用于检测单抗药物和抗单抗药物抗体的试剂及其应用

摘要

本发明涉及血药浓度检测，具体涉及用于检测单抗药物和抗单抗药物抗体的试剂及其应用。所述试剂包括解离液，所述解离液为pH2‑3、8～10mM的甘氨酸缓冲液或醋酸‑醋酸钠缓冲液，其中含有体积分数为0.05%～0.1%的Tween‑20、10～15μg/ml鼠IgG和/或10～15μg/ml人IgG。本发明的试剂可有效降低非特异性反应，解决现有酸解离试剂背景信号强、信噪比低的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及血药浓度检测，具体涉及用于检测单抗药物和抗单抗药物抗体的试剂及其应用。

背景技术

蛋白类药物都属于大分子药物，其药物成分和结构的异物性决定了这些药物均具有免疫原性，由此人体会产生针对该药物的ADA（抗药物抗体，anti-Drug antibody）。ADA的产生除与药物的免疫原性相关外，还与用药剂量、治疗频率、药物动力学个体差异等因素有关。多种因素影响大分子药物的药代动力学，如患者的身体体质、病理状态、用药史等，但ADA的产生是其中最重要的原因之一。ADA主要通过阻断药物与作用靶点的结合，直接影响药物的治疗效果。ADA可以通过增加药物清除率和降低血药浓度改变药物的药代动力学特征，导致临床效果损失。因此，合理的监测药物血药浓度和抗药物抗体对提高患者的治疗效果和降低医疗成本有重要的指导意义。

在上世纪九十年代末，治疗性抗TNF-α抗体被开发（如英夫利西单抗，Infliximab）。嵌合单克隆抗体，含有30％的鼠源和70％的人源（抗体的保守区域由人Fc组成）能够激活效应细胞功能，并具有良好的特异性和亲和性。人源化单克隆抗体，5％鼠源和95％人源，似乎有更好的耐受，但亲和力较低一些。而全人源单克隆抗体（如阿达木单抗，adalimumab；戈利木单抗，golimumab）免疫源性会更小一些。除了这些单克隆抗体外，还有融合蛋白，如依那西普（Etanercept）、益赛普。这些药物的性质导致它们具有免疫原性，并产生抗药物抗体（ADA）。研究表明，无论药物可变区的人源化水平高低均会产生ADA。这种免疫反应多样性与药物治疗方案、药物分子的免疫原性以及病人的敏感性相关。

阿达木单抗（修美乐）为全人源化抗体，由于其较高的活性和低免疫原性，在类风湿治疗中发挥了十分重要的作用，是目前临床主要的治疗药物。但是，在阿达木药物和ADA测试中，有相当一部分药物与ADA结合，需要将药物抗体与药物进行解离后进行测定。而现有的解离方式均为酸性解离方式，即样本在酸性条件下，药物结合型ADA与药物解离，然后中和后测定ADA和药物浓度。由于解离试剂的pH值、浓度（盐离子强度），中和试剂的pH值、浓度（盐离子强度）均会影响ADA的测定，过酸、过碱或高盐的反应体系，会显著降低反应体系的信噪比。此外，由于血液样本在酸性条件下，蛋白的亲水-疏水平衡被打破，酸解离后的样本在ADA和药物浓度测定中非特异性反应增强，背景信号会增加，试剂盒的信噪比变差。

发明内容

针对上述领域存在的不足，本发明提供用于单抗药物和抗单抗药物抗体检测的试剂及检测方法，可有效降低非特异性反应，解决现有酸解离试剂背景信号强、信噪比低的问题。

一方面，本发明提供用于检测单抗药物和抗单抗药物抗体血药浓度的试剂或试剂盒，包括解离液，其特征在于：所述解离液为pH2-3、8～10mM的甘氨酸缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液，其中含有体积分数为0.05%～0.1%的Tween-20、10～15μg/ml鼠IgG和/或10～15μg/ml人IgG。

在本发明的优选实施例中，所述试剂或试剂盒还包括中和液和/或抗体亲水化处理液；所述中和液含有体积分数为10～15%的马血清；所述抗体亲水化处理液含有10～15mg/ml的活性酯PEG羟基和/或活性酯PEG羧基。

在本发明的优选实施例中，所述中和液和/或所述抗体亲水化处理液采用pH7.4，20mM磷酸盐缓冲液配制。

在本发明的一些实施例中，所述解离液为pH2.5，10mM甘氨酸缓冲液，其中含有体积分数为0.05%的Tween-20、10μg/ml 鼠IgG和10μg/ml 人IgG；和/或所述中和液含有体积分数为10%的马血清；和/或所述抗体亲水化处理液含有10mg/ml的活性酯PEG400羟基、活性酯PEG2k羟基、活性酯PEG20k羟基、活性酯PEG400羧基、活性酯PEG2k羧基和/或活性酯PEG20k羧基。

