银缕梅微卫星标记组合及其引物和应用

摘要

本发明公开了一种银缕梅微卫星标记组合，其包括18个银缕梅微卫星标记，同时提供了一组能够高效扩增银缕梅微卫星标记的特异性引物组及银缕梅微卫星标记检测方法，可为银缕梅种质资源的开发及保护、遗传多样性分析、遗传图谱的构建、分子标记辅助育种及遗传结构的分析奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种银缕梅微卫星标记组合及其引物和应用。

背景技术

银缕梅(Parrotia subaequalis)，隶属于金缕梅科(Hamamelidaceae)，是最古的老被子植物之一，是仅存我国被再发现的“活化石”树种，也是中国特有的单种属乔木树种，在植物进化史上有着承前(裸子植物)启后(被子植物)的重要地位。同时银缕梅也是一种珍贵的兼具观花和秋季观叶的优良绿化观赏树种。但由于其分布区狭小，呈间断岛屿状散布于天目山北段及大别山东南部，现存种群个体数量极少，已濒于灭绝。近年来有关银缕梅的研究主要集中于形态解剖、系统分类、生理生态、生物学特性及繁殖培育等方面，在分子水平的研究几乎空白。银缕梅SSR分子标记的开发可为银缕梅种质资源评价、遗传多样性分析、分子标记辅助育种、遗传连锁图谱的构建及功能基因的开发利用等提供依据。

简单序列重复(SSR)，又称作微卫星标记，是一类由1～6个核苷酸组成的基元串联重复的DNA序列。SSR属于一种基于PCR原理的分子标记，其在基因组中广泛存在。与其他分子标记相比，SSR分子标记具有共显性、多态性丰富、重复性和稳定性好等优点,且种属特异性强,广泛地分布于整个真核生物基因组中,是现阶段应用最广泛的分子标记技术之一。目前通过转录组测序技术开发SSR分子标记广泛应用于木本植物中，因此基于转录组测序获取银缕梅的SSR分子标记具有经济、可靠的特点，且具有十分重要的应用价值。

发明内容

本发明立足于现有银缕梅分子研究技术的空白，提供了一种银缕梅微卫星标记组合及其引物和应用，旨在为其种质资源的开发及保护、遗传多样性分析、遗传图谱的构建、分子标记辅助育种及遗传结构的分析奠定基础。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种银缕梅微卫星标记组合，包括以下18个银缕梅微卫星标记：PSSSR139、PSSSR10、PSSSR141、PSSSR17、PSSSR20、PSSSR111、PSSSR138、PSSSR127、PSSSR130、PSSSR150、PSSSR158、PSSSR76、PSSSR9、PSSSR74、PSSSR99、PSSSR71、PSSSR98和PSSSR151。

用于检测上述银缕梅微卫星标记组合的引物组，包括SEQ ID NO.1-36所示的引物。

用于检测上述银缕梅微卫星标记组合的试剂盒，包括上述引物。

进一步地，所述试剂盒还包括以下试剂：Premix Taq聚合酶和ddH₂O。

一种银缕梅微卫星标记的检测方法，包括以下步骤：

步骤1，提取银缕梅基因组DNA；

步骤2，合成SEQ ID NO.1-36所示的引物，并使用荧光染料对正向引物5’端进行标记，获得荧光标记后的银缕梅微卫星引物组；

步骤3，以步骤1提取的基因组DNA为模板，利用荧光标记后的银缕梅微卫星引物组进行PCR扩增获得扩增产物；

步骤4，对扩增产物中的单色荧光标记DNA片段进行检测和分析。

进一步地，所述荧光染料为FAM、HEX或TAMRA中的至少一种。

进一步地，所述的PCR反应体系为：总体积为30μL，含有Premix Taq聚合酶15μL，模板DNA 1μL(20ng/μL)，上下游引物各1μL，ddH₂O>

进一步地，所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，于4℃保存。

上述银缕梅微卫星标记组合、上述引物组或上述试剂盒在构建银缕梅遗传连锁图谱中的应用。

上述银缕梅微卫星标记组合、上述引物组或上述试剂盒在分子标记辅助银缕梅育种中的应用。

上述银缕梅微卫星标记组合、上述引物组或上述试剂盒在银缕梅种质资源遗传多样性分析中的应用。

上述银缕梅微卫星标记组合、上述引物组或上述试剂盒在银缕梅种质资源保护开发中的应用。

上述银缕梅微卫星标记组合、上述引物组或上述试剂盒在银缕梅亲缘关系分析中的应用。

本发明通过对银缕梅进行微卫星位点多态性研究，创造性的开发了18个多态性丰富的银缕梅卫星位点。本发明中所开发的18个银缕梅卫星位点引物退火温度严格保持一致，在实际应用中可以使用同一退火温度进行PCR扩增反应，提高了应用的便捷性。利用本发明公开的18个银缕梅微卫星引物组对采集的银缕梅进行检测，结果表明，所有位点在群体中都能得到100％的扩增。

