用于固定生物催化剂的载体、固定的生物催化剂及固定生物催化剂的方法

摘要

一种用于固定生物催化剂的载体，是通过将N，N-二烷基丙烯酰胺与阳离子丙烯酰胺单体及水溶性交联单体共聚获得的；一种固定的生物催化剂，是通过将生物催化剂截留在所发明的载体中获得的。

说明书

本发明涉及一种用于固定生物催化剂的载体、一种通过将生物催化剂截留在载体内获得的固定的生物催化剂及一种固定生物催化剂的方法。

当生物催化剂在工业规模上应用时，为了防止从生物催化剂中洗脱出杂质，改进生物催化剂与反应产物的分离性能，改进生物催化剂的重复使用性能，提生物催化剂中酶的稳定性，及实现生产流程的连续操作，它们通常是以固定的形式使用的。

生物催化剂的固定是通过载体结合方法、交联方法、截留（entrapping）固定方法等实现的（参看T.Hattori和C.Frusaka的J.Biochem.，Vol.48，PP.831（1960））。所有这些方法中截留固定方法是最有利的，生物催化剂漏失小，而且固定过程引起的生物催化剂的活性下降也小，这是因为生物催化剂和载体不是相互联结的。再者，该方法能够用在多种生物催化剂的固定上。

用于生物催化剂截留固定的载体中已知的实例包括合成高聚物，如聚丙烯酰胺，聚乙烯醇，聚氨基甲酸酯，胶原（蛋白），光固化树脂等，及天然高聚物，如角叉（菜）胶（Carrageenan）、藻酸、琼脂糖，淀粉、动物胶（gelatin）等（参看US4，526，867）。与天然高聚物比较，通常合成高聚物强度高，耐用性和抗生物降解性优良。其中，聚丙烯酰胺的使用最为频繁，因为在工业上价廉，有高的聚合强度，在聚合时所引起的生物催化剂的失活较小（参看US4，421，855和I.Chibata，T.Tosa和T.sato的Appl.Microbiol.Vol.27，PP.878（1974）。

此外，为降低通过截留固定方法获得的以聚丙烯酰胺为基的固定的生物催化剂的溶胀和降低在反应时催化剂的失活，有人提出了一种方法，即使丙烯酰受，一种阳离子烯属不饱和单体与一种水溶交联单体进行共聚（参看JP-B-58-35078;这里“JP-B”指已审查的日本专利申请）。

然而，通过截留固定方法获得的以聚丙烯酰胺为基的固定的生物催化剂通常是浸泡在缓冲溶液或类似物的水溶液中存放，这是因为当它们暴露于空气的氧化中或干燥时，容易降低其活性。当贮藏持续一段较长时间时（例如，超过一个月），贮藏溶液和生物催化剂开始腐败，会产生令人讨厌的气味，贮藏溶液出现混浊，使得其活性降低以致于不能再作为催化剂使用。因此，它们的贮藏通常是将它们放到冷柜或向贮藏溶液中添加防腐剂来进行的。

然而，当以工业规模最大量使用生物催化剂时，冷贮方法的设备和使用等，需要很高的成本，而在另一方法中，向贮藏溶液中添加防腐剂，会使防腐剂渗入到固定生物催化剂中去，从而使得实际应用中产品质量下降。

特别是在工业上应用固定的生物催化剂时，解决以上问题十分重要。

本发明的发明人对生物催化剂的固定方法的开发进行了创造性的研究，使它不仅具有现有技术中以聚丙烯酰胺为基的载体的优点，同时还具有优良的贮藏性能。其结果是发现了使用一种特殊的共聚物能十分有效地解决前面提到的问题。本发明就是基于这一发现来完成的。

因此，本发明包括一种用于生物催化剂固定的载体，它是通过用通式（Ⅰ）所代表的第一单体与阳离子丙烯酰胺单体及水溶性交联单体的共聚得到的，两者都能与第一单体进行共聚。

其中R₁和R₂每一个代表一个甲基或乙基;一种通过将生物催化剂截留在用于生物催化剂固定的载体中而获得的固定的生物催化剂;还有一种固定生物催化剂的方法。

本发明的另外一些目的及优点将随本发明的进一步的描述而变得越来越明显。

前述的通式（1）所代表的化合物的实例包括N，N-二甲基丙烯酰胺，N，N-二乙基丙烯酰胺，及N-甲基-N-乙基丙烯酰胺，它们可以单独使用，或以两种或多种的混合物使用。

