窄多分散性和单分散性阴离子低聚物及其应用，制剂和制备方法

摘要

本发明的窄的多分散或单分散低聚物为具有3—50个重复单元的聚脲、聚碳酸酯、聚酯或聚酰胺。这些低聚物为水溶性的，最好具有刚性骨架，具有通过羰基连接基团偶联的重复单元，具有阴离子基团，主要显示线性几何结构，以致在水介质中在阴离子基团之间存在规则间隔，且该低聚物为药学上可接受的。窄的多分散或单分散低聚物可用于治疗和/或诊断AIDS和/或ARC或HSV。

说明书

本发明是关于窄多分散性和单分散性阴离子低聚物、它们的制备方法，制剂和作为有价值的抗人免疫缺陷痛毒活性剂的应用。因此，这些单分散性阴离子低聚物在获得性免疫缺陷综合症（爱滋病，AIDS）的治疗中和在由1型和2型单纯性疱疹病毒（HSV）及由细胞肥大病毒所引起的疾病的治疗中是有用的。

目前正在进行大量的研究工作以开发对人类及动物的病毒感染，尤其是1型和2型单纯性疱疹病毒（HSV）和爱滋病及爱滋病相关并发症（ARC）的治疗方法。值得注意的是，人类的爱滋病和ARC的发病率正以惊人的速度增加。爱滋病患者的5年存活率是令人诅丧的，因感染而使其免疫系统严重受损的爱滋病患者会遇受许多机会被致病菌感染，包括卡波济氏肉瘤和卡氏肺囊虫肺炎。无法治疗爱滋病是大家都知道的，目前的治疗方法大多没有充足的效果证据且具有许多不利的副作用。对这种病的恐惧使得患有或被怀疑患有该病的患者受到社会的排斥和歧视。

逆转录病毒是一类核糖核酸（RNA）病毒，该病毒借助使用逆转录酶进行复制，形成一条互补DNA（CDNA）链，由此产生双链原病毒DNA。然后这种原病毒DNA会随机掺入宿主细胞的染色体DNA中，这使得通过来自整合病毒基因组的病毒信息的随后转译而进行病毒的复制成为可能。

许多已知的逆转录病毒是致癌或致肿瘤病毒。实际上，发现的头两种人逆转录病毒（被称为人T细胞白血病病毒Ⅰ和Ⅱ或HTLV-Ⅰ和Ⅱ）在感染T-淋巴细胞之后引起人罕见的白血病。被发现的第三种这样的人病毒（HTLV-Ⅲ，现称之为HIV）在感染T-淋巴细胞之后导致细胞死亡并已证明是爱滋病和ARC的病原体。

HIV的被膜蛋白是一种160KDa的糖蛋白。借助蛋白酶将该蛋白切割成120KDa的外蛋白（gp120）和跨膜蛋白（gp41）。gp120蛋白含有能识别人T-协助（T₄）细胞上的CD₄抗原的氨基酸序列。

正在探究的一种方法是阻止HIV结合到其靶物上，即人的T₄细胞上。这些T₄细胞具有一个特定的区，CD₄抗原，其与gp120相互作用。如果能破坏这种相互作用，就能抑制宿主细胞感染。

干扰病毒的被膜糖蛋白的形成能阻止初始病毒-宿主细胞的相互作用或随后的融合，或能通过阻止病毒膜的完成所需的合适的糖蛋白的构建来阻止病毒的复制。已经报道了（见H.A.Blough等人，Biochem.Biophys.Res  Comm.141（1），33-38（1986））非特异性糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖和β-羟基-正缬氨酸能抑制HIV糖蛋白的表达和阻止合胞体的形成。用这些药剂处理过的HIV感染的细胞的病毒繁殖停止了，可能是由于得不到病毒膜形成所需的糖蛋白，在另一份报道中〔W。McDowell等人，Biochemistry24（27），8145-52（1985）〕，发现糖蛋白抑制剂2-脱氧-2-氟-D-甘露糖可通过阻止病毒膜蛋白的糖基化作用可抑制对流感感染的细胞的抗病毒活性。这份报道还研究了2-脱氧葡萄糖和2-脱氧-2-氟葡萄糖的抗病毒活性，结果发现每一种抑制剂都是通过不同的机理抑制病毒蛋白的糖基化作用。然而，已发现其它已知的糖基化抑制剂没有抗病毒活性。因此，糖基化抑制剂对一般性病毒和特殊病毒的抗病毒活性是很难预测的。

目前世界各国都在进行研究以建立1型和2型HSV的治疗方法。1型和2型HSV都易感染外胚层组织，其中这样的病毒感染会引起皮肤、口腔、阴道、结膜，以及神经系统的损伤。一般说来，1型HSV（HSV1）的感染与口部、面部和眼部损伤相关联。2型HSV（HSV2）的感染一般可导致外生殖器和肛门的损伤。不对HSV感染进行理疗常常会引起失明、新生儿死亡，和大脑炎。2型HSV感染在美国由于性交传染而流行。现在美国有大约两千万人以上害这种病。其中新病例和复发病例每年超过50万。每年用于诊断和治疗HSV感染的费用造成了重大的经济损失。HSV的流行病学控制手段较差是因为大多数人口（多达90%）已接触到这种病毒。

人可作为1型和2型HSV感染的天然宿主，在密切的私人交往过程中会传染这种病毒。1型和2型HSV的初始或主要感染是通过粘膜的破裂造成的。在健康病原携带者中，该病毒可从眼泪、唾液、阴道及其它分泌物中分离得到，即使在无明显症状期间也能分离出该病毒。从粘膜中，这些病毒能够复制并蔓延到区域性淋巴结中。有时，这些病毒能感染造血系统并引起病毒血症。

在治疗HBV感染中的一些困难是由这些病毒可以潜在的，或被遏制的形式继续存在的能力造成的。当初次感染缓解时，病毒一般以潜在的形式存在于感觉神经节中，感觉神经节使初次感染的部位受神经支配。在眼或口受到1型HSV感染时，病毒一般存在于三叉神经节中。在2型HSV情况下，病毒一般存在于支配外生殖器和下腹部的骶神经节。HSV病毒潜伏期的鉴定期是未知的，但这个时期可被热、冷、阳光、激素和情绪失调，或被免疫抑制剂打乱，因而通常会导致复发感染。

对HSV感染的治疗大多是无效的。已确立了许多阻止该病毒的战略。这些药剂一般可抑制多种特定的病毒功能中的任一种，如（1）吸附，（2）脱壳，（3）转录，（4）蛋白质合成，（5）核酸复制，（6）成熟，和（7）释放。

目前多数用于治疗HSV感染的抗病毒剂已成为干扰病毒DNA的化合物。这些化合物包括碘苷、阿糖胞苷、阿糖腺苷、和三氟胸苷。这类药剂也干扰相似的宿主功能，从而引起细胞毒性和在人体中全身性应用的一般性问题，目前，阿苷洛维是治疗HSV1和HSV2感染的优选药物，这是由于它具有强有力的抗病毒作用和可忽略的毒性。然而，在高剂量时溶解性差和抗药性病毒的出现限制了这种药物的应用。

许多含有RNA和DNA的病毒都具有病毒编码糖肽掺入其中的被膜。HSV和细胞肥大病毒（CMV）是两种这样的具被膜病毒。具被膜病毒感染宿主最初依赖于宿主细胞表面上的不同受体与病毒膜的被膜糖蛋白之间的相互作用。随后病毒和细胞膜融合并将病毒粒子内容物释放到宿主细胞的胞质中。含有糖蛋白的病毒被膜在病毒粒子与宿主细胞的初始相互作用中和在病毒膜与宿主细胞膜的随后融合中均起重要作用。病毒的被膜衍生于细胞膜，但其特异性是由于病毒编码糖肽。因此，能够干扰病毒特异性膜形成的抑制剂可阻止感染性子代病毒的形成。