在本发明的一些实施例中，所述甘氨酸缓冲液的配方为：每升超纯水中含有甘氨酸 0.75g，用NaOH调节pH至2.5；所述醋酸-醋酸钠缓冲液的配方为：每升超纯水中含有醋酸0.57mL，用NaOH调节pH至2.5；所述磷酸盐缓冲液的配方为：每升超纯水中含有磷酸二氢钠0.6g、磷酸氢二钠5.8g，调节pH至7.4。

本发明所述的单抗药物，包括但不限于阿达木单抗、英夫利西单抗和益赛普；本发明所述的抗单抗药物抗体，包括但不限于抗阿达木单抗药物抗体、抗英夫利西单抗药物抗体和抗益赛普药物抗体。

任一所述的试剂或试剂盒在单抗药物和抗单抗药物抗体血药浓度检测中的应用也属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明还提供一种检测单抗药物血药浓度的方法，包括如下步骤：

（1）取血清样品，加入解离液，混匀；所述解离液为pH2-3、8～10mM的甘氨酸缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液，其中含有体积分数为0.05%～0.1%的Tween-20、10～15μg/ml鼠IgG和/或10～15μg/ml人IgG；

（2）置于37℃温度下反应5-10 min；

（3）加入中和液，混匀；所述中和液中含有吖啶酯标记的抗单抗药物抗体；

（4）加入生物素化TNF-α，混匀；

（5）加入链霉亲和素磁珠，混匀；

（6）置于37℃温度下反应10-15 min；

（7）用清洗液洗涤磁珠；

（8）加入激发液，测定发光值，将发光值带入标准曲线中，获得血清样品中所述单抗药物的浓度。

还在另一方面，本发明提供一种检测抗单抗药物抗体血药浓度的方法，包括如下步骤：

（1）取血清样品，加入解离液，混匀；所述解离液为pH2-3、8～10mM的甘氨酸缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液，其中含有体积分数为0.05%～0.1%的Tween-20、10～15μg/ml鼠IgG和/或10～15μg/ml人IgG；

（2）置于37℃温度下反应5-10 min；

（3）加入中和液，混匀；所述中和液中含有吖啶酯标记的单抗药物；

（4）加入生物素化的所述单抗药物，混匀；

（5）加入链霉亲和素磁珠，混匀；

（6）置于37℃温度下反应10-15 min；

（7）用清洗液洗涤磁珠；

（8）加入激发液，测定发光值，将发光值带入标准曲线中，获得血清样品中抗所述单抗药物抗体的浓度。

在本发明所述方法的优选实施例中，所述中和液还含有体积分数为10～15%的马血清；和/或所述步骤（3）中，吖啶酯标记的抗体是经过亲水化处理的抗体；所述亲水化处理是指将吖啶酯标记的抗体与抗体亲水化处理液混合后置于室温下反应2-3小时；所述抗体亲水化处理液含有10～15mg/ml的活性酯PEG羟基和/或活性酯PEG羧基。

在本发明所述方法的优选实施例中，所述中和液和/或所述抗体亲水化处理液采用pH7.4，20mM磷酸盐缓冲液配制。

在本发明所述方法的一些实施例中，所述解离液为pH2.5，10mM甘氨酸缓冲液，其中含有体积分数为0.05%的Tween-20、10μg/ml 鼠IgG和10μg/ml 人IgG；和/或所述中和液含有体积分数为10%的马血清；和/或所述亲水化处理液含有10mg/ml的活性酯PEG400羟基、活性酯PEG2k羟基、活性酯PEG20k羟基、活性酯PEG400羧基、活性酯PEG2k羧基和/或活性酯PEG20k羧基。

在本发明所述方法的一些实施例中，所述标准曲线的制作方法为：配制梯度浓度的单抗药物或抗单抗药物抗体的标准品，按照所述检测单抗药物血药浓度的方法或所述检测抗单抗药物抗体血药浓度的方法测定各标准品的发光值，将标准品浓度值与其发光值做双对数直线拟合，即得标准曲线。

在本发明所述的方法中，所述单抗药物包括但不限于阿达木单抗、英夫利西单抗和益赛普；所述抗单抗药物抗体包括但不限于抗阿达木单抗药物抗体、抗英夫利西单抗药物抗体和抗益赛普药物抗体。

本发明从解离剂的种类、浓度、pH值、蛋白保护剂、表面活性剂等方面进行了优化选择，成功筛选出可用于药物及ADA检测的解离剂。此外，在中和解离剂过程中，中和试剂中反应成分的亲水-疏水平衡会受到解离剂的影响，从而引起非特异性结合，为此发明人对中和试剂中的吖啶酯标记抗体进行了亲水化处理，从而有效降低了非特异性反应。采用本发明选配的解离液、中和液、亲水化处理液对单抗药物或抗单抗药物抗体进行血药浓度检测，特异性高达98-100%，准确率高达97.3%。

