用于制备α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的“一勺烩”方法

摘要

公开了用于制备α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(α-APM(HCl)的“一勺烩”方法。α-APM(HCl)是制备糖精的中间体。

说明书

本发明涉及制备α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐（α）APM（HCl）的“一勺烩”反应法，该盐酸盐用于制备α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯（α-APM），后者是一种甜味剂，其甜度约是蔗糖的200倍。这种二肽化合物的增甜效果极佳，与普通糖相比，只要非常少的一点量就足以使食品或饮料出现甜味。其结果是使广大消费者在不必放弃享受甜品的同时，可以减少摄取热量。与其他甜味剂（如：糖精，环己基氨基磺酸盐）相比，这种二肽化合物也没有不良回味现象。另外，本发明还涉及增加APM（HCl）α/β比例的方法，以及生产具有易流动的粘度的最终反应混合物（α/β）APM（HCl）的方法。

α-APM是已知化合物，1970年授予Schlatter的美国专利3，492，131号对它作了描述。从那时起不断涌现出大量的涉及各种制备方法及相关化合物的其他专利，并且文献报道之多也预示了这种二肽对低热量甜味剂工业的巨大影响。但是至今为止，制备方法一直局限于高成本的离析和回收方法，这一负担必然地转嫁到消费者身上。与先有技术相比，采用本发明方法在不必离析中间体的同时，可以类似的产率得到所期望的最终产物。

α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯是一种基本上由两种氨基酸，即，L-天冬氨酸和L-丙氨酸组成的二肽。一个时期以来人们认为：该二肽的增甜性能取决于上述各单体氨基酸的立体化学。这两种氨基酸中每一种氨基酸既可以以D式也可以L式存在，并且已经确认：L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸酯具有甜味，而相应的D-D，D-L和L-D异构体则没有。将含有L-L二肽的各异构体混合，也就是说将DL-天冬氨酰-L-苯丙氨酸，L-天冬氨酰-DL-苯丙氨酸和DL-天冬氨酰-DL-苯丙氨酸混合，它们可产生甜味，但甜度只是该二肽的一半，其原因是外消旋体中只含有1/2的L-L体。

通过将天冬氨酸与L-苯丙氨酸或其甲酯连接在一起的偶合反应可以制得上述二肽，该偶合反应需要在天冬氨酸部分接上氨基保护基，例如，甲酰基，乙酰基，乙酰乙酰基，苄基，取代或未取代的苄酯基，叔丁氧羰基，和氢卤酸盐。用于本发明目的的氨基保护基（在本领域常称之为N-保护基）应称之为N-甲酰基，其原因是甲酰基部分是本发明的封锁剂。甲酰化的天冬氨酸酐是一种广泛采用的起始原料，并且该方法已有很多描述（参见：美国专利4，175，562号）。

在溶剂中进行的该偶合反应是下述生产α-L-天冬酰-L-苯丙氨酸甲酯（α-APM）的几种专利方法中一步共同反应;参见;美国专利3，962，207号（Uchiyama），美国专利4，173，562号（Bachman），欧洲专利127，411号（Yaichi等），所有这些均引为本发明的参考文献。在两个氨基酸进行偶合反应的过程中，产生两种异构体作为中间体，并且，它们的立体化学最终决定了具体分子的甜度。α-异构体是所期望的产物，从中离析出的纯α-APM所具有的甜度约是普通糖的200倍。而β-异构体则没有这么高的甜度。本发明的目标是改进α-APM的制备方法，以期以更低的生产成本，更高的产率制备所期望的最终产物-α-异构体。

