基于高通量测序技术的连锁常染色体STR分型系统及试剂盒

摘要

本发明了请求保护一种基于高通量测序技术的连锁常染色体STR分型系统及试剂盒，涉及核酸体外检测技术领域。该STR分型系统包括用于扩增61、121或179个连锁常染色体STR基因座的PCR引物，该试剂盒包括PCR引物组合、Index接头序列、IGT‑EM707聚合酶混合物、扩增缓冲增强剂NB、YF缓冲液B和建库试剂等。本发明提供的STR分型系统及其试剂盒能够实现了对61、121或179个连锁常染色体STR基因座的单管扩增，平衡性好、灵敏度高、特异性好、分型结果准确，可用于鉴定同一级不同亲缘关系的复杂亲缘关系。

说明书

技术领域

本发明涉及核酸体外检测技术领域，具体涉及一种基于高通量测序技术的连锁常染色体STR分型系统及其试剂盒。

背景技术

短串联重复(short tandem repeat，STR)是由2-6bp重复单位串联组成的特殊序列，STR基因座数量大，分布广泛，约占整个基因组的3％，且多态性高，其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异，这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此，STR扩增检测技术被广泛用于法医学个体识别、亲缘鉴定和群体遗传学研究。最常用的STR分型技术是荧光标记多重扩增结合毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)的分型技术和二代测序技术。

复杂亲缘关系的鉴定是目前司法鉴定领域迫切需要解决的技术难题之一，在司法实践中多用于法律诉讼、遗产继承，大型灾难中遗骸的认领、交通事故、移民案件、以及认亲等多个领域，近年来此类案件有增多的趋势。因此这类案件鉴定的成功与否往往是取决于若干家庭的血缘关系和社会关系，不仅对法医遗传学家是巨大的挑战而且对老百姓的切身利益有重大影响。

在复杂亲缘关系鉴定中会面临半同胞与叔(姑)侄，半同胞与爷(奶)孙或者叔侄与爷孙之间这类同一级中不同亲缘关系之间鉴定的需求，但是这三类关系同属二级，通过孟德尔遗传定律推导出的Identity by decent(IBD)值和共祖系数(θ)值都是一致的，所以应用现有常用的独立遗传标记和计算方法是无法将这三种关系给区分开的。有学者提出，虽然这类同一级亲缘关系的鉴定可以通过年龄信息，以及其他DNA信息，如线粒体DNA，性染色体DNA能够辅助此类问题的判断，但是面对同一级不同亲缘关系的一般情况，连锁常染色体遗传标记可以更好的解决以上的问题。在理论研究上，1998年Thompson使用连锁遗传定律的重组率推导出了爷孙、半同胞、叔侄三者之间不同的亲缘关系系数，随着计算机技术在法医物证学领域的应用，在2008年Egeland根据Thompson得出的不同亲缘关系系数做出了使用一定数量的连锁遗传标记做出了理论计算模型。

目前关于亲缘关系鉴定的现有技术，例如：中国专利CN104818323B公开了人类13、18和21号染色体20个STR基因座的基因分型检测试剂盒，可实现了对20个STR基因座的单管扩增；中国专利CN106906292A公开了一种22个短串联重复序列复合扩增方法及其试剂盒，该试剂盒可用于扩增22个STR基因座和1个性别基因座。连锁STR研究大多数都是X-STR和Y-STR遗传标记，该类遗传标记需要特殊的亲缘关系才能应用；独立遗传的常染色体STR也不能区分复杂亲缘关系。

本发明针对连锁常染色体STR的特点，定制多重PCR靶向捕获测序的STR分型系统，STR分型系统可以一次性扩增出所有的STR遗传标记，所采用的引物组合序列平衡性好，能够保证组内所有基因座均被检出，通过二代测序以及后续的数据分析，可以得到每个STR的分型以及序列信息，可用于鉴定同一级不同亲缘关系的复杂亲缘关系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统及其试剂盒。克服了现有技术中存在的技术问题，该STR分型系统及其试剂盒能够实现了对179个连锁常染色体STR基因座的单管扩增，平衡性好、灵敏度高、特异性好、分型结果准确，可用于鉴定同一级不同亲缘关系的复杂亲缘关系。

再一方面，研究过程中发现，上述179个STR基因组能够分为彼此独立的三组，该三组STR基因座单独或两两配合构成的6种STR基因座组合均能够实现与上述179个STR基因座组成的分型系统相同、类似或等同的技术效果。