具体实施方式

以下结合实施例进一步阐述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何形式限制本发明的范围。

试剂与溶液

阿达木单抗（Adalimumab）购自康德乐大药房，厂家AbbVie Ltd，注册证号S20160019。抗阿达木单抗药物抗体（anti-Adalimumab）购自Bio-Rad，货号HCA207。英夫利西单抗（Infliximab）购自康德乐大药房，厂家Cilag AG，注册证号 S20120012。抗英夫利西单抗药物抗体（anti-Infliximab）购自Bio-Rad，货号HCA233。益赛普（注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白，YSP）购自康德乐大药房，厂家：三生国健药业（上海）股份有限公司，国药准字S20050059。抗益赛普药物抗体购自Bio-Rad，货号HCA279。

磷酸盐缓冲液（20mM PB，pH7.4）：称取磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）（国药，20040799）0.6g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）（国药，100203008）5.8g。加入600ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至1000ml。

清洗液：20mM PB，pH7.4：称取磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）（国药，20040799）0.6g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）（国药，100203008）5.8g、氯化钠（NaCl）（国药，10019308）8g、Tween-20（sigma，44112）500μL。加入600ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至1000ml。

1%BSA溶液：20mM PB，pH7.4：称取磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）（国药，20040799）0.6g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）（国药，100203008）5.8g、牛血清白蛋白（amresco，S12003C01）10g。加入600ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至1000ml。

甘氨酸缓冲液（Gly）：pH2.5，称取一定量的甘氨酸（国药，62011516）（5mM:0.38g，10mM:0.75g，20mM:1.5g，50mM:3.75g，100mM:7.5g）溶于900ml纯水中，混匀后用NaOH调节pH至2.5，定容至1000ml。

醋酸-醋酸钠（HAC-NaAC）：pH2.5，量取一定量的醋酸（国药，10000208）（5mM:0.286mL，10mM:0.57mL，20mM:1.14mL，50mM:2.86mL，100mM:5.71mL），于900ml纯水中，混匀后用NaOH调节pH至2.5，定容至1000ml。

柠檬酸-氢氧化钠（HCit-NaOH）：pH2.5，称取一定量的一水柠檬酸（国药，10007108）（5mM:1.0g，10mM:2.1g，20mM:4.2g，50mM:10.5g，100mM:21g），溶于900ml纯水中，混匀后用NaOH调节pH至2.5，定容至1000ml。

激发液A：浓盐酸（质量分数37%）（国药，10011018）8mL、过氧化氢（质量分数30%）（国药，10011208）5mL，用纯水定容至1000mL。

激发液B：NaOH 8g（国药，10019762）、Tween-20（sigma，44112） 10mL，用纯水定容至1000mL。

以下实施例中所使用的健康体检血清样本来源于梧州肿瘤医院。若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级。若未特别说明，以下实施例所使用的方法均为本领域常规方法，可参考相关实验手册或厂商说明书。

实施例1. 用于单抗药物和抗单抗药物抗体检测的试剂优选

（一）相关试剂制备

1. 生物素化肿瘤坏死因子α（TNF-α-Biotin）制备：取0.1mg Biotin-LC-NHS（Cat#21338，Thermo）（10mg/ml，20mM PB，pH7.4）加入到1ml TNF-α溶液（Cat: 10602-HNAE，sinobiological）（1mg/ml，20mM PB，pH7.4）中，RT（室温），1h，透析除去未反应的Biotin。

2. 生物素化阿达木单抗（Adalimumab-Biotin）制备：方法同生物素化TNF-α（TNF-α-Biotin）制备。

3. 吖啶酯标记抗体制备：取0.1μg ME-DMAE-NHS（HS-11015006，heliosense）（10mg/ml，DMSO）加入到1ml抗体溶液（1mg/ml，20mM PB，pH7.4）中，RT（室温），1h，透析除去未反应的吖啶酯。采用该方法制备得到吖啶酯标记抗阿达木单抗抗体（anti-Adalimumab-MDN）、吖啶酯标记阿达木单抗（Adalimumab-MDN）。

（二）解离缓冲液优选

1. 解离缓冲液筛选

解离剂的种类、pH值、浓度与药物结合型ADA的解离效果、中和试剂的中和效果以及检测试剂的反应性密切相关，因此本试验对多种解离剂、不同pH值、不同浓度的缓冲液进行了比较，配制的1-15#解离缓冲液及其解离效果如表1所示。结果表明，2#、7#解离缓冲液在加入血清样本后pH值变化较小，能保证较好的解离效果，加入中和试剂后pH值接近中性，更有利于药物和ADA的测定。