在欧洲专利审查0406512（1991年1月9日公开）中公开了一种纯化形式的肝素，硫酸化多糖，通过相互作用结合到负责细胞识别的病毒蛋白质上并给宿主细胞提供有限的抑制作用。然而，肝素可产生一些副作用，特别是出血，增加血块形成时间以及血小板减少症。有些患者是禁用肝素的，这些患者是自动出血者，或患有血友病，紫癜，血小板减少症，颅内出血，细菌性心内膜炎，活动性结核，增加的毛细血管渗透性，胃肠道溃疡性损伤，严重高血压，先兆性流产或内脏癌的患者。应特别注意血友病者使用的禁忌征，因为许多这样的患者现在都是HIV阳性的。

长期以来，人们一直认为，某些合成的、水溶性聚合物显示出宽的生物学活性范围〔R.M.Ottenbrite  in“Biological  Activities  of  Polymers”，Amer  Chem.Soc.Symp  Ser.No.182，pp.205-220，eds.C.F。Carraher  and  C.G.Gebelein（1982）〕。二乙烯基醚和马来酸酐的共聚物显示出对许多病毒是具有活性的。其在癌症化疗中的应用已被研究了多年〔Breslow，D.S.Pure  and  Applied  Chem.46，103（1976）〕。聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸以及种类繁多的其它脂族主链的水溶性聚合物也显示出具有宽范围的生物学活性〔W.Regelson等人，Nature186，778（1960）〕。不幸的是，这些聚合物的巨大毒性阻止了它们的临床应用。再者，这些聚合物具有很高的分子量，不能通过肾膜。

已作出了许多尝试以通过合成低分子量（1000-10000）的脂族聚合物防止毒性和分泌问题的发生〔R.M.Ottenbrite  in“Biological  Activities  of  Polymers”，AmerChem.Soc.Symp.Ser.No.182.pp.205-220，eds.C.E.Carraher  and  C.E.Gebelein（1982）〕。已发现虽然这样的聚合物毒性较小，但具有大大降低了的抗病毒活性。这些低分子量的脂族聚合物可归入“无规线团”聚合物类。由于主链连接基团的挠性，这样的聚合物具有不可预测的构型。无规线团聚合物在溶液中的构型一般可被描述为球状。虽然这样的水溶性聚合物的作用机理是未知的，但一种假说是，该聚合物通过离子吸引结合到病毒膜，例如引起脑心肌炎的病毒上，从而使得该病毒不能感染宿主细胞。

另一种合成聚合物的方法是将离子基团置于具有更确定几何构型的聚合物主链上。有许多非离子合成聚合物的例子，这些聚合物在非水溶液中显示出比上述脂族聚合物更为线性的几何构型〔J.Macromol.Sci-Reviws in Macromol.Chem.Phys.C26（4），551（1986）〕。造成这种非无规线团结构所涉及的因素很复杂并难以搞清。通常，这样的聚合物或者具有数目很有限的与聚合物轴不平行的可旋转的键，或者存在有利于线性结构的氢键键合或偶极相互作用。这些聚合物被称为具有“刚性主链”。衍生于对苯二酸和对二氨基苯的聚酰胺（由杜邦公司提供的商品Kevlar^TM）是这样的聚合物的一个众所周知的例子。

虽然合成的，水溶性的，刚性聚合物不太常见，但已知有几个高分子量的例子（例如，见美国专利4，824，966和4，895，660）。对于给定的分子量和浓度而言，这类聚合物的非无规线团可导致高的溶液粘度。

现已发现某些阴离子低聚物可抑制病毒的复制且无由肝素和已知聚合物显示的副作用。该低聚物具有有序的阴离子间隔，刚性主链并且是水溶性的。在欧洲专利申请0467185（1992年9月9日公开）中已描述了作为多分散性混合物的低聚物。虽然在这些申请中公开了各种不同的阴离子低聚物，但这些阴离子低聚物是多种分子量的混合物。

显然，人们希望找到一种治疗爱滋病，ARC和HSV的方法，该方法显示最小的或没有副作用且与以前用作药物的聚合物相比具有明显的改进。而且这样的聚合物应最好具有窄的分子量范围，低毒性且易于表征。

在附图1-4中，纵轴为紫外吸光率，横轴为时间（分钟）。

图1示出了作为原料的具有宽的多分散性的式Ⅰ所示的粗制多分散性磺酸化聚脲。

图2示出了在下述步骤Ⅰ之后分散性的降低。从图1的粗制多分散性磺酸化聚脲到作为几个馏分之一的窄多分散性磺酸化聚脲。

图3示出了来自图1的粗制多分散性低聚物的凝胶过滤色谱的馏分7-17的合并，其是来自图2的馏分的再合并物。

图4示出了利用逆相液相色谱法从图1的粗制多分散性低聚物分级分离出的单分散性磺酸化聚脲低聚物。

在图5-9中，纵轴为相对吸光率，横轴为时间（分钟）。

图5示出了式Ⅰ的聚脲的各种HPLC轮廓。

图6示出了用含水的乙酸三乙胺（Et₃NHOAC）作为洗脱剂，式Ⅰ的窄多分散性聚脲的HPLC轮廓。

图7示出了用含水的磷酸四丁基铵〔n-Bu₄N）PO₄〕作为洗脱剂，式Ⅰ的窄多分散性聚脲的HPLC轮廓。

图8示出了用含水的磷酸四丁基铵〔n-Bu₄N）PO₄〕作为洗脱剂，式Ⅰ的单分散性聚脲馏分的HPLC轮廓。

图9示出了式Ⅰ的多分散性和单分散性聚脲的不同低聚物馏分的IC₅₀抗病毒浓度的直方图。

本发明是关于包括3-50个由羰基连接部分偶联的重复单元的窄多分散性和单分散性水溶性低聚物，所说的低聚物具有阴离子基团和主要为线性的几何构型，因此在水介质中阴离子基团之间存在着规则的间隔。本发明的优选低聚物以下式Ⅰ-Ⅳ之任一种表示。

本发明的方法可制备本发明的窄多分散性和单分散性阴离子低聚物，特别是如下式Ⅰ-Ⅳ所示，其步骤为：

1）将粗制多分散性阴离子低聚物混合物限制到窄多分散性阴离子低聚物混合物;和/或

2）分离单分散性阴离子低聚物，和

3）有选择地将得自步骤1或2的窄多分散性或单分散性阴离子低聚物盐转化为所需的药物上可接受的盐，特别是钠盐或钾盐。在以上方法中，可将各步骤进行下列组合：步骤1或2单独进行，步骤1或2之后是步骤3;或所有3个步骤都进行。

窄多分散性和单分散性低聚物可用作抗人免疫缺陷病毒活性剂和抗单纯性疱疹病毒剂，因此这些低聚物可用于治疗爱滋病，ARC和HSV。本发明包括窄多分散性和单分散性低聚物，它们的配方和作为治疗爱滋病，ARC和HSV药剂的应用以及制备这些药剂的方法。

本发明的窄多分散性和单分散性阴离子低聚物是包括3-50个由羰基连接部分偶联的重复单元的水溶性低聚物，所说的低聚物具有阴离子基团和主要为线性的几何构型，因此在水介质中阴离子基团之间存在着规则的间隔。较好的是，这些低聚物由下列结构式之任一种表示：

A）式（Ⅰ）的聚脲：

其中：

R表示氢原子，C₁-C₄烷基，苯基，或被1-2个R¹基团和至多3个独立地选自氟，氯或溴原子或C₁-C₂₀烷基取代的苯基;

R¹表示-SO₃R²，-CO₂R²，-PO₃（R²）₂，或-OPO₃R²;

R²表示氢原子或药物上可接受的阳离子;

m是整数0或1，条件是当m为0时，R为氢原子;

X表示：

Y表示-CO₂-，-C≡C-，-N＝N-，

n是整数3-50;

R³表示-R或-X-NH₂，其中R和X如前定义。

B）式（Ⅱ）的聚碳酸酯

其中：

X和n如上式Ⅰ中所定义;

X¹表示HO-X-基团，其中X如上式Ⅰ定义，或C₁-C₄烷基，苯基，或被1-2个R¹基团和至多3个独立地选自氟、氯或溴原子或C₁-C₂₀烷基取代的苯基;

X²表示氢原子，或-CO₂X¹，其中X¹如上定义;

C）式（Ⅲ）的聚酯

其中：

X和n如上式Ⅰ中所定义;

