一种检测利什曼原虫的引物对、探针及检测方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测利什曼原虫的引物对、探针及检测方法和试剂盒，通过针对利什曼原虫动基体小环的保守区域设计出一对能特异性检测利什曼原虫的引物对和探针；所述引物对的序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示，所述探针的序列如SEQ ID No：3；该引物对和探针能特异性扩增出利什曼原虫的部分片段，且灵敏度高，能检测出仅含有0.001copies/μl的样本；利用该引物对、探针和检测方法能够绝对定量出人外周血、骨髓以及皮肤中利什曼原虫的含量，检测安全、快速方便，可用于利什曼原虫的检测，以及跟踪监测患者药物的治疗效果，有利于开展流行病学调查，预防和控制利什曼原虫的传播。

说明书

技术领域

本发明属于寄生虫分子检测技术领域，更具体地，涉及一种检测利什曼原虫的引物对、探针及检测方法和试剂盒。

背景技术

利什曼病是由利什曼原虫（Leishmania，Lspp.）引起，主要经白蛉传播的一种人兽共患疾病。

利什曼病的诊断是预防及治疗的关键环节。病原学检查是利什曼病诊断的“金标准”，然而，病原学检查的敏感度因取样部位的不同而有所差异，脾脏穿刺物镜检和培养的敏感性分别为95%和100%,但由于脾脏穿刺的风险较高在临床中应用具有一定的局限性。骨髓穿刺相对安全，但灵敏度较低（52-69%），因此，临床上亟需高敏感性，采样便捷的方法来解决这一问题。

专利 CN101613752A公开了一种快速检测杜氏利什曼原虫的荧光定量PCR试剂盒，采用杜氏利什曼原虫kDNA基因特异性引物，以SYBR-Green染料收集荧光定量。

Hossain et al.2017公开了荧光定量PCR法用于检测和定量内脏利什曼病，采用利什曼原虫REPL重复的保守区特异性引物和探针进行定量。

但上述方法仍然存在灵敏度不高、特异性不强的缺陷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有利什曼原虫检测技术的缺陷和不足，提供一种检测人外周血和骨髓中利什曼原虫的引物对和探针。所述引物对和探针能够安全、快速方便地绝对定量出人外周血、骨髓和皮肤中利什曼原虫的含量，灵敏度高，可用于利什曼原虫的检测，以及跟踪监测患者药物的治疗效果，有利于开展流行病学调查，预防和控制利什曼原虫的传播。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种检测利什曼原虫的引物对，包含引物-F，其序列为5’- TCCGGGTAGGGGCGTTCTG -3’（ SEQ ID No：1）或SEQ ID No：1经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与SEQ IDNo:1具有相同功能的DNA分子；引物-R，其序列为5’- TTTACACCAACCCCCAGTTTCC -3’（ SEQID No：2）或SEQ ID No:2经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与SEQ ID No:2具有相同功能的DNA分子。

一种检测利什曼原虫的探针Probe，其序列为5’-FAM-TTTGAACGGGATTTCTGCACCCAT -TAMRA-3’（ SEQ ID NO：3）或SEQ ID No:3经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与SEQ ID No:3具有相同功能的DNA分子。

本发明比对了利什曼原虫动基体小环DNA序列，确定了利什曼原虫的保守区域，并将不同利什曼原虫变异位点设置为简并碱基，经过引物和探针设计，筛选出一对能够特异性检测利什曼原虫的引物对和探针。

本发明还提供一种检测利什曼原虫的试剂盒，所述试剂盒包含引物对引物-F、引物-R和探针Probe。

优选地，所述试剂盒还含有荧光定量PCR扩增的反应试剂。所述的荧光定量PCR扩增的反应试剂是指能够使得样本DNA在上述引物对和探针的作用下进行荧光定量PCR扩增反应的试剂，现有技术中常规荧光定量PCR扩增的反应试剂均可用于本发明。所述荧光定量PCR扩增的反应试剂可用商品化的试剂，例如GoTaq® Probe qPCR Master Mix。

