用于发酵的消泡剂，生产L-氨基酸的培养基和L-氨基酸的生产方法

摘要

本发明公开了用于发酵的消泡剂，其中所含的有效成分为(a)或(b)的至少一种，(a)是通过将至少一种环氧烷烃加成到脂肪和/或油与三元醇或更高级的多元醇的混合物中得到的反应产物；(b)是式(1)所示的化合物，式中n，R1，R2，R3，X，m1，m2和m3的定义详见说明书。本发明还公开了含有这些组分之一的生产L-氨基酸的培养基，以及利用这种培养基生产L-氨基酸的方法。

说明书

本发明涉及在发酵过程中使用的消泡剂，混有该消泡剂的发酵培养基，在消泡剂存在下生产L-氨基酸的方法、和用消泡剂消泡的方法。

在通过深层需氧培养发酵生产有用物质时，大量气泡和泡沫的产生会引起各种各样的问题。例如，当发酵罐中充满气泡时，每单位体积的培养能力就会下降，培养溶液就会溢出来。

为抑制气泡的生成已做了多种尝试，包括向发酵罐中加入消泡剂。聚氧化烯多元醇醚、聚氧化烯烷基醚、聚氧化烯脂肪酸酯等是以前所用的消泡剂（日本专利申请公开号4282/1975，121482/1975，135298/1979，169583/1981和35073/1990）。然而，由于消泡效果不理想，对发酵生产的不利影响（抑制微生物的生长，抑制产物的生成等），在产生消泡作用之前需长时间保温，或不能在长时间内保持消泡作用，所以这些用于发酵浴的消泡剂已证明不是非常令人满意的。

由于发酵生产L-氨基酸如L-谷氨酸，L-赖氨酸，L-谷氨酰胺，L-精氨酸，L-苯丙氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-组氨酸，L-脯氨酸，L-缬氨酸，L-丝氨酸，L-鸟氨酸，L-瓜氨酸，L-酪氨酸，L-色氨酸和L-亮氨酸在商业上是重要的，通过发酵属于短杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属的微生物以工业规模进行L-氨基酸的发酵生产，在生产过程中遇到因泡沫和气泡所造成的问题，所以期望提供一种能克服以上缺点的消泡剂。

此外，常规的L-氨基酸的发酵方法在产率方面是不理想的。为了提高产率，已将特定的表面活性剂加到发酵培养基中以便在结晶出L-氨基酸产物的同时进行连续发酵（日本专利申请公开号288/1977）。然而，这种方法已证明在总产率方面是不理想的，尽管与常规的已知方法相比得到了改进。

因此，本发明的目的是提供一种用于发酵的消泡剂，当将其加到发酵培养基中，具有优异的消泡作用，同时可改善L-氨基酸的产率，本发明还提供一种使用含有该添加剂的培养基生产L-氨基酸的方法。

本发明人已发现当通过将环氧烷烃加到脂肪和/或油与多元醇的混合物中得到的产物，或（环氧烷烃加成的）聚甘油的酰化产物，加入到发酵培养基中，迅速达到消泡作用且能持续，还发现在L-氨基酸的发酵中使用这种消泡培养基可明显改善L-氨基酸的产率。

在本发明的一个方面，是提供了一种用于发酵的消泡剂，它包含的有效成分是（a）至少一种通过将至少一种环氧烷烃加到脂肪和/或油与三元醇或更高级的多元醇中得到的反应产物，或（b）至少一种下列通式（Ⅰ）所代表的化合物：

其中n代表2-50的一个数，R¹，R²和R³分别为氢原子或具有2-31个碳原子的酰基，X表示具有2-4个碳原子的亚烷基，m1，m2和m3分别为0-200的一个数，或（c）一种（a）和（b）的混合物。

在本发明的另一方面，是提供了一种含有水，并根据需要含有一种微生物，营养素和盐，以及含有至少一种（a）反应产物或（b）化合物（1）或（a）和（b）的混合物的生产L-氨基酸的培养基。

在本发明的另一方面，是提供了一种生产L-氨基酸的方法，包括在含有（a）反应产物或（b）化合物（1）的至少一种，或同时含有两者的培养基中培养产生L-氨基酸的微生物，然后从得到的培养混合物中收集L-氨基酸。