APM的α和β异构体的结构如下：

          α异构体                β异构体

已知，由该偶合反应所形成的α和β异构体，以及各异构体的比例取决于用于该反应的溶剂种类、发生该反应的温度和所用溶剂的量。根据美国专利4，173，562号（Bachman），当采用乙酸作为溶剂在50℃进行偶合反应时，α/β异构体比例可以达到75∶25。乙酸对苯丙氨酸的摩尔比必须至少为10∶1。当乙酸对L-苯丙氨酸的摩尔比降至6∶1时，α/β异构体比例突然下降到69/31。本发明表明：如果用烷基酯、位阻醇或它们的混合物部分地代替乙酸作为偶合反应的溶剂，α/β比例可以增至约80/20。为此，本发明所采用的位阻醇应该是指仲或叔醇。

在本方法中采用这些溶剂所引起的问题是在反应0.5至3小时后，反应混合物固化，变得实际上无法搅拌，或者不可能从反应器中取出，可搅拌的体系必须至少满足两个要求，即，一方面搅拌应保证反应物混合达到反应完全的目的，第二方面是在反应后必须能通过蒸馏除去溶剂。

先有技术所存在的另一个问题是：在某些工艺条件下，由于α-APM仍留在原反应液中，因此，会损失25%或更多的α-APM（参见：美国专利4，173，562号）。还有一个问题是：在上述美国专利中，由天冬氨酸，大量过量的甲酸和乙酸酐的反应混合物来生产甲酰基-L-天冬氨酸酐。在反应过程的某一点必须要通过蒸馏除去过量的甲酸，并且，从乙酸中分离甲酸势必要增加最终产物的成本。

美国专利3，962，207号介绍了使L-天冬氨酸酐盐酸盐与L-苯丙氨酸甲酯偶合的类似方法，在该方法中所存在的问题是L-苯丙氨酸甲酯的需要量很大，这也使该方法的成本增加。第二，该方法导致形成相当量的三肽，由于必须要除去这些三肽而势必增加成本，并使分离工艺复杂化。而这一点在本发明中是不会出现的。

本发明的目的是提供制备α-APM（HCl）的方法。采用“一勺烩”方法达到了这一目的，在该方法中，在形成甲酰化L-天冬氨酸酐过程中产生的反应副产物同时作为偶合反应的溶剂，由此避免了分离过程所带来的许多问题，并且使制备成本降低。用酯或位阻醇稀释该偶合反应物料可以提高α-APM（HCl）的收率。

先按类似于先有技术的方法（参见：美国专利3，933，781号，3，962，207号和4，173，562号）使天冬氨酸与乙酸酐和甲酸混合，制得N-甲酰基-L-天冬氨酸酐。但是，在本发明方法中只采用极少量的甲酸（每摩尔天冬氨酸用1.2-1.35摩尔当量），并且，通过加入乙酸酐和异丙醇使其过量部分转化为甲酸异丙酯。

然后，通过加入L-苯丙氨酸（L-Phe）使甲酰化的天冬氨酸酐就地偶合。任选在偶合反应中加入烷基酯或位阻醇可以令人惊奇地改善α/β比例。而且，按通常方式通过醇与酸酐反应制备酯，会出现意料之外的结果，即，在该反应过程中，位阻醇不能进攻甲酰基天冬氨酸酐。该偶合反应可以在低速或无搅拌条件下进行，借以保持反应混合物的低粘度，以使最终的反应混合物为可流动体。

然后，用盐酸脱去所得二肽的甲酰基，并将甲醇、水和盐酸的浓度调节到有效量，使之发生酯化反应。由此产生高收率的α-APM（HCl）。该αAPM（HCl）从反应混合物中沉淀，分离之，用碱中和，形成α-APM。

