用于同时诊断乙型和丙型肝炎的诊断试剂盒和诊断方法

摘要

本发明涉及一种用于同时诊断乙型肝炎和丙型肝炎的诊断试剂盒以及采用所述的诊断试剂盒的诊断方法。更具体地，本发明涉及一种包括乙型肝炎和丙型肝炎病毒抗原的用于同时诊断乙型肝炎和丙型肝炎的诊断试剂盒，以及采用所述试剂盒的诊断方法。

说明书

发明领域

本发明涉及一种用于同时诊断乙型肝炎和丙型肝炎的诊断试剂盒以及采用所述的诊断试剂盒的诊断方法。更具体地，本发明涉及一种包括乙型肝炎和丙型肝炎病毒抗原的用于同时诊断乙型肝炎和丙型肝炎的诊断试剂盒，以及采用所述试剂盒的诊断方法。

发明背景

一般说来，已知病毒诱发的肝炎是由各种肝炎病毒引起的，这些病毒包括甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、巨细胞病毒和Epstein-Barr病毒。

在这些病毒中，乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝DNA病毒并已知可引起包括肝癌在内的各种肝病。HBV具有3.2kb双链DNA，其包括编码包膜蛋白的S基因、编码核心蛋白的C基因、编码DNA聚合酶的P基因和编码未鉴别的X蛋白的X基因组成的4个开放读框(Garnem，D.等人，Ann.Rev.Biochem.，50,651-693(1987))。

包括HBV表面抗原、核心抗原和e抗原的HBV抗原已被用于诊断乙型肝炎，其是通过在HBV感染后检测血清中形成的抗体而进行。特别是核心抗原对于在初始阶段检测乙型肝炎很有用，因为抗核心抗原抗体在感染HBV后很快就会形成并且在几乎每一个被HBV感染的病人的血清中都可检测到；而且，表面抗原在确定乙型肝炎是否痊愈方面很有用，因为在乙型肝炎的恢复阶段发现有抗表面抗原抗体。

另外，已知在输血引起的肝炎中的70-80％是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的(Alter，H.J.等人，Lancet 2，838-841(1975)；Dienstag，J.L.等人，Seminar Liver Dis.，6，67-81(1986))；而且这种输血后肝炎通常会发展成肝硬化或肝细胞癌。所述的病毒是一种由一条RNA正链组成的RNA病毒并且由所述链的开放读框(ORF)产生一多蛋白前体(Choo，Q.L.等人，Science，244,359-362(1989)；Choo，Q.L，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88,2451-2455(1991))。

丙型肝炎病毒的基因结构与黄病毒或瘟病毒的基团结构相似(Miller，R.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci，87,2057-2061(1990)；Muraiso，K.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,172,511-516(1991))，并且以所述的关系为基础，推测丙型肝炎病毒的多蛋白从N末端到C末端依次由核心-包膜1(E1)-包膜2/非结构1蛋白(E2/NS1)-非结构2蛋白(NS2)-非结构3蛋白(NS3)-非结构4蛋白(NS4)-非结构5蛋白(NS5)(Choo，Q.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88,2451-2455(1991)；Takamizawa.A.等，J.Virol.65,1105-1113(1991)；Kato，N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87,6524-6528(1990))。

丙型肝炎病毒的感染可以通过用聚合酶链反应(PCR)直接从血样中检测丙型肝炎病毒RNA而进行诊断(Hosoda，K.等，Hepatology，15,777-781(1992)；Abe，K.，等，Hepatology，15，690-695(1992)；Alter，H.J.，Annals ofInternal Medicine 115，644-649(1991))，通过这种方法可以很容易地检测病毒RNA，即在感染后1到2星期内即可检测；然而由于需分析大量的样品，因此这种方法费用高，时间长。另一种诊断方法是例如通过使用C100-3蛋白的酶联免疫测定检测存在于血清样品中的抗丙型肝炎病毒抗体(Choo，Q.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，2451-2455(1991)；Kuo，G.等，Science，244，362-384(1989))。

然而，Contreras等人指出所述的使用ELISA的诊断方法对于患有除丙型肝炎以外的肝病，例如胆汁型肝硬化、自身免疫病、原因不明的肝硬化等的病人的血清经常会出现假阳性结果(Contreras，M.等，Lancet，2，505(1989)；Cash J.D.等，Lancet，2，505(1989))。Theilmann等人报道当用Ortho Diagnostic SystemsInc.的第一代诊断试剂和诊断方法诊断时，超过60％的患有类风湿关节炎的病人显示出HCV阳性信号(Lancet，335，1346(1990))。上述结果意味着使用ELISA的诊断方法可能会显示假阳性结果，因此也需要进行确证试验。

另外，美国的Chiron Co.和Ortho Diagnostic Inc.开发出一种采用重组免疫印迹测定法。(RIBA)确证用ELISA获得的诊断结果的改进的诊断方法，其中所述的改进的诊断方法包括将两个HCV特异性抗原SOD-5-1-1和SOD-C100-3印到硝酸纤维素膜上，使所述的抗原与取自丙型肝炎患者的血清反应，使抗原-抗体复合物与用过氧化物酶标记的抗人类IgG抗体反应，然后以每一抗原带的颜色强度为基础确定在血清中抗HCV抗体的存在与否。Baudart等人报道在取自副蛋白血症(paraproteinemia)病人的184个血清试样中用ELISA方法诊断出有28个试样呈HCV阳性，然而当用上述RIBA方法确证阳性血清试样时，只有1个试样诊断为阳性，3个试样留待确定(Lancet，336，63(1990))。

美国的Ortho Diagnostic Systems Inc.也报道了对抗HCV抗体具有改善的灵敏性的第二代RI BA诊断试剂(RI BA II)，其是通过向预先存在的第一代诊断试剂中加入核心抗原C22-3和非结构3抗原C33C而制备的。Vallari等人报道使用包括所述的C22-3、C33C和C100-3蛋白的诊断试剂的斑点免疫印迹测定法比仅使用C100-3蛋白的方法检测抗HCV抗体更早并且灵敏性更高(J.Clin.Microbiol.30(3)，552(1992))。

在大多数情况下，乙型肝炎和丙型肝炎是通过不同的诊断试剂盒和试样分别诊断的，其费用高并需大量试样，但现有方法的特异性和精确性却不令人满意。

本发明人致力于开发一种比现有的ELISA方法或RI BA方法具有更高的灵敏度和特异性的用于同时诊断乙型肝炎和丙型肝炎的诊断试剂盒和/或诊断方法。

本发明概述

因此，本发明的主要目的在于提供一种用于同时诊断乙型肝炎和丙型肝炎的诊断试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种使用所述的诊断试剂盒同时诊断乙型肝炎和丙型肝炎的诊断方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种诊断试剂盒，.其包括：包含丙型肝炎病毒的核心蛋白、非结构3蛋白、非结构4蛋白、非结构5蛋白和包膜蛋白一或多种抗原表位的一或多种HCV抗原蛋白，以及包含乙型肝炎病毒的核心蛋白和表面抗原蛋白的一或多种抗原表位的一或多种HBV抗原蛋白。

根据本发明的另一方面，提供了一种使用本发明的诊断试剂盒的用于同时诊断乙型肝炎和丙型肝炎的诊断方法。

附图的简要说明

本发明的上述和其它目的和特点将通过下述结合附图的优选实施方案的描述而更加清楚，其中：

图1显示了编码KHCV CORE14蛋白的核苷酸序列，以及由其编码的多肽氨基酸序列；

图2描述了编码KHCV897蛋白的核苷酸序列，以及由其编码的多肽的氨基酸序列；

图3描述了编码KHCV NS4蛋白的核苷酸序列，以及由其编码的多肽的氨基酸序列；

图4分别表示了编码KHCV EIG、KHCVE2A和KHCV E2E的核苷酸序列，以及由其编码的多肽的氨基酸序列；

图5显示了编码KHCV NS5-1.2蛋白的核苷酸序列，以及由其编码的多肽的氨基酸序列；

图6描述了HBV核心基因的核苷酸序列，以及由其编码的多肽的氨基酸序列；

图7代表编码一种HBV表面抗原的核苷酸序列，以及由其编码的多肽的氨基酸序列；

图8示出了一种表达载体，用于表达与遍在蛋白基因融合的编码KHCV CORE14蛋白和KHCV897蛋白的核苷酸序列；

图9A示出了在大肠杆菌细胞中分别表达编码KHCN UBCORE14蛋白和KHCV UB897蛋白的核苷酸序列后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)的结果；

图9B为使用丙型肝炎患者的血清对图9A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果；

图10示出了制备一种用于表达与遍在蛋白基因融合的编码KHCV NS4E蛋白的核苷酸序列的表达载体的制备策略；

图11A示出了在大肠肝菌细胞中表达编码KHCN UBNS4E蛋白的核苷酸序列后SDS-PAGE结果；

图11B为使用丙型肝炎患者的血清对图11A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果；

图12示出了用于连接编码KHCV E1G、KHCV E2A和KHCV E2E的DNA片段和遍在蛋白基因，以及制备用于表达连接的DNA(UBE1E2 DNA)的表达载体的策略；

图13A为UB E1E2 DNA在大肠杆菌细胞中表达后的SDS-PAGE的结果；

图13B为使用丙型肝炎患者的血清对图13A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果；

图14示意性的示出了用于表达一种编码包含遍在蛋白、KHCV NS4E蛋白和KHCV E1E2蛋白的UBNS4E1E2蛋白的重组DNA的表达载体的制备；

图15A为编码UBNS4E1E2蛋白的重组DNA在大肠杆菌细胞中表达后的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果；

图15B为使用丙型肝炎患者的血清对图15A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果；

图16示意性的示出了用于表达与遍在蛋白基因融合的编码KHCV NS5-1.2蛋白的核苷酸序列的表达载体的制备；

图17A为编码KHCV UBNS5-1.2蛋白的重组DNA在大肠杆菌细胞中表达后的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果；

图17B为使用丙型肝炎患者的血清对图17A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果；

图18示意性示出了用于表达HBV CORE基因和一种遍在蛋白基因的融合基因(UB HBV CORE DNA)的表达载体的制备；

图19A为UB HBV CORE DNA在大肠杆菌细胞表达后的SDS-PAGE结果；

图19B为使用乙型肝炎患者的血清对图19A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果；

图20示意性示出了用于在酵母细胞中表达编码HBV表面抗原的DNA片段的表达载体的制备；

图21示出了编码HBV表面抗原的DNA片段在酵母细胞中表达后的SDS-PAGE结果；以及

图22示出了使用本发明的诊断试剂盒、采用免疫印迹测定法对血清样品的诊断结果。

本发明的详细描述

本文中所引述的所有文献的全文均作为参考文献。

本文中所用的下述术语应具有下述含意；

术语“丙型肝炎病毒”是指引起非甲非乙型肝炎或丙型肝炎的病毒。术语HCV和丙型肝炎病毒在本文中可交替使用。

术语“Korean -1ype丙型肝炎病毒”或“KHCV”是指从韩国丙型肝炎患者中分离出来的一种新型HCV，其cDNA具有一个编码所述氨基酸序列的核苷酸序列的开放读框，其中第842、849和853个氨基酸分别为苯丙氨酸、亮氨酸和苏氨酸；或者为亮氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸。