有益效果：

1、本发明基于转录组测序技术开发分子标记，具有灵敏度高、重复性好、稳定性强的优点。

2、本发明开发的SSR分子标记成功率高、多态性丰富，利用荧光技术标记的24对引物中有18对检测出多态性，成功率为75％。

3、本发明开发的SSR引物都为多态性位点，可为银缕梅亲缘关系的鉴定、种质资源评价、遗传多样性分析、分子标记辅助育种、遗传连锁图谱的构建等提供理论基础。

附图说明

图1为PSSSR139位点扩增的荧光扫描峰图；

图2为PSSSR10位点扩增的荧光扫描峰图；

图3为PSSSR141位点扩增的荧光扫描峰图；

图4为PSSSR17位点扩增的荧光扫描峰图；

图5为PSSSR20位点扩增的荧光扫描峰图；

图6为PSSSR111位点扩增的荧光扫描峰图；

图7为PSSSR138位点扩增的荧光扫描峰图；

图8为PSSSR127位点扩增的荧光扫描峰图；

图9为PSSSR130位点扩增的荧光扫描峰图；

图10为PSSSR150位点扩增的荧光扫描峰图；

图11为PSSSR158位点扩增的荧光扫描峰图；

图12为PSSSR76位点扩增的荧光扫描峰图；

图13为PSSSR9位点扩增的荧光扫描峰图；

图14为PSSSR74位点扩增的荧光扫描峰图；

图15为PSSSR99位点扩增的荧光扫描峰图；

图16为PSSSR71位点扩增的荧光扫描峰图；

图17为PSSSR98位点扩增的荧光扫描峰图；

图18为PSSSR151位点扩增的荧光扫描峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

基于转录组测序的银缕梅SSR分子标记的开发

1.转录组数据的获取

采取银缕梅花芽部位利用Illumina HiSeq 2000进行转录组测序，去除测序原始数据的接头以及低质量的序列。利用组装软件Trinity从头组装样品数据，经过去冗余处理后，得到Unigene。

2.SSR引物设计

利用MISA软件对拼接后的Unigenes进行SSR位点搜索。搜索标准为软件默认值，即以单核苷酸为重复单位时，至少重复10次才会被检测到；双核苷酸为重复单位时，至少重复6次才可以被检测到；三至六核苷酸最少重复5次并筛选碱基被间隔小于或等于100bp的复合型SSR。使用Primer 3.0软件对SSR位点两侧的序列进行引物设计。引物设计的原则是：产物大小100～300bp，引物长度18～25bp，GC含量40％～60％，退火温度55～65℃，上下游引物Tm值相差小于5℃。

3.DNA提取

选取在江苏省宜兴林场大垅沟和安徽省金寨采集的银缕梅个体40个，采用天根(TIANGEN)Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取，利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对DNA质量进行检测，用紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，确保OD260/280在2.0～2.2之间，并将DNA浓度调至20ng/μL，置于-20℃冰箱保存备用。

4.引物筛选

选取具有代表性的8份银缕梅个体进行引物的初筛，扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，于4℃保存。筛选出扩增条带清晰明亮、稳定性好且大小符合预期的引物24对，将其上游序列经5’端利用FAM、HEX、TAMRA进行荧光修饰与未经荧光修饰的下游引物进行配对，用于后续PCR反应。

5.毛细管电泳检测

将上述步骤得到的荧光引物与40份银缕梅DNA模板进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物使用DNA测序仪ABI3730xl进行毛细管电泳检测，筛选出18对多态性标记，如表1所示。

表1

实施例2

18对SSR引物在银缕梅遗传多样性研究中的应用

1.数据处理

取实施例1中得到的毛细管电泳检测数据，以毛细管电泳后的数据为峰图，使用Gene Marker读取。在图中如果只有一个峰，代表是纯合子，如果是两个峰，代表是杂合子。在Excel中记录峰图位置，建立数据矩阵，把图像资料转换为数据资料。

2.银缕梅种质资源遗传多样性分析

使用PopGene软件和cervus分析银缕梅种质资源的遗传多样性，分析的遗传学参数包括(见表2)：观察等位基因数Na、有效等位基因数Ne、观测杂合度Ho、期望杂合度He、Nei’s遗传多样性指数H、Shannon’s信息指数I、多态信息PIC值。

表2

本发明根据银缕梅微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行毛细管电泳进行基因分型，根据分离片段的大小决定基因型，从而揭示其多态性。

序列表

<110> 南京森林警察学院

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