表1. 不同解离缓冲液的解离效果

缓冲液名称缓冲液序号浓度pH加入血清样本后pH（1/10，血清样本/解离缓冲液）加入中和试剂（20mM PB）后pH（10/11，中和试剂/解离缓冲液+血清样本）甘氨酸缓冲液Gly1#5mM2.54.37.1甘氨酸缓冲液Gly2#10mM2.53.16.8甘氨酸缓冲液Gly3#20mM2.52.96.3甘氨酸缓冲液Gly4#50mM2.52.84.2甘氨酸缓冲液Gly5#100mM2.52.73.5醋酸-醋酸钠HAC-NaAC6#5mM2.54.36.9醋酸-醋酸钠HAC-NaAC7#10mM2.53.26.6醋酸-醋酸钠HAC-NaAC8#20mM2.53.16.1醋酸-醋酸钠HAC-NaAC9#50mM2.52.84.0醋酸-醋酸钠HAC-NaAC10#100mM2.52.73.3柠檬酸-氢氧化钠HCit-NaOH11#5mM2.54.36.3柠檬酸-氢氧化钠HCit-NaOH12#10mM2.53.15.8柠檬酸-氢氧化钠HCit-NaOH13#20mM2.52.95.2柠檬酸-氢氧化钠HCit-NaOH14#50mM2.52.84.1柠檬酸-氢氧化钠HCit-NaOH15#100mM2.52.73.3

注：本试验所使用的血清样本为来源于梧州肿瘤医院的健康体检血清样本。血清样本与解离缓冲液的体积比为1:10。本试验所使用的中和试剂为20mM PB，pH7.4，中和试剂：解离缓冲液：血清样本为10:10:1（体积比）。

2. 解离缓冲液的效果验证

采用步骤1优选的2#、7#解离缓冲液作为样本解离液，以1%BSA作为解离液对照，按照下述方法1和方法2分别测定样本P1-P12中阿达木单抗、抗阿达木单抗药物抗体的浓度，检验解离缓冲液的效果。样本P1-P12采用胎牛血清配制，各样本中阿达木单抗、抗阿达木单抗药物抗体的浓度见表2。

表2. P1-P20样本中阿达木单抗、抗阿达木单抗药物抗体的浓度

Anti-Adalimumab Antibody浓度（Bio-Rad，HCA204）Anti-Adalimumab Antibody浓度（Bio-Rad，HCA204）Anti-Adalimumab Antibody浓度（Bio-Rad，HCA204）Adalimumab浓度0ng/ml10ng/ml1000ng/ml0ng/mlP1P2P310ng/mlP4P5P6100ng/mlP7P8P91000ng/mlP10P11P12

注：样本通过向胎牛血清（四季青，货号11011-8611）中添加药物和抗药物抗体配制，加入比例为：（Adalimumab/Anti-Adalimumab Antibody）：胎牛血清＝1：500（体积比）。

方法1：阿达木单抗药物血药浓度测定方法

（1）样本稀释：取10μL血清样本/校准品（校准品采用胎牛血清（四季青，货号11011-8611）配制，分别含有0μg/ml、0.05μg/ml、0.15μg/ml、0.5μg/ml、1.5μg/ml、5μg/ml阿达木单抗），加入100μL解离液混匀；

（2）温育：在37℃条件下，反应6min；

（3）加样：加入100μL 中和液（含 0.05μg/ml吖啶酯标记抗阿达木单抗药物抗体（Biorad，HCA207）（含1%BSA，20mM PB，pH7.4），混匀；

（4）加样：加入100μL 1.0μg/ml生物素标记TNF-α（TNF-α-Biotin）（1%BSA稀释），混匀；

（5）加样：加入20μL 1.0μg/ml链霉亲和素磁珠（MP-SA）（GE，cat#30-1029-61）（1%BSA稀释），混匀；

（6）温育：在37℃条件下，反应10min；

（7）洗涤：用清洗液洗涤3次；

（8）检测：分别加入200μL激发液A、200μL激发液B，测定发光值（南京迪格诺斯ACL180）；

（9）计算：将校准品浓度值与其发光值做双对数直线拟合（LogX-LogY），得到标准曲线，然后将血清样本的发光值带入标准曲线即可获得血清样本中阿达木单抗的浓度。

方法2：抗阿达木单抗药物抗体测定方法

（1）样本稀释：取10μL血清样本/校准品（校准品采用胎牛血清（四季青，货号11011-8611）配制，分别含有0μg/ml、0.05μg/ml、0.15μg/ml、0.5μg/ml、1.5μg/ml、5μg/ml抗阿达木单抗药物抗体），加入100μL解离液混匀；

（2）温育：在37℃条件下，反应6min；

（3）加样：加入100μL 中和液（含 0.05μg/ml吖啶酯标记阿达木单抗）（含1%BSA，20mMPB，pH7.4），混匀；

（4）加样：加入100μL 1.0μg/ml生物素标记阿达木单抗（Adalimumab-Biotin）（1%BSA稀释），混匀；

（5）加样：加入20μL 1.0μg/ml链霉亲和素磁珠（MP-SA）（GE，cat#30-1029-61）（1%BSA稀释），混匀；

（6）温育：在37℃条件下，反应10min；

（7）洗涤：用清洗液洗涤3次；

（8）检测：分别加入200μL激发液A、200μL激发液B，测定发光值（南京迪格诺斯ACL180）。

（9）计算：将校准品浓度值与其发光值做双对数直线拟合（LogX-LogY），得到标准曲线，然后将血清样本的发光值带入标准曲线即可获得血清样本中抗阿达木单抗药物抗体的浓度。