优选地，所述试剂盒中包含引物-F，引物-R，探针Probe，利什曼原虫阳性对照，质粒标准品，热启动酶，氯化镁，dNTPs，缓冲液，若丹明参考染料，无菌双蒸水。

优选地，所述试剂盒还包含待测样品DNA提取的试剂和普通PCR扩增的试剂。

同时，本发明还提供一种检测利什曼原虫的方法，所述方法包括如下步骤：以待测样品人外周血单核细胞或骨髓或皮肤的DNA为模板，利用引物-F、引物-R和探针进行荧光定量PCR扩增，通过标准曲线计算出利什曼原虫的含量。

优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应体系包括：引物-F、引物-R和探针Probe，模板DNA，热启动酶，氯化镁，dNTPs，缓冲液，若丹明参考染料，无菌双蒸水。

优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应条件：94-96℃ 2-3min；94-96℃ 15-30s，53-56℃ 15-30s，72℃ 30-40s，共35-40个反应循环。

进一步优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃2min；95℃15s，55℃15s，72℃30s，共40个反应循环。

优选地，所述标准曲线的建立包括如下步骤：以提取出利什曼原虫培养物的DNA为模板进行普通PCR扩增，将扩增产物重组转化入质粒载体pUC19，用提取出的重组质粒DNA建立标准曲线。

此外，本发明还提供了所述引物-F、引物-R和探针Probe的组合在制备检测利什曼原虫产品中的应用。优选的，所述的产品为试剂盒。

作为一种优选地可实施方式，所述利什曼原虫检测试剂盒的使用方法为：提取待测样品人外周血或骨髓或皮肤中利什曼原虫的DNA，以提取出的DNA为模板，利用引物-F、引物-R和探针Probe进行荧光定量PCR扩增，通过标准曲线计算出利什曼原虫的含量。

所述荧光定量PCR扩增的反应体系：引物-F、引物-R和探针Probe，模板DNA，热启动酶，氯化镁，dNTPs，缓冲液，若丹明参考染料，无菌双蒸水。

所述荧光定量PCR扩增的反应条件：94-96℃ 2-3min；94-96℃ 15-30s，53-56℃15-30s，72℃ 30-40s，共35-40个反应循环。

所述荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃2min；95℃15s，55℃15s，72℃30s，共40个反应循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用利什曼原虫动基体保守区设计引物对和探针，筛选出能特异性扩增出利什曼原虫的引物对和探针，且灵敏度高，能检测出仅仅含有0.001copies/μl的样本；利用该引物对、探针和检测方法能够绝对定量出人外周血、骨髓以及皮肤中利什曼原虫的含量，检测安全、快速方便，可用于利什曼原虫的检测，以及跟踪监测患者药物的治疗效果，有利于开展流行病学调查，预防和控制利什曼原虫的传播。

本发明所述的术语PCR是指聚合酶链式反应。

本发明所述的术语TAMRA 是指羧基四甲基罗丹明。

本发明所述的术语FAM是指羧基荧光素。

本发明所述的术语dNTPs是指三磷酸碱基脱氧核苷酸，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP等。

附图说明

图1为定量检测利什曼原虫标准品的扩增曲线图，标准品浓度从左至右依次为10⁸copies/μl，10⁷copies/μl，10⁶copies/μl，10⁵copies/μl，10⁴copies/μl，10³copies/μl，10²copies/μl，10copies/μl。

图2为定量检测利什曼原虫标准品的标准曲线图，标准曲线可准确定量的线性范围为10-10⁸>2=0.998。

图3为荧光定量PCR特异性实验的扩增曲线图，扩增曲线为阳性质粒质控样品。

图4为检测利什曼病患者外周血及骨髓的扩增曲线图，左侧扩增曲线为骨髓样本检测结果Ct=19.64，右侧扩增曲线为外周血样本检测结果Ct=28.25。

图5为检测利什曼病患者外周血及骨髓样本扩增产物电泳图，泳道1是阴性对照，泳道2是患者外周血单核细胞提取DNA，泳道3是患者骨髓提取DNA，泳道4是阳性对照，泳道M是DNA Marker；

图6为利什曼病患者骨髓涂片镜检结果，瑞士染色，×1000。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。如无特殊说明，均为常规方法。除非另行定义，文中所用的专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。