最后，本发明提供一种消泡的方法，其中将（a）反应产物或（b）式（1）的化合物的至少一种或两者加到预计会产生泡沫的培养基中或加到已出现泡沫的培养基中。

（a）反应产物或（b）化合物（1）或二者的应用可在培养期间迅速、可靠和持久地抑制气泡的产生。因此，可改善每单位发酵罐中预期发酵产物的收率。

具体地说，当将以上消泡剂加到生产L-氨基酸的培养基中以生产L-氨基酸时，可明显改善L-氨基酸的产率。

可用于实施本发明的组分（a）是通过将一种或多种环氧烷烃加到至少一种脂肪和/或油与至少一种三元醇或更高级的多元醇的混合物中得到的反应产物。在此用作原料的脂肪或油的实例包括植物油如椰子油、棕榈油、橄榄油、豆油、菜子油、亚麻子油和蓖麻油;动物油如猪油，牛油和骨油;鱼油;和硬化油及部分氢化的油，以及在这些脂肪和油的纯化过程中得到的回收油。

任何已知的含有3个或更多个-OH基的醇都可用作三元醇或更高级的多元醇。然而，这些具有3-15个碳原子的三元醇至六元醇，如甘油、山梨糖醇、葡萄糖、三羟甲基丙烷、三羟甲基乙烷、1，2，4-丁三醇、1，2，6-己三醇、1，1，1-三羟甲基己烷、季戊四醇、赤藓糖、四羟甲基环己醇、双甘油和聚甘油是优选的，既可单用也可合用。其中，甘油是特别优选的。

这里使用的环氧烷烃的实例包括环氧乙烷、环氧丙烷和环氧丁烷。这些环氧烷烃可以单独加入或以它们的各种组合形式加入。但优选的是这些环氧烷烃应两种或多种组合加入。两种或多种环氧烷烃组合的实例包括环氧乙烷-环氧丙烷，环氧乙烷-环氧丁烷，和环氧乙烷-环氧丙烷-环氧丁烷。在环氧乙烷和环氧丙烷或环氧丁烷的组合中，要求加入的环氧丙烷或环氧丁烷的摩尔数应大于所加的环氧乙烷的摩尔数。可以混合物形式进行环氧烷烃的加成（随机加成）或连续加入环氧烷烃进行加成反应（嵌段加成）。所加的环氧烷烃的总摩尔数较好的是每摩尔脂肪和/或油与多元醇的混合物中1-100摩尔，更好为5-100摩尔，最好为5-50摩尔。脂肪或油与多元醇的混合比为1∶0.1-1∶6（摩尔）较好，1∶0.3-1∶3（摩尔）更好。

对环氧烷烃，脂肪和/或油和多元醇的加成反应没有特别的限制，该反应可在环氧烷烃与含活性氢的化合物的加成反应的一般条件下进行。更具体地说，该反应可如下进行：将催化量的碱性物质加入到脂肪和/或油与多元醇的混合物中，混合物中组分的摩尔比如上所述，在大约100-200℃下使1-3kg/Cm²的环氧烷烃与混合物反应。

用于实施本发明的组分（b），即式（1）化合物的实例包括聚甘油，聚甘油的一、二和三酰化产物，聚甘油与聚氧化烯的加合物，聚甘油与聚氧化烯加合物的一、二和三酰化产物。其它的优选化合物是那些m1，m2和m3是0-100，n是2-10，R¹，R²和R³是具有4-24个碳原子的酰基，X是2-4个碳原子的亚烷基的化合物。

这些化合物（1）可用本领域中已知的任何方法来生产。聚甘油生产方法的一个例子是在碱催化剂存在下，在200～300℃的高温下，对甘油进行脱氢缩聚的方法。在此所用的碱催化剂的实例包括NaOH，KOH，LiOH，Na₂CO₃，K₂CO₃，Li₂O₃，CaO和MgO。聚甘油的聚合度可通过改变反应条件来调节。然而，得到的聚甘油不是一种单一的组分，而是一种具有某种分子量分布的混合物。例如，被称为六甘油的商品化聚甘油符合其计算的化学式，但该聚合物实际上是一种由不同聚合度的聚甘油组成的混合物。

用上述方法得到的聚甘油是一种具有高粘度的黄色或棕色稍黑的液体。随着聚合度变高，其颜色逐渐变差，接近棕黑色。因此，在使用之前，用吸附剂如活性炭或活性粘土对有色的聚甘油进行脱色处理，或除去催化剂并用离子交换树脂进行脱色处理。双甘油、四甘油、六甘油和十甘油已经商品化。

聚甘油与聚氧化烯的加合物可用任何已知的方法生产，已知的方法包括在加入碱催化剂之后，在加压和加热条件下，将环氧烷烃加到，例如，按上述方式得到的聚甘油中。加入的环氧烷烃的实例包括环氧乙烷、环氧丙烷和环氧丁烷，它们分别具有2，3和4个碳原子。这些环氧烷烃可以单独加入或组合加入，以嵌段形式加成或随机加成。其加入量以每摩尔聚甘油计平均为1-200摩尔较好，1-50摩尔更好。

