG CCC GGC TTT GAA GGC TCT TCA-3′12. 5′-TTC GAT GTC AGC CTG GAC GGC GAGACC GCC ACG TTC CAG GAT TGG ATCGGG GGC AAC TAC GTG AAC ATC CGCCGC ACA TCC AAG GCA TGA AGG CTCTTC ATG ACG-3′13. 5′-GAT GTC AGC CTG GAC GGC GAG ACCGCC ACG TTC CAG GAT TGG ATC GGGGGC AAC TAC GTG AAC ATC CGC CGCACA TCC AAG CTA TGA AGG CTC TTCATG ACG-3′C1.大肠杆菌cefE表达质粒pMCTSE和pMCTNE的构建

在使用N.lactamdurans的染色体DNA和寡核苷酸1和2进行的第一个PCR中，获得作为0.9kb PCR产物的N.lactamdurans cefE开放读码框架，其含有5’—端的单—NdeI限制位点和3’—端的单—XbaI位点。PCR，2：带棒链霉菌cefE

在使用带棒链霉菌的染色体DNA和寡核苷酸3和4的第二个PCR中，获得作为0.9kb PCR产物的带棒链霉菌cefE开放读码框架，它也含有5’—端的单一NdeI限制位点和3’—端的单一XbaI限制位点。

为了cefE基因在大肠杆菌中获得表达及通过DNA序列分析表征PCR产物，将PCR产物1和2克隆在载体pMCTNde中，该质粒为pMC—5的衍生物(Stanssens等，Nucleic Acids Res.17(1989)，4441)。通过插入编码tac启动子的片段从pMC 5—8(欧洲专利申请No.0351029)衍生得到质粒pMCTNde，tac启动子后有RBS位点和NdeI克隆位点(图3)

PCR产物1和2用NdeI和XbaI消化，并连接到经NdeI—XbaI消化的载体pMCTNde中。连接混合物用于转化大肠杆菌WK6。选择对氯霉素有抗性的转化子。这些转化子用于分离质粒DNA。先通过限制酶消化产生预期的限制片段来分析cefE表达盒的插入。最后通过自动DNA序列分析来分析含有预定限制酶位点的质粒。

质粒pMCTSE(图2)中带棒链霉菌cefE开放读码框架的DNA序列与文献公开的序列(kovacevic，见上)具有100％的一致率。

含有N.lactamdurans cefE开放读码框架的、所分析的所有克隆的DNA序列(图8)与文献公开的序列(coque，同上)不同。

文献公开的N.lactamdurans cefE基因对应的氨基序列在第41个氨基酸位为脯氨酸(见SEQ ID No.14)。在PCR1所得克隆中没有该脯氨酸。此质粒被称为pMCTNE(图1)。

C2.产黄青霉cefE表达质粒的构建PCR，3：gpdA启动子

在此第三个PCR中，使用pAN—1质粒DNA(Punt等，Gene 56(1987)，117—124)和寡核苷酸5和6，所述质粒DNA含有A.nidu-lans gpdA启动子控制下的大肠杆菌hph基因，作为0.9kb的PCR产物获得了gpdA启动子，其在5’端含有单一EcoRI制限位点，在3’—端含有单一NdeI位点。PCR，4：AT启动子

在第四个PCR中，使用产黄青霉的染色体DNA和寡核苷酸7和8获得1.5kb的AT启动子片段，它在5’—端含单一EcoRI限制位点，在3’—端含有单一NdeI位点。PCR，5：AT终止子和N.lactamdurans cefE基因的3’—末端

在第5个PCR中，使用产黄青霉染色体DNA及分别用寡核苷酸9＋10，11＋10获得0.5kb的pen DE(AT)终止子区。从而这些PCR产物含有cefE基因的3’—端序列，其有或无微体靶向信号序列，该信号序列由C—末端氨基酸序列ARL组成(Muller等，Biochem-ica et Biophysica Acta 1116(1992)，210—213)。