基于以上：

第一、本发明提供了一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统，所述的STR分型系统包括用于扩增60个连锁常染色体STR基因座的PCR引物组合1；

所述的60个连锁常染色体STR基因座、在参考基因组Hg38上所对应物理位置、染色体分区和遗传距离为：

；

所述的PCR引物组合1包括正向引物组和反向引物组；所述的正向引物组为：

；

所述的反向引物组为：

。

第二、本发明提供了一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统，所述的STR分型系统包括用于扩增58个连锁常染色体STR基因座的PCR引物组合2；

所述的58个连锁常染色体STR基因座、在参考基因组Hg38上所对应物理位置、染色体分区和遗传距离为：

；

所述的PCR引物组合2包括正向引物组和反向引物组；

所述的正向引物组为：

；

所述的反向引物组为：

。

第三、本发明提供了一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统，所述的STR分型系统包括用于扩增61个连锁常染色体STR基因座的PCR引物组合3；

所述的61个连锁常染色体STR基因座、在参考基因组Hg38上所对应物理位置、染色体分区和遗传距离为：

；

所述的PCR引物组合2包括正向引物组和反向引物组；

所述的正向引物组为：

；

所述的反向引物组为：

。

第四、本发明提供了一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统，所述的STR分型系统包括用于扩增118个连锁常染色体STR基因座的PCR引物组合4；所述的118个连锁常染色体STR基因座为本发明说明书记载中STR位点序号为1-118的STR基因座；所述的PCR引物组合4为用于扩增本发明说明书记载中STR位点序号为1-118的STR基因座的正向和反向引物组合，具体由引物组合1和2组成。

第五、本发明提供了一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统，所述的STR分型系统包括用于扩增121个连锁常染色体STR基因座的PCR引物组合5；所述的121个连锁常染色体STR基因座为本发明说明书记载中STR位点序号为1-60和119-179的STR基因座；所述的PCR引物组合5为用于扩增本发明说明书记载中STR位点序号为1-60和119-179的STR基因座的正向和反向引物组合，具体由引物组合1和3组成。

第六、本发明提供了一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统，所述的STR分型系统包括用于扩增119个连锁常染色体STR基因座的PCR引物组合6；所述的119个连锁常染色体STR基因座为本发明说明书记载中STR位点序号为61-179的STR基因座；所述的PCR引物组合6为用于扩增本发明说明书记载中STR位点序号为61-179的STR基因座的正向和反向引物组合，具体由引物组合2和3组成。

第七、本发明提供了一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统，所述的STR分型系统包括用于扩增179个连锁常染色体STR基因座的PCR引物组合7；所述的179个连锁常染色体STR基因座为本发明说明书记载中STR位点序号为1-179的STR基因座；所述的PCR引物组合7为用于扩增本发明说明书记载中STR位点序号为1-179的STR基因座的正向和反向引物组合，具体由引物组合1、2和3组成。

为更直观体现本发明技术方案，将以上第一到七所述技术方案要点总结如下：

第八、本发明提供了一种用于复杂亲缘关系鉴定的试剂盒，所述的试剂盒包括本发明说明书中记载的PCR引物组合1、2、3、4、5、6或7。

所述的引物组合中，正反引物浓度均是0.1μM。

进一步，所述的试剂盒还包括Index接头序列和DNA聚合酶；

进一步优选地，所述的Index接头序列包括IGT-I5Index和IGT-I7Index，工作液浓度均为10μM。

Index接头序列是illumina测序平台所通用得接头序列，用作样本间的区分。

优选地，所述的试剂盒还包括将基因组DNA制成可供测序的文库的试剂。

本发明另一方面还提供了一种复杂亲缘关系鉴定的方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)提取人基因组DNA，定量基因组DNA浓度为1-20ng/μL；

(2)多重PCR文库构建：

A.经第一轮多重PCR反应、第一轮磁珠纯化，得到纯化后的多重PCR产物；

B.以纯化后的多重PCR产物为模板，进行第二轮多重PCR反应，插入Index接头序列，经第二轮磁珠纯化，得到多重PCR文库；

C.对得到的多重PCR文库进行定量和质量检测；

(3)对步骤(2)得到的多重PCR文库进行测序和数据分析，得到每个个体对应的STR分型结果和法医学参数。

进一步优选地，基因组DNA浓度为10-20ng/μL。

所述的STR分型系统和试剂盒适用于所有包含DNA的检材，包括但不限于血液、精斑、毛发、骨骼、皮肤、实体组织等。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