聚甘油的一、二或三酰化产物，和聚甘油与聚氧化烯加合物的一、二或三酰化产物（这两种产物可称为聚甘油脂肪酸酯）通常可通过各种直接的酯化反应来制备。通过不同聚合度的聚甘油彼此适当地结合并选择所用的脂肪酸的种类和酯化程度可得到不同种类的亲水酯或亲油酯。因此，用Davis方法测得的HLB为1～20，更好为2-10（就消泡剂而言），和10-18（就改善L-氨基酸的产率而言）的任何酯都可被制备和使用。

酯化反应一般是在不低于200℃的温度下，不用任何催化剂进行的或可在碱催化剂存在下进行。在反应期间可加入亚硫酸盐，还可加入脂酶等。按照其预期的最终用途，通过改变纯化的程度提供各种不同的产物。生产出的聚甘油脂肪酸酯的质量大部分取决于聚甘油原料的质量。随着聚甘油的聚合度增加，这一趋势变得更加明显。

一种优选的物料是聚甘油缩聚蓖麻油酸酯，其合成方法是在加热下使蓖麻油酸（蓖麻油脂肪酸）脱水以使之预缩聚3-6分钟，然后用如此预缩聚的蓖麻油酸酯化聚甘油。反应条件通常与上述用于任何聚甘油脂肪酸酯的条件相同。

反应产物（a）或化合物（1）或它们的混合物可作为消泡剂直接用于发酵培养基和发酵方法或其它需要消泡的应用方面。反应产物（a）或化合物（1）或它们的混合物可在开始出现泡沫之前或之后分成一至数份加到发泡性培养基中。对于发酵培养基，可在温育开始时或在温育期间加入消泡剂。加入的量以培养基重量计为0.0001～5%较好，0.001～2.5%更好。较好的是，以0.0001～2%，更好为0.0001～1.0%的量加入本发明的消泡剂，这样使用时它只产生消泡作用，或者以0.001～5%，更好为0.01～5%，最好为0.05～2.5%的量加入本发明的消泡剂，此时除产生消泡作用外还可期望改善L-氨基酸的发酵产率。

对适用于本发明消泡剂的发酵培养方法无特殊限制，发酵培养方法的实例包括需氧培养、搅拌培养、振荡培养等等，所有这些方法都会产生气泡。在下文中将叙述用本发明的上述组分发酵生产L-氨基酸。

在生产L-氨基酸时，可将反应产物（a）或化合物（1）或它们的混合物至少一种加到用于种子培养的培养基中或加到用于主发酵的培养基中。作为拟向其中加入至少一种反应产物（a）和/或化合物（1）的培养基，可使用含有碳源、氮源、盐和其它添加剂常用于温育L-氨基酸产生菌的培养基。在本发明中，碳源的实例包括碳水化合物如葡萄糖、右旋糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、粗糖、液体糖、蔗糖蜜、甜菜糖、赤糖糊、木薯淀粉和淀粉糖化液;脂肪酸如乙酸和丙酸;有机酸如丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸和苹果酸;和醇类如乙醇和丁醇，所有这些既可单独使用又可以多种组合使用。作为氮源，实例包括铵盐如硫酸铵、氯化铵和乙酸铵、尿素、氨水、玉米浆、酵母提取液、大豆水解产物、胨、多胨、肉浸膏等等。作为盐，可使用磷酸盐、镁盐、钙盐、钾盐、钠盐、铁盐、锰盐、锌盐、铜盐等等。根据需要还可加入其它的金属盐。

如上所述，除（a）或（b）以外的表面活性剂可加到发酵培养基中以提高L-氨基酸的产率。这样的表面活性剂的实例包括阴离子表面活性剂如高级（C₆-C₂₅）醇硫酸酯，烷基苯磺酸酯，磷酸烷基酯和磺基琥珀酸二烷基酯;阳离子表面活性剂如烷基胺和季铵盐;非离子表面活性剂如聚氧乙烯烷基醚，聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，脱水山梨糖醇脂肪酸酯，聚乙二醇酯脂肪酸酯，烷基糖苷和酰胺酯;和两性表面活性剂如咪唑啉和甜菜碱。其中，优选烷基糖苷和酰胺酯。这些表面活性剂既可单独使用又可任意组合使用，加入的量以培养基的重量计在0.01～2.5%（重量）范围内为宜。