R⁴表示-R²，如式Ⅰ中所定义，或-X¹，如上式Ⅱ中所定义;

R⁵表示

其中R⁴如上式Ⅲ中所定义;或-R²，其中R²如上式Ⅰ中所定义：

X³表示

其中R¹和Y如上式Ⅰ中所定义;或

D）式（Ⅳ）的聚酰胺：

其中：

X和n如上式Ⅰ所定义;

X³如上式Ⅲ所定义;

R⁶表示H₂N-X-NH-，R²O-，RNH-或R-C（O）-NH-X-NH-，其中R、R²和X如式Ⅰ中所定义;

R⁷表示氢原子，

其中R和R²如上式Ⅰ所定义;

X³如上式Ⅲ所定义。

本发明所用的术语如下定义：

术语“C₁-C₂₀”烷基包括“C₁-C₄”烷基，支链或直链基团，如甲基，乙基，异丙基，叔丁基，正-癸基，正十二烷基。

术语“药物上可接受的阳离子”是指药用可接受的阳离子。那些些在为达到所希望的效果所给的剂量下基本上没有毒性且不单独具有显著的药理学活性的阳离子均包括在术语“药物上可接受的阳离子”中。这些盐的例子包括碱金属，如钠和钾的盐;碱土金属，如钙和镁的盐;铵盐;包括铝在内的ⅢA族轻金属的盐;以及衍生于伯、仲、叔胺的有机阳离子、铵或烷基铵，特别是叔铵盐。例如包括三烷基胺，包括三乙胺、普鲁卡因、二苄胺、N，N′-二苄基亚乙基二胺、二氢枞胺、N-（C₁-C₄）烷基哌啶、和任何其它合适的胺。优选钠盐和钾盐。术语“药物上可接受的”是指适合给温血动物使用，特别是人类，并且包括无毒的，例如适合药用且对温血动物是无毒的。本发明低聚物的药物上可接受的阳离子可用常规的离子交换法或通过用合适的碱处理R¹酸来制备。特别是，可将作为方法一部分（步骤2）所制备的三乙铵盐转化为更优选的药物上可接受的盐，例如钠盐。

本发明的低聚物是窄多分散性和单分散性低分子量的水溶性聚合物。此外，这些聚合物具有有序的阴离子间隔。所谓“有序的阴离子间隔”或阴离子基团之间规则的间隔”是指阴离子基团（R¹）在聚合物主链中以通过所用的原料试剂所确定的间隔存在并且用可预测的方法控制阴离子基团的存在。尽管不希望受任何理论所束缚，但据信低聚物的阴离子基团是结合到HIV，HSV和/或细胞膜上的那部分，因而抑制了病毒的复制能力。

术语在水介质中“主要为线性的几何构型”是指低聚物的溶液构型。本领域中熟知的用于表征聚合物分子的溶液构型的方法基于下面的公式，它被称为Mark-Houwink方程〔“Introduction  to  Physical  Polymer  Science”，ed.L.H.Sperling，pub.John  Wiley  &  SONS（1985），pp.81-83〕，

〔η〕＝KMα

其中η是特性粘度;M是重均分子量;K是与链键长短有关的常数;α是由聚合物构型确定的常数。对于无规线团聚合物，α常数为0.5＜α＜0.8;对于线性聚合物α为0.8＜＝α＜1.8。该公式与溶液粘度“η”和分子量“M”有关。对于本发明，线性聚合物被限定为具有大于或等于0.8的“α”值。对于刚性链段聚合物，理论上限为1.8。对于给定的分子量，与以无规线团形式存在的那些聚合物相比具有线性构型的聚合物含有更高的溶液粘度。还需要考虑的是“α”值是所用溶剂的函数。对于给定的水溶性聚合物，“α”在不同的盐浓度下是不同的。对于本发明，盐浓度被设定在存在于血清中的水平（约80g/LNaCl，4g/LKCl）。

术语“单分散性”和“多分散性”低聚物（以及相似的术语）是指聚合物在样品中的分布。在样品中的多分散性是通过重均分子量（Mw）与数均分子量（Mn）之比测定的（见G.Odian，“Principles  of  Polymerization”，2d  ed，pp，20-25，John  Wiley  &  Sons，1981）。为本发明的目的，“粗制多分散性”低聚物样品为Mw/Mn＝＞1.3（见图1）。本发明的低聚物当Mw/Mn＝1.0-1.3时为“窄多分散性”低聚物（见图2）;优选Mw/Mn＝1.0-1.2更好为1.0-1.15。已由粗制多分散性低聚物混合物制备出窄多分散性低聚物。当Mw/Mn＝1.0-1.1时本发明的低聚物为“单分散性”低聚物（见图4），该Mw/Mn是在窄多分散性范围之内的一个更窄的范围。术语“窄分子量范围”是指多分散性比率比先前的样品降低了一定的量。

术语“刚性主链”是指重复单元（也称之为重复单位）主要由限制远离链轴的旋转的基团。例如，对亚苯基和酰胺基团-（C（O）-NR-）不易远离链轴而弯曲。有限数目的弯曲基团在链轴中是可耐受的，例如间亚苯基和脲。本发明的低聚物最好具有这样的刚性主链。

任何所希望的n馏分的每一单分散性馏分的纯度至少为75%，优选约85-100%。纯度被定义为所需低聚物的面积相对于在HPLC分析时所观察到的所有峰的面积之比。

这里所用的术语“低聚物”，n值包括所有可能的值，例如3-50，这些低聚物最好是n等于整数3-50，优选5-15，更好为5-10，最好为6-9的线性低聚物。当然，分子量直接关系到最终低聚物的n值。这些低聚物需具有足够低的分子量以通过肾排泄膜，而能够抑制HIV病毒。

对于本发明来说，在此描述的低聚物及其出现上可接受的盐被认为是等价的。生理上可接受的盐是指与R¹基团中至少一个酸基形成盐且当如在此所描述的那样给药时不会产生明显不利的生理学作用的那些碱的盐。合适的碱包括，例如，碱金属和碱土金属的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸镁等等，氨、伯、仲、叔胺等。特别优选的碱是碱金属氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。生理上可接受的盐可用常规的离子交换方法或通过用合适的碱处理R¹酸来制备。在此已描述了其它盐的例子。

本发明的制剂是固体或液体形式的。这些制剂可以是药盒形式的以便在使用前的适宜时间将各组分混合。不管是预混的还是以药盒形式存在的，这些制剂通常需要药物上可接受的载体或佐剂。

本发明的低聚物可溶于水和盐溶液中，特别是在生理pH下，还可溶于盐水溶液中。因此，本发明的低聚物易于配制成适宜的含水的药物剂型。当在本发明的低聚物制剂给药之后，该低聚物在体内仍是可溶的。

前面描述的式Ⅰ-Ⅳ的优选术语如下：

R和R³为4-甲苯基;

m为1;

n为3-15;

R⁴和R⁵为氢;

R⁶为苯基;

R⁷为苯甲酰基;

X¹为4-甲苯基;

X²为-CO₂-（4-甲苯基）

X³表示：

X表示：

特别优选的是式Ⅰ的聚脲，其中R和R³为4-甲苯基;m为1;n为3-15;X表示：

R²如前所定义。这样的聚脲的具体实例为：

StDS/P/T＝聚〔亚氨基（3-磺基-1，4-亚苯基）-1，2-乙烯二基-（2-磺基-1，4-亚苯基）亚氨基羰基〕，α-｛〔（4-甲苯基）氨基羰基｝-ω-〔（4-甲苯基）-氨基-，用上式Ⅰ表示，此时R和R³为4-甲苯基，R²为氢，X为

PDS/P/T＝聚〔亚氨基（2，5-二碘基-1，4-亚苯基）亚氨基羰基〕，α-｛〔（4-甲苯基）氨基〕羰基｝-ω-〔（4-甲苯基）氨基〕-，用上式Ⅰ表示，此时R和R³为4-甲苯基，R²为氢，X为

BPDS/P/T＝聚｛亚氨基〔2，2′-二磺基（1，1′-二苯基）-4，4′-二基〕亚氨基羰基｝，α-｛〔（4-甲苯基）氨基〕-羰基｝-ω-〔（4-甲苯基）氨基〕-，用上述Ⅰ表示，此时R为4-甲苯基，R²为氢，X为