能与通式（1）的单体共聚的阳离子丙烯酰胺单体的实例包括N，N-二烷基氨基烷基甲基丙烯酰胺，N，N-二烷基氨基烷基丙烯酰胺及其四元化合物，如N，N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺，N，N-二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺，N，N-二乙氨基丙基甲基丙烯酰胺，N，N-二乙基氨基丙基丙烯酰胺及其四元化合物。

水溶性交联单体的实例包括N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，N，N′-亚甲基双甲基丙烯酰胺，N，N′-（1，2-二羟基亚乙基）-双丙烯酰胺，1，3-二-丙烯酰胺甲基-2-咪唑酮，二丙烯酰胺甲基亚乙基脲，二丙烯酰胺甲基醚，乙二醇二丙烯酸酯，乙二醇二甲基丙烯酸酯，六氢-1，3，5-三酰基-S-三嗪，2，2-双（丙烯酰胺）-乙酸及类似物。其中，N，N′-亚甲基-双丙烯酰胺，N，N′-亚甲基双甲基丙烯酰胺，N，N′-（1，2-二羟基亚乙基）双丙烯酰胺，1，3-二丙烯酰胺甲基-2-咪唑酮和二丙烯酰胺甲基亚乙基脲是特别优选的。

以这些单体的总量为基准，通式（1）的单体的用量约70-99.8wt%，优选80-99wt%，阳离子丙烯酰胺单体的量约0.1-10wt%，优选0.5-10wt%，水溶性交联单体的量约0.1-20wt%，优选0.5-10wt%。

必要时，能与通式（1）所示单体共聚的水溶性单体的用量可为约0.1-10wt%。

要通过截留固定在前面提到的固定载体中的生物催化剂的实例包括酶，微生物，细胞器，动物和植物细胞，它们可以是纯化的或破裂的形式，对它们的来源或形态没有特别的限制。例如，包括细菌、放线菌、酵母菌、真菌等的任何属的微生物都可以使用。如它们可以属于以下的属：短颈细菌属、棒状杆菌属、红球菌属（Rhodococcus）、Gordona、弧菌属、亚硝单胞菌属、链球菌属、乳（酸）杆菌属、杆菌属、定氮菌类、诺卡（放线）菌属、酵母菌属、内孢霉属、曲霉属、青霉属、毛霉菌属、根霉菌属等等。

本发明的固定的生物催化剂可以这样制备，如，将单体混合物添加到生物催化剂的悬浮液中，再向悬浮液中添加如过硫酸钾和N，N，N′N′-四甲基亚乙基二胺的常用聚合抑引发和加速剂，然后将所得混合物在PH为约5-10，优选6-8，温度为约0-50℃，优选0°-35℃下保温15-120分钟，进行聚合和胶凝。

在聚合后的凝胶中生物催化剂的含量随所用生物催化剂的种类、形态等而变化，但含量一般在约0.1-40wt%的范围内，优选1-20wt%。在聚合反应溶液中单体的含量一般在约2-30wt%的范围内，优选5-15wt%。

这些固定的生物催化剂可以做成如颗粒、薄膜、平板状等任何形状。

使用本发明的生物催化剂固定载体可以制备具有优良的贮藏稳定性，同时具有良好强度及与现有技术中以高聚物为基的载体，特别是以聚丙烯酰胺为基的载体相似的优点的固定的生物催化剂。本发明的固定的生物催化剂在常温下即使贮藏一个月以后也不会腐败，所以十分稳定。

下面的实施例用来进一步描述本发明。应当理解，这些实施例的目的仅在于详细描述，而不是限定本发明。术语“份”和“%”除特别声明外均是以重量为基础的。

实施例1

红球菌属的Rhodochruos菌株J-1（FERM BP-1478）是在有氧条件下培养的，所得细胞经洗涤和浓缩以制备用来固定的细胞悬浮液（15%的干细胞）。16份50mM的磷酸钾缓冲溶液（PH 7.0，以下相同）和10份包含有92%的N，N-二乙基丙烯酰胺，3%的N，N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺及5%的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的单体混合物的溶液加到在冰浴中冷却的70份浓缩细胞悬浮液中。在冰浴中连续搅拌该混合物以得到均一的悬浮液。加入2份10%的N，N，N′N′-四甲基亚乙基二胺的水溶液和2份10%的过硫酸钾的水溶液，然后在35℃或更低的温度下保温1小时，进行聚合和胶凝。如此获得的固定细胞块切成小的颗粒，用水洗涤，作为固定细胞的样品来评估。