术语“抗原表位”是指一种多肽的抗原决定簇，其能够在免疫活性宿主体内引起免疫反应和/或能够自身特异性的与一种互补抗体结构。本发明的抗原表位通常至少由6个氨基酸组成，优选由7或8个氨基酸组成。

本文中所用的其它术语具有与现有技术所用的相同的和传统的含义。

下文中HCV cDNA的核苷酸序号或HCV蛋白的氨基酸序号是基于韩国专利公开出版物93-683号公开的全KHCV核苷酸序列或氨基酸序列。

以下将更详细地描述本发明。1.HCV抗原蛋白的抗原表位的确定

HCV，例如KHCV(KHCV-LBC1，于1991年5月14日保藏在ATCC，保藏号为ATCC 75008，根据关于用于专利程序的微生物的保藏的国际承认的布达佩斯条约，见韩国专利公开出版物93-683号)的cDNA的核苷酸序列的信息被用于合成聚合酶链反应的引物，其相应于编码KHCV897蛋白、包膜1和包膜2蛋白或非结构5蛋白的cDNA片段的5’和3’末端。

用所述的引物以KHCV897基因(根据布达佩斯条约其在1991年6月27日被保藏于ATCC，保藏号为ATCC68640)、KHCV包膜基因(其在1991年12月11日被保藏于ATCC，保藏号为ATCC 68878、69866和74117)以及KHCV NS5基因(见韩国专利公开出版物93-683)为模板进行聚合酶链反应，以获得KHCV897基因、KHCV包膜1和包膜2基因以及KHCV NS5基因的cDNA片段。将每一cDNA片段插入一个载体，用所述的表达载体转化合适的宿主如大肠杆菌。将由转化的宿主细胞生产的多肽进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后使用丙型肝炎患者的血清进行蛋白质印迹分析，以确定那些特异性地与KHCV抗体反应的多肽为KHCV抗原的表位。也检测了被确定的抗原表位在KHCV cDNA全序列中的位置。

其结果是，发现KHCV897蛋白的抗原表位存在于KHCV897蛋白的羧基末端，其是从对应于KHCV cDNA的第4348到4713核苷酸的366个碱基对表达的(见图2所示的KHCV897蛋白的抗原表位的氨基酸和核苷酸的序列)。

对于包膜蛋白，发现表位存在于KHCV包膜1蛋白(E1G蛋白)的羧基末端，其是从对应于KHCV cDNA的第1201到1509核苷酸的309个碱基对表达的；以及存在于KHCV包膜2蛋白(E2A蛋白)的氨基末端，其是从对应于KHCV cDNA的第1510到1749核苷酸的240个碱基对表达的；以及存在于KHCV包膜2蛋白(E2E蛋白)的羧基末端，其是从对应于KHCV cDNA的第2281到2529核苷酸的249个碱基对表达的(见图4示出的KHCV E1G、KHCV E2A和KHCV E2E蛋白的氨基酸序列和编码这些蛋白的核苷酸序列)。

另外，NS5蛋白的抗原表位存在于NS5蛋白的氨基末端，其是由对应于包括KHCV403 cDNA片段的第6649到7284核苷酸的1200个碱基对编码的，并以比KHCV403更高的灵敏度特异性地与KHCV患者的血清反应。

2、包括一或多个HCV抗原表位的重组蛋白

HCV或HBV抗原的表位对于开发有效和经济的诊断试剂是非常重要的。具体说来，考虑到经济、效果及精确度更优选的是包含一或多个抗原表位的融合蛋白；包含多于一个抗原表位的融合蛋白是最优选的。

作为包含多于一个HCV表位的HCV重组蛋白，优选的是可以包括含有KHCV核心蛋白和NS3蛋白的表位的重组KHCV CORE518融合蛋白，以及含有KHCV E1、E2和NS4蛋白的表位的重组KHCV NS4E1E2融合蛋白。

这些重组蛋白可以通过含有编码所述的融合蛋白的核苷酸序列的各种表达载体系统进行制备；并且该载体可调控包含所述的融合蛋白和其它可增加蛋白表达率的特异性蛋白，优选为遍在蛋白的重组融合蛋白的生产。包含遍在蛋白和KHCV融合蛋白的重组融合蛋白可以用于本发明的用途，只要其含有KHCV蛋白的必要特征例如HCV抗原性即可。

上述的表达体系可以有效地用于所需的蛋白不稳定以及可被宿主细胞的蛋白酶很容易地消化的场合，因为遍在蛋白可保护所需的蛋白不被蛋白酶攻击或稳定所需的蛋白。另外，与遍在蛋白融合的所需重组蛋白的表达可以用抗遍在蛋白抗体确定，并利用遍在蛋白的特性而很容易地被纯化。3、HBV抗原蛋白

采用例如在韩国专利文献90-5959中公开的乙型肝炎病毒cDNA的核苷酸序列信息制备乙型肝炎病毒核心抗原和表面抗原，这两种抗原分别包含一或多种抗原表位。HBV核心抗原和表面抗原(Pre S2 S Ag)的氨基酸序列分别示于图6和图7。由于现在已知有许多类型的HBV，因此在每种类型的HBV中HBV核心抗原和表面抗原的氨基酸序列可能会有轻微差别，其也可以被本发明采用。

可以通过采用各种表达载体系统表达编码一种HBV抗原蛋白的DNA片段来制备HBV抗原蛋白。编码HBV抗原蛋白的DNA片段可以例如通过采用合成引物利用PCR来制备，该合成引物分别与编码HBV核心抗原和表面抗原的cDNA片段的5’端和3’端对应。

HBV抗原蛋白可以以重组蛋白形式制备，该重组蛋白包含HBV抗原蛋白和其它可以增加蛋白稳定性或促进纯化步骤的特异性蛋白，优选为上述第2项所述的遍在蛋白。4、抗原蛋白质在微生物宿主中的表达

为了获得所希望的包含HCV或HBV表位的HCV或HBV蛋白，用含有编码HCV或HBV表位的HCV或HBV cDNA片段的表达载体转化一相容宿主细胞；在允许表达的条件下培养转化后的细胞。

合适宿主的选择受一系列公知因素的影响，这些因素包括，例如与所选择载体的相容性、由重组质粒编码的蛋白的毒性，回收所希望蛋白的容易程度、蛋白质特性、生物安全性及费用。必须均衡考虑这些因素，应该理解的是不是所有的宿主都同等有效地表达特定的重组DNA分子。

本发明中可使用的合适的宿主包括，但不限于，细菌如大肠杆菌和酵母如酿酒酵母。

在宿主细胞中生产的多肽可以通过结合使用传统方法，例如，细胞破碎，离心、透析、盐析、层析、凝胶过滤、电泳和电洗脱来分离和纯化。

本发明的多肽也可以通过合适的方法化学合成，如纯粹固相合成，部分固相方法，片段缩合或经典溶液合成。优选的是由Merrifield(J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963))公开的固相合成。

另一方面，已知会发生基本上不会改变生物学和免疫学活性的在蛋白质中的氨基酸取代并由Neurath等人描述于The Proteins，Academic Press，New York(1979)。只要由其产生的蛋白质保持相同的抗原特性，则这种功能上等价的氨基酸取代也包括在本发明范围内。

在本说明书中采用标准的单字母或三字母缩写表示核苷酸和氨基酸。这些缩写的含义可在标准的生物化学教科书如Lehninger，Principles of Biochemistry，Worth Publishers Inc.New York，pp.96，798(1984)中找到。

5、用于同时诊断乙型肝炎和丙型肝炎的诊断试剂盒和方法

根据本发明的诊断试剂盒包含至少一种含有一或多个HCV抗原表位的HCV抗原蛋白，优选包括KHCV NS4E蛋白、KHCV E1G蛋白、KHCV E2A蛋白、KHCV E2E蛋白、KHCV COREEPI蛋白、KHCV518蛋白和KHCVNS5-1，2蛋白；以及至少一种包含HBV核心蛋白或表面抗原蛋白的一或多个抗原表位的HBV抗原蛋白。

更优选地，本发明的诊断试盒包括以重组蛋白形式存在的HCV或HBV抗原蛋白，其中抗原表位与另一种蛋白，优选为遍在蛋白融合。

最优选地，本发明的诊断试剂盒可以包含KHCVCORE14蛋白、KHCV UB897蛋白、KHCV UBNS4E蛋白、KHCV UBNS4E1E2蛋白、KHCV UBNS5-1，2蛋白、HBV CORE蛋白和HBVS2 S Ag蛋白。因此，本试剂盒由于其能够检测用其它已知诊断试剂盒不能检测的HCV包膜蛋白的特异性抗体，所以其在检测HCV时可以给出更精确的诊断结果。另外，在本发明试剂盒中也包含HBV CORE蛋白和HBVS2表面抗原这一点使得可以在诊断丙型肝炎的同时诊断乙型肝炎。

在本发明的诊断试剂盒中所包含的每种抗原蛋白的量可以任意地调整，优选的是使用等摩尔量的每种蛋白。

在使用融合遍在蛋白抗原蛋白的情况下，遍在蛋白也包括在试剂盒中作为一对照蛋白。

另外，本发明的诊断试剂盒可以包含缓冲液、作为阳性对照的人免疫球蛋白、支持材料或其它可能需要的试剂，这取决于采用试剂盒的诊断方法。

对乙型肝炎和丙型肝炎的诊断可以通过用任何现有技术中公知的方法使用本发明的诊断试剂盒来进行，优选的是用免疫印迹测定。

本发明还涉及一种通过用免疫印迹测定法利用本发明的诊断试剂盒的诊断方法。本发明的诊断方法在用于检测肝炎患者的血清中的HBV和HCV抗体时比任何现存方法都更具有特异性和精确性，因此，其可以用作一种诊断丙型肝炎的诊断方法和确定丙型肝炎的试验以及用作同时诊断HBV和HCV的诊断方法。

采用抗原蛋白的诊断方法可以包含下述步骤：

第一、将一或多种HBV抗原蛋白和一或多种HCV抗原蛋白加到一固体支持物上，例如硝酸纤维素滤膜或微升加样孔，以使所述抗原蛋白吸附在所述材料的表面；

第二、将用稀释剂稀释的一种待测样品加到抗原复盖的固体支持物上，若血清中存在HBV抗体或HCV抗体，则会形成抗原-抗体复合体；

第三，向支持材料上加入一种酶，例如HRP(辣根过氧化物酶)，或碱性磷酸酶缀合的抗人IgG，以使该酶与在第二步形成的复合体中的抗体结合；以及

最后，向所述材料上加入酶的底物，例如过氧化物酶的底物邻苯二胺二盐酸(OPD)和过氧化氢以出现颜色反应。当被测血清中含有HCV抗体或HBV抗体时，由于酶与底物的反应而会出现特定的颜色。