本发明涉及制备α-APM（HCl）的改进方法。本发明的“一勺烩”方法，在开始阶段是在催化剂（如氧化镁）存在下，将L-天冬氨酸与最少量的甲酸（以天冬氨酸计至少为1.2摩尔当量）和乙酸酐（以天冬氨酸计至少为约2.0摩尔当量）混合，借以形成N-甲酰基-L-天冬氨酸酐。适宜的催化剂包括金属的氧化物、氢氧化物和盐，并且，本文引为参考文献的美国专利4，508，912号和4，550，180号公开了这些催化剂。该反应温度高至约52℃，最好在50℃左右将该混合物至少搅拌约2.5小时。约2.5小时后补加乙酸酐（约0.2mole），其目的是将所有过量的未反应甲酸转化为甲酸-乙酸酐，即，混合酸酐。再过2.5小时后，加入过量的异丙醇（以加入的甲酸总量计至少为约0.3摩尔当量）使所有的甲酸-乙酸酐转化为甲酸异丙酯。以天冬氨酸计，所采用的甲酸量最好是1.3至1.35摩尔当量。

另一方式，在反应开始时间将乙酐一次全部加到反应混合物中（每摩尔天冬氨酸加2.3-2.9摩尔），然后加入仲醇，通过与混合酸酐反应生成相应的酯来消耗掉过量的甲酸。或者将少量的乙酸酐与仲醇一起一次加入即可。但是，最好将甲酸、大部分乙酐及催化剂混合2-3小时左右，然后再加入少量的乙酐。在混合状态下使该反应再维持2-3小时，然后向该反应物中加入仲醇（异丙醇）。将该最终反应混合物混合，最好是在50℃左右再混合2-3小时致使反应完全。

然后，使产物N-甲酰基-L-天冬氨酸酐与L-苯丙氨酸就地反应，由此省去了全部昂贵、耗时的分离过程。该反应副产物可用作该偶合方法的共溶剂。

任选在烷基酯或位阻醇或两者的适宜混合物存在下，使L-苯丙氨酸与等摩尔量的N-甲酰基-L-天冬氨酸酐偶合。现已发现：如果每摩尔L-苯丙氨酸中加入至少1.2摩尔左右的烷基酯和/或位阻醇时，可以增加α/β比。随着酯或醇的量增加，α/β比也增加，但其最高点是酯、醇或其混合物的摩尔量为L-苯丙氨酸摩尔量的约4.7倍，此时，达到饱和水平，即无论再加入多少酯或醇，异构体的比例保持恒定。

在该偶合反应中所采用的烷基酯最好选自乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸异丙酯，乙酸正丁酯和甲酸异丙酯。乙酸甲酯（MeOAc）是优选的烷基酯。可采用的位阻醇包括异丙醇、仲或叔丁醇。异丙醇是优选的位阻醇。这些是本发明的优选实施例，但这并不意味着限制使用其他烷基酯或位阻醇，也不意味着限制本发明的范围。

然后，在约5°-60℃，最好是在15°-30℃（即，室温）将上述混合物搅拌4-6小时左右，即可完成该偶合反应。在该偶合反应期间出现的问题是：随着该反应形成N-甲酰基-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸，该混合物或浆状物开始固化，即，粘度增高，直到搅拌变得非常困难，甚至无法搅拌，当粘度高到这种地步时，就很难过滤，并且妨碍热传导，致使下文所述的乙酸、酯和/或位阻醇的蒸馏受到妨碍。现已发现：在偶合反应中加入乙酸可以抑制这一固化，即，降低其粘度。正是这一混合作用保证了反应完全。此外，在脱甲酰基之前必须通过蒸馏从该混合物中除去酸和酯。为了做到这一点，该反应混合物必须是可搅拌的。

加入乙酸酐的量取决于合成多少N-甲酰基天冬氨酸酐。由于该偶合反应直接在反应副产物中进行，因此，在L-天冬氨酸和乙酐之间进行初反应时就应已有一些乙酸存在了。在该系统中的乙酸总量，以摩尔/摩尔计算，应该是L-苯丙氨酸量的7倍左右。因此，没有必要以7倍于L-苯丙氨酸的量加入乙酸。当该体系中已有乙酸的总摩尔量约为L-苯丙氨酸量的7倍时，只加少量的乙酸就可以了。

