β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B

摘要

本发明公开一种β‑呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因，及其在制备维生素B₁₂中的应用。

背景技术

维生素 B₁₂>12)在药物和食品工业中具有广泛的应用，其又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基（R基团）种类不同，维生素B₁₂可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B₁₂参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。

由于维生素B₁₂分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素B₁₂的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。

目前，国内外针对维生素B₁₂生产菌生物合成维生素B₁₂的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH和供氧的控制等。有文献报道通过在脱氮假单胞菌基因组上表达单拷贝的透明颤菌vgb>12的能力（程立芳等,>

本发明人前期筛选出了一株高产维生素B₁₂的苜蓿中华根瘤菌CGMCC>12。

β-呋喃果糖苷酶的作用机理是将蔗糖的葡萄糖基与果糖基的β-(1, 4)糖苷键断裂，生成果糖与葡萄糖。果糖与葡萄糖随后进入糖酵解途径。目前，尚未有β-呋喃果糖苷酶cscA用于维生素B₁₂合成的报道。

发明内容

本发明人对前期筛选出的高产维生素B₁₂的苜蓿中华根瘤菌CGMCC>12能力提高的诱变菌株。本发明作了进一步研究以发现对产维生素B₁₂能力有影响的基因。经过研究发现一种发现β-呋喃果糖苷酶基因和其突变基因，其导入苜蓿中华根瘤菌中过表达，能够提高所述菌的产维生素B₁₂的能力。

本发明首先提供一种β-呋喃果糖苷酶的突变体，其多肽氨基酸序列相对于如SEQID No.4所示氨基酸序列，第436位氨基酸替换为T，和/或第330位氨基酸替换为L。

更具体地，其多肽氨基酸序列如SEQ ID NO：5或6所示。

进一步地，本发明提供上述的β-呋喃果糖苷酶的突变体的编码基因。

更具体地，所述核苷酸酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

本发明尤其提供β-呋喃果糖苷酶编码基因在制备维生素B₁₂中的应用。

在具体实施方式中，其是通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达。进一步地，所述导入的编码基因位于质粒或染色体中。

优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCC NO.9638保藏号的菌株。

在某些实施方式中，所述β-呋喃果糖苷酶编码基因编码具有SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽。优选地，所述β-呋喃果糖苷酶编码基因具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。

经研究证实，本发明中，过量表达β-呋喃果糖苷酶基因和突变基因的基因工程菌生物安全（在菌内过表达未对菌体的生长造成影响），尤其可以有效的提高苜蓿中华根瘤菌生产维生素B₁₂的能力。经实验数据表明其中对于原始基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，可以提高产维生素B₁₂的能力达16.7%，而突变基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达能进一步提高产维生素B₁₂的能力即提高20%，尤其是具有两突变位点时提高达>

附图说明

图1：质粒载体pBBR-P21-cscA的图谱。

图2：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的VB₁₂产量。

图3：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的生物量。

图4：维生素B₁₂的标准曲线图。

具体实施方式

本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

培养基配方：

LB 培养基（g/L）：氯化钠 10 ，胰蛋白胨10 ，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉15。

种子培养基（g/L）：蔗糖40，玉米浆20，甜菜碱5，(NH₄)₂SO₄>4)₂HPO₄>4·H₂O>2·6H₂O>4·7H₂O>3>

发酵培养基(g/L)：蔗糖80，玉米浆30，甜菜碱15，(NH₄)₂SO₄>4 1.5,>2HPO₄0.75，CoCl₂·6H₂O>4·7H₂O>3>

检测方法

(1) 样品预处理

取1 mL发酵液，加入8%的亚硝酸钠溶液和冰醋酸各0.25mL摇匀，置于95～100℃水浴中30-40 min；待冷却至室温，在10000转离心1分钟，上层清液通过0.22μm膜(⌀= 0.22µm)过滤器过滤至上样瓶中，再加20μl 2%的NaCN (w / v)至1mL的上清液中。亚硝酸钠溶液和冰醋酸的加入量可随发酵液的量进行相应调整。