(1)本发明所提供的一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统及其试剂盒，能够同时一次性检测60、58、61、118、121、119或179个连锁常染色体STR基因座，在建立多重PCR扩增体系过程中，随着所检测STR基因座个数的增加，各对引物间的相互干扰也会增加，本发明通过优化的设计，实现了对上述各种数量的STR连锁常染色体STR基因座的单管扩增，STR分型系统及其试剂盒平衡性好。

(2)现有技术中，独立遗传的常染色体STR和性染色体连锁的STR遗传标记，均不能鉴定例如半同胞与叔(姑)侄，半同胞与爷(奶)孙或者叔侄与爷孙之间这类同一级不同亲缘关系的复杂亲缘关系。而本发明提供的STR分型系统及其试剂盒是针对连锁常染色体STR的特点，可用于这类鉴定复杂亲缘关系，且鉴定结果准确。

(3)本发明提供的STR分型系统及其试剂盒，采用两轮PCR反应进行文库构建，具有文库构建周期短，比对率高，捕获效率好，重复性好，操作简便等诸多优点，检测结果的灵敏度高，特异性好，分型结果准确，可一次性有效扩增60、58、61、118、121、119或179个连锁常染色体STR基因座。

应当明确的是，在本发明公开了所记载的全部179个STR基因座及其相应扩增的正向引物和反向引物的基础上，本领域技术人员能够根据本发明所公开的内容，合理预期：采用本发明所记载的179个STR位点中的任意具有遗传检测效能数量的搭配组合、或相应正向和反向引物的搭配组合构成的技术方案，均能够获得与本发明等同或类似的技术效果。所述的任意具有遗传检测效能数量具体可以为3-179之间的任一整数。因此，通过本段内容记载方式获得的技术方案均在本发明的技术延伸、保护范围以及侵权范围内。

附图说明

图1为利用实施例1公开的引物组合制备的文库的质检峰图。

图2为利用实施例2公开的引物组合制备的文库的质检峰图。

图3为利用实施例3公开的引物组合制备的文库的质检峰图。

图4为利用实施例4公开的引物组合制备的文库的质检峰图。

图5为利用实施例5公开的引物组合制备的文库的质检峰图。

图6为利用实施例6公开的引物组合制备的文库的质检峰图。

图7为利用实施例7公开的引物组合制备的文库的质检峰图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1：一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统及其试剂盒

1.1常染色体连锁STR基因座构成及特性：

(1)本实施例中的STR分型系统包含以下60个STR基因座：

D1S2131、D1S3721、D1S2130、D1S1600、D1S1653、D1S1660、D1S3732、D2S1364、D2S2734、D2S1396、D2S428、D2S435、D2S1387、D2S1792、D2S1399、D2S2959、D3S2431、D3S4547、D4S1643、D4S2408、D4S3326、D4S2368、D5S2845、D5S1473、D5S813、D5S1716、D5S1459、D5S1487、D5S1466、D5S2496、D5S2501、D6S1019、D6S2417、D6S2412、D6S1284、D7S1820、D7S3050、D7S821、D8S594、D8S1468、D8S2322、D8S569、D8S1475、D9S746、D9S319、D9S2149、D11S2010、D11S1392、D12S376、D12S1052、D13S317、D13S790、D14S1432、D14S1428、D15S644、D15S1507、D16S752、D16S485、D20S481和D20S1151；