尽管可在常温下进行偶合反应，但最好将温度升高，这样也有助于降低反应混合物的粘度。有利于该反应的温度在25℃至40℃之间，最好是在30℃左右。

本发明的另一特点是通过控制对偶合反应混合物的搅拌来降低偶合反应混合物的粘度。现已发现：在偶合反应过程中停止或降低搅拌速度可以显著地降低偶合反应混合物的粘度。在大型反应器中（装有5英尺长桨叶机械搅拌器的直径为10英尺的反应器），以很慢的速度搅拌，例如，每分钟5-40转（rpm），并采用间歇搅拌法，即每隔5-15分钟短暂地启动搅拌，与每分钟60转或更快的搅拌速度下进行的反应相比，采用前一种方法可以大大地降低偶合反应混合物的粘度。在实验室规模的反应器中（装有3英寸桨叶的4英寸圆底烧瓶），200-300rpm使反应混合物变得很稠，而以5-15rpm搅拌时，则成为流动性很好的低粘度反应混合物。在该反应混合物中加入L-Phe后1小时左右关掉搅拌器，待该反应（约6小时）产生低粘度反应混合物后再启动搅拌。但是在工业生产中，搅拌器停止时间超过1小时后，由于沉淀物沉积和结块，使得再启动搅拌器变得很困难。因此，最好采用慢搅拌和间歇搅拌。

本文所采用的术语“可流动”或“低粘度”用于偶合反应混合物时，意指可从玻璃容器或反应器中倾出的液体。这类液体的粘度一般在约15000厘泊（cp）以下，优选者在1000-10000cp之间，最好是在150-500cp之间。

在实施本发明的过程中搅拌方法并不十分重要。可以采用任何标准的搅拌方式，例如，注入惰性气体，振荡，翻滚反应器，机械搅拌等。优选的是机械搅拌。具体的搅拌器结构也并不十分严格。采用桨式或叶片搅拌器时，搅拌速度一般是5-40rpm左右，最好是20rpm左右。虽然桨端速度（米/秒）随根据桨长而调定的rpm而改变，但就实施本发明而言，rpm更准确地反映了搅拌速度。低于40rpm（±）的任何搅拌速度均可以降低反应混合物的粘度。但是，应该注意到，就实验室设备（4英寸烧瓶）而言，搅拌速度在40-150rpm之间即可成为可流动的反应混合物。

通过高效液相色谱（HPLC）可以分析由上述发明方法生产的N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的α和β-异构体（α/βF-AP），并由此测得这些方法所得α/β比非常之高，约为79.5∶20.5。

在进行下述脱甲酰基反应前，任选从该反应混合物中除去乙酸和所有的酯（乙酸甲酯，甲酸异丙酯等）或位阻醇。最好在约15-25英寸Hg进行减压蒸馏除去乙酸和酯。先进行减压蒸馏，然后再加入HCl，使α/βF-AP脱甲酰基。回收乙酸、酯和/或醇，并且在其后的偶合反应中循环使用。

然后脱去N-甲酰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸α和β异构体的甲酰基。为使α/βF-AP脱甲酰基生成α/β-AP，在上述异构体混合物中加入盐酸和甲醇。过量的甲醇也可以与存留在反应混合物中的所有乙酸和甲酸反应，形成乙酸甲酯和甲酸甲酯，它们的沸点比乙酸或甲酸的沸点低得多，因此，可以通过较低温度的蒸馏从该体系中除去之。

然后，将HCl、甲醇和水的浓度调到足以高产率产生α-APM（HCl）的浓度，借以将所得α/β-AP混合物和它们的各种甲酯酯化。甲醇浓度应该是约1-10%（重量），最好是约3-5%（重量）。HCl浓度应为约9-18%（重量），最好是约12.5-14.5%（重量）。水的浓度应约为32-50%（重量），最好是约37-42%（重量）。将水HCl和甲醇浓度调好后，在约35℃，最好是环境温度（20-30℃）温和地搅拌该反应混合物。在4-8天左右，通常是约6天，该酯化反应完成。