设计寡核苷酸使PCR产物5’—端引入单一BspEI位点，在PCR产物3’—端引入speI位点。PCR，6：AT终止子和带棒链霉菌基因的3’—末端

在第6个PCR中，用产黄青霉的染色体DNA及分别用寡核苷酸12＋10，13＋10获得0.5kb的penDE(AT)终止子区。这些PCR产物从而含有带或不带微粒靶向信号序列的带棒链霉菌cefE基因的3’—末端，该信号序列由C—末端氨基酸序列SKL组成(De Hoop等，Biochem.J.286(1992)，657—669)。

设计寡核苷酸使得在PCR产物5’—端引入单一BglI位点，在PCR产物3’—端引入单一SpeI位点。

为了使cefE基因在产黄青霉中获得表达，将gpdA启动子和AT启动子片段连接到来自质粒pMCTNE和pMCTSE的cefE片段上。将这些连接后的片段克隆到载体pBluescriptII KS中。

用EcoRI和NdeI消化PCR3产物。pMCTNE和pMCTSE用NdeI和XbeI消化。通过琼脂糖凝胶电泳分离限制片段。从琼脂糖凝胶纯化0.9kb的cefE编码片段。将EcoRI—NdeI启动子片段与NdeI—XbaIcefE片段一起连接到用EcoRI—XbaI消化后的载体pBluescript II KS中。这样就得到下列质粒：pGSE和pGNE。

为了获得cef基因在产黄青霉中的最佳表达，我们选择在上述青霉表达质粒中cefE基因后克隆AT终止信号序列。GNETA-pGNEWA

pPCR5产物用Bsp EI和SpeI消化并连接到BspEI和SpeI消化的载体pGNE中。连接混合物用于转化大肠杆菌HB101。选择氨苄青霉素抗性转化子。从这些转化子分离到的质粒通过限制片段分析随后经DNA序列分析来表征。这样就得到下列质粒：pGNEWA和pGNE-TA(图4)。pGSETA-pGSEWA

PCR 6产物用BglI和SpeI消化并连接到BglI和SpeI消化的载体pGSE中。连接混合物用于转化大肠杆菌HB101。选择氨苄青霉素抗性转化子。从这些转化子分离的质粒也通过限制片段分析和随后经DNA序列分析进行表征。这样得到下列质粒：pGSEWA和pGSETA(图5)。pANETA、pANEWA和pASETA和pASEWA

质粒pGNETA、pGNEWA、pGSETA和pGSEWA用EcoRI和NdeI消化。经琼脂糖凝胶电泳分离限制片段，并从该凝胶纯化4.5kb的片段。

PCR4产物用EcoRI和NdeI消化并与上述纯化的片段连接。连接混合物转化至大肠肝菌HB101后，选择氨苄青霉素抗性转化子。

让转化子生长并分离其质粒，经限制片段分析再用DNA序列分析来表征。这样获得目标构建物，即pANETA(图6)、pANEWA、pASETA(图7)和pASEWA。d.产黄青霉的转化

使用Ca—PEG介导的原生质体转化方法。

按照Cantoral(见上)、Gouka等(J.Biotechn.，见上)和Gouka等(Appl.Microbiol.Biotechnol.见上)描述的步骤，总质粒或纯化的cefE表达盒(无大肠杆菌载体序列)用于转化产黄青霉的菌株，分别用pyrG、niaD、facA或amdS(Beri等，Curr.Genet.11(1987)，639—641)基因作为选择标记。

通过使用纯化形式的同源性pyrG，niaD或facA选择标记(不含大肠杆菌载体序列)，获得转化的产黄青霉菌株，它们不含细菌抗性基因。

欧洲专利申请No.94201896.1描述了获得无选择标记基因的重组菌株的方法。该方法被成功地用于含有A.nidulan与amdS基因作为显性选择标记的产黄青霉转化子。