（2）标准品的制备

配置梯度维生素B₁₂标准品(20>

（3）HPLC检测条件

C18-250A柱（Agilent，4.6 mmid 9×250 mm，5µm）。流动相为70%有机相（乙腈）和 30%无机相（乙酸钠水溶液），吸收波长为361 nm，柱温为35℃，流速0.8 mL/min，进样量20 µL。

（4）维生素B₁₂标准曲线的绘制

将不同浓度的标准品按上述条件进行HPLC检测，绘制峰面积A-VB₁₂浓度标准曲线。以测得的峰面积A为纵坐标，维生素B₁₂质量浓度C（mg/L）记为横坐标，绘制维生素B₁₂标准曲线。见图4，得回归方程y=19.846x-80.857，R²=0.>12标准曲线计算样品产量。

实施例1：常压室温等离子体（ARTP）诱变时间的确定、突变体库的构建及高产菌种的获得

（1）致死率的测定

为了获得一个比较广的突变体库，对底盘细胞苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638进行了常压室温等离子体（ARTP）诱变。首先，对等离子诱变条件下CGMCCNO.9638的致死率进行测定。将种子用LB培养基培养至对数中期的CGMCCNO.9638细胞(OD₆₀₀=1)>8个细胞/mL的悬液。取10uL悬液均匀的涂布在铁片上，进行ARTP诱变，诱变时间分别为0>-3，取稀释后的细胞悬液100>

从表1中可知，诱变10s时的致死率为82.2％，诱变15s时的致死率达到95％以上，致死率为80％-90％时，诱变后发生正突变的概率最高，因此选择10s作为最终构建突变体库的诱变时间。

（2）突变体库的构建及筛选

取浓度为10⁸个/mL的细胞悬液10>-3，取稀释后的细胞悬液100>

（3）突变株96深孔板发酵初筛

分别挑取平板上的所有单菌落接种于含有500uL的种子培养基的96深孔板中（每个孔板上包含6株对照菌株CGMCC NO.9638），30℃、800rpm、80%湿度振荡培养36h后，按10%（v/v）接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80%湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B₁₂产量。

（4）突变株96深孔板发酵复筛

将步骤（3）中产量排前30的株菌的单菌落（包含一个对照菌株CGMCC NO.9638）接种于含有500uL种子培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80%湿度振荡培养36h后，按10%（v/v）接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中（每株菌3个平行），30℃、800rpm、80%湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B₁₂产量。

重复步骤（3）和（4）三次，最后获得一株高产维生素B₁₂的菌种SM*，96孔板中产量从50>

实施例2：突变菌株与出发菌株进行比较基因组分析

将菌种SM*和出发菌株CGMCC NO.9638送金唯智生物科技有限公司进行全基因组测序。通过比较两个菌株的全基因组序列发现β-呋喃果糖苷酶编码基因cscA发生了点突变，其第989位核苷酸由C变为T，第1306位核苷酸由G变为A。为了验证突变位点对维生素B₁₂产量的影响，将突变前和突变后的cscA基因在出发菌种CGMCC>

实施例3：质粒载体的构建

1、pBBR-P21-cscA的构建：

分别利用表2的引物对P21-XbaI-F和P21-R，以Ensifer> Casida A（黏着剑菌）基因组为模板，通过PCR 扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI（NEB公司）在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21片段。P21启动子序列如SEQ>

分别利用表2的引物对cscA-F和cscA-XhoI-R，以Ensifer> Casida A（黏着剑菌）基因组为模板，通过PCR 扩增，引入XhoI酶切位点，得到cscA片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的cscA片段。cscA基因序列如SEQ>

然后，利用引物对P21-XbaI-F和cscA-XhoI-R，以纯化的P21片段和cscA片段为模板，通过融合PCR，得到P21-cscA片段（含XbaI和XhoI酶切位点），经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-cscA片段。

将上述纯化的P21-cscA片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和XhoI进行双酶切，将P21-cscA片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pBBR-P21-cscA。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-cscA备用，质粒图谱如图1所示。

、pBBR-P21-cscA（G1306A）

以质粒pBBR-P21-cscA为模板，用引物对>DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的产物。取30ng纯化后的产物加入2>E.coli/pBBR-P21-cscA（G1306A）。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-cscA（G1306A）备用。其中，突变的cscA基因序列如SEQ>