特别是此时n为5，6，7，8，9或10。

特别优选的是式Ⅱ的聚碳酸酯，其中X¹为4-甲苯基;X²为-CO₂-（4-甲苯基）;n为3-15，X为

这样的聚碳酸酯的具体实例为：

HBDS/P/C＝聚〔氧（2，5-二磺基-1，4-亚苯基）氧羰基〕，α-〔（4-甲基苯氧基）-羰基〕-ω-（4-甲基苯氧基）-，用上式Ⅱ表示，此时X¹为4-甲苯基，R²为氢，X为

n为整数3-15。

HBPDS/P/C＝聚｛氧〔2，2′-二磺基（1，1′-二苯基）-4，4′-二基〕氧羰基〕-ω-（4-甲基苯氧基）-，用上式Ⅱ表示，此时X¹为4-甲苯基，R²为氢，X为

n为整数3-15。

特别优选的是式Ⅲ的聚酯，其中R⁴和R⁵为氢;n为3-15;X³表示

X表示

这样的聚酯的具体实例为：

HBPDS/TPC＝聚｛氧〔2，2′-二磺基（1，1′-二苯基）-4，4′-二基〕氧羰基-1，4-亚苯基羰基｝-，用上述式Ⅲ表示，此时R⁴和R⁵为氢，X³为对亚苯基，X为

n为整数3-15。

HBDS/TPC＝聚〔氧（2，5-二磺基-1，4-亚苯基）-氧羰基-1，4-亚苯基羰基〕-，用上式Ⅲ表示此时R⁴和R⁵为氢，X³为对亚苯基，X为

n为整数3-15。

特别优选的是式Ⅳ的聚酰胺，其中R⁶为苯基;R⁷为甲基苯甲酰基;n为3-15，X³表示

X表示

这样的聚酰胺的具体实例为：

BPDS/TPC/MBC＝聚｛亚氨基〔2，2′-二磺基（1，1′-二苯基）-4，4′-二基〕亚氨基羰基-1，4-亚苯基羰基｝，α-｛〔（4-甲苯基）氨基〕羰基｝-ω-〔（4-甲苯基）氨基〕-，用上式Ⅳ表示，此时R⁶为R-C（O）-NH-X-NH-，R为4-甲苯基，R²为氢，R⁷为4-甲基苯甲酰基，X³为对亚苯基，X为

n为整数3-15。

本发明涉及制备窄的多和单分散的阴离子低聚物的方法，该低聚物具有窄的分子量范围，这使其可用作药物（尤其是用于人类的）来治疗AIDS或ARC。具有窄分子量范围的这些低聚物优点是比该低聚物的相应混合物有更大的活性且比该低聚物有更好的性能。

本发明还涉及将上述低聚物分离成它们的单个成份（如窄分子量范围）的方法和制得所分离的低聚物产品。

在制备本发明窄的多和单分散的阴离子低聚物方法中，各个步骤如下进行：

步骤1-将粗的多分散阴离子低聚物混合物限定为窄的多分散阴离子低聚物混合物，这可通过凝胶过滤，选择性沉淀，膜透析或逆相色谱完成;和/或

步骤2-分离单分散的阴离子低聚物，这可通过凝胶电泳或逆相色谱完成。每一所需n馏分的单分散纯度至少是75%，优选约85-约100%;和

步骤3-任意地将步骤1或2的窄的多或单分散的阴离子低聚物盐转变为所需的药用盐，尤其是钠或钾盐，这可通过离子交换（尤其是当形成四丁基铵盐时）或通过加够的挥发性酸的盐来完成。

在本发明方法中，所用的方法是本领域中常规的和已知的。既然这些技术是已知的，则这些方法的一些实例描述可见如下记载：

凝胶过滤-"Protein  Purification"，ed.Charles  R.Cantor，Springer-Verlag，1987，in  the  chapter  by  Robert  K.Scopes，"Separation  in  Solution"，pp  186-198.

选择性沉淀-"Polymer  Fractionation"，ed.Manfred  J.R.Cantow，Academic  Press，1967，in  the  chapter  by  Akira  Kotera，"Fractional  Precipitation"，pp.43-65.

膜透析-"Polymer  Fractionation"，ed.Manfred  J.R.Cantow，Academic  Press，1967，pp.462.

逆相色谱-J.Chrom.Library，41A，"High-Performance  Liquid  Chromatography  of  Biopolymers  and  Biooligomers"，ed.O.Mikes，Elsevier，1988，pp.A127-A208，A303-A399.

凝胶电泳-"Protein  Purification"，ed.Charles  R.Cantor，Springer-Verlag，1987，in  the  chapter  by  Robert  K.Scopes，"Separation  in  Solution"，pp  199-215.

离子交换-"Dowex：：Ion  Exchange"，The  Dow  Chemical  Company，The  Lakeside  Press，1958，pp.39-66.

弱挥发酸盐的加入-低聚物的挥发酸铵盐溶液可通过用弱挥发酸的碱金属盐处理转变为更优选的药用盐，如钠或钾盐。通过蒸发或冷冻干燥来浓缩溶液从而除去胺和弱酸，并分离出低聚物的碱金属盐，在该步骤中可被转变的铵盐适宜例子是：氨盐，单乙胺盐，三乙胺盐，三甲胺盐或二甲胺盐（在此统一称为“铵盐”）。碱金属例子是氢氧化钠或钾，硫酸氢钠或钾，乙酸钠或钾，甲酸钠或钾或丙酸钠或钾。

粗多分散的阴离子低聚物（起始物）的制备：

在本发明制备本发明窄的多和单分散的阴离子低聚物的方法中，用作起始物的粗多分散的阴离子低聚物是按欧洲专利申请0467185（1992、9、9公开）记载的方法制备的。制备这些多分散的低聚物的方法采用了改进了的Kershner方法（美国专利No.4，895，660，其在下面进一步描述），其是用单官能封端剂取代一部分双官能单体中的一个，反应在无表面活性剂存在下进行。数均分子量（Mn）是通过化学计量的反应物来控制的。

多分散的阴离子低聚物是通过下述各种反应制备的。

上述式Ⅰ和Ⅱ的多分散的聚脲和聚酰胺

上述式Ⅰ和Ⅱ的多分散的聚脲和聚酰胺的优选方法描述于Kershner的美国专利US4824916中，进一步的说明如下，其中还叙述了各种反应物和反应条件。

二胺：包括各种各样的芳族二胺，可能的取代基的范围也很宽，可包括：羟基、烯基、低级烷基部分，羧酸酯、磺酸酯和卤素。在中性pH的水中，取代基不是必须是阴离子。

二官能亲电子试剂：碳酰氯（碳酰二氯），碳酰二溴，Cl₃COCOCl、碳酰二咪唑，Cl₃COCO₂CCl₃、芳族二元酸（如对苯二酸、间苯二酸、2，6-萘二甲酸）的酰卤化物。

酸性接受体：使用若干种碱，如碳酸钠、NaOH和三丁基胺。

溶剂混合油添加剂：可添加各种表面活性剂，合适的表面活性剂可以是非离子的，如单月桂酸脱水山梨糖醇酯，单硬脂酸脱水山梨糖醇酯、二硬脂酸乙二醇酯、聚亚乙基氧/聚亚丙基氧的聚合物。因为这样的表面活性剂从产品中除去较困难，因此，不优选使用这些表面活性剂。

溶剂：单一溶剂法使用极性非质子传递溶剂，如N，N-二甲基乙酰胺和N，N-二甲基甲酰胺。另外还可使用的是水和第二溶剂如甲苯、CCl₄、苯、丙酮、CH₂CH₂Cl₂等的混合物。通常有机的与含水的溶剂比值为约0.5至约2。

在现有技术叙述的方法中，将二酰卤添加至搅拌溶液或其它起始原料的悬浮液中。在一些例子中，碱是在添加二酰卤期间添加的。温度维持在0至50℃之间，最好是在20-30℃。可使用的反应物的比率（二胺对二酰卤的摩尔比）为约0.9-1.2，优选基本上是等摩尔量。