由于α-APM·HCl·2H₂O在水溶液中的溶解度比β-APM（HCl）要低，因此，所得α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的盐酸盐（α-APM（HCl））很容易与β-异构体分离（参见前述Ariyoshi）。α-异构体从溶液中沉淀，通过过滤，离心，滗析任何一种惯用方法分离之。

然后，用碱中和α-APM（HCl），形成APM，最后采用本领域公知的结晶技术回收之。

下列实施例旨在具体例证本发明。所列这些实施例仅作阐示之用，并表明本发明的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。对于本领域技术人员，即可从此中所披露内容显见其所用物料及方法。

实施例1

将0.12g（0.003mole）氧化镁（催化剂）溶解在16ml（0.405mole）95%的甲酸中。然后将60.2ml乙酐加到上述溶液中，在35°-40℃加热10-15分钟。然后加入39.93g（0.3mole）L-天冬氨酸，将该混合物在50±20℃搅拌2.5小时。此时，补加8.6ml乙酸酐，在50±20℃再继续反应2.5小时，向该反应混合物中加入9.2ml（0.120mole）异丙醇，再继续加热2小时，此时经高效液相色谱（HPLC）证实已形成了N-甲酰基天冬氨酸酐。

将N-甲酰基天冬氨酸酐混合物冷却至室温（20-25℃），向该混合物中加入150ml（1.89moles）乙酸甲酯，然后加入44.6g（0.27moles）L-苯丙氨酸。将该混合物在室温（20-30℃）搅拌3小时，然后将其在室温放置过夜（18-24小时），固化。

将该固化产物溶解在甲醇和水（9∶1）的溶液中。通过HPLC分析所得N-甲酰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的α和β异构体混合物，结果发现：α/β异构体比率为79.2∶20.8。

实施例2

采用就地偶合反应制得的N-甲酰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的α/β比例与采用不同酯/醇作共溶剂时的α/β比例之比较。将氧化镁（0.121g;0.003mole）在充氮下溶解在16.4ml（0.406mole）93.4%的甲酸中。然后在搅拌下将62.5ml（0.655mole）乙酸酐加到该混合物中，形成白色沉淀。在随后的30分钟内将混合物的温度升至37-38℃，加入L-天冬氨酸（39.93g;0.3mole），将该混合物在48-50℃加热2.5小时。补加乙酸酐（8.6ml，0.09mole），再加热2.5小时，然后在该反应混合物中加入9.2ml（0.120mole）异丙醇，在50±2℃再继续加热2.0小时，然后将该反应混合物冷却至室温（22-27℃）。

为制备多份第一反应混合物，将制备N-甲酰基-L-天冬氨酸酐的过程重复数次。在每一份这种第一反应混合物中加入100ml表1列出的某一烷基酯或位阻醇溶剂，然后加入44.6g（0.27mole）L-苯丙氨酸。将所得浆液在室温保温5小时以就地完成偶合反应。随着反应的进行，每一反应物浆液越来越固化，为溶解其中的所有固体，加入大量的甲醇/水（10∶1）溶液。每一反应混合物中取2.0g等分试样进行HPLC分析，每一反应物中所形成的N-甲酰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的α/β比率如下：

表1

溶剂  α/β比例

乙酸甲酯  79∶21

乙酸乙酯  79∶21

乙酸异丙酯  80∶20

乙酸正丁酯  78∶22

甲酸甲酯  75.5∶24.5

甲酸异丙酯  78∶22

异丙醇  78∶22

仲丁醇  76∶24

叔丁醇  78∶22

不加溶剂  71∶29

实施例3

按实施例1所述方法再次制备N-甲酰基天冬氨酸酐，将该天冬氨酸酐留在原反应混合物中就地与L-苯丙氨酸偶合。向该反应混合物加入100ml乙酸甲酯，44.6g（0.27mole）L-苯丙氨酸和84ml（1.47mole）乙酸。由于乙酸酐与L-天冬氨酸反应时，在形成酸酐的过程中生成乙酸副产物，这样在该反应物存在的乙酸总量等于166.4ml（2.912mole）。