、pBBR-P21-cscA（G1306A，C989T）

以质粒pBBR-P21-cscA（G1306A）为模板，用引物对C989T-F/>DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的产物。取30ng纯化后的产物加入2>E.coli/pBBR-P21-cscA（G1306A，C989T）。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-cscA（G1306A，C989T）备用。其中，突变的cscA基因序列如SEQ>

实施例4：含质粒载体菌株的构建

将实施例3中的4个质粒pBBR1MCS2、pBBR-P21-cscA、pBBR-P21-cscA（G1306A）和pBBR-P21-cscA（G1306A，C989T）按照如下方法转入苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638中：

（1）接种新活化的苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638、大肠杆菌（含有相应的质粒）以及辅助载体MT616，并分别在30℃和37℃的培养箱中振荡培养到OD值为1.0左右；

（2）无菌条件下分别将苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638的菌液、MT616和大肠杆菌的菌液各500 μL转移至1.5mL无菌EP管中并在4 ℃，12,000 rpm条件下离心1 min。

（3）在无菌条件下弃掉上清液，并用1mL 0.85%的无菌生理盐水对沉淀进行悬浮。

（4）再次在4℃，12,000 rpm条件下离心1min，并在无菌条件下去除上清。

（5）分别采用500μL新鲜的LB液体培养基对受体细胞、大肠杆菌和MT616的沉淀进行悬浮。

（6）分别取各2μL的三种菌液，滴在不添加抗性的LB固体培养基的同一位置，并小心将其混匀。分别将单一组分的菌液以及两两之间混合的菌液进行点样，用来作为试验对照组。

（7）待菌液自然风干后，在37℃培养箱中倒置培养约1天，至单菌落长出。

（8）挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线，将平板倒置于30℃培养箱中进行培养，直到菌落长出。同时对照组也需挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线。

（9）从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落PCR验证。得到阳性苜蓿中华根瘤菌:SM/pBBR (对照菌)、SM/pBBR-P21-cscA（简写为SM1）、SM/>cscA（G1306A）（简写为SM2）、SM/>cscA（G1306A，C989T）（简写为SM3）。

实施例5：不同菌株评价

1、苜蓿中华根瘤菌的培养条件：

将对照菌、SM1、SM2和SM3菌株在无菌条件下用接种针在含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，30℃恒温静置48 h培养，获得单菌落。用接种针挑取单菌落于装有5 mL含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基的试管中，30℃，200 rpm培养36h。将种子培养基按照10%比例接种至含有100mg/L卡那霉素的30mL发酵培养基中（250ml摇瓶）。30℃震荡（220 r/min）培养144 h后收集菌体并检测产量。摇瓶发酵每个实验做3个平行。

、不同苜蓿中华根瘤菌菌株产VB₁₂能力的比较

SM1、SM2和SM3三个菌株与对照菌相比生产维生素B₁₂的能力均得到提高。

其中SM1提高16.7%,，SM2提高20%，SM3提高 25.6%（参见表3和图2）。结果说明本发明中过量表达β-呋喃果糖苷酶编码基因cscA的苜蓿中华根瘤菌菌株生产维生素B₁₂的能力得到显著提高。四个菌株生物量变化不大，说明cscA基因的过表达未对菌体的生长造成影响（见表3和图3）。