此外，根据需要可将抗菌素、维生素等等加到发酵培养基中。抗菌素的实例包括青霉素、氯霉素、红霉素、链霉素、卡那霉素、竹桃霉素、春日霉素、四环素、丝裂霉素、放线菌素和环丝氨酸。其中，优选青霉素。维生素的实例包括生物素、烟酸和硫胺素。

对加入到本发明的发酵培养基中的微生物无特殊限制。可以使用任一种微生物或组合使用多种微生物，只要它们能产生L-氨基酸即可。其具体实例包括下列微生物：

棒杆菌：

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium    glutamicum），乙酰谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium    acetoglutamicum），嗜乙酰乙酸棒杆菌（Corynebacterium    acetoacidophilum）;

微杆菌：

Microbacterium    amnonidfirum;

短杆菌：

嗜乙酰乙酸短杆菌（Brevibacterium

    acetoacidophilum），黄色短杆菌（Brevibacterium    flavum），乳酸发酵短杆菌（Brevibacterium    lactofermentum），解糖短杆菌（Brevibacterium    saccharolyticum），玫瑰色短杆菌（Brevibacterium    roseum），叉开短杆菌（Brevibacterium    divaricatum）;

节杆菌：

柠檬节杆菌（Arthobacter    Citreus）;

芽孢杆菌：

枯草芽孢杆菌（Bacillus    subtilis），球形芽孢杆菌（Bacillus    sphaericus）。

通过在本发明的发酵浴中温育上述微生物得到的L-氨基酸的实例包括L-谷氨酸，L-赖氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸。

用本发明的培养基温育L-氨基酸产生菌的条件与用于一般的氨基酸发酵的条件相同。虽然温育温度依预期的L-氨基酸和所用的菌株稍有不同，但可为20-40℃，最好为28～37℃。

在温育期间当将PH控制在中性附近时可得到较好的结果。一般在通气条件下进行温育，例如通气、搅拌或振荡培养。温育时间一般为1-7天。然而，可通过连续培养或类似的方法进一步延长温育时间。从含有L-氨基酸的各个发酵溶液中分离L-氨基酸可通过离子交换处理或本领域内已知的任何其它方法进行。

实施例

下面用实施例更详细地描述本发明，然而，应该记住本发明不受这些实施例的限制。

实施例1：

具有表1所示组成的100ml培养基（在121℃下灭菌10分钟，PH：7.2）用黄色短杆菌接种后分置于发酵器（500ml（量筒）中并以5l/分钟的速度通气。当气泡达到400ml处的标线时，将表2所示的反应产物（a）消泡剂一点一点地加到培养基中，然后在30℃下保温2小时。将气泡控制在标线或低于标线的水平所需的消泡剂量列于表2中，以重量比计。

表1

表2

EO：环氧乙烷;PO：环氧丙烷

从表2可以看出，本发明的消泡剂在极小量时显示出优异的消泡作用。

实施例2

含有10%（就糖而言）赤糖糊，0.5%尿素和0.3%玉米浆的培养基用谷氨酸棒杆菌接种后在30℃下保温。在对数生长期的前期，将0.15%聚氧化烯-棕榈酸酯加到培养基中并在30℃下保温30小时。

此后，将得到的培养混合物分成15ml一份，分置于500ml量筒中。以5ml/分钟的速度将空气导入量筒。当气泡达到400ml处的标线时，将0.001g表2所示的消泡剂加到各个培养基部分中。通气30分钟以上，然后测量每一量筒中所出现的气泡的高度。结果示于表3中。

在5，7，8号消泡剂情况下，气泡从各个量筒中溢出。

实施例3

一种生产L-赖氨酸的培养基制备如下：

葡萄糖    10%

（NH₄）₂SO₄4.5%

盐酸硫胺素    200μg/l

K₂HPO₄0.1%

胨    1%

生物素    50mg/l

其中%为重量百分比。将每份100ml具有以上组成的培养基置于500ml坂口烧瓶中，在120℃下灭菌15分钟，然后用L-赖氨酸产生菌短杆菌种接种。此后，将表1所示的消泡剂分别加到培养基部分中，所加的量以每一培养基部分计为0.05%和1.0%（重量），在30℃下进一步保温30小时。然后测定各个培养基部分中L-赖氨酸的产量，结果示于表4中。

表4

从表4的结果可以看出，本发明的消泡剂（1-4号）是优良的消泡剂，它们均能改善发酵产物L-赖氨酸的产率。

实施例4

制备一种组成如下的培养基，各组分以重量计：

赤糖糊    4%

KH₂PO₄0.2%

MgSO₄0.05%

尿素    0.8%

生物素    5μg/l

水    加到100%

用KOH将培养基的PH调至7.2，取一份30ml培养基，置于500ml坂口烧瓶中并加热灭菌。这一培养基部分用生长于葡萄糖-胨斜面上的谷氨酸棒杆菌接种，在30℃下预保温18小时。