颜色深度可用光密度计或微孔阅读器测量，以测定结果为基础可确定HCV抗体或HBV抗体的存在。

第一步所用的固相支持体可包括硝酸纤维素滤膜、乙烯膜和immobilon P^R，优选为硝酸纤维素滤膜。HBV抗原蛋白可以混合或单独地吸附到固体支持物上，HCV抗原蛋白也是如此。

优选地，采用本发明的诊断试剂盒的诊断方法包含下述步骤：

(A)用一封闭溶液处理吸附有纯化的人免疫球蛋白、KHCV UB CORE14蛋白、KHCVUB NS5-1，2、HBV CORE、HBVPre S2 S Ag和遍在蛋白的硝酸纤维素滤膜；

(B)将封闭后的滤膜与一支持膜平行相贴，切割膜以制备滤膜条，该滤膜条包括可形成8条蛋白带的等面积的每一个滤膜；

(C)将所述的滤膜条与一待测血清样品反应；

(D)将(C)中所得的滤膜条与用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体反应；

(E)加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的底物；以及

(F)在(E)中获得的滤膜条上呈现颜色反应后测定每一蛋白带的颜色深度。

在使用包含多于一种抗原表位的本发明的重组蛋白来制备诊断试剂的情况下，其可以获得比使用仅有一种抗原表位的现有抗原的情况更灵敏和更精确的诊断。另外，本发明的包含多于一种的包括多于一种HBV或HCV抗原表位的重组蛋白的诊断试剂盒显示了优异的诊断结果。

下述实施例是用于具体描述本发明而不是限制本发明，除非另有说明，实施例中的实验方法均根据下述的参考例而进行。

除非另有说明，下述的固固混合物的百分比、液液百分比和固液百分比分别以重量/重量、体积/体积和重量/体积为基础。参考例1：用限制性内切酶酶切DNA

在一灭菌的1.5ml eppendorf管中加入限制性内切酶和反应缓冲液，使反应体积在50-100μl之间，反应在37℃进行1-2小时。反应完成后，将反应混合物在65℃热处理15分钟(或在耐热内切酶情况下用苯酚抽提并用乙醇沉淀)以失活限制性内切酶。

本参考例中所用的限制性酶和反应缓冲液购自NEB(New Engand Biolabs，Jolla，MA，U.S.A.)。

用于限制性内切酶反应的10倍反应缓冲液的组成如下：

10×NEB反应缓冲液1：100mMbisTris丙烷-HCl，100mMMgCl₂，10mM二硫苏糖醇(DTT)，pH7.0

10×NEB反应缓冲液2：100mM Tris-HCl，100mM MgCl₂，500mMNaCl，10mM DTT，pH7.0

10×NEB反应缓冲液3：100mM Tris-HCl，100mM MgCl₂，1000mM NaCl，10mM DTT，pH7.0

10×NEB反应缓冲液4：200mM Tris-乙酸，100mM乙酸镁，500mM乙酸钾，10mM DTT，pH7.0参考例2：苯酚抽提和乙醇沉淀

酶与DNA反应完成后，反应混合物用苯酚抽提以失活酶或回收反应混合物中的DNA，其中所用的苯酚预先用含10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mM EDTA的缓冲液平衡。

苯酚抽提是如下进行的：通过剧烈振荡混合等体积的样品和苯酚；在15000rpm离心混合物5分钟；将水相转移至一新管中。重复上述步骤三次。

然后用等体积的氯仿(氯仿∶异丁醇＝24∶1)抽提上述水相并再分离出水相；向水相中加入0.1体积的3M乙酸钠和2.5体积的无水乙醇；在-70℃存放30分钟或-20℃存放12小时以上后在15000rpm、4℃下离心混合物20分钟以回收核酸。参考例3：连接反应

用购自NEB的T4DNA连接酶和10×连接反应缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH7.0，0.1M MgCl₂，0.2M DTT，10mMATP，0.5mg/ml小牛血清白蛋白(BSA))进行DNA的连接反应。反应体积通常为20μl，DNA粘性末端连接用10单位T4连接酶，DNA平末端连接用100单位T4 DNA连接酶。

反应在16℃进行5小时或在4℃进行14小时以上，反应完成后，将反应混合物在65℃加热15分钟以失活T4DNA连接酶。参考例4转化E.coli

E.coli菌株(例如E.coli HB101(ATCC33694)，E.coli W3110(ATCC27325)成E.coli JM105(ATCC47016))的转化是采用现有技术中公知的方法，例如，Maniatis等人在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，N.Y.(1982)中所述，或Cohen在Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A69,2110(1972)中所述。参考例5：寡核苷酸的合成

使用自动固相亚磷酰胺化学法利用一DNA合成仪(Applied Biosystems Inc.，型号：380B，U.S.A.)合成寡核苷酸。

用变性聚丙烯酰胺凝胶(2M尿素，12％丙烯酰胺和bis(29∶1)，50mM Tris，，50mM硼酸，1mM EDTA-Na₂)电泳和采用乙腈∶水(50∶50)作洗脱剂的C₁₈ SEP-PAK(Waters Inc.U.S.A)柱色谱纯化合成的寡核苷酸；通过在260nm测量O.D.确定核苷酸的量。参考例6：聚合酶链反应(PCR)

在10-100ng模板DNA、10μl 10×Taq聚合酶反应缓冲液(10mm Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mMMgCl₂，0.1％(w/v)明胶)、10μldNTP的混合物(dGTP、dATP、TTP和dCTP各为10mM)、2μg每个引物(通常反应中使用2个引物，当使用3个引物时位于中间的引物的用量为0.02μg)和0.5μl Ampli Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，U.S.A.)组成的混合物中加入适量的蒸馏水以使总体积为100μl，向其中加入50μl矿物油以保护反应混合物不被蒸发。

采用一种热循环仪(Perkin ElmerCetus，U.S.A.)进行PCR，热循环被设成重复25次或更多；所述的循环为：95℃1分钟→55℃1分钟→72℃2分钟，最后在72℃反应10分钟。

反应完成后用酚抽提混合物，用乙醇沉淀回收PCR产物，并将沉淀物溶于20μl TE缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5)。参考例7：HRP缀合的抗人IgG抗体的制备

用人IgG吸附的sepharose CL-4B亲和柱和蛋白G柱(Pharmacia LKB，Sweden)色谱纯化抗人IgG Fc区(Immunovision Inc.，Arizona，U.S.A.，Cat.No.GHF-1001)的抗体以使所述抗体的纯度超过90％。根据Nakane等在J.Histochemcytochem.22，1084(1974)中所述的高碘酸钠方法用辣根过氧化物酶标记所获得的抗体，方法如下：

在溶于1.2ml蒸馏水(DW)的5mg辣根过氧化物酶(Boehringer Mannheim，Germany，Cat.No.814,393)的溶液中加入0.3ml溶于100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)的0.1M高碘酸钠溶液，混合物在室温下反应20分钟。得到的溶液对1mM乙酸钠缓冲液透析16小时。

1.5ml得到的过氧化物酶溶液与以10mg/ml浓度溶有纯化抗体的1ml 20mM碳酸钠溶液(pH9.5)混合，混合物在室温下反应2小时。随后加入10μl溶于DW的硼酸氢钠溶液(4mg/ml)以通过一还原反应除去未反应的席夫斯碱。由此得到的溶液对磷酸盐缓冲的生理盐水透析过夜，随后过sephadex G-200柱以除去自由抗体或过氧化物酶。实施例1 制备KHCV UBCORE14和KHCV UB897蛋白

<步骤1>KHCV CORE14和KHCV897 DNA的扩增(1-1)制备引物

为了扩增KHCV CORE14和KHCV897 DNA(其分别由KHCV LBC1的第343-726核苷酸区和第3916-4713核苷酸区组成)和将它们克隆到在色氨酸启动子控制下包含遍在蛋白基因的E.coli表达载体上，合成下列引物：

PCOREUBI 引物：5′-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTATGAGCACGAATCCTAAACC-3′在5’末端包含与遍在蛋白基因3’末端重叠的25个核苷酸，以及KHCV-LBC1的第343-360核苷酸；

PSALCORE14 引物：5′-GGGGTCGACTATTAGCATGTGAGGGTGTGGATGAC-3′在KHCV-LBC1的第726核苷酸之后含有一翻译终止密码子，以及一个SalI识别位点；PK897SAL 引物：5′-GACTGGTCGACTATTAACACGTATTACAGTCGATCAC-3′在KHCV-LBC1第4713核苷酸后包含位于3′末端的两个翻译终止密码子(TAATAC)，以及一SalI识别位点；PK897UBI 引物：5′-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGCGGTGGAATTCATACCCG-3′含有与遍在蛋白基因3’末端重叠的位于5’末端的25个核苷酸，以及设计用来从KHCV-LBC1第3916核苷酸起始翻译的其它核苷酸。(1-2)聚合酶链反应

试管A中加入2μg PCOREUB1引物和2μg PSALCORE14引物，试管B中加入2μg PK897SAL引物和2μg PK897UB1引物，每个试管中各加入50ng KHCV-LBC1 DNA(ATCC 75008)，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl 2mM dNTP(12mM dGTP，2mM dATP，2mM TTP，2mM dCTP)，2.5单位Taq聚合酶，加入蒸馏水使总体积调至100μl。

向反应混合物中加入矿物油以防止蒸发，重复25次与参考例6中相同的热循环以进行PCR。(1-3)分离和纯化PCR产物

上述(1-2)中获得的产物进行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果证实试管A中约384bp DNA被扩增，试管B中约897bp DNA被扩增，用与(1-2)相同的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化所述的DNA片段并分别命名为K384片段及K897片段。<步骤2>制备遍在蛋白基因(2-1)制备引物

根据Ozkaynak等人在EMBO.J.，6，1429-1439(1987)中报道的遍在蛋白基因的信息设计下述3种不同的寡核苷酸并用一DNA合成仪合成：UBIl：5′-CCCCATATGCAAATTTTCGTCAAAACTCTAACAGGGAAGACTATAACCCT

      AGAGGTTGAATCTTCCGACACTATTGACAACGTCAA-3′UBI2：5′-TAGTTGCTTACCAGCAAAAATCAATCTCTGCTGATCCGGAGGGATACCTT

      CTTTATCTTTGAATTTTACTTTTGACGTTGTCAATAGTCTC-3′UBI3：5′-ACCACCGCGGAGTCTCAACACCAAGTGAAGAGTAGATTCCTTTTGGATGT

      TGTAGTCAGACAAGGTTCTACCATCTTCTAGTTGCTTACCAGCAAAAA-3′

UBI1设计成在5’末端具有NdeI识别位点(5’-CATATG-3’)并约有20个核苷酸与UBI2重叠；UBI2设计成具有SacII识别位点(5’-CCGCGG-3’)并且不会改变其所编码的氨基酸序列。(2-2)制备遍在蛋白基因

向2μg UBI1、0.02μg UBI2和2μg UBI3的混合物中加入1μl 10×PCR缓冲液、10μl 2mM dNTP混合物和2.5单位Taq聚合酶，加蒸馏水使总体积调至100μl，以与参考例6相同的方式进行PCR。将得到的混合物进行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳以分离约240bp DNA，其被命名为Ub片段，将分离到的片段溶于20μl TE缓冲液。<步骤3>制备表达载体(3-1)聚合酶链反应

