动态导入外源遗传物质获得杂交生物的方法

摘要

一种通过外源遗传物质动态导入法获得远缘杂交生物，特别是获得远缘杂交植物的方法。采用植物分生细胞或人工脱分化的细胞作为受体细胞，将纯化的或未纯化的外源遗传物质导入上述受体细胞，然后利用植物活体组织培养技术，也就是通过适当处理使植物分生细胞在植物体或部分器官组织上迅速萌芽，从而通过另外处理使该芽枝发根或者辅以已有的离体组织培养技术而迅速获得杂交生物。例如，青菜-马兰；大蒜-青菜；罗汉松-青菜等等。

说明书

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本发明是关于通过外源遗传物质动态导入法获得远缘杂交生物，特别是获得远缘杂交植物的方法。

本发明的方法采用植物分生细胞或人工脱分化的细胞作为受体细胞，将纯化的或未纯化的外源遗传物质导入上述受体细胞，然后利用植物活体组织培养技术，也就是通过适当处理使植物分生细胞在植物体或部分器官组织上迅速萌芽，从而通过另外处理使该芽枝发根的技术，或辅以已有的离体组织培养技术，迅速获得杂交生物。

在为获得远缘杂交生物的现有技术中，有较为新颖的技术，譬如植物细胞融合技术，通过某些处理，使两种不同植物的去壁原生质体融合，然后通过植物离体组织培养技术，使融合细胞产生体细胞杂种。但上述过程需要无菌操作，并且由于植物体细胞杂交的不亲和性，至今无法获得科间的杂交植物，并且仅能在少数植物，例如不同种的烟草及矮牵牛属的某些植物中进行。另外，将目标基因与载体质粒联结后转入微生物细胞，也能使该微生物产生与目标基因相关的蛋白质，国内外将这种单基因工程的方法移植在高等生物的遗传工程中，至今效果甚微。因为高等生物的遗传机制高度复杂，高等生物的性状特别是与经济利益有关的性状，绝大多数是由不同的多基因系统决定的，显然用单基因工程的技术使高等生物具有外源多基因系统决定的性状是难能实现的。此外，向植物或动物的生殖细胞微注射外源DNA溶液，试图获得新性状动植物的研究也有所报导，但是由于这一方法采用的受体细胞是生殖细胞，实验材料有一定的局限性，而且获得杂交生物的速度比辅以活体组织培养技术获得杂交生物的速度慢得多。因此，目前来说，采用该方法还无法普遍获得各种性状明显改变的远缘杂交生物。如果向动物的去核生殖细胞植入另一种动物的细胞核，也有可能获得杂交生物，但是该技术也较难克服不同种属生物的不亲和性，至今尚未超越科间杂交的界限，仅在少数两栖类动物例如蛙类中或鱼类例如鲫鱼与鲤鱼的杂交中取得成功。

本发明人发现，采用外源遗传物质动态导入法向特定状态的植物体细胞（分生细胞）导入外源遗传物质，可以明显克服远缘杂交不亲和性的困难，能实现纲间（例如：大蒜-青菜，胡葱-青菜等）、门间（例如：罗汉松-青菜，见照片）甚至界间（例如：能表达噬菌体（入）蛋白质的甘蓝）的生物杂交。受体细胞在导入外源遗传物质后，由于采用活体组织培养技术，因而不需要调换培养基，仅需几个星期就能简便地获得具有明显新性状的杂交个体。

本发明提供的远缘杂交方法的基本实施例过程是，首先对某受体植物采取一定措施，例如去顶、摘心或部分摘心（图1A）等，使植物体上的某些分生细胞，例如腋部的分生细胞处于剧烈分化的状态;然后马上用利刃在上述受体细胞附近处切开一缝（图1B），但不可损伤分生细胞;同时将供体例如上下面通过人工损伤的叶片或叶柄薄片或茎段薄片等插入上述切缝处，如结合不够紧密，可用塑料丝带缚紧，但不可堵住腋芽发生部位（图1C）。然后，将此植株移至阴凉处或造成一个阴凉的环境，这时发生如下过程：供体细胞内的遗传物质通过穿壁运动导入受体细胞并马上与分生细胞内的DNA得以重组。几天后，腋部分生细胞萌生出芽点（图1D），即可移至光照正常的环境。待该芽点长出4至5张叶片时，可用剪刀着基部剪下，然后使其发根，成为完整植株，移至大田种植即可。如果再将该杂交植物的叶片或茎段配合采用常规的离体组织培养，可获得大量杂交植物。前述纲间与门间杂交植物就是用如图1所示的方法获得的。

与现有的有性杂交技术相比，本发明的特点能克服不同种属的植物难以授精杂交的困难;与现有的嫁接技术相比，本发明采用植物分生细胞作为受体细胞，对于供体来说，只要它完成提供外源遗传物质的作用而不必考虑它的成活问题。因此非但可以克服不同种属植物嫁接不亲和性的困难，而且能高效快速改变受体细胞的遗传控制，与现有的植物细胞融合技术相比，本发明不是通过细胞融合而是通过外源遗传物质的导入实现基因杂交，不是通过原生质体的组织培养而是通过分生细胞的活体组织培养获得杂交植物，因此既能克服不同种属细胞难以融合杂交成功的困难又能经济简捷地获得杂交植物;与现有的DNA微注射技术相比，本发明利用植物自身的穿壁运动与细胞间的各种通道向体细胞（分生细胞）导入未纯化或纯化的遗传物质，甚至可将以自然状态存在于供体细胞内的DNA导入受体细胞，因此适用范围广。加之将分生细胞作为受体细胞，因此杂交成功率高。