最后，计算测定结果与理论结果的偏差。理论结果为表2所列P1-P12样本中阿达木单抗、抗阿达木单抗药物抗体的浓度值。计算公式为：偏差=（测定结果/理论结果-1）×100%。结果如表3所示，2#、7#缓冲体系均有较好的解离效果，考虑醋酸缓冲液中醋酸的挥发性，优选2#解离缓冲液。

表3. 测定结果与理论结果的偏差

AdalimumabAdalimumabAdalimumabAnti-AdalimumabAnti-AdalimumabAnti-Adalimumab1%BSA2#7#1%BSA2#7#P13.5%--4.5%--P25.0%---4.2%-2.8%-4.2%P32.6%--2.5%-5.2%-3.5%P43.4%4.5%4.1%-4.6%--P5-90.3%-3.1%-5.4%-80.7%-3.2%-3.5%P6-98.2%-8.1%-8.2%-6.8%-5.7%-3.1%P72.5%3.8%3.6%3.4%--P8-9.6%-4.7%-5.2%-85%-5.6%-5.2%P9-96.9%-6.8%-7.3%-25%-6.7%-6.2%P102.6%2.3%2.5%5.6%--P11-1.2%-7.8%-7.1%-93.2%-8.1%-8.0%P12-86.3%-9.2%-9.3%-87.5%-5.8%-6.3%

（三）表面活性剂种类优选

在酸性解离条件下，血清中蛋白的酸解平衡会打破，蛋白析出团聚，造成反应的非特性结合增强。表面活性剂可以改善酸性条件下蛋白的溶解性，以降低非特异性反应。候选表面活性剂及其使用浓度如表4所示。将表面活性剂分别溶解于2#解离缓冲液中，得到6种解离液。以2#解离缓冲液作为解离液对照，使用这6种解离液，按照上述方法1和方法2，分别测定100例健康体检血清样本中Adalimumab的阳性率以及Anti-Adalimumab的阳性率（所述阳性率是指判定为阳性样本的百分比），对表面活性剂进行筛选。结果表明，体积分数为0.05%的Tween-20可以改善非特异性反应（表4）。

表4. 表面活性剂筛选

试剂名称厂商/货号使用浓度Adalimumab阳性率Anti-Adalimumab阳性率2#解离缓冲液--23%17%Tween-20Sigma，441120.05%（v/v）21%15%Triton X-100Sigma, V9005020.01%（v/v）22%16%PEG20000Sigma, 8188970.1%（w/w）23%16%羟丙基甲基纤维素-II型阿拉丁,100G/H1088220.1%（w/v，g/ml）23%17%羟丙基甲基纤维素-II型阿拉丁,100G/H1088230.1%（w/v，g/ml）24%17%羟丙基甲基纤维素-II型阿拉丁,100G/H1088240.1%（w/v，g/ml）24%17%

注：采用2#解离缓冲液溶解表面活性剂，制成解离液。

（四）解离液中的蛋白保护剂优选

蛋白保护剂可以对蛋白形成包裹，一定程度上降低酸对蛋白结构的改变，以降低非特异性反应。候选蛋白保护剂及其使用浓度如表5所示。将蛋白保护剂分别溶解于2#解离缓冲液（含0.05%Tween-20）中，得到6种解离液。使用这6种解离液，按照上述方法1和方法2，分别测定100例健康体检血清样本中Adalimumab的阳性率以及Anti-Adalimumab的阳性率（所述阳性率是指判定为阳性样本的百分比），对不同蛋白保护剂进行筛选。结果表明，解离液中含10μg/ml鼠IgG和10μg/ml人IgG可以改善非特异性反应（表5）。

表5. 解离液中的蛋白保护剂筛选

试剂名称厂商/货号使用浓度Adalimumab阳性率Anti-Adalimumab阳性率BSAamresco，S12003C011.0%（w/v，g/ml）21%14%酪蛋白Sigma，C65540.5%（w/v，g/ml）23%16%蔗糖国药，100214183%（w/v，g/ml）23%15%鼠IgG启泰，MG0110μg/ml19%12%人IgG启泰，HG0110μg/ml17%13%鼠IgG＋人IgGMG01+HG01，启泰各10μg/ml17%12%

注：采用含0.05%（v/v）Tween-20的2#解离缓冲液溶解蛋白保护剂，制成解离液。

（五）中和液中的蛋白保护剂优选

候选蛋白保护剂及其使用浓度如表6所示。将蛋白保护剂分别溶解于含相应抗体的20mM PB（pH7.4）中，制成5种含不同蛋白保护剂的中和液。采用2#解离缓冲液（含0.05%Tween-20、10μg/ml 鼠IgG、10μg/ml 人IgG）作为解离液，分别使用这5种中和液，按照上述方法1和方法2，分别测定100例健康体检血清样本中Adalimumab的阳性率以及Anti-Adalimumab的阳性率（所述阳性率是指判定为阳性样本的百分比），对中和液中的蛋白保护剂进行筛选。结果表明，中和液中含体积分数为10%的马血清可以有效改善非特异性反应（表6）。