准备2个试管，各含引物如下：

试管A：2μg UBI1引物和2μg PSALCORE14引物；以及

试管B：2μg UBI1引物和2μg PK897SAL引物。

向试管A中加入50ng K384片段和50ng UB片段作为模板，向试管B中加入50ng K897片段和50ng UB片段作为模板，再各加入10μl 10×聚合酶缓冲液、10μl 2mMdNTP和2.5单位Taq聚合酶，加蒸馏水使总体积调至100μl，向每个反应混合物中加入50μl矿物油以防止蒸发，重复25次参考例6中的热循环以进行PCR。(3-2)用限制性内切酶消化区段和载体DNA

在NEB缓冲液3中用NdeI和SalI完全消化上述(3-1)中得到的每种PCR产物。

在试管A和试管B中获得的片段分别被命名为KHCV UBCORE14和KHCV UB897。

在NEB缓冲液3中用PstI和SalI完全消化2μg ptrp 322H-HGH(见韩国专利公开91-457)，在NEB缓冲液4中用PstI和NdeI完全消化2μg该质粒。在0.7％琼脂糖凝胶上分离产物，分离到约1.5kb和0.86kb的片段，分别命名为PL和PT片段。(3-3)连接

使用上述(3-2)中制备的片段，进行如下连接反应：

连接试管A中加入100ng KHCV UBCORE14，连接试管B中加入100ng KHCV UB897。向每管中各加入100ng PL、100ng PT、2μl 10×连接缓冲液和10单位T4DNA连接酶，加入蒸馏水使总体积调至20l，反应在16℃进行12小时。分离每种连接后的载体，用其转化大肠杆菌HB101(ATCC33694)，分离含有UBCORE14片段的载体并命名为ptrpH-UB-CORE14，分离含有KHCV UB897片段的载体并命名为ptrpH-UB-KHCV897。<步骤4>KHCV UB CORE14 DNA和KHCV UB897·DNA的表达

用上述<步骤3>制备的每种质粒转化E.coli W3110(ATCC37339)细胞，其中用ptrpH-UB-KHCV897转化的E.coli W3110于1991年6月27日在ATCC保藏，保藏号为ATCC69640；用ptrpH-UB-CORE14转化的E.coli W3110于1991午7月1日在ATCC保藏，保藏号为ATCC68642，以上保藏是根据关于国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约进行的。

用质粒ptrpH-UB-CORE14和ptrpH-UB-KHCV897转化的E.coli W3110(ATCC37339)在含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基(6％Bacto胰化蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl)中于37℃振荡培养12小时。将5ml培养物接种到1l M9培养基(40mM K₂HPO₄，22mM KH₂PO₄)，8.5mM NaCl，18.7mM NH₄Cl，1％葡萄糖，0.1mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，0.4％酪蛋白水解物，10μl/ml维生素B1，40μg/ml氨苄青霉素)中，于37℃振荡培养3-4小时。当其650nm处OD值到达0.5时，向培养物中加入吲哚丙烯酸(IAA)使终浓度为1.4mM，5小时后以3000rpm离心所得培养物25分钟以收集E.coli细胞沉淀物。<步骤5>用丙型肝炎患者血清确定表达蛋白及其反应性

将上述<步骤4>中得到的每种细胞沉淀物悬浮于缓冲液中然后采用Laemmli方法(Nature，227,680(1970))进行15％SDS-PAGE以确定KHCV UB CORE14和KHCV UB897蛋白的表达。结果示于图9A中。

图9A中，泳道M代表标准分子量标记，即从上到下依次为72、43、29和18千道尔顿；泳道1为具有不含KHCV基因的质粒的E.coli的产物；泳道2为用ptrpH-UB-CORE14转化的E：coli的产物，其中产有约23kd的蛋白；泳道5为用ptrpH-UB-KHCV897转化的E.coli的产物，其中产有约40kd的蛋白；泳道3、4和6示出了其它的KHCV蛋白。

根据Towbin在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，76，4750(1979)中所述的方法将在凝胶上分离的蛋白印到硝酸纤维素滤膜(Bio-Rad Lab.，孔径0.22μm，CA，U.S.A)上。将滤膜放入含0.2％Tween20的PBS(10mM磷酸盐，pH7.0，0.15M NaCl)中，并在室温下振荡2小时以阻断IgG与蛋白的非特异性结合。将滤膜放入一IgG溶液中，该溶液是通过用200倍体积的含0.5％明胶和0.05％Tween20的PBS稀释从韩国HCV患者中纯化的IgG(8.2mg/ml)而制备的；在室温温和振荡1小时以使蛋白和IgG反应。随后用含0.2％Tween20的PBS洗滤膜4次，每次5分钟。将滤膜放入一抗人IgG抗体溶液中，该溶液是通过用200倍体积的含0.5％明胶和0.05％Tween20的PBS稀释用辣根过氧化物酶(Bio-Rad Lab.，CA，U.S.A.)标记的山羊抗人IgG而制备的；在室温下振荡1小时。用含0.2％Tween20的PBS洗滤膜4次，每次5分钟，然后用50mM Tris缓冲液(pH7.0)洗两次。

向滤膜加入含有400μg/ml 4-氯-1-荼酚和0.03％过氧化氢的50mM Tris缓冲液以产生颜色反应。由上述蛋白质印迹分析所得的结果示于图9B，图B中每条泳道的样品与图9A相同。

结果证实在重组E.coli中产生的蛋白特异性地与KHCV抗体结合。<步骤6>转化KHCV UBCORE14蛋白和KHCV UB897蛋白<步骤6-A>纯化KHCV UBCORE14蛋白(6-A-1)破碎细胞和除去可溶性蛋白

将在<步骤4>中获得的4g E.coli细胞沉淀物悬浮于20ml 4℃缓冲液1(50mM Tris，pH7.5，5mM EDTA，10mM β—巯基乙醇，1mM苯甲基磺酰氟，1μg/ml抑胃酶肽A)中，向悬浮物中加入4mg溶菌酶，在冰上搅拌混合物30分钟，然后在冰浴上用一能率循环输出为80％和50％的超声处理器(HEAT SYSTEMS ULTRASONIC INC.，W225,U.S.A.)超声处理20分钟以破碎细胞并获得E.coli细胞匀浆。(6-A-2)用尿素处理

在12000rpm下用离心机(BeckmanJ2-21，Rotor JA20)离心(6-A-1)中获得的细胞匀浆20分钟以除去不溶性沉淀物，获得上清。

向上清中加入9M尿素使终浓度为8M，在室温下搅拌所得物12小时。(6-A-3)用酸处理

向(6-A-2)中得到的溶液中加入1M乙酸钠(pH4.5)以使终浓度为10mM，随后加入1M乙酸调节pH为5.0，室温搅拌1小时。用离心机(Beckman J2-21，ROtor JA14)在11000rpm下离心溶液以除去沉淀，获得上清。(6-A-4)CM离子交换层析

在(6-A-3)中获得的含KHCV UB-CORE14蛋白的溶液以1ml/分钟的流速过用缓冲液2(8M尿素，1mM EDTA，100mMβ-巯基乙醇和10mM乙酸盐，pH5.0)平衡的含25ml CM-Sepharose树脂(Pharmacia，Sweden)的柱(2.5cm×10cm)，用所述的缓冲液充分洗涤以自由形式留在柱中的物质，随后以3ml/分钟的流速加入500ml氯化钠浓度梯度为0-0.5M的上述缓冲液2以洗脱结合蛋白，将洗脱物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，显示KHCV UBCORE14蛋白在约0.3M浓度下被洗脱，收集含KHCV UBCORE14的组分用于下一步骤。(6-A-5)S-200凝胶渗透层析

用YM5超滤膜(Amicon，U.S.A.)将(6-A-4)中收集的组分浓缩至10ml，浓缩物以0.5ml/分钟的流速通过用含6M尿素，1mMEDTA和1mMβ-巯基乙醇的PBS溶液平衡的S-200 Sephacryl柱(2.5cm×100cm，Pharmacia，Sweden)以根据分子量分离蛋白，将蛋白组分进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集含KHCV UBCORE14的组分。(6-A-6)Mono-S层析

用相同体积的缓冲液3(6M尿素，1mMEDTA，1mMβ-巯基乙醇和10mM磷酸盐，pH7.0)稀释(6-A-5)中获得的含KHCV UBCORE14蛋白的组分，随后通过用缓冲液A平衡的FPLCMono-S柱(HR5/5，Pharmacia，Sweden)，用所述的缓冲液A洗柱，然后以0.8ml/分钟的流速逐渐加入含6M尿素，1mMEDTA，1mMβ-巯基乙醇，10mM磷酸盐和0.4mM氯化钠的缓冲液B，加量为：前5分钟加35％，以下55分钟加70％，最后10分钟加100％，以洗脱结合蛋白。当缓冲液B的用量达到60％，即氯化钠浓度为0.25M时，KHCV UB-CORE14蛋白被洗脱。

将组分在4℃对PBS溶液进行透析，获得4mg纯度至少为90％的KHCV UB-CORE14蛋白。<步骤6-B)纯化KHCV UB897蛋白(6-B-1)细胞破碎和除去可溶性蛋白

4g由<步骤4>中获得的E.coli细胞沉淀物如<步骤6-A>的(6-A-1)所述进行处理以破碎细胞并从中获得不溶性沉淀物。(6-B-2)用Triton X-100和Tris缓冲液洗不溶性沉淀物

将(6-B-1)中得到的沉淀物悬浮于50ml含1％Triton X-100的缓冲液4(50mM Tris，pH8.5，5mM EDTA，2mMβ-巯基乙醇)中，室温下搅拌悬浮液30分钟并用离心机(Beckman J2-21，RotorJA14)在11000rpm离心25分钟，除去上清，获得不溶性沉淀物。随后将沉淀重新悬浮于50ml缓冲液4中。再一次搅拌和离心悬浮液，弃去上清，得到不溶性沉淀物。

仅通过上述简单的洗涤程序即可获得纯度至少为60％的KHCV UB897蛋白。(6-B-3)用8M尿素溶解不溶性沉淀物。

将在(6-B-2)中获得的含KHCV UB897蛋白的不溶性沉淀物悬浮于50ml含8M尿素的缓冲液5(20mM磷酸盐，pH6.0，2mM EDTA，2mMβ-巯基乙醇)中，室温搅拌悬浮液1小时并离心弃去不溶性沉淀物，获得上清。(6-B-4)S-Sepharose离子交换层析

在(6-B-4)中获得的上清通过用含4M尿素的缓冲液5平衡的S-Sepharose柱(Pharmaeia，FF，2.5cm×7cm，U.S.A.)，用600ml氯化钠浓度梯度为0-0.2M的缓冲液洗脱，将蛋白组分进行SDS-PAGE，收集含高纯度KHCV UB897蛋白的组分。(6-B-5)除去尿素及FPLC-Mono Q离子交换层析