其具有如下可测特性：

1)核心区重复单位为四核苷酸；

2)每个STR的杂合度大于0.6；

3)每组包含的STR数至少为两个且其遗传距离小于3cM；

4)每个STR都有DXSXX的命名。

(2)用于同时扩增本实施例中的60个STR基因座的引物组合1为：

表1：引物组合1的正向引物组

。

表2：引物组合1的反向引物组

。

(3)本实施例中正向引物的工作浓度为0.1μM；反向引物的工作浓度为0.1μM。

1.2一种用于复杂亲缘关系鉴定的试剂盒：

包括上述的PCR引物组合1、Index接头序列、IGT-EM707聚合酶混合物。

所述的Index接头序列包括IGT-I5Index和IGT-I7Index，工作液浓度均为10μM。

Index接头序列为：IGT-I7index艾吉泰康的I7端接头序列，浓度为10μM；一个包含96个，接头序列信息如下表

IGT-I5Index艾吉泰康的I5端接头序列，工作浓度为10μM；一个包含4个,接头序列信息如下表

注：接头序列是illumina测序平台所通用得接头序列，用作样本间的区分

实施例2：一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统及其试剂盒

2.1常染色体连锁STR基因座构成及特性：

(1)本实施例中的STR分型系统包含以下58个STR基因座：

D1S3736、D1S1665、D1S2127、D1S2138、D1S1642、D1S518、D1S1604、D1S3729、D1S3727、D2S1336、D2S1779、D2S1771、D2S437、D2S2970、D2S2944、D2S1327、D3S2402、D3S1766、D4S2411、D4S3351、D4S243、D4S2426、D4S2373、D5S1490、D5S2856、D5S2495、D5S2855、D5S1722、D5S1725、D6S1048、D6S1275、D7S796、D7S1799、D8S2324、D8S2330、D8S1144、D9S745、D9S301、D9S1124、D10S1246、D10S2485、D11S1983、D11S2363、D11S1368、D12S393、D12S1063、D13S1807、D13S1492、D14S738、D14S301、D14S583、D15S816、D15S1514、D18S872、D18S972、D18S548、D20S1145、D20S477；

其具有如下可测特性：

1)核心区重复单位为四核苷酸；

2)每个STR的杂合度大于0.6；

3)每组包含的STR数至少为两个且其遗传距离小于3cM；

4)每个STR都有DXSXX的命名。

(2)用于同时扩增本实施例中的58个STR基因座的引物组合2为：

表3：引物组合2的正向引物组

；

表4：引物组合2的反向引物组

(3)本实施例中正向引物的工作浓度为0.1μM；反向引物的工作浓度为0.1μM。

2.2一种用于复杂亲缘关系鉴定的试剂盒：

与实施例1的区别仅在于，所用的PCR引物组合为引物组合2。

实施例3：一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统及其试剂盒

3.1常染色体连锁STR基因座构成及特性：

(1)本实施例中的STR分型系统包含以下61个STR基因座：

D1S532、D1S1611、D1S3733、D1S533、D1S1614、D2S2977、D2S1374、D2S1394、D2S2966、D2S2969、D2S1371、D2S434、D2S1338、D3S4016、D3S2388、D4S1626、D4S1653、D5S2858、D5S2796、D5S1463、D5S815、D5S2499、D5S2498、D6S1043、D6S1274、D6S1056、D6S1013、D6S1054、D7S820、D7S2205、D7S3071、D7S2845、D8S2326、D8S1464、D8S2320、D8S1470、D8S588、D8S1471、D9S2026、D9S747、D9S2128、D10S2469、D10S1238、D11S4464、D11S4958、D13S1818、D13S767、D14S615、D14S608、D14S597、D14S302、D14S749、D16S767、D16S3393、D18S537、D18S875、D18S1367、D20S1152、D20S206、D20S607、D20S1146；