将1份20g如此制备的样品浸渍于盛在聚乙烯瓶中的80g0.5%的硫酸钠水溶液中，从瓶密封后算起在30℃贮存一个月后，没有发现表观上的变化，微生物的污染十分低。

比较例1

作为比较，用丙烯酰胺为基的固定载体制备一份固定化细胞的样品。

1份50mM磷酸钾缓冲溶液（PH7.0）和25份含有92%丙烯酰胺，3%N，N-二甲基胺基丙基甲基丙烯酸酯和5%N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的单体混合物的40%的水溶液加到70份浓缩细胞悬浮液中，再向混合物中加入2份10%的N，N;N′，N′-四甲基亚乙基二胺水溶液和2份10%的过硫酸铵水溶液。然后以与实施例1相同的方式进行聚合和洗涤。

将所制备的样品以与实施例1相同的方式浸渍在0.5%的硫酸钠水溶液中，并在30℃下贮藏一个月。可以观察到相当多的污染的微生物的明显生长，并产生强烈的腐臭味及混浊。

实施例2-6和比较例2-6

改变单体及生物催化剂的种类和浓度制备固定的生物催化剂，并进行评估，其方式与实施例1和比较例1相同，结果示于表1中。

在实施例2-4及比较例2-4中，固定的生物催化剂浸渍在100mM磷酸钾缓冲溶液中（PH7）在30℃下贮藏一个月，而在实施例5和6及比较例5和6中是浸渍在0.9%的氯化钠溶液中在30℃下贮藏一个月。

根据浸渍溶液中发生臭味和出现混浊的级别判断腐败的程度。

在表中，评估的结果分5级，0表示浸渍溶液没有腐败臭味或混浊，4表示最大的腐败臭味或混浊。

表1

单体  生物催化剂  腐败

试验号  名称  比率  浓度.  菌株  浓度  臭味  混浊

(%)  (%)  (%)

实施例2

N,N-二甲基丙

烯酰胺  92

N,N-二甲基氨

基丙基甲基丙  红球菌属

烯酰胺  5  10  sp.EA4  10  0  0

(FERM P-12136)

N,N'-亚甲基双

丙烯酰胺  3

比较例2.

丙烯酰胺  92

N,N-二甲基氨

基丙基甲基丙  红球菌属

烯酸酯  5  10  sp.EA4  10  3  4

N,N'-亚甲基双  (FERM P-12136)

丙烯酰胺  3

实施例3

N,N-二乙基丙

烯酰胺  95

N,N-二甲基氨

基丙基甲基丙

烯酰胺的四元  棒状杆菌属

化合物  1  10  sp.N-771  8  0  0

N,N'-亚甲基双  (FERM BP-959)

丙烯酰胺  4

比较例3

丙烯酰胺  95

N,N-二甲基氨

基丙基甲基丙  棒状杆菌属

烯酸酯  1  10  sp.N-771  8  3  4

N,N'-亚甲基双  (FERM BP-959)

丙烯酰胺  4

实施例4

N,N-二乙基丙

烯酰胺  92

N,N-二甲基氨  Gordonaterrae

基丙基甲基丙  2  8  MA-1  5  0  0

烯酰胺的四元  (FERM BP-4535)

化合物

N,N'-亚甲基

双丙烯酰胺  6

表1(续)

单体  生物催化剂  腐败

试验号  名称  比率  浓度  菌株  浓度  臭味  混浊

(%)  (%)  (%)

比较例4

丙烯酰胺  92

N,N-二甲基氨  Gordona terrae

基丙基甲基丙  2  8  MA-1  5  2  3

烯酸酯  (FERM BP-45350)

N,N'-亚甲基双

丙烯酰胺  6

实施例5

N,N-二甲基丙

烯酰胺  8

N,N-二乙基丙  诺卡放线菌属

烯酰胺  5  sp.N-775

N,N-二甲基氨  (FERM BP-961)

基丙基丙烯酰胺  5  10  8  0  0

N,N'-亚甲基

双丙烯酰胺  5

比较例5

丙烯酰胺  90

N,N-二甲基氨  诺卡放线菌属

基丙基丙烯酸酯  5  10  sp.N-775  8  3  3

N,N'-亚甲基  (FERM BP-961)

双丙烯酰胺  5

实施例6

N,N-二乙基丙  92

烯酰胺

N,N-二乙基氨  短颈细菌属

基丙基甲基丙  3  8  sp.R-312  4  0  0

烯酰胺  (FERM P-2722)

N,N'-亚甲基

双丙烯酰胺  5

比较例6

丙烯酰胺  92

N,N-二甲基氨  短颈细菌属

基丙基甲基丙  3  8  sp.R-312  4  2  3

烯酸酯的四  (FERM P-2722)

元化合物

N,N'-亚甲基

双丙烯酰胺  5

参照特别的实施例，已经对本发明进行了详细的描述。很明显，本领域内的普通技术人员可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种变化和修改。