(6-B-4)中收集的含KHCV UB897蛋白的蛋白组分对缓冲液6(10mM Tris，pH8.5，2mM EDTA，2mMβ-巯基乙醇)透析以除去尿素，加样至用所述缓冲液平衡的FPLC Mono Q离子交换树脂柱(Pharmacia，HR5/5)，用40ml含有氯化钠浓度梯度为0-0.4M的缓冲液洗脱，收集含高度纯化的KHCV UB897蛋白的组分，得到纯度至少为90％的KHCV UB897蛋白。实施例2制备KHCV UB NS4E蛋白

<步骤1>扩增KHCV NS4E DNA

(1-1)制备引物

为制备KHCV NS4E DNA(其由KHCV-LBC1的第5422-5547核苷酸区组成(并将其克隆至一在色氨酸启动子控制下的含遍在蛋白基因的表达载体中，合成下列引物：

PNS4ET2引物：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTATCATCCCCGATAGGGAAGTT-3′包含SacII识别位点和KHCV-LBC1的第5422-5442核苷酸；以及

PNS4ESAL引物：5′-AAAAAAGTCGACTATTACAACCCGAGCGCCTTCTGTTT-3′包含位于KHCV-LBC1第5547核苷酸后的翻译终止密码子，和一个SalI识别位点。(1-2)聚合酶链反应

在一试管中加入2μg PNS4ET2引物和2μg PNS4ESAL引物，再加入50ng KHCV-LBC1 DNA (ATCC 75008)，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl 2mMdNTP(2mM dGTP，2mMdATP，2mMTTP，2mM dCTP)，2.5单位Taq聚合酶，加蒸馏水调节总体积为100μl。

向反应混合物中加入50μl矿物油以防止蒸发，重复25次与参考例6相同的热循环以进行PCR。(1-3)分离和纯化PCR产物

将上述(1-2)中获得的PCR产物进行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果证实约130bp DNA被扩增。如上所述用相同的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化DNA并命名为NS4E片段。<步骤2>制备表达载体

在NEB缓冲液3中用SacII和SalI完全消化2μg ptrpH-UB-CORE14(ATCC68642，见韩国专利公开出版物93-683)，得到的混合物进行7％琼脂糖凝胶电泳以分离2.7kb片段，其被命名为ptrpH-UB-T2/L片段。

另外，如参考例1所述在NEB缓冲液3中用SacII和SalI充分消化2μg上述<步骤1>的(1-3)中获得的NS4E片段。

在一连接试管中加入100ng上述得到的DNA片段，同时加入50ng上述得到的ptrpH-UB-T2/L片段、2μl 10×连接缓冲液、10单位T4 DNA连接酶，加入蒸馏水使总体积调至20μl，在16℃进行连接反应12小时。

用连接混合物转化E.coli W3110(ATCC37339)以获得含有包含NS4E片段的ptrpH-UB-NS4E质粒的重组E.coli细胞(图10)。<步骤3>制备KHCV NS4E蛋白

用上述<步骤2>制备的质粒ptrpH-UB-NS4转化E.coli W3110(ATCC37339)。

转化后的E.coli细胞在含50μg/ml氨苄青霉素的液体Luria培养基(6％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl)中于37℃振荡培养12小时。将3ml培养物接种至300ml M9培养基(40mMK₂HPO₄，22mMKH₂PO₄，8.5mM NaCl，18.7mM NH₄Cl，1％葡萄糖，0.1mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，0.4％酪蛋白水解物，10μg/ml维生素B1，40μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃振荡培养4小时，当在650nmOD值达到0.3时，向培养物中加入吲哚丙烯酸(IAA)使终浓度为50μg/ml，5小时后以11000rpm离心培养物25分钟，收集E.coli细胞沉淀物。<步骤4>用丙型肝炎患者的血清确定UB NS4E蛋白的表达及其反应性

用Laemmli方法(Nature227，680(1970))将上述<步骤3>获得的细胞沉淀物进行15％SDS-PAGE，凝胶用考马斯亮蓝R250染色以确定重组蛋白的表达(图11A)。在图11A中，泳道1代表标准分子量标记物，泳道2-13示出了用质粒ptrpH-UB-NS4E转化的E.coli产物，泳道14显示了具有不带任何KHCV DNA片段的质粒的E.coli产物。

将在凝胶上分离的蛋白用Towbin方法(Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，76,4750(1979))印到硝酸纤维素滤膜(Bio-Rad Lab.，孔径0.22μm，CA.U.S.A.)上，将滤膜放入含0.5％Tween20的PBS(10mM磷酸盐，pH7.0，0.15M NaCl)，在室温轻摇2小时以阻断IgG和蛋白的非特异性结合。将滤膜放入IgG溶液中，该溶液是通过用含0.5％明胶和0.05％Tween20的PBS稀释从韩国HCV患者中纯化的IgG至终浓度16μg/ml而制备的；在室温温和振荡1小时以使蛋白和IgG反应。随后用含0.2％Tween20的PBS洗滤膜4次，每次5分钟。将滤膜放入抗人IgG抗体溶液中，该溶液是通过用500倍体积的含0.5％明胶和0.05％Tween20的PBS稀释用辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(山羊抗人IgG-HRP，Bio-RadLab.，CA.，U.S.A.)而制备的；在室温振荡1小时，用含0.2％Tween20的PBS洗滤膜4次，每次5分钟；随后用50mM Tris缓冲液(pH7.0)洗二次。向滤膜上加入含400μg/ml 4-氯-1-荼酚和0.03％过氧化氢的50mM Tris缓冲液以产生颜色反应。上述蛋白质印迹分析的结果示于图11B，其中泳道1-4示出了用质粒ptrpH-UB-NS4E转化的E.coli产物，泳道5显示了含有不带任何KHCV DNA片段的质粒的E.coli产物，泳道6示出了标准分子量标记物。<步骤5>纯化UBNS4E蛋白(5-1)破碎细胞及除去不溶性蛋白

将3g在上述<步骤3>中得到的E.coli细胞沉淀物悬浮于40ml缓冲液7(20mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，10mMβ-巯基乙醇，1mM苯甲基磺酰氟，1μg/ml抑胃酶肽A)中，向悬浮液中加入溶菌酶使终浓度为0.2mg/ml，将得到的溶液置于冰上30分钟。得到物在冰浴中用能率循环输出为80％和50％的超声处理器进行15分钟超声处理以破碎细胞，得到E.coli细胞匀浆。

将上述得到的细胞匀浆在一离心机(BeckmanJ2-21，Rotor JA20)中以15000rpm离心25分钟以除去不溶性沉淀物，获得溶解蛋白。(5-2)DEAE-Sepharose离子交换层析

向(5-1)中得到的蛋白溶液加入1M HCl调整溶液pH为9.0，得到以2ml/分钟流速通过用缓冲液8(20mM Tris，pH9.0，1mM EDTA和1mMβ-巯基乙醇)平衡的DEAE-Sepharose柱，用同样的缓冲液洗脱存留在柱中的自由蛋白。随后以8ml/分钟的流速加入300ml含有浓度梯度为0-0.4M的NaCl的缓冲液8以洗脱结合蛋白，每4ml组分收集洗脱液。将蛋白组分进行15％SDS-PAG E以收集含UBNS4E蛋白的组分。(5-3)S-200凝胶过滤层析

用YM10超滤膜(Amicon，U.S.A.)浓缩(5-2)中收集的蛋白组分至体积为5ml，然后以1ml/分钟的流速通过用PBS平衡的S-200树脂柱(Pharmacia，2.5cm×90cm)，每3ml组分收集洗脱下来的蛋白并进行15％SDS-PAGE以收集含高纯度UBNS4E蛋白的组分。(5-4)FPLC-phenyl-superose层析

向(5-3)中收集的蛋白组分中加入NaCl至终浓度为2.0M，得到物以0.7ml/分钟的流速通过用含2.0MNaCl的PBS平衡的FPLC-phenyl-superose柱(Pharmacia，HR5/5，0.5cm×5cm)，加入同样的缓冲液以洗脱存留在柱中的自由蛋白。随后加入40ml含线性浓度梯度为2.0M-OM的NaCl的PBS(10mM磷酸盐，pH7.0)以洗脱结合蛋白，每1.4ml组分收集洗脱液。

将蛋白组分进行15％SDS-PAGE以收集包含具有至少95％纯度的UBNS4E蛋白的组分，用蛋白质印迹分析测定纯化蛋白的抗原特异性。实施例3制备KHCV UBE1E2蛋白

<步骤1>扩增KHCV E1E2 DNA

(1-1)制备引物

为了扩增包含HCV包膜蛋白抗原表位的KHCV E1E2基因并将其克隆至在色氨酸启动子控制下的包含遍在蛋白基因的表达载体中，合成下列引物：

PE2ET2引物：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTACTCGGGGAGAGCGTTGTGAC-3′包含一个SacII识别位点和KHCV-LBC1的第2281-2298核苷酸；

PE2EGE1G引物：5′-TTCCTTCTTCTGGCGGACGCGGTTTCCCAGCTGTTCACCTTC-3′包含为E2E DNA3’末端区的KHCV-LBC1的第2509-2529核苷酸区，以及为E1G基因的5’末端区的KHCV-LBC1的第1201-1221核苷酸区；以及

PE2AXHO引物：5′-AAAAAACTCGAGTTACCACCCCTGCGCGAATGTATC-3′包含位于KHCV-LBC1第1749核苷酸之后的翻译终止密码子，以及一个XhoI识别位点。(1-2)聚合酶链反应

在一试管中加入2μg PE2EGE1G引物和2μg PE2AXHO引物，同时加入50ngKHCV-LBC1 DNA(ATCC 75008)作为模板，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl 2mM dNTP(2mMdGTP，2mMdATP，2mM TTP，2mMdCTP)，2.5单位Taq聚合酶，加蒸馏水使总体积调至100μl。

向反应混合物中加入50μl矿物油以防止蒸发，重复25次与参考例6所述相同的热循环以进行PCR。(1-3)分离和纯化PCR产物

将上述(1-2)中得到的PCR产物进行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果证实有约550bpDNA被扩增。用上述相同的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化该DNA并命名为GE1GE2A片段。(1-4)第二聚合酶链反应

在一试管中加入2μg PE2ET2引物和2μg PE2AXHO引物，同时加入作为模板的50ng质粒pYLBC-A/G-UBE2C(ATCC74117，见韩国专利公开出版物93-683)和50ng GE1GE2A片段，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl 2mM dNTP(2mMdGTP，2mM dATP，2mM TTP，2mMdCTP)，2.5单位Taq聚合酶，向其中加蒸馏水使总体积调至100μl。

向反应混合物中加入50μl矿物油以防止蒸发，重复25次参考例6所述相同的热循环以进行PCR。(1-5)分离和纯化PCR产物

将上述(1-4)中得到的PCR产物进行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果证实有约800bp DNA被扩增。用上述相同的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化所述的DNA并命名为E1E2片段。<步骤2>制备表达载体