其具有如下可测特性：

1)核心区重复单位为四核苷酸；

2)每个STR的杂合度大于0.6；

3)每组包含的STR数至少为两个且其遗传距离小于3cM；

4)每个STR都有DXSXX的命名。

(2)用于同时扩增本实施例中的61个STR基因座的引物组合3为：

表5：引物组合3的正向引物组

；

表6：引物组合3的反向引物组

。

(3)本实施例中正向引物的工作浓度为0.1μM；反向引物的工作浓度为0.1μM。

3.2一种用于复杂亲缘关系鉴定的试剂盒：

与实施例1的区别仅在于，所用的PCR引物组合为引物组合3。

实施例4：一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统及其试剂盒

4.1常染色体连锁STR基因座构成及特性：

(1)本实施例中的STR分型系统包含118个STR基因座，具体包括实施例1所述的60个STR基因座和实施例2所述的58个STR基因座。

其具有如下可测特性：

1)核心区重复单位为四核苷酸；

2)每个STR的杂合度大于0.6；

3)每组包含的STR数至少为两个且其遗传距离小于3cM；

4)每个STR都有DXSXX的命名。

(2)用于同时扩增本实施例中的118个STR基因座的引物组合4为实施例1和实施例2中的引物组合构成的组合。

(3)本实施例中正向引物的工作浓度为0.1μM；反向引物的工作浓度为0.1μM。

4.2一种用于复杂亲缘关系鉴定的试剂盒：

与实施例1的区别仅在于，所用的PCR引物组合为引物组合4。

实施例5：一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统及其试剂盒

5.1常染色体连锁STR基因座构成及特性：

(1)本实施例中的STR分型系统包含121个STR基因座，具体包括实施例1所述的60个STR基因座和实施例3所述的61个STR基因座。

其具有如下可测特性：

1)核心区重复单位为四核苷酸；

2)每个STR的杂合度大于0.6；

3)每组包含的STR数至少为两个且其遗传距离小于3cM；

4)每个STR都有DXSXX的命名。

(2)用于同时扩增本实施例中的121个STR基因座的引物组合5为实施例1和实施例3中的引物组合构成的组合。

(3)本实施例中正向引物的工作浓度为0.1μM；反向引物的工作浓度为0.1μM。

5.2一种用于复杂亲缘关系鉴定的试剂盒：

与实施例1的区别仅在于，所用的PCR引物组合为引物组合5。

实施例6：一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统及其试剂盒

6.1常染色体连锁STR基因座构成及特性：

(1)本实施例中的STR分型系统包含119个STR基因座，具体包括实施例2所述的58个STR基因座和实施例3所述的61个STR基因座。

其具有如下可测特性：

1)核心区重复单位为四核苷酸；

2)每个STR的杂合度大于0.6；

3)每组包含的STR数至少为两个且其遗传距离小于3cM；

4)每个STR都有DXSXX的命名。

(2)用于同时扩增本实施例中的119个STR基因座的引物组合6为实施例3和实施例2中的引物组合构成的组合。

(3)本实施例中正向引物的工作浓度为0.1μM；反向引物的工作浓度为0.1μM。

6.2一种用于复杂亲缘关系鉴定的试剂盒：

与实施例1的区别仅在于，所用的PCR引物组合为引物组合6。

实施例7：一种用于复杂亲缘关系鉴定的STR分型系统

7.1常染色体连锁STR基因座构成及特性：

(1)本实施例中的STR分型系统包含179个STR基因座，具体包括实施例1所述的60个STR基因座、实施例2所述的58个STR基因座和实施例3所述的61个STR基因座。

其具有如下可测特性：

1)核心区重复单位为四核苷酸；

2)每个STR的杂合度大于0.6；

3)每组包含的STR数至少为两个且其遗传距离小于3cM；

4)每个STR都有DXSXX的命名。

(2)用于同时扩增本实施例中的179个STR基因座的引物组合7为实施例1、实施例3和实施例2中的引物组合构成的组合。

(3)本实施例中正向引物的工作浓度为0.1μM；反向引物的工作浓度为0.1μM。

7.2一种用于复杂亲缘关系鉴定的试剂盒：

与实施例1的区别仅在于，所用的PCR引物组合为引物组合7。

实验例

下述实验例中，所使用的试剂均为合法市售途径可获得，其获得渠道如下：

组织、血液DNA提取试剂盒：购自北京天根生化科技有限公司；货号为：DP304-03；

QIAamp DNA Investigator Kit(50)：购自德国凯杰公司；货号为：5650；

Enhancer buffer NB(1N)：购自艾吉泰康公司名称为NB的PCR反应增强剂；货号为：MT017035

IGT-EM707polymerase mixture：购自艾吉泰康公司，名称为EM707的DNA聚合酶混合液；货号为：MT017035；

YF Buffer B：购自艾吉泰康名称为YF的磁珠漂洗缓冲液；货号为：MT017035；

上述试剂为北京艾基泰康公司(iGeneTech^TM)所定制合成，货号为：MT017035

引物或Index序列：均委托北京艾基泰康公司(iGeneTech^TM)所定制合成；

1、检测样本：108个北京汉族无关个体样本，包括48个血液样本和60个FTA血卡。

2、检测对象：分别采用实施例1-7所述的分型系统或试剂盒，针对检测样本按照检测流程进行检测。

3、检测流程：

(1)血液样本、FTA血卡分别采用北京天根生化科技有限公司的组织、血液DNA提取试剂盒和德国凯杰(QIAGEN)公司的QIAamp DNA Investigator Kit(50)提取全基因组DNA。使用核酸定量仪进行浓度测定，定量基因组DNA浓度为1、5、10、20ng/μL。

(2)多重PCR文库构建：

使用上述1、5、10、20ng/μL的基因组DNA进行文库构建，文库编号分别为F01、F02、F03和F04。

A.第一轮多重PCR反应：按照表7配制反应混合液，每管25μL，按照表8的反应条件进行多重PCR反应，得到多重PCR产物；其中所述的Primer pool在不同的检测试验中分别指实施例1-7中的引物组合；