在室温（20°-25℃），将该偶合反应混合物搅拌6小时左右，在偶合反应完成后，该混合物不出现固化。采用HPLC分析所得α/β异构体之比为79.5∶20.5。

实施例4

按实施例1所述方法制备N-甲酰基天冬氨酸酐（F-Asp＝0）并将其留在原反应混合物中。然后加入44.6g（0.27mole）L-苯丙氨酸，106.89g（1.26mole）乙酸甲酯和足量乙酸（使乙酸总量达2.91mole），由此，就地进行偶合反应（见：实施例3）。

将该混合物在室温（20°-25℃）搅拌6小时左右进行偶合反应。偶合反应完成后该混合物也不出现固化。α/β异构体比是79.5∶20.5

表3归纳了在偶合反应中加入不同浓度乙酸甲酯和乙酸（HOAc）时，所得产物α/β异构体之比。N-甲酰基天冬氨酸酐和L-苯丙氨酸的用量保持恒定，即每一反应中为0.27mole。反应温度和时间也不变。在每一反应中，以每摩尔L-苯丙氨酸所加溶剂摩尔数分别表示乙酸甲酯和乙酸的浓度。每种混合物中所得α/β之比列于表的右边，由此可以证实本发明方法的确可制得高α/β比的产物。

表3

在L-Phe和F-Asp＝0偶合时，改变HOAc和MeOAc的浓度，所得α/β比

实验＃  每摩尔L-Phe的溶剂摩尔数  α∶β

MeOAc  HOAc

1  4.65  0.00  80.0/20.0

2  4.65  5.34  78.6/21.4

3  7.00  5.34  79.2/20.8

4  4.60  10.79  79.5/20.5

5  3.49  10.79  79.2/20.8

6  2.33  10.79  77.9/22.1

7  1.17  10.79  77.1/22.9

8  2.94  9.00  77.4/22.6

9  3.50  9.00  78.0/22.0

10  2.28  7.00  77.15/22.85

11  1.17  8.58  76.3/23.7

12  2.61  7.67  77.8/22.2

13  0.00  5.34  69.0/31.0

14  0.00  10.50  74.0/26.0

实施例5

尽管在偶合反应中推荐的乙酸用量一般是L-苯丙氨酸用量的7倍，但是经证实，即使少量的乙酸也可起催化剂的作用。将按实施例2所述方法制得的N-甲酰基天冬氨酸酐（31.0g;0.217mole）在充氮下与150ml乙酸甲酯及25.8ml（0.45mole）乙酸混合。然后加入33.0g（0.20mole）L-苯丙氨酸，在约25℃搅拌该混合物。3.5小时后，补加100ml乙酸甲酯以防止固化，4.5小时后重复此步骤，总共反应6小时后，将反应浆液溶解在足量的甲醇和水（10∶1）中。用HPLC分析该溶液，经测定α/β异构体比例为80∶20。

实施例6

将氧化镁（0.4g;0.01mole）溶解在53.3ml（1.35mole）95%的甲酸和200ml（2.10mole）乙酸酐中。该反应本身放热，使反应温度在15分钟由20-22℃升至40℃。在该反应混合物中加入L-天冬氨酸（133.1g;1.0mole），将所得浆液在48°-50℃加热2.5小时，此时，加入28.9ml（0.303mole）乙酸酐。再连续加热2.5小时，然后混入30.7ml（0.4mole）异丙醇，将该反应混合物在48-50℃搅拌1.5小时，然后使之冷却至室温（25°±2℃）。所得混合物含有N-甲酰基天冬氨酸酐。