反应是在足以使反应物混合的搅拌速率下进行的。反应速率部分取决于相之间的界面面积，因此，优选剧烈搅拌，为此，可使用市售的掺混器。

用来制备多分散的聚脲的方法是上述方法的改进型。

二胺：本发明的二胺主要是具有前述结构式的芳族二胺。这样的二胺至少由一个在中性pH值时是带电的基团取代，最好是磺酸酯。一价脂族取代基也是允许的。可使用一小组连接芳基基团的脂族连接基团，如反式-取代的乙烯和乙炔。优选的二胺为：其中碳-氮链受迫为平行的二胺，如2，5-二氨基-1，4-苯二磺酸（PDS）、4，4′-二氨基-（1，1′-二苯基）-2，2′-二磺酸（BPDS）、反-2，2′-（1，2-乙烯二基）双（5-氨基苯磺酸）（StDS）和2，5-二氨基苯磺酸。

二官能亲电子试剂：对于聚脲的制备而言，可使用碳酰氯（碳酰二氯）和碳酰二溴，以及其它的脲前体，如碳酰咪唑、六氯丙酮、Cl₃COCO₂CCl₃、CCl₃COCl和Cl₃OCOCl。

酸性接受体：可以使用各种无机碱，如碱金属或二价金属的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐。当在添加二官能亲电子试剂之前添加所有碱时，优选有缓冲能力的酸性接受体。可使用有机碱（例如三烷基胺），但不是优选的。

单官能封端剂：可以使用各种各样这样的分子量限制剂。这样的限制剂可以是与二胺或二官能亲电子试剂反应的脂族或芳族化合物。合适的单官能封端剂的例子为胺，如苯胺、甲苯胺、甲胺、乙胺、丁胺、二乙胺、氨、N-甲苯胺、苯酚和甲酚。单官能胺反应活性剂的例子为：苯甲酰氯、甲基苯甲酰氯、乙酰氯和氯甲酸苯酯。这些封端剂还可含带电取代基，例如，2-磺基苯酚钾或4-磺基苯胺钾。

溶剂混合油添加剂：表面活性剂的添加不是必须或优选的，因为添加可使分离处理复杂化。

溶剂：当在反应温度下，二官能亲电子试剂是液体时，优选使用单一溶剂和水。这样的二官能亲电子试剂的例子是碳酰氯，当使用水不溶性固体反应物时，希望使用少量水不混溶的共溶剂，这样的水不混溶共溶剂的例子为氯仿、CCl₄、甲苯和CH₂Cl₂。通常，有机的与含水的溶剂比值为0-1，优选0-0.1。

该方法是在反应能进行的，通常为约0-100℃下进行。温度最好为0～25℃。当使用低沸点原料时，如碳酰氯（沸点6℃），在沸点或低于沸点的温度下进行操作是有利的。压力并不重要，通常使用常压。对于最佳方法而言，必须细心地维持反应的pH值。在低pH值（＜6）时，反应进行得很慢，而在高pH值（＞10）时，二官能亲电子试剂是不稳定的，这是由于受到了氢氧化物或其它碱的进攻。另外，在高pH值时，还可能发生聚脲的降解。因此，pH值最好控制在7至9之间。

当不使用封端剂时，可通过细心地调整化学计量的反应物来控制分子量。可以使用过量的二胺或二官能亲电子试剂，例如过量从1～100%摩尔。化学计算量必须计及在与二胺反应前任何被水解破坏的二官能亲电子试剂。例如，当在高pH值使用碳酰氯时，需要很大的过量，以便对破坏碳酰氯的氢氧化物的快速反应进行补偿。由于该付反应很难控制，因此，最好使用单官能封端剂来控制分子量。虽然能用所提及的工艺来控制数均分子量，但是产物仍是在分布上有特征的几种分子量的聚合物的混合物。

反应物的添加次序并不严格，然而，优选的次序是先添加二官能亲电子试剂。当使用不是缓冲剂的酸性接受体时，如氢氧化物，最优选的是，在开始时添加一部分，达到希望的pH值后，将剩下的与二官能亲电子试剂一起加入。

最后，希望在高浓度下将这些物质聚合，这样减少了为离析产物必须去除的溶剂量。在某些场合，也可在反应将近结束时，将产物从反应液中沉淀出来，也可借助简单的滗析溶剂而进行离析。除去在该方法中由酸性接受体反应产生的绝大多数无机盐。浓度并不严格，可从0.5-50wt%，其是二胺重量与溶剂重量比，优选范围为5-20wt%。

可通过用与水可混溶的、但对产物是不良溶剂的溶剂对反应溶液进行沉淀，而将产物离析，这样的溶剂的例子是丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇。

上述式Ⅱ和Ⅳ的聚碳酸酯和聚酯

使用前面应用于聚脲和聚酰胺所述的方法，下述情况除外：使用二酚代替二胺，合适的芳族二酚至少含一个在pH值为7时是阴离子的取代基。除了用羟基替代胺以外，这些二酚与那些二胺具有相同的结构。能用一或二摩尔碱预处理二酚，以形成单或二酚氧化物。一些具体的例子是：4，4′-二羟基（1，1′-联苯基）-2，2′-二磺酸二钾（HBPDS）和2，5-二羟基-1，4-苯二磺酸二钾（HBDS）。

由于在水溶液中产物的不稳定性，处理条件要严格得多，最重要的是控制pH值，在pH值低于7时，聚合速率很低，然而在高pH值（＞9）时，聚合物中的碳酸酯或酯基团将水解。优选pH值范围为7-8，并希望有一台pH值自动控制仪来维持pH值。能在更窄范围内聚合的有用的温度范围为0～40℃，优选0～25℃。

在二酰氯化物加完后，希望能搁置一段时间，通常为15-20分钟，以保证原料完全转化，在此期间可以添加附加的碱，但pH值决不能让其升至前述限量以上。粗多分散的产物如上述进行离析。

使用的方法

本发明窄的多和单一分散的阴离子低聚物可用于防止受HIV-I病毒或其它有关病毒感染的细胞中合胞体的形成。抗HIV阴离子低聚物可用于治疗由逆转录病毒HIV-I或其它有关病毒引起的AIDS、ARC和其它疾病。本发明窄的多一和单一分散的阴离子低聚物可下列形成使用：多分散比不大于1.3的混合物，或单分散的低聚物，如选择n值的具体式Ⅰ至式Ⅳ的低聚物，或多于一种通式的混合物。如式Ⅰ和式Ⅱ化合物的混合物，或与其它已知用于抗病毒的药物（如3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷（AZT））合用的混合物。

用来阻止被HIV感染的细胞中形成合体细胞的抗HIV的窄的多一和单一分散的阴离子低聚物的用量可是任意的有效量。在实验上已确定，当以10μg/mL浓度的含水配方使用时，抗HIV阴离子低聚物能完全抑制合体细胞形成，并能将存在的P₂₄抗原降低。为了医治爱滋病、ARC或由HIV感染引起的其它病症，给药的抗HIV阴离子低聚物的量能在很大范围内变化，这将根据使用的特定的剂量单位，医治周期，医治病人的年龄和性别，要医治病症的性质以及严重程度以及对从事临床工作的医生熟知的其它的因素。此外，抗HIV阴离子低聚物还能与在逆病毒病医治中是有用的并是已知的其它制剂一起使用，以及能与医治由逆病毒引起的与病症和状态有关的症状和并发症是有用的已知制剂一起使用。

根据本发明，给药的抗HIV的窄的多一或单一分散的阴离子低聚物的抗HIV有效量通常在约0.1-500mg/kg病人体重，并且能一天给一次药或多次。抗HIV阴离子低聚物与药物载体一起利用常规的剂量单位形式，或口服给药或胃肠外给药。

本发明窄的多一或单一分散的低聚物作为抗病毒剂的能力可通过它们抑制HSV病毒的生长和复制的能力来证明。这里所用的术语“治疗疱疹病毒感染的方法”意指受疱疹病毒（1型或2型）感染的患者，并给该患者服用抗病毒有效量的窄的多一或单一分散的式Ⅰ-Ⅳ化合物。因此，也可理解术语“病毒感染”意指由存在于所述患者细胞或体内的病毒为特征的任何状态或状况。

