提取细胞内环核苷酸的方法

摘要

一种提取细胞内环核苷酸的方法，不需要破膜，也不受温度和试剂的影响，而是通过加热，在终止酶反应的同时提取细胞内的环核苷酸，操作简便快速，提取结果准确，易于推广应用。

说明书

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本发明是关于小分子物质的提取方法，特别是关于提取细胞内环核苷酸的方法。

环核苷酸在细胞功能调节中起重要作用，是一项不可缺少的分子学指标。目前，对提取细胞内环核苷酸，常采用的是冻融裂解法、超声波破膜法和低渗破膜法。

冻融裂解法是通过将细胞反复冻融，使细胞膜破裂而释放出环核苷酸，采用此法时必须在细胞悬液中加磷酸二酯酶抑制剂（EDTA），以防止环磷酸腺苷（CAMP）和环磷酸乌苷（CGMP）被磷酸二酯酶（PDE）水解。由于酶抑制剂的存在，使细胞内其他酶类未被灭活，易受冻融温度和EDTA的交互影响，从而影响细胞内环核苷酸的含量，特别是对CGMP的影响，使其含量偏高。

超声波破膜法是通过超声波发生器机械性破细胞膜，释放出环核苷酸。该法需用三氯醋酸或高氯酸终止酶反应，但细胞的膜蛋白经酸固定后会影响破膜率，并且在破膜后须用水饱和乙醚提取三氯醋酸或用碱中和高氯酸。整个提取过程操作步骤多而复杂，易造成实验误差大，并且受到仪器设备限制，不易推广应用。

低渗破膜法采用细胞悬液中加水低渗、破膜，然后加热和加酸去蛋白，由于终止酶反应前细胞受到低渗刺激，影响环核苷酸的含量，加之须除去膜蛋白和提取酸，否则环核苷酸含量偏高。

用上述各方法提取细胞内环核苷酸，均须经过破膜，并且要加一定的试剂。膜蛋白和试剂的存在，以及温度的变化，影响了环核苷酸的含量。由于提取过程操作步骤多而复杂，易造成实验系统误差大，而且所需仪器设备要求高，不易推广应用。

本发明的目的是建立一种操作简单，易推广，不受温度和试剂影响的提取细胞内环核苷酸的稳定方法。

本发明采用加热提取细胞内环核苷酸的方法，是将自然沉降的血浆，用等渗离子液做基质进行细胞分离处理，处理后的细胞悬液置于80°～100℃水浴加热5～40分钟，立即冰浴冷却，经离心后的上清液即含环核苷酸。

本发明是在加热终止酶反应的同时，提取细胞内的环核苷酸，提取时不需要加EDTA和其它试剂，可以消除酶抑制剂等试剂和温度变化对细胞内环核苷酸含量的影响;并且采用等渗离子液为基质以提高细胞存活率，特别是不经过破膜，其可溶性蛋白小于100微克/10⁷细胞，因此不需要除蛋白。整个操作简便，结果稳定，可以减少实验的系统误差，提高结果准确性，易于推广。并且还适用于提取血小板内的环核苷酸，以及作体外抗炎、免疫、药理等实验研究。

本发明的实施例是这样的：抗凝血置室温下自然沉降30～40秒，吸出富有白细胞的血浆，根据标准要求分别分离白细胞、淋巴细胞、血小板等。若处理白细胞、淋巴细胞，则分别取富有白细胞的血浆沉淀物和淋巴细胞分离后的沉淀物，用少量生理盐水悬浮，加四倍体积的蒸馏水低渗30秒～2分钟（视标本对象而定），立即加3.6%氯化钠恢复等渗，再离心，取沉淀物加0.1%葡萄糖等渗离子液洗2次，取其细胞悬液分装试管内，置80°～100℃水浴，加热5～40分钟，取出试管，放入冰浴冷却，然后经3000rpm离心10分钟，上清液即含环核苷酸。可直接定量吸取上清液，加上一定量的氚标抗原和一定稀释量的抗体，作放射免疫竞争反应，测定环核苷酸的含量。也可以将上清液定量吸入小烧杯中，置65℃水浴蒸干，放入冰箱保存，待测环核苷酸，保存期可达2～3个月。

进行细胞分离处理所用的0.1%葡萄糖离子液的组成是：

138mM    NaCl    2.7mM    KCl

8.1mM Na₂HPO₄1.5mM>2PO₄

1mM MgCl₂0.6mM>2

0.1%葡萄糖液，PH7.4。

用该离子液做基质，可以提高细胞存活率。