序列表

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用

<160>15

<170> PatentIn Version 3.1

<210>1

<211> 1707

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 1

atgacttcgc agacaaaacc cgcgagcccc gtgcttgaaa tcgtcgaggc cgaactcccg 60

gccgggaccg tgctgcatct ctggctgaag gcgcgcaaaa ttggcgacga ggcaatactg 120

tccgtcacct tagaccgcag tgagattgcc ggtccgtcca cgcgccgcgc cggggagttc 180

gaattcttcg cggtgacgct cgggacgact ggccgcacgg tgcttgccta tgatgcggaa 240

acaactgcgc tctccgtcgc ctatgcgttc cacccgcaga cggtgctgga ggaggggatc 300

cgcgtcctcc atcacgacgt ccgcacggcg ccgcctgagg ttcccggcag ctaccatttc 360

cgaccgccct tcggctggat gaacgacccg aacggcttcg gccggttcaa aggtctcggc 420

catctcttct accagcacta tccgcatggc ttgcgttgga acaccatgca ctggggccat 480

gcggtctcga aagatttgat ccgctggacg cacctgccga tgttcctgtt tccggcggac 540

cacctgtcgg aaaaggacga tggccgtggc ggcgcctttt ccggctcggc cgtccccgtc 600

tccgggccgg acggggacga catccgggtc ttctacaccg aacacgttcg cgaccgggag 660

ccggaggagc agatccagct ctcggccgtc agccgagacg gcatcgttgc cggcccgtcc 720

gaggtgatcc tgcctatccg tccggagggt ctgaacctca cgactgattt ccgcgatccc 780

tatgtgttca agggcccgga cggccgctgg aagatgctgc ttggcagtcg cgaccgatcg 840

ggcggtgtcg tcctgcttta cgagacggcg gatctgcagg gtgccacggg ctggaccttc 900

ctcgacatca tccatcgcga ggacggtttc ggcatgaccg cagcggagtg cccttgcatg 960

ctgccggtcg gcggcatggc ggatgatccg gagacccgct gggcgctgat ctttggcctg 1020

ctcacaagcc gtgacccggc caccggccgg cgcaacctca catccgtcac cgtcggccgc 1080

ttcgacggcc ggtcgttcac ggccgaattc gaacaggaac tggatttcgg ctccgacgcc 1140

tacgccttcc aggccttcgt cgacggcgac gaaccggtcg gcatcgcctg gcttgccaac 1200

tggacagact tttccaagaa ggacgatttc ccgacggcga tgaccttgcc gcgtcgcgtg 1260

cttctcgatg ggggtgccgt gttgacgccg ccggtcgcgg cagtcgaaaa cctgcgccac 1320

aggctgctcg atgaagcagc ccttgctgcg ggcgaaacgg ttccactcga aagcggtgcg 1380

gtcgagatcg tgcttgcact gcccgaggcc ggcgcggctt tcgagctcgt cctcgatcac 1440

ccggatgtcg cgcttggcgt caggctcgat gacgagggcc ttgcaatcct cttcgatgcc 1500

ggtaccggca agccgccacc gcgatatctg gcgtcaggcg ccagaccttc gcagctgcgc 1560

atcttcctcg atgcgggctc gatcgaggtc tttgccgaca acggccgctg gacaggcacc 1620

aagcgcattc ccggatttgc cgccgcgcga tcggcaaggc tgacgggcgc cgtcacgggc 1680

gcgaaaatct ggcaactcaa gctttga 1707

<210>2

<211> 1707

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 2

atgacttcgc agacaaaacc cgcgagcccc gtgcttgaaa tcgtcgaggc cgaactcccg 60

gccgggaccg tgctgcatct ctggctgaag gcgcgcaaaa ttggcgacga ggcaatactg 120

tccgtcacct tagaccgcag tgagattgcc ggtccgtcca cgcgccgcgc cggggagttc 180

gaattcttcg cggtgacgct cgggacgact ggccgcacgg tgcttgccta tgatgcggaa 240

acaactgcgc tctccgtcgc ctatgcgttc cacccgcaga cggtgctgga ggaggggatc 300

cgcgtcctcc atcacgacgt ccgcacggcg ccgcctgagg ttcccggcag ctaccatttc 360