人外周血、骨髓或皮肤中利什曼原虫总DNA的提取：

1.人外周血单核细胞制备：

（1）使用EDTA抗凝管采集患者血液，室温放置30分钟以上；

（2）将外周血上下颠倒混匀，轻轻倒入装有5ml淋巴细胞分离液的液面上方，2200rpm/min，离心20min；

（3）取中间的白膜层放入新的15ml离心管，加入1640培养基上下颠倒混匀，2200rpm/min，离心10min；

（4）倒出上清，轻弹细胞，加入细胞保存液，分装保存，即为单核细胞。

2.皮肤组织预处理：

（1）取皮肤利什曼患者的皮损组织10-50mg，尽量剪成小块，加入20μl蛋白酶K和350μl组织消化液，混匀，65℃金属浴上消化3h；

（2）将步骤（1）处理好的样本溶液转移到一个新的1.5ml的离心管中，加入350μl裂解液GHL和300μl异丙醇，震荡混匀10s，再加入15μl磁珠悬浮液GH，振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min；

3.提取外周血单核细胞或骨髓或皮损组织中的总DNA：

（1）取步骤1.（4）的单核细胞样本或骨髓样本或步骤2.（2）的预处理皮损组织样本200μl，加入20μl蛋白酶K和350μl裂解液GHL，颠倒混匀，75℃金属浴上裂解30min；

（2）将步骤（1）的样品取出，加入350μl异丙醇，震荡混匀10秒；

再加入15μl磁珠悬浮液GH，振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min；

（3）将步骤（2）的样品放置于磁力架上，静置30s，吸弃上清；

（4）在步骤（3）的样品中，加入900μl缓冲液GDZ，振荡混匀2min，放置于磁力架上静置30s，吸弃上清；

（5）在步骤（4）的样品中，加入500μl缓冲液GDZ，振荡混匀2min，放置于磁力架上静置30s，吸弃上清；

（6）在步骤（5）的样品中，加入900μl漂洗液PWD，振荡混匀2min，放置于磁力架上静置30s，吸弃上清；

（7）在步骤（6）的样品中，加入300μl漂洗液PWD，振荡混匀2min，放置于磁力架上静置30s，吸弃上清，室温晾干10-15min；

（8）在步骤（7）的样品中，加入100μl洗脱缓冲液TB，振荡混匀，置于56℃，孵育10min，每3min颠倒混匀1次，每次3-5下；

（9）将步骤（8）的样品放置于磁力架上静置2min，吸取液体转移至一个新的离心管中，测定DNA含量。

实施例1 引物和探针设计

将不同的利什曼原虫动基体小环DNA序列进行比对，确定了利什曼原虫的保守区域，并将不同利什曼原虫变异位点设置为简并碱基，设计了引物和探针，引物和探针的序列如下，其引物的扩增片段长度为114bp：

引物-F：5’- TCCGGGTAGGGGCGTTCTG -3’（ SEQ ID No：1）；

引物-R：5’- TTTACACCAACCCCCAGTTTCC -3’（ SEQ ID No：2）；

探针Probe：5’-FAM- TTTGAACGGGATTTCTGCACCCAT -TAMRA-3’（ SEQ ID No：3）。

实施例2 质粒标准品的制备

1.目的片段的制备及纯化：

（1）建立PCR扩增反应体系：2×GoTaq Green Master Mix 10μl，引物-F 200nM，引物-R200nM，56ng/μl DNA样品0.5μl，无菌双蒸水补充至20μl。

（2）PCR扩增反应条件：95℃，5min；95℃ 15s，63.2℃ 15s，72℃ 30s，共35个循环；72℃ 5min，4℃∞。

（3）扩增产物回收：采用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，使用天根生物的通用性DNA纯化回收试剂盒切胶回收目的片段。

2.质粒载体的酶切及纯化：

（1）EcoRⅠ和HindⅢ酶切质粒载体pUC19线性化的酶切反应体系： HindⅢ 1ul，EcoRⅠ1ul，10×M buffer 2ul，pUC19 1μg，dH2O 14ul。