在该反应混合物中加入187ml乙酸甲酯和148.68g（0.9mole）L-苯丙氨酸，将所得浆液搅拌1.5小时。加入120ml乙酸以促进搅拌，并将该混合物在25-26℃再保温4.5小时，将该混合物进行减压（22英寸Hg）蒸馏，直到反应混合物达到65℃为止。

将甲醇（220ml）和100ml盐酸（1.2mole）混入该浆液中，并将其在60℃左右加热1小时。蒸馏所得澄清液，直到蒸馏头的温度达到63℃为止，而该反应混合物的温度是73℃。补加甲醇（400ml），继续蒸馏，直到反应混合物的温度达到85℃。在约26英寸Hg下将反应混合物减压处理45分钟，使剩余的残留物冷却至室温（约25℃），在冷却的残留物中加入120ml  37%的盐酸、19ml甲醇和94.8ml水。然后在室温将该混合物搅拌6天。

将所得浆液过滤，洗涤，在50℃干燥10小时后得到白色固体（197.54g）。该产物经HPLC分析显示含有61.5%的α-APM。

实施例7

方法与实施例6基本相同，不同之处是以维持恒定体积的速度加入400ml甲醇。所得固体（197.85g）经HPLC测定含有67.18%的α-APM。

实施例8

方法与实施例7基本相同，不同之处是完全在减压条件下进行最后的蒸馏，最高顶温为55-56℃。L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的收率为理论量的51%。

实施例9

方法与实施例7基本相同，不同之处是加入甲醇后，在减压（20英寸Hg）下，于55-67℃蒸馏2小时。分离得到186.15g  α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐二水合物，经分析表明：α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的含量是64.68%。

实施例10

用5分钟的时间将甲酸（95.7%;16ml;0.405mole）滴加到60.2ml（0.631mole）乙酸酐中，在此期间温度升至40℃。将该混合物搅拌55分钟，加入39.93g（0.3mole）L-天冬氨酸和0.43g（0.003mole）乙酸镁。将所得浆液在47-48℃加热2.5小时。加入乙酸酐（7.1ml;0.0744mole），连续加热2.5小时，加入异丙醇（7.21g;0.120mole），连续加热1.5小时。停止加热，加入130ml乙酸和44.6g（0.27mole）L-苯丙氨酸。将该混合物在环境温度搅拌过夜。将所得浆液溶解在750ml水和1.05升甲醇中，称重，取出一等份该溶液用HPLC分析α/β-N-甲酰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸，经测定α-异构体的得率为71.5%，

实施例11

在充氮下将甲酸（16.0ml;0.405mole）加到0.121g（0.003mole）氧化镁中，搅拌，直到固体溶解，加入乙酸酐（60.2ml;0.631mole），立即出现沉淀，经15分钟温度升到40℃，加入L-天冬氨酸（39.93g;0.3mole），将该浆液在48-50℃加热2.5小时，补加乙酸酐（9.3ml;0.0974mole），再连续加热2.5小时，加入异丙醇（11.9ml;0.155mole），并将该混合物加热1.5小时。使温度升至53℃，用15分钟时间，分四次加入44.6g（0.27mole）L-苯丙氨酸。在10分钟内温度升至58℃，再继续搅拌50分钟以上。使该反应混合物冷至环境温度，加入30.1ml37%的盐酸和70ml水。将该浆液加热至60℃，保温1小时，在此期间所有的固体溶解，减压蒸馏除去溶剂，将蒸馏瓶的温度保持在55±2℃。称重，残留物为119g。在该残留物中加入100g水，重复蒸馏，得到107g残留物。加入50.5ml盐酸、41.2ml水和31.5ml甲醇，将该浆液在20-30℃搅拌4天。滤出固体，用50ml饱和盐水洗涤，经干燥过夜后，得到43.95g白色结晶状α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐二水合物。