表6. 中和液中的蛋白保护剂筛选

试剂名称厂商/货号使用浓度Adalimumab阳性率Anti-Adalimumab阳性率酪蛋白Sigma，C65540.5%（w/v，g/ml）23%17%鼠IgG启泰，MG0110μg/ml18%15%人IgG启泰，HG0110μg/ml19%14%胎牛血清四季青，11011-861110%（v/v）11%9%马血清Hyclone，SH30074.0310%（v/v）8%6%

注：1. 解离液为含有0.05%（v/v）Tween-20、10μg/ml 鼠IgG、10μg/ml 人IgG的2#解离缓冲液。2. 采用含相应抗体的20mM PB（pH7.4）溶解蛋白保护剂，制成中和液。

（六）中和溶液中吖啶酯反应物亲水化处理效果

1. 将1ml 1mg/ml吖啶酯标记的抗体（20mM PB，pH7.4）与 10mg/ml 活性酯PEG羧基（PS2-HCM-400/2k/20k，芃硕生物，加入量分别为0.1mg.5mg5mg）或活性酯PEG羟基（PS2-HO-400/2k/20k，芃硕生物，加入量分别为0.1mg.5mg5mg）溶液（20mM PB，pH7.4）混合后，室温条件下，反应2h后，保存待用。

2. 采用2#解离缓冲液（含0.05%Tween-20、10μg/ml 鼠IgG、10μg/ml 人IgG）作为解离液，采用含有10%（v/v）马血清的20mM PB（pH7.4）作为中和液，用中和液稀释步骤1制备的吖啶酯标记的抗体（MDN-anti-Adalimumab-PEG-OH或MDN-anti-Adalimumab-PEG-COOH、MDN-Adalimumab-PEG-OH或MDN-Adalimumab-PEG-COOH）至终浓度为0.05μg/ml，按照上述方法1和方法2分别测定100例健康体检血清样本中Ada limumab的阳性率以及Anti-Adalimumab的阳性率（所述阳性率是指判定为阳性样本的百分比）。

结果如表7所示，采用活性酯PEG400羧基或活性酯PEG400羟基处理的吖啶酯标记抗体均具有较好的效果，其分子量大小差异较小，考虑到使用成本，优选分子量较小的，如活性酯PEG400羟基。

表7. 抗体亲水化处理试剂的筛选

试剂名称厂商/货号Adalimumab阳性率Anti-Adalimumab阳性率活性酯PEG400羧基PS2-HCM-4000%1%活性酯PEG2k羧基PS2-HCM-2k0%0%活性酯PEG20k羧基PS2-HCM-20k1%2%活性酯PEG400羟基PS2-HO-4000%0%活性酯PEG2k羟基PS2-HO-2k0%0%活性酯PEG20k羟基PS2-HO-20k1%1%

注：1. 采用含有0.05%（v/v）Tween-20、10μg/ml 鼠IgG、10μg/ml 人IgG的2#解离缓冲液作为解离液。2. 采用含有10%（v/v）马血清的20mM PB（pH7.4）作为中和液。3. 上述吖啶酯标记抗体用中和液稀释，终浓度为0.05μg/ml。

通过上述试验优选的用于单抗药物和抗单抗药物抗体检测的试剂如下：

（1）解离液：含0.05%（v/v）Tween-20、10μg/ml 鼠IgG、10μg/ml 人IgG的10mM甘氨酸缓冲液，pH2.5。

（2）中和液：含10%（v/v）马血清，20mM PB，pH7.4。

（3）抗体亲水化处理液：10mg/ml活性酯PEG400羟基溶液（20mM PB，pH7.4）。

采用优选的解离液、中和液和抗体亲水化处理液，按照方法1和方法2分别测定P1-P20样本中阿达木单抗、抗阿达木单抗药物抗体的浓度，并计算测定结果与理论结果的偏差。理论结果为表2所列P1-P12样本中阿达木单抗、抗阿达木单抗药物抗体的浓度值。计算公式：偏差=（测定结果/理论结果-1）×100%。结果见表8。

表8. 测定结果与理论结果的偏差

AdalimumabAnti-AdalimumabP1--P2--2.9%P3--3.2%P44.3%-P5-3.1%-3.2%P6-7.4%-3.5%P73.6%-P8-4.2%-5.4%P9-6.1%-6.5%P102.7%-P11-7.1%-8.3%P12-8.7%-5.4%