这样仅有的外源性质元件是0.9kb的cefE编码区和可能的0.9kb的gpbA启动子区。e.转化子的分析

通过在选择性培养基上重复培养来纯化产黄青霉转化子。单一的稳定菌落用于制备琼脂倾面以产生孢子并筛选含有cefE表达盒的转化子。将从琼脂板上转化子得到的新生菌丝体片段煮沸，用于获得足够的模板DNA，以利用PCR技术有效地筛选存在cefE基因的数百个转化子。(Seth，Fungal Genetics Conference，Asilomar(1991)，在Fungal Genetics Newsletter 38，55中的摘要)。通过这一操作估价了转化子的效力。

还用生物检测进行了转化子筛选。转化子在含有所选侧链前体的琼脂培养基上生长。大肠杆菌ESS 2231用作琼脂涂层中的指示细菌，该琼脂层还含有Bacto penase以能够按本领域熟知的方法区别青霉素和头孢菌素产物，这些方法例如描述在Guttierez等，Mol，Gen.Genet.225(1991)，56—64中。

如d.节所述，用孢子接种产黄青霉培养基。在25℃培养72小时后，从菌丝体分离染色体DNA。用识别6bp序列的限制酶如EcoRI或PstI消化该DNA。

用琼脂糖凝胶分离DNA片段，并印在基因筛选尼龙膜上(NewEngland Nuclear)。用作cefE基因序列之探针的³²P标记PCR 2产物与Southern印迹杂交。用市场供应的标记试剂盒(BoehringerMannheim)，在α³²P dCTP存在下通过随机引物标记达到纯化的PCR2产物的标记。

检测含cefE编码序列的转化子对cefE基因产物的表达，本文称为扩环酶活性。

在青霉素生产培养基中培养选择的转化子(见实施例2)。

在一时间参数的试验中，发酵48、72和96小时后取菌丝体样品。制备菌丝体萃取物并测定粗萃取物中的扩环酶活性，基本按Rollins等在Can.J.Microbio1.34(1988)，1196—1202中所述方法进行。按Alvarez等在Antimicrob.Agent Chem.31(1987)，1675—1682中所述方法，测定具有扩环酶活性的转化子的酰基转移酶活性。

通过这些分析，选择了具有不同水平酰基转移酶和扩环酶酶活性的转化子，以发酵生产7—ADCA衍生物。实施例22—(羧乙硫基)乙酰—和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA的发酵生产和分离

产黄青霉株Wisconsin 54—1255(ATCC 28089)用实施例1中所述DNA构建物之一转化，并以2×10⁶分生孢子/ml接种在下列组成的种子培养基中(g/l)：葡萄糖，30；(NH₄)₂SO₄，10；KH₂PO₄，10；痕量元素溶液I(MgSO₄·7H₂O，25；FeSO₄·7H₂O，10；CuSO₄·5H₂O，0.5；ZnSO₄·7H₂O，2；Na₂SO₄，50；MnSo₄·H₂O，2；CaCl₂·2H₂O，5)，10(ml/l)(消毒前pH6.5)。

该种子培养物在25—30℃孵育48—72小时，然后用于接种10—20体积的生产培养基，其含有(g/l)乳糖，80；麦牙糖，20；CaSO₄，4；脲，3；MgSO₄·7H₂O，2；KH₂PO₄，7；NaCl，0.5；(NH₄)₂SO₄，6；FeSO₄·7H₂O，0.1；3’—羧甲基硫基丙酸，5；痕量元素溶液II(CuSO₄·5H₂O，0.5；ZnSO₄·7H₂O，2；MnSO₄·H₂O，2；Na₂SO₄，50)，10(ml/l)(消毒前pH5.5—6.0)。然后继续孵育96—120小时。