根据参考例1在NEB缓冲液3中用SacII和XhoI完全消化2μg(1-5)中得到的DNA片段。

在一试管中放入100ng上述得到的DNA片段，再加入50ng在实施例2的<步骤2>中得到的ptrpH-UB-T2/L片段，2μl 10×连接缓冲液，10单位T4 DNA连接酶，加蒸馏水调整总体积为20μl，在16℃进行连接反应12小时。

用连接混合物转化E.coli W3110(ATCC37339)获得含有包含E1E2片段的质粒ptrpH-UB-E1E2的重组E.coli细胞(图12)。<步骤3>表达KHCV UBE1E2蛋白

用上述<步骤2>制备的质粒ptrpH-UB-E1E2转化的E.coli W3110(ATCC37339)细胞以实施例2<步骤3>相同的方法进行培养，然后离心收集E.coli细胞沉淀物。<步骤4>用丙型肝炎患者的血清确定UBE1E2蛋白的表达及其反应性

以实施例2的<步骤4>相同的方式用上述<步骤3>的细胞沉淀物用丙型肝炎患者的血清证实了UBE1E2蛋白的表达及其反应性，结果示于图13，其中A是SDS-PAGE结果，B是蛋白质印迹分析结果。

在图13A和B中，泳道1和4为具有不带任何KHCV DNA片段的质粒的E.coli产物；泳道2和5示出用ptrpH-UB-E1E2转化的E.coli产物；泳道3为标准分子量标记物，即从凝胶上至下为43、29、18和14千道尔顿。<步骤5>纯化UBE1E2蛋白(5-1)破碎细胞和除去可溶性蛋白

将3g上述<步骤3>中获得的E.coli细胞沉淀物如实施例2<步骤5>(5-1)所述进行处理以破碎细胞并从中获得不溶性沉淀物。(5-2)洗涤不溶性沉淀物

将(5-1)中获得的沉淀物悬浮于40ml含1％Triton X-100的缓冲液8中，在室温搅拌悬液30分钟并在一离心机(Beckman J2-21，Rotor JA20)中以15000rpm离心25分钟以除去溶解蛋白，获得不溶性沉淀物。(5-3)用4M尿素和0.5％Triton X-100洗涤

将(5-2)的不溶性沉淀物悬浮于100ml含8M尿素和0.5％Triton X-100的缓冲液9(20mM磷酸盐，pH6.0，1mM EDTA和10mMβ-巯基乙醇)中，室温搅拌悬液2小时并离心除去溶解蛋白，获得不溶性沉淀物。(5-4)用1％SDS溶解沉淀物

将(5-3)的不溶性沉淀物悬浮于10ml含1％SDS的PBS(10mM磷酸盐，pH7.0，150mM NaCl)中，室温下搅拌悬液12小时并离心除去不溶性沉淀物，得到上清。(5-5)S-200凝胶过滤层析

用YM10超滤膜(Amicon，U.S.A.)将20ml(5-4)中得到的上清浓缩至4ml，随后用一离心机(Beckman J2-21，Rotor JA21)在15000rpm离心25分钟以除去不溶性沉淀物，得到上清。该上清以40ml/小时的流速通过用含1％SDS的PBS平衡的S-200树脂柱(Pharmacia LKB，2.5cm×90cm)。每3ml组分收集洗脱下的蛋白并进行15％SDS-PAGE以收集包含纯度至少为90％的UBE1E2蛋白的组分。实施例4制备KHCV NS4E1E2蛋白<步骤1>扩增NS4E1E2基因(1-1)制备引物

为扩增编码HCV包膜蛋白抗原表位的基因和KHCV NS4E DNA并将其克隆至一在色氨酸启动子控制下的含遍在蛋白基因的表达载体中，合成下列引物。PNS4ET2引物：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTATCATCCCCGATAGGGAAGTT-3′包含一个SacII识别位点和KHCV-LBC1的第5422-5442核苷酸；PNS4EGE2C3引物：5′-CAGAAGGCGCTCGGGTTGCCAGGAGGAGGAGGTGGTA

CTCGGGGAGAGCGTTGT-3′.依次包含为NS4E DNA3’末端区的KHCV-LBC1第5530-5547核苷酸区，一个脯氨酸密码子，六个甘氨酸密码子，以及为E2E基因5’末端区的KHCV-LBC1第2281-2298核苷酸区；以及PE2AXHO引物：5′-AAAAAACTCGAGTTACCACCCCTGCGCGAATGTATC-3′包含位于KHCV-LBC1第1749核苷酸之后的翻译终止密码子以及一个XhoI识别位点。(1-2)聚合酶链反应

在一试管中放入2μg PNS4EGE2C-3引物和2μg PE2AXHO引物，再加入50ng作为模板的ptrpH-UB-E1E2(实施例3的<步骤2>)，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl 2mM dNTP(2mMdGTP，2mMdATP，2mMTTP，2mMdCTP)，2.5单位Taq聚合酶，加蒸馏水至总体积为100μl。

向反应混合物中加入50μl矿物油以防止挥发，重复25次与参考例6相同的热循环以进行PCR。(1-3)分离和纯化PCR产物

将上述(1-2)中得到的PCR产物进行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果证实有约800bp DNA被扩增。用上述同样的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化该DNA并命名为GENVEPI-III片段。(1-4)第二聚合酶链反应

在一试管中放入2μg PNS4ET2引物和2μg PE2AXHO引物，再加入作为模板的50ng实施例2的<步骤2>中获得的质粒ptrpH-UB-NS4E，50ng上述(1-3)获得的GENVEPI-III片段，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl2mMd NTP(2mMd GTP，2mM dATP，2mMTTP，2mMdCTP)，2.5单位Taq聚合酶，加蒸馏水至总体积为100μl。

向反应混合物中加入50μl矿物油以防止蒸发，重复25次与参考例6相同的热循环以进行PCR。(1-5)分离和纯化PCR产物

将上述(1-4)获得的PCR产物进行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果证实有约920bp DNA被扩增，用上述同样的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化该DNA并命名为NS4E1E2片段。<步骤2>制备表达载体

如参考例1所述在NEB缓冲液3中用SacII和XhoI完全消化2μg<步骤1>的(1-5)中获得的DNA片段。

在一试管中放入100ng上述得到的DNA片段，再加入50ng实施例2<步骤2>中获得的ptrpH-UB-T2/L片段，2μl10×连接缓冲液，10单位T4 DNA连接酶，加蒸馏水至总体积为20μl，在16℃进行连接反应12小时。

用连接混合物转化E.coli W3110(ATCC37339)以获得含有包含NS4E1E2片段的质粒ptrpH-UB-NS4E1E2的重组E.coli细胞(图14)。<步骤3>NS4E1E2 DNA片段的表达

以实施例2的<步骤3>相同的方式培养带有上述<步骤2>中制备的质粒ptrpH-UB-NS4E1E2的E.coli W3110(ATCC37339)转化子，然后离心收集E.coli细胞沉淀物。<步骤4>用丙型肝炎患者的血清确定UBNS4E1E2蛋白的表达及其反应性

以实施例2的<步骤4>相同的方式用上述<步骤3>的细胞沉淀物用丙型肝炎患者的血清证实了UBNS4E1E2蛋白在E.coli中的表达及其反应性，结果示于图15，其中A是SDS-PAGE结果，B是蛋白质印迹分析结果。

在图15A和B中，泳道1和4为具有不带任何KHCV DNA片段的质粒的E.coli产物；泳道2和5示出用ptrpH-UB-NS4E1E2转化的E.coli产物；泳道3为标准分子量标记物，即从凝胶上至下为92、70、43、29和18千道尔顿。<步骤5>纯化UBNS4E1E2蛋白(5-1)破碎细胞和除去可溶性蛋白

将3g上述<步骤3>中获得的E.coli细胞沉淀物如实施例2<步骤5>所述进行处理以破碎细胞并从中获得不溶性沉淀物。(5-2)洗涤不溶性沉淀物

将(5-1)中获得的不溶性沉淀物如实施例3<步骤5>(5-2)所述进行处理以除去溶解蛋白，获得不溶性沉淀物。(5-3)用4M尿素洗涤

将(5-2)中的不溶性沉淀物悬浮于30ml含4m尿素的缓冲液2中，室温搅拌悬液2小时并用一离心机(Beckman J2-21，Rotor JA21)在15000rpm离心以除去溶解蛋白；获得不溶性沉淀物。(5-4)用6M盐酸胍洗涤

将(5-3)中的不溶性沉淀物悬浮于30ml含6M盐酸胍的缓冲液2中，室温搅拌悬浮液2小时并用一离心机(Beckman J2-21，Rotor JA21)在15000rpm离心以除去溶解蛋白，获得不溶性沉淀物。(5-5)用1％SDS溶解沉淀物

将(5-3)的不溶性沉淀物悬浮于10ml含1％SDS的PBS(10mM磷酸盐，pH7.0，150mM NaCl)中，室温下搅拌悬液12小时并在一离心机(Beckman J2-21，Rotor JA21)中以15000rpm离心除去不溶性沉淀物，得到上清。(5-6)S-300凝胶过滤层析

用YM10超滤膜(Amicon，U.S.A.)将10ml(5-5)中得到的上清浓缩至4ml，随后用一离心机(Beckman J2-21，Rotor JA21)，在15000rpm离心25分钟以除去不溶性沉淀物，得到上清。该上清以40ml/小时的流速通过用含0.1％SDS的PBS平衡的S-300树脂柱(Pharmacia LKB，2.5cm×90cm)进行凝胶过滤层析。每2ml组分收集洗脱下的蛋白并进行15％SDS-PAGE以收集包含纯度至少为90％的UBNS4E1E2蛋白的组分，纯化蛋白的抗原特异性由蛋白质印迹分析得以证实。实施例5制备KHCV NS5-1.2蛋白<步骤1>扩增NS5-1.2DNA(1-1)制备引物

为了扩增KHCV NS5-1.2DNA(其由KHCV-LBC1的第6649-7824核苷酸组成)并将其克隆至一在色氨酸启动子控制下的含遍在蛋白基因的表达载体中，合成下列引物。PNS5T2引物：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTACGGGCATGACCACTGACAAC-3′包含一个SacII识别位点和KHCV-LBC1的第6649-6669核苷酸；以及PNS51.2SAL引物：5′-AAAAAAGTCGACTATTACGCCTTCCCCTTCATCTCCTT-3′包含位于KHCV-LBC1第7824核苷酸之后的翻译终止密码子，以及一个SalI识别位点。(1-2)聚合酶链反应

在一试管中加入2μg PNS5T2引物和2μg PNS51.2SAL引物，同时加入50ngKHCV-LBC1 DNA(ATCC75008)作为模板，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl2mMdNTP(2mMdGTP，2mMdATP，2mMTTP，2mMdCTP)，2.5单位Taq聚合酶，加蒸馏水使总体积调至100μl。

向反应混合物中加入50μl矿物油以防止蒸发，重复25次与参考例6所述相同的热循环以进行PCR。(1-3)分离和纯化PCR产物

将上述(1-2)中得到的PCR产物进行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果证实有约1.3kbDNA被扩增。用上述相同的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化该DNA并命名为NS5-1.2片段。<步骤2>制备表达载体