本发明的第二个实施方法是，如果在植物去顶后的界面，从上向下沿中髓向下挖一孔穴，并通过这个孔穴向分生细胞导入各种形式存在的DNA（图2），本发明人曾获得的（入）蛋白-甘蓝就是按图2方法获得的（参见“世界科学”1986年第1期p.1-5）;或者，第三个实施方法是不挖孔穴，而将吸水性强的中性薄膜作为载体插入受体细胞附近的切缝处，通过滴在薄膜上的各种形式存在的DNA向受体细胞导入外源基因（图3）。按图3的方法，向甘蓝分生细胞导入青菜DNA和叶用甜菜DNA（均存在于叶、茎汁液中），也能得到杂交植物。因此，与现有的基因体外重组技术相比，本发明虽然也可以将目标基因与载体作为外源基因，但是也可以不必获取目标基因与载体，直接向活体植物或活体植物的某些器官组织的分生细胞导入各种形式存在的遗传物质，例如各种DNA溶液、各种生物器官组织的汁液以及包括以自然状态存在于生命细胞内的DNA等各种类型的遗传物质，简捷地获得各种类型的新植物。另外，与现有的所有杂交技术相比，本发明获得杂交植物的时间最短，一般仅需几周就可以，并且成本最低廉，设备最简单，既可以被普通人员普遍采用又可以成为专家学者手中进行遗传工程和探索生命本质的手段。

本发明按照不同的情况，可作出相应的许多变更和变化。例如，按图4的第四个实施方法，可将两种植物的遗传物质进行双向导入。在这个实施方法中，供体与受体是相对的，也就是说受体可以从供体中获得遗传物质，也可以向供体反过来导入受体自己的遗传物质，使供体本身所有的分生细胞也产生基因杂交。图4所示的实施方法特别适用于获得既作供体又作受体的杂交植物或者向细软茎段的植物导入外源遗传物质，例如，青菜-马兰就是这样获得的（《中国科学》，印刷中）。

图5所示的第五个实施方法，是将包含分生细胞的植物茎段浸在含有DNA的溶液或汁液的各种遗传物质中，几天后，这些分生细胞萌芽，待芽稍大，可将芽连茎枝着基部剪下发根，就获得完整的杂交植株。或者将该植物茎段浸在营养液中，然后用本发明的其他实施方法在它的分生细胞附近导入各种遗传物质。例如，用图5所示的方法可以将（入）DNA导入甘蓝体细胞。

又例如，按图6所示的第六个实施方法，可直接向植物顶端的分生细胞导入外源遗传物质，往往能获得变异强烈的杂交植物，本发明人获得的大蒜-青菜，玉米-青菜（见照片）就是按图6所示的方法实施成功的。这个实施例特别适用于腋部分生细胞难于分化出芽或者太易分化出芽（即不经去顶就见腋芽萌生）的植物，还适用于生长期不适宜获取腋芽的植物。

另外，本发明可以在分生细胞导入外源的遗传物质后，马上将含分生细胞的器官组织块进行离体组织培养，获得大量的杂交植物。

本发明的方法，对于具有特殊形状的植物器官，例如，马铃薯块茎，在外源遗传物质的导入实验中，其方法可作相应的改变。例如将具有分生细胞的该器官切成小块或者去除表皮后浸在含有外源DNA的溶液中，又例如将含有外源遗传物质的中性薄膜敷贴在估计能发生分生细胞变异芽的部位进行外源基因的导入，也能够获得杂交植物。

本发明的方法，对于不属于分生细胞但经适当处理产生的脱分化细胞也是适用的。例如图7所示甘薯块根，经机械切割可促使块根上的某些细胞脱分化，从而使其具有分生能力。对这些具有分生能力的细胞导入外源DNA也能获得杂交植物。当然，敷贴含有外源DNA的中性薄膜也可实施。

本发明的技术方法，对于单子叶植物，例如水稻，向第一分蘖节的分生细胞或其它富有分生细胞的部位导入外源遗传物质，也可迅速获取各种类型的杂交植物。对于高大的果树或乔木，可将分枝条剪下插在营养液里，当然也可不剪下，直接在分枝上或顶芽直接实施本发明的方法。

附图的简要说明如下：

图1表示本发明方法的基本实施例，其中，图1A表示受体的去顶;图1B表示受体的切缝;图1C表示供体的插入与外源遗传物质的导入，图1D表示腋部分生细胞的萌芽-即为杂交植物。

图2表示本发明方法的第二实施例，在植物分生细胞附近去顶后的界面从上向下挖的孔穴中导入外源DNA。

图3表示本发明方法的第三个实施例，用吸水性强的中性薄膜作为载体插入受体细胞附近的切缝处，以导入DNA。

图4表示本发明方法的第四个实施例，两种植物的遗传物质的双向导入。

图5表示本发明方法的第五个实施例，将包含分生细胞的植物茎段浸在含有DNA的液体中，或者浸在营养液中实施本发明的其他方法以导入各种遗传物质。

图6表示本发明方法的第六个实施例，直接向植物顶端的分生细胞导入外源遗传物质。

图7表示本发明方法的第七个实施例，通过机械切割，促使甘薯块根的某些细胞脱分化，然后将上述切块浸入含有各种外源DNA的溶液中，即可进行杂交。

本发明已通过上述附图和实施例的描述详细公开了本发明的内容，这谨是为了说明本发明而不是对本发明加以任何限制。可以理解的是，对于那些本技术领域中的科学技术人员来说，可以作出许多改换和变更而不偏离本发明权利要求书所确定的本发明的特征和保护范围。