另外，将每份30ml组成如下的培养基（PH：7-8）：

赤糖糊    10%

尿素    1.0%

KH₂PO₄0.1%

MgSO₄0.05%

水    加到100%

置于500ml坂口烧瓶中并加热灭菌。然后通过将0.3%（重量）的表5所示的反应产物（a），或0.3%（重量）的聚氧乙烯脱水山梨糖醇-硬脂酸酯分别加到这些一份30ml的每一份中制备培养基样品，在对比实施例中无添加剂。将每份500μl的上述预培养混合物加到这些其中加有表5中物质的培养基样品中，在30℃下振荡培养48小时。然后测定在各个培养基中L-谷氨酸的产量，结果示于表6中。

表6

L-谷氨酸的量(g/l)

9    45.0

10    38.9

11    37.9

12    41.3

13    37.6

14    39.5

15    17.6

16    1.3

实施例5

制备下列培养基A和B，各组分以重量计：

培养基A：

赤糖糊    10%（就葡萄糖而言）

（NH₄）₂SO₄4.5%

KH₂PO₄0.1%

胨    1%

水    加到100%

培养基B：

葡萄糖    10%

生物素    50μg/l

盐酸硫胺素    200μg/l

（NH₄）₂SO₄4.5%

KH₂PO₄0.1%

胨    1%

水    加到100%

将每份40ml的制成的培养基分别倒入两个500ml坂口烧瓶中并灭菌。灭菌后，将L-赖氨酸产生菌，短杆菌种接种并在30℃下保温18小时。然后将每份400μl的得到的培养混合物接种到相应的培养基A和B中，在30℃下振荡培养8小时。此后，将0.15%（重量）表7所示的反应产物（a）分别加到被接种的培养基A和B中，振荡培养24小时。为进行比较，其中含有0.15%（重量）聚氧乙烯脱水山梨糖醇-棕榈酸酯，但不含添加剂的培养基A和B部分按与上述相同的方式保温。然后测定培养混合物中L-赖氨酸的量，结果示于表8中。

表8

实施例6

按重量组成如下的培养基：

赤糖糊    4%

KH₂PO₄0.1%

MgSO₄0.05%

尿素    0.8%

生物素    5μg/l

水    加到100%

用KOH调至PH7.2，取一份30ml，置于500ml坂口烧瓶中并加热灭菌。这一部分用生长于葡萄糖-胨斜面上的谷氨酸短杆菌接种，在30℃下温孵18小时。

另外，将每份30ml的组成如下的培养基（PH：7-8）：

赤糖糊    10%（就糖而言）

尿素    1.0%

K₂HPO₄0.1%

MgSO₄0.05%

水    加到100%

置于4个500ml坂口烧瓶中并加热灭菌以制备4个培养基A、B、C和D。然后，将每份300μl的以上制得的培养混合物分别接种到培养基A-D中。此外，将0.2%聚-月桂酸甘油酯和0.2%聚氧乙烯脱水山梨糖醇-硬脂酸酯加到培养基A中，将0.3%聚-月桂酸甘油酯加到培养基B中，将0.3%聚氧乙烯脱水山梨糖醇-硬脂酸酯加到培养基C中。培养基D不含添加剂。

在30℃下，对培养基A-D分别进行振荡培养基48小时，测定各个培养基中L-谷氨酰胺的量。结果示于表9中。

表9

实施例7

制备下列培养基A和B，各组分以重量计：

培养基A：

赤糖糊    10%（就葡萄糖而言）

（NH₄）₂SO₄4.5%

KH₂PO₄0.1%

胨    1%

水    加到100%

培养基B：

葡萄糖    10%

生物素    50μg/l

盐酸硫胺素    200mg/l

（NH₄）₂SO₄4.5%

KH₂PO₄0.1%

胨    1%

水    加到100%

将每份40ml的制成的培养基分别倒入两个500ml坂口烧瓶中并灭菌。灭菌后，用L-赖氨酸产生菌，短杆菌种接种，在30℃下温孵18小时。将400μl得到的培养混合物接种到其相应的培养基A和B中，在30℃下振荡培养8小时。此后，将0.15%聚硬脂酸甘油酯加到被接种的培养基A和B中，进一步振荡培养24小时。为进行比较，其中不含聚硬脂酸甘油酯的培养基A和B部分按与上述相同的方式温孵。在如此得到的各个培养基混合物中L-赖氨酸的产量示于表10中。

表10