本发明低聚物的抗病毒活性可通过Tyms等人在J.Antimicrobial Chemotherapy，8，65-72（1981）中所述蚀斑一减少分析来评价。简单讲，人胚胎成纤维细胞（MRC5）在加有10%胎牛血清的Eagles′最小基本介质（MEM）在下。在24孔组织培养盘中培养。当单细胞应是半融合的时，用30-50个蚀斑形成单位的HSV2毒株HG52或HSV1毒株17i〔Davison & Wilkie，J.General Virology，55，315-331（1981）〕给它们接种。在室温1小时吸附期结束时，感染的单细胞层用含2%胎牛血清，0.5%低温胶凝琼脂糖和一定浓度范围的抗病毒化合物的MEM覆盖。在培育3天后，细胞在10%福尔马林的盐水中固定，随后用0.3%亚甲基兰染色。剂量一反应曲线是从存在的蚀斑平均数对化合物浓度的log值绘制出来的。50%有效剂量（ED₅₀）是在线性回归分析后计算出来的。

将本发明窄的多一或单一分散的阴离子低聚物用于治疗人类HSV感染是非常重要的。术语“疱疹病毒感染”意指由疱疹Ⅰ型或Ⅱ型病毒引起的感染。这里所用的术语“患者”意指哺乳动物，如灵长类，包括人，羊，马，牛，猪，狗，猫，大鼠和小鼠。

所服用的窄的多一或单一分散的式Ⅰ-Ⅳ阴离子低聚物的量可广泛变化，这将根据所用的具体剂量单位，治疗周期，所治疗患者的年龄和性别，所治疗疾病的性质和严重程度，选择的具体阴离子低聚物，更具体讲，阴离子低聚物可与已知在治疗HSV和CMV感染中有效的其它药物一起合用，并能与治疗由病毒引起的疾病或状况有关的症状或并发症中有效的已知药物一起合用。式Ⅰ阴离子低聚物的抗疱疹病毒和抗细胞肥大病毒的有效给药量一般为约15mg/kg至500mg/kg。单位剂量可含25至500mg阴离子低聚物，并可一天分一次或多次给药，阴离子低聚物可与药物载体一起以常规剂量单位形式口服，非肠道给药或局部给药。

对口服给药而言，抗HIV或抗HSV阴离子低聚物能配制成固体或液体制剂，如胶囊、丸剂、片剂、糖锭剂、锭剂、熔化物、粉剂、溶液、悬浮液或乳液。固体单位剂量形式可是常规的硬壳或软壳明胶类的胶囊，其含例如，表面活性剂，润滑剂和惰性填料如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、磷酸钙和玉米淀粉。在另一个具体例中，本发明的阴离子低聚物能与下述物质一起制成片剂，这些物质如常规的片剂载体如乳糖、蔗糖和玉米淀粉以及粘合剂如阿拉伯胶，玉米淀粉或明胶;用来帮助给药后片剂破碎和溶解的崩解剂，如土豆淀粉、藻酸、玉米淀粉和瓜尔树胶;用来改善片剂流动性并防止片剂与压片模和冲片头表面粘结的润滑剂，如滑石、硬脂酸或硬脂酸镁、硬脂酸锌或硬脂酸钙;用来增加片剂美学程度并使病人更容易接受的染料、着色剂和调味剂。用于口服液体剂量形式的合适的赋形剂包括稀释剂如水和醇，例如，乙醇、苯甲醇和聚乙二醇，既可添加也可不加药物可接受的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂。

本发明的抗HIV或抗HSV的窄的多一和单一分散的阴离子低聚物也可胃肠外给药，也就是，以生理上可接受的用药物载体稀释的阴离子低聚物可注射的剂量形式进行皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内给药。药物载体可是无菌液体或液体混合物，如。水、盐水、葡萄糖和相应糖水溶液、醇（如乙醇、异丙醇、十六烷醇），二醇（如丙二醇或聚乙二醇），甘油酮缩醇类（如2，2-二甲基-1，3-二氧戊烷-4-甲醇），醚类（如聚乙二醇400），油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯，可以有或没有附加的药物可接受的表面活性剂（如皂或洗涤剂），悬浮剂（如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、或羧甲基纤维素），或乳化剂和其它药物辅助剂。

作为能用于本发明胃肠外给药的油的例证是：由石油、动物、植物、或合成来源的那些油，例如：花生油、豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林和矿物油。合适的脂肪酸包括：油酸、硬脂酸和异硬脂酸。合适的脂肪酸酯是：例如，油酸乙酯和十四烷酸异丙酯。合适的皂包括：脂肪碱金属盐、铵盐和三乙醇铵盐。合适的洗涤剂包括：阳离子洗涤剂，例如卤化二甲基二烷基铵，卤化烷基吡啶鎓和乙酸烷基胺;阴离子洗涤剂，例如，烷基、芳基和烯基的磺酸盐，烷基、烯基、醚和单甘油酯的硫酸盐和硫代琥珀酸盐;非离子洗涤剂，例如，脂肪胺氧化物，脂肪酸烷醇酰胺以及聚氧乙烯聚丙烯共聚物;两性洗涤剂，例如，烷基-β-氨基丙酸和2-烷基-咪唑啉季铵盐，以及其混合物。本发明的胃肠外给药组合物通常含约0.5～25%重量的抗HIS的阴离子低聚物溶液。还可有利地使用防腐剂和缓冲剂。为最大程度地减少或消除注射时的病疼，该组合物可以含具有亲水-亲油平衡值（HLB）为约12～17的非离子表面活性剂。在这样的配方中，表面活性剂的量在约5～15%重量范围内。表面活性剂可是具有上述HLB的单一组份，或可是具有所需HLB的两组份或多组份的混合物。用于胃肠外给药配方的表面活性剂的例子是聚亚乙基脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯。

本发明的窄的多一和单一分散的低聚物还能预防性地使用，也就是，防止将感染人的病毒传播到未感染的目标上。病毒主要是通过血交换而传播的。但是也可以通过其它体液的交换而传播。因此，本发明的低聚物可制成用于清洁的标准洗涤剂产品，特别是用于研究和临床实验室以及医院中处理被感染人的血制品处。含本发明低聚物的配方能用来清洁医疗/手术设备和器皿，以及护理人员的手和其它部位的皮肤。本发明的低聚物也能以液体或粉末组合物的形式，由使用者或在销售前由制造者用至性预防工具如阴茎套的表面。本发明的低聚物能制成供女性使用的灌洗组合物，其是在随后要与已感染的人进行性接触前使用。本发明的低聚物还能制成润滑剂、杀精子凝胶和洗液。最后，本发明的低聚物还能制成添加至热浴盆、涡旋浴和游泳池的组合物以便使潜在病毒的活性失活。

本发明将通过下面的实例进一步说明，其仅仅是对本发明的解释。

除另有说明外，实施例中所用术语如下定义，例如，在表示适宜的仪器和树脂情况下，可使用相似的仪器或不同参数或树脂：

凝胶过滤柱＝Sephadex^TMG-25凝胶过滤柱（3.0cm×94cm）;

蠕动泵＝Gilson Minipuls^TM蠕动泵;

UV检测器＝Isco型UA-5紫外检测器;

HPLC＝高效液相色谱;

具有10000道尔顿截止能的膜过滤器＝Amicon的Centricon-10

具有3000道尔顿截止能的膜过滤器＝Amicon的Centricon-3;

液相色谱＝Hewlett Packard^TM1090;

二极管阵列检测器＝具有4nm或100谱带宽度的280nm，320nm，340nm或550nmUV;

逆相色谱柱Ⅰ＝Alltech Hypeoprep^TM120ODS;

逆相色谱柱Ⅱ＝Alltech Absorbosphere^TMHS高碳载C18;

注射柱＝Alltech Maxi-Clean^TMSCX;

TCID50＝组织培养感染剂量，即感染7天后感染50%细胞（50%细胞致病作用）的有效培养液量;

MTT＝四唑鎓还原剂;3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-苯基四唑鎓溴化物;

RPMI1640＝由GIBCO得到的标准细胞培养基;