（2）酶切的反应条件：37℃ 1h。

（3）线性化pUC19质粒的回收：采用1%琼脂糖凝胶电泳检测步骤（2）酶切后的产物，使用天根生物的通用性DNA纯化回收试剂盒切胶回收线性化的pUC19质粒。

3.目的片段与线性化质粒载体pUC19的重组及转化：

（1）重组反应体系：线性化载体pUC19 50ng，目的片段8ng，2×EasyGeno Assembly Mix5μl，无菌双蒸水补充反应体系至10μl；

（2）反应条件：50℃水浴，15min；

（3）取100μl感受态细胞DH5α置于冰浴中解冻；

（4）在步骤（3）的感受态细胞DH5α悬液中加入步骤（2）的10ul重组产物，轻弹混匀，在冰浴中静置30min；

（5）将步骤（4）的样品置于42℃水浴中放置90s，然后快速转移到冰浴中，使细胞冷却3min，该过程不要摇动离心管；

（6）在步骤（5）的样品中加入350ul无菌的不含抗生素的37℃预热的SOC培养基，混匀后置于37℃摇床震荡培养45min；

（7）吸取步骤（6）的已转化的感受态细胞100ul，加到含100 μg/ml氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的平板涂布棒轻轻的将细胞均匀涂开，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16h。

4.单克隆菌株的鉴定：

（1）随机挑取步骤3.（7）中的3个单克隆菌株放入含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，并送测序；

（2）测序结果如SEQ ID No：4，SEQ ID No：5，SEQ ID No：6所示，均含有插入的119bp的目的序列，质粒构建成功。

5.质粒DNA的提取：

（1）将测序鉴定含有目的序列的菌株在含有氨苄青霉素的LB培养基中扩大培养；

（2）将步骤（1）的培养菌株12000rpm离心1min，收集菌体；

（3）在步骤（2）的样品中加入150μl溶液P1，涡旋振荡混匀；

（4）在步骤（3）的样品中加入150μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次，使菌体充分裂解；

（5）在步骤（4）的样品中加入350μl溶液P5，立即快速上下颠倒数次，充分混匀；

（6）将步骤（5）的样品12000rpm离心2min，将上清液转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心30s，倒掉废液；

（7）将步骤（6）的吸附柱CP3放入收集管中，并加入300μl漂洗液PWT，12000rpm离心30s，倒掉废液；

（8）将步骤（7）的吸附柱CP3放回收集管，12000rpm离心1min；

（9）将步骤（8）的吸附柱CP3置于一个新的离心管中，向膜的中间位置加50μl洗脱缓冲液TB，12000rpm离心30s，收集溶液，即为质粒DNA，并用NanoDrop定量。

6.质粒标准曲线的建立：

（1）稀释步骤5.（9）获得的质粒DNA浓度分别为10⁸copies/μl，10⁷copies/μl，10⁶copies/μl，10⁵copies/μl，10⁴copies/μl，10³copies/μl，10²copies/μl，10copies/μl>

（2）荧光定量PCR扩增的反应体系：引物-F 200nM、引物-R 200nM和探针Probe 100nM，1μl步骤（1）的质粒DNA，5μl的 GoTaq® Probe qPCR Master Mix，30nM的CXR referencedye，无菌双蒸水补齐至10μl；

（3）荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃2min；95℃15s，55℃15s，72℃30s，共40个反应循环。

（4）步骤（3）得到的扩增曲线和标准曲线如图1、图2所示，标准曲线的斜率为-3.38，通过公式E=10^-1/斜率-1计算得到扩增效率为E=0.98，相关系数R²=0.998,表明本发明使用的反应体系和反应条件扩增效率高，定量准确，可以准确定量的线性范围较宽。

实施例3 荧光定量PCR灵敏度实验

1.荧光定量PCR检测利什曼原虫灵敏度实验

（1）将培养得到的利什曼原虫显微镜下计数后，用正常人全血进行稀释，分别稀释为以下浓度：0.1copies/μl，0.05 copies/μl，0.025 copies/μl，0.01 copies/μl，0.005copies/μl，0.0025 copies/μl，0.001 copies/μl；

（2）将步骤（1）中含有不同浓度原虫的全血样本分别提取DNA，每个反应中分别加入0.1copies，0.05 copies，0.025 copies，0.01 copies，0.005 copies，0.0025 copies，0.001 copies的利什曼原虫模板，使用实施例2中的荧光定量PCR扩增反应体系和反应条件进行PCR扩增。

（3）实验结果如表1所示，按照实施例2中的荧光定量PCR检测方法，至少能检测利什曼原虫含量为0.001copies/μl的样品，灵敏度高。

2.荧光定量PCR检测质粒灵敏度实验

（1）将实施例2中的质粒标准品稀释成一系列低浓度样品，分别为1000copies/μl，100copies/μl，10copies/μl，1copies/μl，使用实施例2中的荧光定量PCR扩增反应体系和反应条件进行PCR扩增。