cgaccgccct tcggctggat gaacgacccg aacggcttcg gccggttcaa aggtctcggc 420

catctcttct accagcacta tccgcatggc ttgcgttgga acaccatgca ctggggccat 480

gcggtctcga aagatttgat ccgctggacg cacctgccga tgttcctgtt tccggcggac 540

cacctgtcgg aaaaggacga tggccgtggc ggcgcctttt ccggctcggc cgtccccgtc 600

tccgggccgg acggggacga catccgggtc ttctacaccg aacacgttcg cgaccgggag 660

ccggaggagc agatccagct ctcggccgtc agccgagacg gcatcgttgc cggcccgtcc 720

gaggtgatcc tgcctatccg tccggagggt ctgaacctca cgactgattt ccgcgatccc 780

tatgtgttca agggcccgga cggccgctgg aagatgctgc ttggcagtcg cgaccgatcg 840

ggcggtgtcg tcctgcttta cgagacggcg gatctgcagg gtgccacggg ctggaccttc 900

ctcgacatca tccatcgcga ggacggtttc ggcatgaccg cagcggagtg cccttgcatg 960

ctgccggtcg gcggcatggc ggatgatccg gagacccgct gggcgctgat ctttggcctg 1020

ctcacaagcc gtgacccggc caccggccgg cgcaacctca catccgtcac cgtcggccgc 1080

ttcgacggcc ggtcgttcac ggccgaattc gaacaggaac tggatttcgg ctccgacgcc 1140

tacgccttcc aggccttcgt cgacggcgac gaaccggtcg gcatcgcctg gcttgccaac 1200

tggacagact tttccaagaa ggacgatttc ccgacggcga tgaccttgcc gcgtcgcgtg 1260

cttctcgatg ggggtgccgt gttgacgccg ccggtcgcgg cagtcaaaaa cctgcgccac 1320

aggctgctcg atgaagcagc ccttgctgcg ggcgaaacgg ttccactcga aagcggtgcg 1380

gtcgagatcg tgcttgcact gcccgaggcc ggcgcggctt tcgagctcgt cctcgatcac 1440

ccggatgtcg cgcttggcgt caggctcgat gacgagggcc ttgcaatcct cttcgatgcc 1500

ggtaccggca agccgccacc gcgatatctg gcgtcaggcg ccagaccttc gcagctgcgc 1560

atcttcctcg atgcgggctc gatcgaggtc tttgccgaca acggccgctg gacaggcacc 1620

aagcgcattc ccggatttgc cgccgcgcga tcggcaaggc tgacgggcgc cgtcacgggc 1680

gcgaaaatct ggcaactcaa gctttga 1707

<210>3

<211> 1707

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 3

atgacttcgc agacaaaacc cgcgagcccc gtgcttgaaa tcgtcgaggc cgaactcccg 60

gccgggaccg tgctgcatct ctggctgaag gcgcgcaaaa ttggcgacga ggcaatactg 120

tccgtcacct tagaccgcag tgagattgcc ggtccgtcca cgcgccgcgc cggggagttc 180

gaattcttcg cggtgacgct cgggacgact ggccgcacgg tgcttgccta tgatgcggaa 240

acaactgcgc tctccgtcgc ctatgcgttc cacccgcaga cggtgctgga ggaggggatc 300

cgcgtcctcc atcacgacgt ccgcacggcg ccgcctgagg ttcccggcag ctaccatttc 360

cgaccgccct tcggctggat gaacgacccg aacggcttcg gccggttcaa aggtctcggc 420

catctcttct accagcacta tccgcatggc ttgcgttgga acaccatgca ctggggccat 480

gcggtctcga aagatttgat ccgctggacg cacctgccga tgttcctgtt tccggcggac 540

cacctgtcgg aaaaggacga tggccgtggc ggcgcctttt ccggctcggc cgtccccgtc 600

tccgggccgg acggggacga catccgggtc ttctacaccg aacacgttcg cgaccgggag 660

ccggaggagc agatccagct ctcggccgtc agccgagacg gcatcgttgc cggcccgtcc 720

gaggtgatcc tgcctatccg tccggagggt ctgaacctca cgactgattt ccgcgatccc 780

tatgtgttca agggcccgga cggccgctgg aagatgctgc ttggcagtcg cgaccgatcg 840

ggcggtgtcg tcctgcttta cgagacggcg gatctgcagg gtgccacggg ctggaccttc 900