MT4＝人T细胞转化的细胞系;

IC₅₀＝抑制50%病毒生长的抑制剂量;和

pfu＝蚀斑形成单位。

起始物的制备

实施例A：溴封端

4-颈烧瓶带有注射口，温度计，机械搅拌器，pH电极，干冰冷凝器和碳酰氯气体插管。该烧瓶载有8.00g（23.23mmol）4，4′-二苯基-2，2′-二磺酸，0.961g（5.162mmol）2-溴-4-甲基苯胺和250ml水。将该烧瓶冷却至12℃，并用11ml5M氢氧化钠处理搅拌的悬浮液直到所有固体溶解并且pH达到11.5。用10分钟往该混合物中加入4.5g（45mmol）碳酰氯，并补加5M氢氧化钠以保持pH为8-9。搅拌3小时后，将1.848（9.93mmol）额外的2-溴-4-甲基苯胺与100ml水一起加入其中，然后往其中再加入3.7g（37mmol）碳酰氯，并加足够的5M氢氧化钠以保持pH为8-9。继续搅拌过夜（约16小时），然后将内容物在1000ml丙酮中沉淀，过滤产物，用100ml丙酮洗三次，然后将滤瓶转至结晶盘中并于50℃真空烘箱中干燥过夜，得11.249g粗米色粉末。所得产物结构如下：

其粗多分散度（Mw/Mn）约为1.4。

实施例B

式Ⅰ-Ⅳ的粗多分散的低聚物的制备方法见欧洲专利申请0467185，1992，9，9公开。

将粗低聚物混合物限定成窄的多分散的低聚物混合物;步骤1

实施例1：凝胶过滤

A：将0.542g式Ⅰ粗多分散的磺化聚脲（实施例B起始物，数均聚合度为9（图1所示，Mn＝2348，Mw＝3408Mw/Mn＝1.45）的8.43ml水溶液通过凝胶过滤柱，去离子水流速恒定为5.0ml/分钟，用蠕动泵维持。洗脱液于310nm通过UV检测器检测阴离子低聚物混合物的存在。40分钟后样品开始出现，收集4.0ml馏分。HPLC分析表明每一馏分的分散度都比起始原料有了很大降低。例如，馏份14（见图2）由25mg窄分散度的低聚物（Mn＝2549，Mw＝2880，Mw/Mn＝1.13）组成。馏分7-17合并得271mg样品（如图3所示，Mn＝2860，Mw＝3830，Mw/Mn＝1.34）其具有降低量的低滞馏时间杂质。

在图1-4中，0-3分钟间的峰代表无封端的低聚物，3-5分钟间的峰代表单封端的低聚物，5-14分钟间的峰代表所需的二-封端的低聚物，在14分钟时，n为1，13分钟时，n为2，12分钟时，n为3，类似地从右到左计数n。

纵坐标轴代表于280nm处的UV吸收，单位为毫吸收单位（“mAU”）。样品浓度没有测定;因此，样品峰大小变化没有意义。

B：凝胶过滤柱是通过将115gPharmacia Sephadex^TMG-10（40-120μm微球）树脂在约500ml蒸馏水中膨胀1小时制备的。将该悬浮液置于1升量筒后，从树脂混合物除去细粉。玻璃柱用树脂浆填，500ml蒸馏水通过该柱生成2.5×50cm过滤床。用蠕动泵保持通过柱的恒定流速（流速约3-4ml/分钟）。洗脱液通过UV检测器在310nm处检测窄多分散阴离子低聚物混合物的存在。

50mg式Ⅰ多分散阴离子聚脲（实施例B起始物，¹HNMR测定Mn为2730）溶于2.5ml蒸馏水中，然后将该溶液加到柱子顶部。该材料用蒸馏水洗脱，收集三份馏分，每份25ml，用HPLC分析这些馏分表明：馏份1主要是较高分子量低聚物，馏份2和3主要是相对起始物分子量更低的低聚物。

C：

1.078g上述制备的溴封端产物（实例A的起始物）于10ml水中的粗混合物溶液通过凝胶过滤柱。用蠕动泵保持去离子水的恒定流速为5.0ml/分钟。洗脱液用UV检测器于310nm处检测低聚物混合物的存在。40分钟后样品开始出现，收集3.0ml馏份，HPLC分析表明每一馏份的分散度都比起始物的降低很多。合并馏份8-11得约300mg溴封端样品，其具有降低量的低滞留时间杂质。因此分离出提高了纯度的溴封端的多分散低聚物。

实施例2：选择性沉淀

制备3.93g式Ⅰ粗多分散磺化的聚脲混合物（来自实施例B起始物，数均聚合度为6）的40ml水溶液。往该溶液中加40ml丙酮，离心分离产生沉淀。蒸发可溶部分得平均聚合度约为4的0.82g窄的多分散度馏份。

实施例3：膜渗透

将每mL溶液含10mg多分散磺化的式Ⅰ聚脲（实施例B起始物，数均聚合度为6）的167μL粗混合物采用离心通过具有10000道尔顿截止能的膜过滤器。通过该过滤器的部分类似地采用具有3，000道尔顿截止能的膜进行分级分离。分离的结果产生了低聚物混合物，其中每一馏份的分散度都比起始物的降低了很多，且没有来自所需聚合度的低和高分子部分。图5顶部曲线表示式Ⅰ的粗多分散的聚脲，图5的第二条曲线表示通过10，000道尔顿过滤器的物质被3，000道尔顿过滤器截留了。

实施例4：逆相色谱

配有二极管阵列检测器（280nm）的液相色谱带有250μL样品圈。使用填有10μm颗粒的逆相色谱柱Ⅰ（9.4cm×50mm）。3.8g式Ⅰ多分散磺化的聚脲（来自实施例B起始物，数均聚合度为6）粗混合物的2.65mL水溶液以每批200μL的量注入。两个洗脱剂的比恒定：5mM（n-Bu₃N）PO₄水溶液∶乙腈＝45∶55（v/v），观察到的宽峰是手工分离的。每一馏份用HPLC分析，分析结果表明低聚物混合物的多分散度比粗原料的窄。

分离单分散低聚物作为其铵盐;步骤2

实施例5：逆相色谱

A.

用250μL样品环对装有二级管阵列检测器（320nm）的液相色谱仪进行改装。使用填有3μm颗粒的逆相色谱柱Ⅰ（10mm×250mm）。将905.2mg得自实施例B起始物的式Ⅰ多分散磺化聚脲在18ml水中的粗混合物溶液以每批200μL的量注入柱内。以1.5mL/min注入的洗脱剂为5mM水溶性Et₃NHOAc、乙腈及四氢呋喃的溶液。开始时这三种成分的比例为80∶20∶0（v/v/v），该比例线性改变，至21.5分钟时为70∶30∶0（v/v/v），至27分钟时为30∶40∶30（v/v/v），然后将其维持不变，直至36分钟，此时色谱终止。5分钟后，注入附加样品，用级分收集器收集洗脱液。连续洗脱约24小时后，分析所收集的级分，得到几个含2-9个重复单位低聚物的级分（85-100面积百分纯度）。将这些级分于50-55℃、约20mmHg柱压力下蒸发，然后于50℃真空烘箱中干燥过夜。得到为浅琥珀色玻璃的聚脲的三乙基铵盐，产量为10-30mg。

B.