（2）实验结果如表2所示，按照实施例2中的荧光定量PCR检测方法，至少能检测质粒含量为1copies/μl的样品，检测的灵敏度高。

实施例4 荧光定量PCR特异性实验

1.应用实施例2中检测利什曼原虫荧光定量PCR反应体系及反应条件分别检测了布鲁氏杆菌，疟原虫，弓形虫，恙虫，麻风杆菌；同时，以质粒样本作为阳性质控样品。

2.实验结果如图3显示，只有阳性质粒质控样品有扩增曲线，表明与布鲁氏杆菌，疟原虫，弓形虫，恙虫和麻风杆菌均无交叉反应，只能特异性检测利什曼原虫。

实施例5 利什曼原虫试剂盒检测的建立

1.一种利什曼原虫检测试剂盒，所述试剂盒中含有以下试剂：引物-F、引物-R和探针Probe，利什曼原虫阳性对照，质粒标准品，GoTaq® Probe qPCR Master Mix ，CXRreference dye和无菌双蒸水；

引物-F、引物-R和探针Probe的序列如下：

引物-F：5’- TCCGGGTAGGGGCGTTCTG -3’（ SEQ ID NO：1）；

引物-R：5’- TTTACACCAACCCCCAGTTTCC -3’（ SEQ ID NO：2）；

探针Probe：5’-FAM- TTTGAACGGGATTTCTGCACCCAT -TAMRA-3’（ SEQ ID NO：3）。

2.所述试剂盒的使用方法如下：

以待测样品的DNA为模板，利用引物-F、引物-R和探针Probe进行荧光定量PCR扩增反应。

荧光定量PCR扩增的反应体系：引物-F200nM、引物-R200nM和探针Probe100nM，20ng模板DNA，5μl的 GoTaq® Probe qPCR Master Mix，30nM的CXR reference dye，无菌双蒸水补齐至10μl；

所述荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃2min；95℃15s，55℃15s，72℃30s，共40个反应循环。

扩增结束后，可根据标准曲线准确定量出待测样品DNA中利什曼原虫的绝对含量。

实施例6 实施例5试剂盒的批内批间精密度检测

按照实施例5试剂盒的检测方法，以患者的高、低两个不同浓度的DNA样本为模板对实施例5进行精密度评价。批内精密度：两个不同浓度的样本批内重复20次，计算批内差，用SD和CV%来表示；批间精密度：两个不同浓度的样本重复检测20次，计算批间差，用SD和CV%来表示，实验结果如表3所示。

实施例7 应用实施例5所述试剂盒对利什曼患者的外周血和骨髓进行检测

1.利什曼病患者骨髓涂片经镜检确认阳性（见图6），镜下可见少量利杜体。

2.使用该患者外周血单核细胞提取DNA、患者骨髓样本DNA分别作为模板，使用实施例5的试剂盒检测方法进行检测，检测结果如图4所示，骨髓样本Ct=19.64，经标准曲线定量为1.5×10⁶copies/μl，外周血单核细胞样本Ct=28.25，经标准曲线定量为4.0×10³copies/μl，阴性对照未检测到。

实施例8 应用实施例5所述试剂盒对皮肤利什曼患者进行检测

使用实施例5的试剂盒检测方法分别对17例利什曼患者皮损组织提取的DNA进行检测，检测结果如表4所示，17例皮损组织患者的利什曼原虫都能特异性的检出。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行一些改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京友谊医院

<120> 一种检测利什曼原虫的引物对、探针及检测方法和试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tccgggtagg ggcgttctg 19

<210> 2

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<212> DNA

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gaagcagtta ccttcggaaa agaattggta gctcttgatc c 1061

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<211> 1124

<212> DNA

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tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 960

gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 1020

taccttcgga aaaagaattg gtagctcttg atccggcaaa aaaaccaccg ctgggaacgg 1080

ggggtttttt tgtttgcaac cgcaattacc gccaaaaaaa aggt 1124

<210> 6

<211> 1131

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

acggacgtga ttctccgggt aggggcgttc tgcgaaatcc gaaaaatggg tgcagaaacc 60

ccgttcaaaa aatgctcgaa aatgccattt ttggcctccg gggcggaaaa ctgggggttg 120

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ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 300

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