生产发酵结束后，通过离心或过滤除去菌丝体，在反相柱上用高压液相色谱(HPLC)分析2—(羧乙硫基)—乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA。HPLC仪使用Beckman System Gold，由126型程序化溶剂系统、507型自动进样器、168型二极管阵列检测器和System Gold数据系统(5.10)组成。固定相使用两个串联的Chromspher C18圆柱型柱(100×3mm，Chrompack)。流动相：以0.5ml/min的流速15分钟内由100％0.07M pH4，8磷酸缓冲液到25％乙腈和75％pH4.8磷酸缓冲液的线性梯度。用合成的2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA作为参照物，在260nm对2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA的产率进行定量。

比较联机UV和NMR光谱证实了峰的鉴定。

过滤发酵液后，向滤液中加入约0.1体积的1—丁醇。用稀盐酸调节pH值至2，在室温搅拌此混合物5分钟。分离后，将有机层蒸发进一步用于化学脱酰化(实施例3)或用0.33体积pH8的水反萃取并进一步用于酶促脱酰化(实施例4和5)。实施例32—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA的脱酰化

室温下向3g(8mmol)2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA的混合物中加入3.5ml(36mmol)N，N—二甲基苯胺，13ml二氯甲烷和2.6ml(21mmol)三甲基氯代甲硅烷。搅拌30分钟后，将此反应混合物冷却至约-50℃，并一次加入1.8g(8.5mmol)五氯化磷。保持温度在-40℃计2小时，然后冷却反应混合物至-65℃。然后用12ml(137mmol)异丁醇处理，加入速度应使温度不超过-40℃。再搅拌2小时后，将此溶液倾入15ml水中，然后立即加入5ml 4.5N氨水。慢慢加入固体碳酸氢铵调节pH至4。冷却至5℃后，过滤混合物，7—ADCA结晶用5ml丙酮水溶液(1∶1)洗涤并分离。实施例4用假单胞菌SY77酰化酶突变体对2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA进行酶促脱酰化

使用特异性酰化酶在一步酶反应中进行2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA的转化，该酰化酶从假单胞菌SY77酰化酶经区域定向诱变衍生而来。EP—A—0453048中描述了关于提高了对2—(羧乙硫基)乙酰和3—(羧甲硫基)丙酰侧链活性的假单胞SY77酰化酶突变体的构建和鉴定。在此突变体中，假单胞菌SY77酰化酶α—亚单位中178位的酪氨酸已被组氨酸替代。过滤收集产生该突变酰化酶的大肠杆菌细胞并重悬于含140mM NaCl的10mM pH7.4的磷酸缓冲液中。然后超声破坏这些细胞。除去细胞碎片后，收集含酰化酶活性的上清液。通过一系列色谱步骤进一步纯化该酰化酶：(1)在快流型Q—Sepharose上于pH8.8的离子交换色谱；(2)在苯基—Sepharose上的疏水作用色谱；和(3)在Sephacryl S200HR柱上的凝胶渗透色谱。

将纯化的酰化酶固定在由明胶和脱乙酰壳多糖混合物组成的颗粒上。在临加入酶之前用戊二醛处理这些颗粒。

在一有搅拌装置的池形反应器中进行2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA的转化。首先将头孢菌素水溶液加入反应器中，然后在恒定搅拌下将溶液温度升至30℃，用氢氧化钾将pH固定在8。然后加入固定化酶开始转化。在转化过程中持续记录反应器中的pH并保持在8。反应中释放的3’—羧甲硫基丙酸用KOH滴定。将加入的KOH量积分化并在平板记录仪上记录。从反应器中取样并如实施例2中所述HPLC方法分析2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA及7—ADCA以监测此转化反应。

反应完成后，过滤去除固定化酶，调节滤液pH至1并加入乙酸丁酯。分离各层，调节含7—ADCA之水相的pH至3。滤出结晶的7—ADCA。实施例5用假单胞菌SE 83酰化酶对2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA进行酶促脱酰化

按实施例4中方法进行2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA的转化，但使用假单胞菌SE83酰化酶作为酰化酶，得到相同结果。