根据参考例1在NEB缓冲液3中用SacII和SalI完全消化2μg<步骤1>(1-3)中得到的DNA片段。

在一试管中放入100ng上述得到的DNA片段，再加入50ng在实施例2的<步骤2>中得到的ptrpH-UB-T2/L片段，2μl 10×连接缓冲液，10单位T4 DNA连接酶，加蒸馏水调整总体积为20μl，在16℃进行连接反应12小时。

用连接混合物转化E.coli W3110(ATCC37339)获得含有包含NS5-1.2片段的质粒ptrpH-UB-NS5-1.2的重组E.coli细胞(图16)。<步骤3>表达NS5-1.2DNA片段    

用上述<步骤2>制备的质粒ptrpH-UB-NS5-1.2转化的E.coli W3110(ATCC37339)细胞以实施例2<步骤3>相同的方式进行培养，然后离心收集E.coli细胞沉淀物。<步骤4>用丙型肝炎患者的血清确定UBNS5-1.2蛋白的表达及其反应性

以实施例2的<步骤4>相同的方式用上述<步骤3>的细胞沉淀物用丙型肝炎患者的血清证实了UBNS5-1.2蛋白的表达及其反应性，结果示于图17，其中A是SDS-PAGE结果，B是蛋白质印迹分析结果。

在图17A和B中，泳道1为具有不带任何KHCV DNA片段的质粒的E.coli产物；泳道2和3示出用ptrpH-UBNS5-1.2转化的E.coli产物。<步骤5>转化UBNS5-1.2蛋白(5-1)破碎细胞和除去可溶性蛋白

将3g上述<步骤3>中获得的E.coli细胞沉淀物如实施例2<步骤5>(5-1)所述进行处理以破碎细胞并从中获得不溶性沉淀物。(5-2)洗涤不溶性沉淀物

如实施例3的<步骤5>(5-2)所述处理(5-1)中得到的沉淀物以除去溶解蛋白，获得不溶性沉淀物。(5-3)溶解不溶性沉淀物

将(5-2)的不溶性沉淀物悬浮于100ml含8M尿素的缓冲液3(50mM Tris，pH9.0，1mM EDTA，10mMβ-巯基乙醇)中，室温搅拌悬浮液1小时并离心除去不溶性沉淀物，得到上清。(5-4)DEAE-Sepharose离子交换层析

(5-3)中获得的上清以2ml/分钟流速通过用上述缓冲液3平衡的DEAE-Sepharose柱(Pharmacia，2.5cm×3cm)，用同样的缓冲液洗脱存留在柱中的自由蛋白。随后以8ml/分钟的流速加入300ml含有浓度梯度为0-0.3M的NaCl的缓冲液3以洗脱结合蛋白，每4ml组分收集洗脱液。将蛋白组分进行15％SDS-PAGE以收集含UBNS5-1.2蛋白的组分。(5-5)S-300凝胶过滤层析

用YM10超滤膜(Amicon，U.S.A.)浓缩(5-4)中收集的蛋白组分至体积为3ml，然后以10ml/小时的流速通过用含8M尿素的缓冲液3平衡的S-300树脂柱(Pharmacia，1.2cm×120cm)，以0.5ml组分收集洗脱下来的蛋白并进行15％SDS-PAGE以收集含高纯度UBNS5-1.2蛋白的组分。(5-6)FPLC-phenyl-superose层析

将(5-5)中收集的蛋白组分过YM10超滤膜(Amicon，U.S.A.)以浓缩其体积至4ml。用一透折膜(Spectrum Medical Industries，Inc.M.W.截断值6000-8000)将浓缩液对PBS(10mM磷酸盐，pH7.0，15mM NaCl)透析以除去尿素。向溶液中加入NaCl至终浓度为1.5M，得到物以0.7ml/分钟的流速通过用相同缓冲液平衡的FPLC-phenyl superose柱(Pharmacia，HR5/5，0.5cm×5cm)；加入相同的缓冲液以洗脱保留在柱中的自由蛋白。然后加入含线性浓度梯度为1.5M-0M的NaCl的PBS洗脱结合蛋白，并每0.7ml为一组收集洗脱物。将蛋白组分进行15％SDS-PAGE以收集包含纯度至少为95％的UBNS5-1.2蛋白的组分；纯化蛋白的抗原特异性用蛋白质印迹分析得以确证。实施例6制备HBVCORE蛋白<步骤1>制备引物

为了扩增HBVCORE DNA(其为韩国型乙型肝炎cDNA(pHBVadr)的一部分，见韩国专利申请出版物90-5959)并将其克隆至色氨酸启动子控制下的包含遍在蛋白基因的表达载体中，合成下列引物：PCORET2    引物：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTATGGACATTGACCCGTATAAA-3’包含一个SacII识别位点和HBVCORE DNA的第1-21核苷酸。PCORESAL   引物：5’-AAAAAAGTCGACTATTAACATTGAGATTCCCGAGATTG-3′包含一个在HBVCORE DNA的3’末端终止翻译的终止密码子和一个SalI识别位点。(1-2)聚合酶链反应

在一试管中加入2μg PCORET2引物和2μg PCORESAL引物，同时加入50ng pHBVadr作为模板，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl 2mM dNTP(2mM dGTP，2mM dATP，2mMTTP，20mMdCTP)，2.5单位Taq聚合酶，加蒸馏水使总体积调至100μl。

向反应混合物中加入50μl矿物油以防止蒸发，重复25次与参考例6所述相同的热循环以进行PCR。(1-3)分离和纯化PCR产物

将上述(1-2)中得到的PCR产物进行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果证实有约550bpDNA被扩增。用上述相同的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化该DNA并命名为HBVCORE片段。<步骤2>制备表达载体

根据参考例1在NEB缓冲液3中用SacII和SalI完全消化2μg上述<步骤1>的(1-3)中得到的DNA片段。

在一试管中放入100ng上述得到的DNA片段，再加入50ng在实施例2的<步骤2>中得到的ptrpH-UB-T2/L片段，2μl 10×连接缓冲液，10单位T4 DNA连接酶，加蒸馏水调整总体积为20μl，在16℃进行连接反应12小时。

用连接混合物转化E.coli W3110(ATCC37339)获得含有包含HBVCORE片段的质粒ptrpH-UB-HBVCORE的重组E.coli转化子(图18)。<步骤3>表达HBVCORE DNA

用上述<步骤2>制备的质粒ptrpH-UB-HBVCORE转化的E.coli W3110(ATCC37339)细胞以实施例2<步骤3>相同的方式进行培养，然后离心收集E.coli细胞沉淀物。<步骤4>用乙型肝炎患者的血清确定HBVCORE蛋白的表达及其反应性

以实施例2的<步骤4>相同的方式用上述<步骤3>的细胞沉淀物用乙型肝炎患者的血清证实了UBHBVCORE蛋白的表达及其反应性，结果示于图19，其中A是SDS-PAGE结果，B是蛋白质印迹分析结果。

在图19中，泳道1为具有不带任何HBVDNA片段的质粒的E.coli产物；泳道2和3示出用ptrpH-UB-HBVCORE转化的E.coli产物。<步骤5>纯化UB HBVCORE蛋白(5-1)破碎细胞和除去可溶性蛋白

将3g上述<步骤3>中获得的E.coli细胞沉淀物如实施例2<步骤5>(5-1)所述进行处理以破碎细胞并从中获得不溶性沉淀物。(5-2)用6M尿素处理及DEAE-Sepharose离子交换层析

向上述(5-1)中获得的不溶性沉淀物中加入尿素至终浓度为6M，通过加入1M NaOH至终体积为280ml将悬液的pH调至9.0。

得到物以3ml/分钟的流速通过用含6M尿素的缓冲液8平衡的DEAE-Sepharose柱(Pharmacia，1.25cm×5cm)，加入相同的缓冲液以洗脱存留在柱中的自由蛋白。随后以3ml/分钟的流速加入100ml具有浓度梯度为0-0.5M NaCl的缓冲液8以洗脱结合蛋白并每3ml一组收集洗脱物。蛋白组分进行15％SDS-PAGE以收集包含UB HBVCORE蛋白的组分。(5-3)S-300凝胶过滤层析

上述(5-2)中获得的蛋白组分用YM10超滤膜(Amicon，U.S.A.)浓缩至5ml体积，然后以1ml/分钟的流速通过用缓冲液8平衡的S-300树脂柱(Pharmacia LKB，2.5cm×90cm)。以3ml一组收集洗脱下来的蛋白并进行15％ SDS-PAGE以收集包含高纯度UB HBVCORE蛋白的组分。(5-4)透析除去尿素

使用一透析膜(Spectra/por，No.1，M.W.截断值：6000-8000)在4℃将上述(5-3)中收集的蛋白组分对缓冲液10(20mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，10mM β-巯基乙醇)进行透析以除去尿素，随后离心以获得含有纯度至少为95％的UB HBVCORE蛋白的可溶性上清。实施例7制备HBV Pre S2 S Ag蛋白<步骤1>制备表达载体

10μg包含HBV Pre S2 DNA的载体pLBC-PSAG14(见韩国专利出版物90-5959)在37℃用10单位限制性内切酶BamH处理1小时，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳以获得含有编码ADH2启动子-前表面抗原-表面抗原-GAPDH终止子的DNA序列的BamHI盒。将该盒溶于20μl TE缓冲液，克隆至用BamHI酶切并用细菌碱性磷酸酶处理的pYLBC。根据Hinnen方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，1929-1933(1978))转化酿酒酵母X400-5B(Yeast Genetics Stock Center，U.S.A.)并从中分离重组表达载体pYPSAG100(图20)。<步骤2>制备HBV Pre S2 S Ag蛋白

用上述<步骤1>中得到的载体pYPSAG100转化酿酒酵母X400-5B(Yeast Genetics Stock Center，U.S.A.)，转化后的酵母在3ml亮氨酸缺陷培养基(每升培养基含6.7g不含氨基酸的酵母氮源，182g山梨醇，2％葡萄糖，0.25g补加亮氨酸)于30℃培养24小时。

用一离心机(DYNAC，U.S.A.)在3000rpm离心培养物5分钟，除去上清。沉淀物在5ml培养基(2％葡萄糖，1％酵母膏，2％Bacto蛋白胨)中振荡8小时，在3000rpm离心培养物以除去上清，获得沉淀物，将沉淀物在5ml YEPE培养基(5％乙醇，1％酵母膏，2％Bacto蛋白胨)中于30℃培养4小时以诱导乙型肝炎病毒的前表面抗原和表面抗原的表达。<步骤3>纯化Pre S2 S Ag蛋白

在一离心机(Beckman rotor JA4.2，U.S.A.)以3500rpm离心1l上述<步骤2>获得的培养物10分钟以收集酵母细胞沉淀物。细胞沉淀物溶于50ml缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5)，1mM EDTA，0.1％ Triton X-100,1mM苯甲基磺酰氟)中并向该悬液中加入等体积的直径为0.45mm的玻璃珠，将得到的悬液剧烈振荡3次，每次5分钟，用一离心机(Beckman rotor JS-13，U.S.A.)在1500rpm离心得到物30分钟，获得上清。