实施例12

按实施例1制备N-甲酰基天冬氨酸酐的混悬液。先加入乙酸甲酯（75ml）和84ml乙酸，然后再加入L-苯丙氨酸（44.6g），将所得浆液在20-30℃搅拌6小时，在50mmHg减压蒸除溶剂（350g）。加入盐酸（37%;30ml）和66.7ml甲醇，在60-62℃加热1小时。补加甲醇（528ml），蒸馏到瓶温为85℃为止。减压至26英寸Hg，蒸馏至瓶温为30℃。然后加入36.4ml盐酸、24.4ml水和5.5ml甲醇，将所得混合物搅拌4天。滤出所得沉淀，洗涤，干燥，得到63.1g白色固体。HPLC分析表明α-AMP含量为63%。

实施例13

按实施例1制备N-甲酰基-L-天冬氨酸酐（F-Asp＝0）的各种混悬液，并将其置于装有Talboys  134-2型机械搅拌器的500ml圆底烧瓶中。在这些反应混合物中加入乙酸甲酯（MeOAc），乙酸（HOAc）和L-苯丙氨酸（L-Phe），加入量应达到下述摩尔比：MeOAc/HOAc（总量）/Phe/F-Asp＝0是2.73/10.64/1.0/1.0。在室温，以200-300rpm的搅拌速度使该反应混合物反应1小时。此时反应温度上升至40℃，将搅拌速度降至5-15rpm之间。3小时内Phe基本转化完全。于室温反应6小时（包括在50-55℃反应的1.5-2.0小时）后，用Brookfield粘度计LV测定粘度。结果如下：

1小时  1小时后  粘度（厘泊）（RPM-转子2）

搅拌速度  温度

6＊  12＊  30＊  60＊

200-300rpm  室温  2860cp  1587cp  819cp  483cp

（对照）

5-15rpm  25℃  1225  937  490  301

5-15rpm  40℃  690  485  287  170

＊转子rpm

实施例14

除反应混合物在反应1小时后完全停止搅拌外，其他操作与实施例13的方法相同。总共反应6小时后，可以搅拌反应混合物，但需要辅助启动搅拌器。一旦开始搅拌，反应混合物变成很好的流体，与以200-300rpm搅拌反应6小时的反应混合物相比，前者的粘度低得多。分析该反应混合物表明Phe转化完全。

实施例15

除将反应混合物间歇搅拌外，即，反应开始45分钟后，每隔5-15分钟，低速搅拌12秒，其它操作与实施例13的方法相同。先将上述反应所得混合物以200-300rpm搅拌1小时，在反应结束时，该反应混合物成为流动液体。对反应混合物的分析表明Phe完全转化。

实施例16

按实施例1制备N-甲酰基-L-天冬氨酸酐（F-Asp＝0）的混悬液，并将其置于装有Talboys  134-2型机械搅拌器的500ml圆底烧瓶中。在该反应混合物中加入MeOAc，HOAc和Phe，使它们的摩尔比达到MeOAc/HOAc（总量）/Phe/F-Asp＝0为2.73/7.84/1.0/1.0。以200-300rpm的搅拌速度，在室温使该反应混合物反应1小时。然后将搅拌速度降至5-15rpm，在约5小时内Phe完全转化。两个对照组是以200-300rpm的搅拌速度反应6小时。于室温反应6小时（包括在50-55℃反应的1.5-2小时）后，用Brookfield粘度计LV测定粘度。结果如下：

1小时后的搅拌速度  粘度（cP）（RPM-转子4）

12＊  30＊  60＊

200-300rpm（对照）  9，100  6，740  5，110

200-300rpm（对照）  12，000  8，000  6，000

5-15rpm  6，850  3，740  2，410

＊转子rpm

实施例17

除了在搅拌速度降至5-15rpm时，将反应混合物温度升至40℃外，其他操作与实施例16的方法相同。所得反应混合物的流动性很好，与以200-300rpm操作的对照组相比，前者的粘度低得多。分析表明Phe完全转化。

以类似的操作，采用本文所述的各种烷基酯、位阻醇、搅拌参数及蒸馏技术，可以很高的收率生产α-APM（HCl）。