实施例2. 优选试剂在英夫利西单抗（Infliximab）和抗英夫利西单抗药物抗体（anti-Infliximab）测定中的应用

1、试剂制备

生物素化肿瘤坏死因子α（TNF-α-Biotin）、生物素化英夫利西单抗（Infliximab-Biotin）、吖啶酯标记的抗英夫利西单抗抗体（anti-Infliximab-MDN）、吖啶酯标记的英夫利西单抗（Infliximab-MDN）的制备方法同实施例1中（一）所述。

吖啶酯标记的英夫利西单抗（Infliximab-MDN）、吖啶酯标记的抗英夫利西单抗抗体（anti-Infliximab-MDN）的亲水化处理方法（即MDN-Infliximab-PEG400-OH和MDN-anti-Infliximab-PEG400-OH）同实施例1中（六）所述。

2、英夫利西单抗药物血药浓度测定方法

（1）样本稀释：取10μL样本/校准品（校准品采用胎牛血清（四季青，货号11011-8611）配制，分别含有0μg/ml、0.05μg/ml、0.15μg/ml、0.5μg/ml、1.5μg/ml、5μg/ml英夫利西单抗），加入100μL 解离液（含有0.05%Tween-20、10μg/ml 鼠IgG、10μg/ml 人IgG的10mM甘氨酸缓冲液，pH2.5），混匀；

（2）温育：在37℃条件下，反应6min；

（3）加样：加入100μL 中和液（含 0.05μg/ml亲水化的吖啶酯标记的抗英夫利西单抗药物抗体，MDN-anti-Infliximab-PEG400-OH）（Bio-Rad，HCA233）（含10%马血清，20mM PB，pH7.4），混匀；

（4）加样：加入100μL 1.0μg/ml生物素化TNF-α（TNF-α-Biotin）（1%BSA稀释），混匀；

（5）加样：加入20μL 1.0μg/ml链霉亲和素磁珠（MP-SA）（GE，cat#30-1029-61）（1%BSA稀释），混匀；

（6）温育：在37℃条件下，反应10min；

（7）洗涤：用清洗液洗涤3次；

（8）检测：分别加入200μL激发液A、200μL激发液B，测定发光值（南京迪格诺斯ACL180）；

（9）计算：将校准品浓度值与其发光值做双对数直线拟合（LogX-LogY），得到标准曲线，然后将血清样本的发光值带入标准曲线即可获得样本中英夫利西单抗的浓度。

3、抗英夫利西单抗药物抗体测定方法

（1）样本稀释：取10μL样本/校准品（校准品采用胎牛血清（四季青，货号11011-8611）配制，分别含有0μg/ml、0.05μg/ml、0.15μg/ml、0.5μg/ml、1.5μg/ml、5μg/ml抗英夫利西单抗药物抗体），加入100μL 解离液（含有0.05%Tween-20、10μg/ml 鼠IgG、10μg/ml 人IgG的10mM甘氨酸缓冲液，pH2.5），混匀；

（2）温育：在37℃条件下，反应6min；

（3）加样：加入100μL 中和液（含 0.05μg/ml亲水化的吖啶酯标记的英夫利西单抗，MDN-Infliximab-PEG400-OH）（含10%马血清，20mM PB，pH7.4），混匀；

（4）加样：加入100μL 1.0μg/ml生物素化英夫利西单抗（Infliximab-Biotin）（1%BSA稀释），混匀；

（5）加样：加入20μL 1.0μg/ml链霉亲和素磁珠（MP-SA）（GE，cat#30-1029-61）（1%BSA稀释），混匀；

（6）温育：在37℃条件下，反应10min；

（7）洗涤：用清洗液洗涤3次；

（8）检测：分别加入200μL激发液A、200μL激发液B，测定发光值（南京迪格诺斯ACL180）；

（9）计算：将校准品浓度值与其发光值做双对数直线拟合（LogX-LogY），得到标准曲线，然后将血清样本的发光值带入标准曲线即可获得样本中抗英夫利西单抗药物抗体的浓度。

4、样本测定

按照本实施例中2和3所述方法，分别测定100例健康体检血清样本中英夫利西单抗的阳性率和抗英夫利西单抗药物抗体的阳性率（所述阳性率是指判定为阳性样本的百分比）。

按照本实施例中2和3所述方法，分别测定阳性样本（P1和P2）中英夫利西单抗和抗英夫利西单抗药物抗体的浓度，计算测定结果与理论结果的偏差。计算公式：偏差=（测定结果/理论结果-1）×100%。其中，阳性样本P1含10ng/ml英夫利西单抗和1000ng/ml抗英夫利西单抗药物抗体（anti-Infliximab，Bio-Rad，HCA213）；阳性样本P2含1000ng/ml英夫利西单抗和10ng/ml抗英夫利西单抗药物抗体（anti-Infliximab，Bio-Rad，HCA213）。阳性样本（P1和P2）是通过向胎牛血清（四季青，货号11011-8611）中添加英夫利西单抗和抗英夫利西单抗药物抗体配制而成，加入比例为：（Infliximab / anti-Infliximab antibody）：胎牛血清＝1：500（体积比）。