上清通过与抗HBV表面抗原的单克隆抗体(CHII5-60，Lucky Central Research Institute)结合的Sepharose CL-4B亲和柱(Pharmacia，U.S.A.)，其中该柱每克干Sepharose CL-4B含8mg单克隆抗体。通过洗脱缓冲液(10mM Tris，pH7.5，1MNaCl)充分洗柱以活化柱。以1ml/小时的流速加入含表面抗原的上清并用10mM Tris-1M NaCl缓冲液连续洗柱直至洗脱物的A₂₈₀达到0。向柱中加入缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5)以除去非特异性蛋白并调节洗脱物的A₂₈₀为1。

当A₂₈₀到达1时，加入缓冲液(3M NH₄SCN，50mM Tris，pH7.5)以洗脱结合的表面抗原蛋白，并在A₂₈₀的峰值处收集20ml洗脱下的组分，在4℃将该组分对4l缓冲液(50mM Tris，pH7.5)透析24小时。

用YM30超滤膜(Amicon，U.S.A.)将得到物浓缩至1ml，浓缩物过Sepharose

CL-4B柱(1.5×90cm，Pharmacia Co.，U.S.A.)，通过以50ml/小时的流速加入缓冲液(0.1M磷酸钠，pH7.0以洗脱结合蛋白，并以每组2ml收集洗脱物。使用OszymeII(Abott Co.)测定每管并收集具有反应性的组分。向得到的溶液中加入CsCl₂溶液以使其终浓度为1.2g/cm³，用一离心机(Beckman rotor 41Ti，U.S.A.)在35000rpm离心悬液24小时以获得沉淀物。

采用Laemmli方法(Nature 227，680(1970))将沉淀物进行SDS-PAGE以收集含所述蛋白的组分(图21)。实施例8制备免疫印迹分析试剂盒

用印迹分析缓冲液(100mM碳酸钠，pH9.5)稀释5种HCV抗原蛋白(KHCV CORE14，KHCV NS4E，KHCV NS4E1E2，KHCV 897和KHCV NS5-1.2)，2种HBV抗原蛋白(HBV CORE和HBV Pre S2 S Ag)，遍在蛋白以及人免疫球蛋白G(hIgG)使其浓度如下：

hIg G：5μg/ml和0.1μg/ml；

KHCV CORE14：10μg/ml；

KHCV NS4E：20μg/ml；

KHCV NS4E1E2：10μg/ml；

KHCV897：10μg/ml；

KHCV NS5-1.2：20μg/ml；

HBV CORE：10μg/ml；

HBV Pre S2 S Ag：10μg/ml；以及

UB：5μg/ml。

将每种含抗原蛋白的稀释液加到硝酸纤维素滤膜(Schliescher&Schuell，BA83，孔径0.22μm，U.S.A.)的狭线(0.7×0.7mm)中，所述的狭线预先用一种狭线印迹装置(Bio-Rad Lab.，Dot SF印迹装置，Cat.No.170-6542，U.S.A.)浸上印迹缓冲液，随后以下述顺序和体积用相同的缓冲液洗一次：

狭线1：hIgG 5μg/ml，250μl；

狭线2：KHCV CORE14 10μg/ml，250μl；

狭线3：KHCV NS4E 20μg/ml，125μl；以及

KHCV NS4E1E2 10μg/ml，125μl；

狭线4：KHCV897 10μg/ml，250μl；

狭线5：KHCV NS5-1.2 20μg/ml，250μl；

狭线6：HBV CORE 10μg/ml，250μl；

狭线7：HBV Pre S2 S Ag 10μg/ml，250μl；

狭线8：UB 5μg/ml，250μl；以及

狭线9：hIgG 0.1μg/ml，250μl.

通过向硝酸纤维素滤膜上施加10-20分钟的8-10Hg的真空压力过滤蛋白溶液而将抗原蛋白印到硝酸纤维素滤膜上，向每一狭线中加250μl印迹缓冲液洗一次膜，并再进行一次过滤。

用一小镊子取下硝酸纤维素滤膜并在60℃干燥约10分钟。将干燥后的硝酸纤维素滤膜放入含0.1％明胶的由磷酸盐缓冲的生理盐水中，在室温轻摇30分钟以阻断蛋白与自由印迹位点的非特异性结合。在上述相同条件下干燥处理后的滤膜，随后以合适的方法编号或结合于标有编号的支持体上。将滤膜切成包含所有狭线的滤膜条，每条含有一种抗原蛋白。实施例9使用免疫印迹试剂盒进行诊断

将上述实施例8中制备的每条滤膜条放入一玻璃管(13×100mm)中，向管中加入含有5μg/ml UB的、用PBS(0.25％明胶，1％Triton X-100，1mM EDTA和0.02％Thimerosal)稀释50倍的血清样品直至完全浸没滤膜条。将管用parafilm膜封口并在室温轻微振荡2小时以使滤膜条上的抗原与血清样品中的抗体反应。

用一吸取装置从玻璃管中除去血清，向每个玻璃管中加入4ml洗涤溶液(包含0.05％Tween20的PBS)洗一次滤膜条，振荡管约4分钟，随后除去洗涤溶液。

将10个滤膜条收集在一含20ml洗涤溶液的反应皿中并用洗涤溶液洗3次。向反应皿中加入含10μg/ml UB的20ml用辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体(山羊抗hIgG(γ)-HRP)，所述的抗体用5-7μg/ml酶标抗体稀释剂(含10％胎牛血清、1％Ficoll，0.05％Tween20，0.02％Thimerosal的PBS)稀释。

得到物在室温轻微振荡40分钟以发生反应，并每次用20ml所述的缓冲液洗涤，共洗四次，然后每次用20ml反应缓冲液(50mM Tris，pH7.5)洗涤，共洗2次。向其中加入20ml含400μg/ml 4-氯-1-荼酚和0.03％过氧化氢的反应缓冲液，并在室温轻微振荡20分钟以发生反应。

除去反应缓冲液后，膜用蒸馏水洗2次，转移至吸收纸上并室温干燥20分钟，可见色带示出在滤膜条中。

结果示于表1，其中样品1-18号示出了被Ortho诊断试剂盒诊断为阳性的结果，样品19-21号示出了用取自乙型肝炎患者的血清获得的结果。

                                        表1

    ELISA                                                 免疫印迹分析  样品   No. Ortho 第1代 Lucky 第1代                                HCV抗原蛋白        HBV抗原蛋白          判断KHCV CORE14    KHCV NS4E1E2 KHCV897   KHCVNS5-1.2  HBV CORE  HBV Pre S2   HCV HDV    1    +    -    -    -    -    -    -    -    -  -    2    +    +    3+    3+    3+    3+    -    -    +  -    3    +    +    3+    2+    3+    3+    -    -    +  -    4    +    +/-    -    -    -    -    -    -    -  -    5    +    +    -    2+    3+    2+    1+    2+    +恢复期    6    +    -    -    -    -    -    -    -    -  -    7    +    -    -    -    -    -    -    +    -恢复期    8    +    -    -    -    -    -    +    +    -恢复期    9    +    -    -    -    -    -    +    -    -  -    10    +    -    -    -    -    -    -    -    -  -    11    +    -    -    -    -    -    -    +    -恢复期    12    +    -    -    -    -    -    -    +    -恢复期    13    +    -    2+    2+    2+    2+    1+    1+    +恢复期    14    +    -    2+    1+    3+    -    1+    1+    +恢复期    15    +    -    -    -    -    -    1+    1+    -恢复期    16    +    -    -    -    -    -    1+    1+    -恢复期    17    +    -    -    -    -    -    1+    1+    -恢复期    18    +    -    -    -    -    -    -    -    - -    19    -    -    -    -    2+    -    -急性    20    -    -    -    -    3+    -    -急性    21    -    -    -    -    2+    2+    -恢复期实施例10测试结果的判断

通过比较每种抗原蛋白与两种对照的颜色深度，如下判断上述测试结果。

1)首先，检查在带1和带9中hIgG上是否存在颜色以及在带8中遍在蛋白上是否不存在颜色。

2)以色度为基础示出每条带的反应性如下：

在每条带上的色度                 反应性

0                                  -    

小于带9中hIgG的色度                +/-

类似于带9中hIgG的色度              1+

在带1和带9中hIgG的色度之间         2+

大于带1中hIgG的色度                3+

3)根据上述2)的指示，如下判断测试样品：

反应性                   判断

1+或更高                 阳性

-或+/-                   阴性

1+或更高但带8中

的UB的色度为1+或更高     待定

4)在乙型肝炎情况下，如果HBVCORE和HBV Pre S2 S Ag带均为+或者只有HBV Pre S2 S Ag带为+，则该患者被认为正处于乙型肝炎恢复期，如果只有HBVCORE带为+，则认为患者正患有急性乙型肝炎。

根据上述标准的判断结果示于表1中，在被Ortho第一代诊断试剂盒诊断为阳性的18种血清样品中，用Lucky Ltd.的ELISA方法(韩国专利出版物93-683)诊断仅有5种样品呈阳性，一种样品为未定；而用本发明的诊断试剂盒诊断有5种样品呈阳性。

用Lucky Ltd.的ELISA方法诊断为中性的样品4在用本发明的诊断试剂盒诊断时为阴性。

这些结果显示本发明的诊断试剂盒比Ortho诊断试剂盒大大降低了假阳性结果，并可用于确证由ELISA诊断为阳性的血清样品以降低假阳性诊断几率。

另一方面，用本发明的诊断试剂盒和PCR测试了178种肝炎患者的血清样品，有136种样品被诊断为阳性，测试结果显示于下表2。

                                    表2

    NS51.2    897    CORE14    NS4E1E2 PCR+(123)    75    83    119    88 PCR-(13)    8    11    13    11

另外，用RIBAII(Orho Diagnostic Systems Co.，USA)诊断上述血清样品，以证实上述测试结果。

其结果与用本发明的诊断试剂盒获得的结果的比较示于下表3。

                              表3

本发明的诊断试剂盒      RIBAII阳性未定阳性未确定PCR+    (123) 123   0 113  10PCR-    (13) 13 13

如表3所示，在被PCR诊断为阳性的123种样品中，用本发明的诊断试剂盒诊断结果相同，而用RIBAII(Ortho Diagnostic Sytems Co.)诊断有10种样品为未确定。

这些结果显示本发明的诊断方法能显著降低错误诊断几率并可同时诊断两种肝炎，即丙型和乙型肝炎。

并且，由于本发明诊断试剂盒含有许多KHCV包膜蛋白、KHCV E1E2蛋白和KHCV NS5-1.2蛋白的抗原表位，所以有可能更精确地诊断HCV侵染。

尽管本发明已结合上述具体实施方案加以描述，但应理解的是对于本发明所作出的各种改进和变化对本领域人员来说是显而易见的，并也包含在所附权利要求书限定的范围内。