用250μL样品环改装装有二级管阵列检测器（320mm）的液相色谱仪。使用填有3μm颗粒的逆相色谱柱Ⅱ（10mm×250mm）。将得自实例1C的粗品混合物溶液溶于5ml水中并过滤。按75μL的量进行注射。流速为1.5ml/min的洗脱剂为50mM水溶性Et₃NHOAc及乙腈的溶液。两种成分的起始比例为70∶30（v/v），该比例在维持10分钟后被线性改变，直至15分钟时为60∶40（v/v），将这一比例保持至25分钟，此时洗柱结束。5分钟后注入附加样品，用级分收集器收集洗脱液，连续操作约24小时后，分析级分。得到含有1-9个重复单位低聚物的9个级分（95-100面积百分纯度）。将这些级分于20mmHg、50-55℃条件下蒸发后，在室温下于真空烘箱中干燥过夜。得到为浅琥珀色玻璃的单分散聚脲的三乙基铵盐（Mw/Mn低于1.1），产量为5-10mg。

C：

用250μl样品环改装装有二级管阵列检测器的液相色谱仪，使用填有7μm颗粒的逆相色谱柱（10mm×250mm）。将按类似于实例1C方法制备的200mg式Ⅳ聚酰胺粗品混合物（Mn＝1300）溶液溶于3ml水中并过滤。注入75μL该溶液，流速为1.0mL/min的洗脱剂为50mM水溶性Et₃NHOAc和乙腈的溶液。这两种成分的比例为72∶28（v/v）。用级分收集器收集洗脱液，连续操作24小时后，对级分进行分析。得到含有1-4个重复单位低聚物的级分。于20mmHg、60℃条件下蒸发这些级分后再于50℃真空烘箱中干燥过夜。得到为白色固体的单分散聚酰胺的三乙基铵盐。所形成的产物具有如下通式：

D：

当在Et₃NHOAc存在下进行分离时，随着保留时间的增加低聚物链长下降;而当在磷酸四丁铵存在下进行分离时，则得到反规则洗脱，即链长随时间增加而增加。图6显示了使用Et₃NHOAc的HPLC图谱，图7显示了使用磷酸四丁铵的HPLC图谱。图8显示了纯化的图6单分散成分的HPLC图谱。

利用磷酸四丁铵进行其它HPLC色谱。图8显示了式Ⅰ聚脲的低聚物的各种级分。图8中，顶端的曲线代表多分散低聚物粗品起始物。各成分的链长随保留时间的增加而增加（与图7一致）。第二条曲线为按实例3方法用膜过滤器将粒径分布限制在3，000-10，000道尔顿之间而将粗阴离子低聚物混合物限制为较窄的多分散阴离子低聚物混合物之后的低聚物。收集单个低聚物级分后用磷酸四丁铵再次进行HPLC，其结果示于图8的其它分离图谱中，其中显示了n为1-9的每种单分散低聚物。图8中最后的图谱显示了n等于10-13的低聚物混合物。

将低聚物铵盐转化为相应的钠盐;步骤3

实施例6：离子交换

A：

将得自实施例5的样品分别溶于约2ml去离子水中，并将其通过填有0.5meq酸式磺化交联聚苯乙烯的注射层析柱。用1mL水两次洗涤该柱。蒸发后，通过质子NMR分析所有样品，结果发现三乙基铵离子已被完全除去并被氢所取代。

含有一个以上重复单位低聚物的样品为非对映体混合物。虽然这些级分似乎为单一化合物，但它们实际上是非对映体的异构混合物，这是由于重复单位中联苯基团的手性特征所造成的。图4显示了典型的HPLC分析（Mw＝2950，Mn＝2800，Mw/Mn＝1.05），它显示单峰占优势。在该样品中，较小的早期保留时间峰为单封端低聚物系列，它由主成分在分离过程中被水解造成。

通过¹H-NMR比较甲基区域及芳香区域在末端上的整合可计算出低聚物的Mn。通过飞行时间质谱分析法对几个选择样品也进行了分析，它证实了NMR的测定结果。

B：

用2mL5M NaCl预处理填有0.5meq酸式磺化交联聚苯乙烯的注射层析柱，并用5ml水冲洗该柱。将得自实施例5B的样品分别溶于约2mL去离子水中并通过该柱，以用Et₃NH⁺阳离子交换Na⁺。用1ml水洗柱两次，蒸发后，通过质子NMR分析所有样品，结果显示三乙基铵离子已被除去。通过飞行时间质谱分析法对几个选择的样品也进行了分析，它证实了NMR测定的结果。

C：

使用实施例6A中所述的注射层析柱，将实施例5C聚酰胺的三乙基铵阴离子转化为相应的钠盐。

实施例7：挥发性弱酸的盐的加入

将冻干的式Ⅰ聚脲低聚物（由BPDS和甲苯胺制得，并通过制备性HPLC利用Et₃NHOAc缓冲液分离）溶于去离子水中，并用乙酸钠处理。每当量低聚物的磺酸盐加入1当量乙酸钠。将溶液冷冻干燥20小时以除去水、三乙胺和乙酸。

将63mgn等于9的低聚物级分溶于10ml水及195μl1.1M乙酸钠（NaOAc）溶液中。冷冻干燥所得溶液，回收57mg低聚物。

按类似方法，将82mgn等于7的低聚物级分溶于10ml水及250μl1.1M  NaOAc溶液中。冷冻干燥溶液，回收到79mg低聚物。

将162mgn等于5的低聚物级分溶于10ml水及277μl1.1M  NaOAc溶液中。冷冻干燥溶液，回收到144mg低聚物。

生物学实验数据

例Ⅰ：各种抗HIV低聚物阻止病毒诱导的细胞死亡的能力（利用MT4细胞和HIV-1RF株）

利用标准的四唑鎓还原检测法〔Nakashima et al.，J.Vizol Methods 26，319-330（1989）〕测定式Ⅰ聚脲的各种单分散低聚物的抗病毒活性。将低聚物以标准浓度（约100μg/ml）溶于RPMI中，然后在96孔微量滴定板上通过双稀释测定抗HIV活性。向每孔中加入5×10⁴MT4细胞和100TCID50病毒（HIV-1RF株），并将平板于37℃保温7天。向每孔中加入MTT后再将平板保温2小时。利用酸性异丙醇溶解蓝色甲结晶，并测定540nm处的吸收光率。其结果示于表Ⅰ。

表Ⅰ

MTT检测

例Ⅱ：用各种低聚物处理细胞并阻止HIV-Ⅰ感染的能力（利用JM细胞和HIV-Ⅰ的GB8株）

利用标准的合胞体检测法〔Cardin  et  al.，Trans  Assoc  Amer  Phys.C，101-109（1989）和Cardin  et  al.，J.Biol  Chem.266，13355-13363（1981）〕鉴定式Ⅰ聚脲的各种单分散低聚物的抗病毒活性。于37℃用各种浓度（μg/ml）的不同化合物处理JM细胞。或将其放置不处理。将RPMI培养基中的细胞用HIV-Ⅰ（GB8）在室温下感染2小时。然后将细胞在RPMI培养基中洗涤两次，并重新悬浮于含有已被分级分离的低聚物的新鲜培养基中，然后分配至双份孔中，于37℃保温。3天后记录合胞体，其结果见表Ⅱ。

表Ⅱ

合胞体检测

图9显示了各种低聚物级分的IC₅₀抗病毒浓度的直方图。抗病毒效价随低聚物链长的增加（直至n＝9）而增加。多分散级分及n为10-13的级分的混合物的抗-HIV-1活性的效价几乎相等，但它们均低于单分散低聚物级分的n为6-9的各级分的效价。

实施例Ⅰ：窄的多分散和单分散式Ⅰ聚脲对HSV-2复制的影响

将Vero细胞在24孔组织培养平板上培养至融合。按50-pfu/孔的感染复数用HSV-2感染细胞。感染是在有或没有BPDS/P/T存在的情况下进行，BPDS/P/T即为聚｛亚氨基〔2，2′-二硫代（1，1′-二苯基）-4，4′-二基〕亚氨基羰基｝，α-｛〔（4-甲基苯基）氨基〕-羰基｝-ω-〔（4-甲基苯基）氨基〕-，且由权利要求1的式Ⅰ表示，其中R为4-甲基苯基，R²为氢，X为

且n的定义如表Ⅰ所示，于室温下吸收2小时后，除去接种物，并用含有合适化合物浓度的琼脂糖叠层培养细胞。37℃培养2天后固定细胞，并用亚甲蓝染色。对噬菌斑进行计数，并计算出每种浓度化合物的抑制百分数。利用线性回归分析计算出每种化合物的IC₅₀，结果见表Ⅲ。

表Ⅲ

单线性疱疹Ⅱ型

参照本说明书或这里所公开的本发明的实施，本领域熟练技术人员将很容易看出本发明的其它实施方案。本说明书及实施例反应被看作是解释性的，本发明的实际范围及精神将由下面的权利要求书加以说明。