ctcgacatca tccatcgcga ggacggtttc ggcatgaccg cagcggagtg cccttgcatg 960

ctgccggtcg gcggcatggc ggatgatctg gagacccgct gggcgctgat ctttggcctg 1020

ctcacaagcc gtgacccggc caccggccgg cgcaacctca catccgtcac cgtcggccgc 1080

ttcgacggcc ggtcgttcac ggccgaattc gaacaggaac tggatttcgg ctccgacgcc 1140

tacgccttcc aggccttcgt cgacggcgac gaaccggtcg gcatcgcctg gcttgccaac 1200

tggacagact tttccaagaa ggacgatttc ccgacggcga tgaccttgcc gcgtcgcgtg 1260

cttctcgatg ggggtgccgt gttgacgccg ccggtcgcgg cagtcaaaaa cctgcgccac 1320

aggctgctcg atgaagcagc ccttgctgcg ggcgaaacgg ttccactcga aagcggtgcg 1380

gtcgagatcg tgcttgcact gcccgaggcc ggcgcggctt tcgagctcgt cctcgatcac 1440

ccggatgtcg cgcttggcgt caggctcgat gacgagggcc ttgcaatcct cttcgatgcc 1500

ggtaccggca agccgccacc gcgatatctg gcgtcaggcg ccagaccttc gcagctgcgc 1560

atcttcctcg atgcgggctc gatcgaggtc tttgccgaca acggccgctg gacaggcacc 1620

aagcgcattc ccggatttgc cgccgcgcga tcggcaaggc tgacgggcgc cgtcacgggc 1680

gcgaaaatct ggcaactcaa gctttga 1707

<210>4

<211>568

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 4

MTSQTKPASP VLEIVEAELP AGTVLHLWLK ARKIGDEAIL SVTLDRSEIA GPSTRRAGEF 60

EFFAVTLGTT GRTVLAYDAE TTALSVAYAF HPQTVLEEGI RVLHHDVRTA PPEVPGSYHF 120

RPPFGWMNDP NGFGRFKGLG HLFYQHYPHG LRWNTMHWGH AVSKDLIRWT HLPMFLFPAD 180

HLSEKDDGRG GAFSGSAVPV SGPDGDDIRV FYTEHVRDRE PEEQIQLSAV SRDGIVAGPS 240

EVILPIRPEG LNLTTDFRDP YVFKGPDGRW KMLLGSRDRS GGVVLLYETA DLQGATGWTF 300

LDIIHREDGF GMTAAECPCM LPVGGMADDP ETRWALIFGL LTSRDPATGR RNLTSVTVGR 360

FDGRSFTAEF EQELDFGSDA YAFQAFVDGD EPVGIAWLAN WTDFSKKDDF PTAMTLPRRV 420

LLDGGAVLTP PVAAVENLRH RLLDEAALAA GETVPLESGA VEIVLALPEA GAAFELVLDH 480

PDVALGVRLD DEGLAILFDA GTGKPPPRYL ASGARPSQLR IFLDAGSIEV FADNGRWTGT 540

KRIPGFAAAR SARLTGAVTG AKIWQLKL 568

<210>5

<211>568

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400>5

MTSQTKPASP VLEIVEAELP AGTVLHLWLK ARKIGDEAIL SVTLDRSEIA GPSTRRAGEF 60

EFFAVTLGTT GRTVLAYDAE TTALSVAYAF HPQTVLEEGI RVLHHDVRTA PPEVPGSYHF 120

RPPFGWMNDP NGFGRFKGLG HLFYQHYPHG LRWNTMHWGH AVSKDLIRWT HLPMFLFPAD 180

HLSEKDDGRG GAFSGSAVPV SGPDGDDIRV FYTEHVRDRE PEEQIQLSAV SRDGIVAGPS 240

EVILPIRPEG LNLTTDFRDP YVFKGPDGRW KMLLGSRDRS GGVVLLYETA DLQGATGWTF 300

LDIIHREDGF GMTAAECPCM LPVGGMADDP ETRWALIFGL LTSRDPATGR RNLTSVTVGR 360

FDGRSFTAEF EQELDFGSDA YAFQAFVDGD EPVGIAWLAN WTDFSKKDDF PTAMTLPRRV 420

LLDGGAVLTP PVAAVKNLRH RLLDEAALAA GETVPLESGA VEIVLALPEA GAAFELVLDH 480

PDVALGVRLD DEGLAILFDA GTGKPPPRYL ASGARPSQLR IFLDAGSIEV FADNGRWTGT 540

KRIPGFAAAR SARLTGAVTG AKIWQLKL 568

<210>6

<211>568

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 6

MTSQTKPASP VLEIVEAELP AGTVLHLWLK ARKIGDEAIL SVTLDRSEIA GPSTRRAGEF 60

EFFAVTLGTT GRTVLAYDAE TTALSVAYAF HPQTVLEEGI RVLHHDVRTA PPEVPGSYHF 120