结果表明，健康体检血清样本均为阴性，阳性样本P1和P2的测定结果与理论结果的偏差均在10%以内。

实施例3. 优选试剂在益赛普和抗益赛普抗体测定中的应用

1、试剂制备

生物素化肿瘤坏死因子α（TNF-α-Biotin）、生物素化益赛普、吖啶酯标记的抗益赛普抗体（anti-YSP-MDN）、吖啶酯标记的益赛普（YSP-MDN）的制备方法同实施例1中（一）所述。

吖啶酯标记益赛普（YSP-MDN）、吖啶酯标记抗益赛普抗体（anti-YSP-MDN）的亲水化处理方法（即MDN-YSP-PEG400-OH和MDN-anti-YSP-PEG400-OH）同实施例1中（六）所述。

2. 益赛普药物血药浓度测定方法

（1）样本稀释：取10μL样本/校准品（校准品采用胎牛血清（四季青，货号11011-8611）配制，分别含有0μg/ml、0.05μg/ml、0.15μg/ml、0.5μg/ml、1.5μg/ml、5μg/ml益赛普），加入100μL 解离液（含有0.05%Tween-20、10μg/ml 鼠IgG、10μg/ml 人IgG的10mM甘氨酸缓冲液，pH2.5），混匀；

（2）温育：在37℃条件下，反应6min；

（3）加样：加入100μL 中和液（含 0.05μg/ml亲水化的吖啶酯标记的抗益赛普药物抗体，MDN-anti-YSP-PEG400-OH）（Biorad，HCA279）（含10%马血清，20mM PB，pH7.4），混匀；

（4）加样：加入100μL 1.0μg/ml生物素化TNF-α（TNF-α-Biotin）（1%BSA稀释），混匀；

（5）加样：加入20μL 1.0μg/ml链霉亲和素磁珠（MP-SA）（GE，cat#30-1029-61）（1%BSA稀释），混匀；

（6）温育：在37℃条件下，反应10min；

（7）洗涤：用清洗液洗涤3次；

（8）检测：分别加入200μL激发液A、200μL激发液B，测定发光值（南京迪格诺斯ACL180）；

（9）计算：将校准品浓度值与其发光值做双对数直线拟合（LogX-LogY），得到标准曲线，然后将血清样本的发光值带入标准曲线即可获得样本中益赛普的浓度。

3. 抗益赛普药物抗体测定方法

（1）样本稀释：取10μL样本/校准品（校准品采用胎牛血清（四季青，货号11011-8611）配制，分别含有0μg/ml、0.05μg/ml、0.15μg/ml、0.5μg/ml、1.5μg/ml、5μg/ml抗益赛普药物抗体），加入100μL 解离液（含有0.05%Tween-20、10μg/ml 鼠IgG、10μg/ml 人IgG的10mM甘氨酸缓冲液，pH2.5）混匀；

（2）温育：在37℃条件下，反应6min；

（3）加样：加入100μL 中和液（含 0.05μg/ml亲水化的吖啶酯标记的益赛普，MDN-YSP-PEG400-OH）（含10%马血清，20mM PB，pH7.4），混匀；

（4）加样：加入100μL 1.0μg/ml生物素化益赛普（YSP-Biotin）（1%BSA稀释），混匀；

（5）加样：加入20μL 1.0μg/ml链霉亲和素磁珠（MP-SA）（GE，cat#30-1029-61）（1%BSA稀释），混匀；

（6）温育：在37℃条件下，反应10min；

（7）洗涤：用清洗液洗涤3次；

（8）检测：分别加入200μL激发液A、200μL激发液B，测定发光值（南京迪格诺斯ACL180）；

（9）计算：将校准品浓度值与其发光值做双对数直线拟合（LogX-LogY），得到标准曲线，然后将血清样本的发光值带入标准曲线即可获得样本中抗益赛普药物抗体的浓度。

4. 样本测定

按照本实施例中2和3所述方法，分别测定100例健康体检血清样本中益赛普的阳性率和抗益赛普药物抗体的阳性率（所述阳性率是指判定为阳性样本的百分比）。

按照本实施例中2和3所述方法，分别测定阳性样本（P1和P2）中益赛普和抗益赛普药物抗体的浓度，计算测定结果与理论结果的偏差。计算公式：偏差=（测定结果/理论结果-1）×100%。其中，阳性样本P1含10ng/ml益赛普和1000ng/ml抗益赛普药物抗体（anti-YSP，Bio-Rad，HCA277）；阳性样本P2含1000ng/ml益赛普和10ng/ml抗益赛普药物抗体（anti-YSP，Bio-Rad，HCA277）。阳性样本是通过向胎牛血清（四季青，货号11011-8611）中添加益赛普和抗益赛普药物抗体配制而成，加入比例为：（YSP / anti-YSP antibody）：胎牛血清＝1：500（体积比）。

结果表明，健康体检血清样本均为阴性，阳性样本P1和P2的测定结果与理论结果的偏差均在10%以内。