RPPFGWMNDP NGFGRFKGLG HLFYQHYPHG LRWNTMHWGH AVSKDLIRWT HLPMFLFPAD 180

HLSEKDDGRG GAFSGSAVPV SGPDGDDIRV FYTEHVRDRE PEEQIQLSAV SRDGIVAGPS 240

EVILPIRPEG LNLTTDFRDP YVFKGPDGRW KMLLGSRDRS GGVVLLYETA DLQGATGWTF 300

LDIIHREDGF GMTAAECPCM LPVGGMADDL ETRWALIFGL LTSRDPATGR RNLTSVTVGR 360

FDGRSFTAEF EQELDFGSDA YAFQAFVDGD EPVGIAWLAN WTDFSKKDDF PTAMTLPRRV 420

LLDGGAVLTP PVAAVKNLRH RLLDEAALAA GETVPLESGA VEIVLALPEA GAAFELVLDH 480

PDVALGVRLD DEGLAILFDA GTGKPPPRYL ASGARPSQLR IFLDAGSIEV FADNGRWTGT 540

KRIPGFAAAR SARLTGAVTG AKIWQLKL 568

<210>7

<211> 1000

<212>DNA

<213>Ensifer adhaerens Casida A

<400> 7

caaacagacc gggatatgcg ggtattcttc cgccgcgccg aggatgaggt ggcgcaggaa 60

cgcgtcaccg gcataggagc gggcgccacg gcttgcctga aggatgaccg ggctgtcggt 120

cgcatcggcg gcgcgcatga cggcctgaat gtattccaga ttgttcacat tgaacgccgg 180

cagcgcgtaa tcgttctccg ccgcatggtc gagcagttgc cgcaatgtga tcaatgccat 240

tcgctatctc cctttggata ctcggtgcaa cctatgcggc gcaccacaaa aacaatccgg 300

ccgttgaacc gcacgaaatg catcgatggc aaagtcgatg gccggctttt tcgtgcggcg 360

tgacggcgcg cgcgaattgg tcgcgcccac cgaagtcagg cgcacaatag ttcatcgaag 420

tggtttgaca accgggcaaa aggcaggttg ccagaggtcg aaactcgctt caatcgattt 480

tactgtggac tggatgcaac accttcagtg tgaagtgttt tcactttctg gtggtgcctg 540

agaggagggg gagtcgaggg cagtggatgc aaccattggg cgctgatttt gtctgttaca 600

ccatcgtggt ggatgccctg tcggaaacag tctgtcgaca ggaggtgaac gtcccgcaag 660

aagattgcgg caacgcccct ctttctttgc gcagattacg taaactgccg ctaaaattca 720

caaactttgc atcgcggatg attcgaggct caatccggcc gacaaaaagc gcggacctaa 780

aacgttgcag tagatttcgc aaaaatgccc tgttcacgtc atatgcccgt cgcaaaggcg 840

acgaaaagaa tcgcaaacaa aatacaacct atgggatagg ccgattcccc tcctatagat 900

aaagatgcag acagccgcag aatccgcctt gcgttcgcga acgatttgcg cttctctcct 960

gcgatcacaa acccaaaaca aggggaagga gagaaacaaa 1000

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 8

ctagtctaga caaacagacc gggatatgcg gg 32

<210>9

<211> 42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gggttttgtc tgcgaagtca ttttgtttct ctccttcccc tt 42

<210>10

<211> 42

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 10

aaggggaagg agagaaacaa aatgacttcg cagacaaaac cc 42

<210>11

<211> 30

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 11

ccgctcgagt caaagcttga gttgccagat 30

<210>12

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 12

cggcggcatg gcggatgatc tggagacccg ctgggcgctg a 41

<210>13

<211> 41

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 13

tcagcgccca gcgggtctcc agatcatccg ccatgccgcc g 41

<210>14

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 14

cgccgccggt cgcggcagtc aaaaacctgc gccacaggct g 41

<210>15

<211> 41

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 15

cagcctgtgg cgcaggtttt tgactgccgc gaccggcggc g 41