表7：第一轮多重PCR反应体系

试剂体积(μL)双蒸水4Enhancer buffer NB(1N)7引物组合8基因组DNA1IGT-EM707polymerase mixture5

表8：第一轮多重PCR反应的条件

第一轮磁珠纯化：

向25μL多重PCR产物加入23μL室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次，室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min，彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，加入40μL YF buffer B(磁珠漂洗缓冲液)用移液器吸打混匀数次，室温孵育5min，移除上清，加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s，移除上清，加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清，室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发，加入24μL Nuclease-free water(无核酸酶水)或者1×TE buffer(pH 8.0)，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min，将PCR管重新置于磁力架上静置3min，用移液器吸取上清液，转移到新的PCR管内，管内上清液为纯化后的多重PCR产物。

B.第二轮多重PCR反应：以步骤A得到的纯化后的多重PCR产物为模板，进行第二轮多重PCR反应，插入Index接头序列，第二轮多重PCR反应体系如表9所示，反应条件如表10所示；

表9：第二轮多重PCR反应体系

试剂体积(μL)纯化后的多重PCR产物18IGT-I5Index(10μM)1IGT-I7Index(10μM)1IGT-EM707polymerase mixture5

表10：第二轮多重PCR反应条件

第二轮磁珠纯化：

具体操作与第一轮磁珠纯化步骤相同，最后一步转移到新的PCR管中的上清为制备好的多重PCR文库。

C.对得到的多重PCR文库进行定量和质量检测：

取1μL步骤B得到的多重PCR文库，使用核酸定量仪进行文库浓度测定，记录文库浓度；

取1μL步骤B得到的多重PCR文库，使用全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度检测，正常文库的靶片段分布区间为300bp-450bp，主峰在339bp左右。文库检测结果如表11和图1所示。

(3)对步骤(2)得到的多重PCR文库进行二代测序，对测序得到的fastq文件使用FASTQC软件进行质量控制，然后用Trimmomatic软件对数据进行过滤，修剪低于Q30的序列，去除测序片段低于100bp的序列，然后将质控过后的fastq文件用STRaitRazor3.0对STR的分型，最后将得到每个个体所对应的STR分型文件。

4、检测结果：

(1)、利用实施例1-7公开的分型系统及试剂盒能够准确针对108个样本实现分型和亲缘关系鉴定。

(2)、利用实施例1-7公开的引物组合制备的文库的质检峰图分别如图1-7所示：表明本发明提供的7个STR分型系统及其试剂盒均能够一次性、同时扩增上述60、58、61、118、121、119或179个STR基因座，且平衡性好，引物特异性好、灵敏度高，可有效检测浓度低至1ng/μL的gDNA。

(3)、利用实施例1-7公开的分型系统及试剂盒针对108个样本均能够得到有效分型信息，为合理简化申请文件，现列举其中3个样本的分型信息：

分析软件：STRait Razor 3.0软件

表格解释：以下空白格代表该样本的该位点为纯合子，两种分型代表杂合子；每个分型后面的样本reads数代表使用STRait Razor 3.0的配置文件所得到得该位点所对应分型的覆盖度。

实施例1中的STR位点在3个样本中的分型结果信息如下：

实施例2中的STR位点在3个样本中的分型结果信息如下：

实施例3中的STR位点在3个样本中的分型结果信息如下：

实施例4对上述3个样本的分型结果等同于实施例1和实施例2的结果合并；实施例5对上述3个样本的分型结果等同于实施例1和实施例3的结果合并；实施例6对上述3个样本的分型结果等同于实施例2和实施例3的结果合并；实施例7对上述3个样本的分型结果等同于实施例1、实施例2和实施例3的结果合并；为避免赘述，在此不再重复放置表格。

(4)、分型效能：

实施例1-7公开的分型系统及试剂盒中分别包含的60、58、61、118、121、119、179个STR位点的法医学参数如下：

分析工具：STRAF 1.0.5:(STR Analysis for Forensics)；

分析数据来源：上述108个北京汉族无关个体样本的分型结果信息；

表格解释：Locus表示STR基因座的名字；N表示等位基因数目，共108个北京汉族无关个体，因此每个STR遗传标记有216个等位基因；Nall表示各基因座分型的总数，分型的范围为5-19；GD(Genetic diversity，遗传多态性)，其范围为0.4911-0.9013之间；PIC(Polymorphism Information Content，多态性信息含量)，其范围为0.4368-0.8880之间；PM(match probability，匹配概率)，其范围在0.0297-0.5111之间；PD(power ofdiscrimination，个人识别概率)，其范围在0.4889-0.9703之间。

(5)、文库浓度：

gDNA起始量在1ng和5ng时RFU(荧光信号强度)值稍有偏低，但均为正常主峰，当gDNA起始量在10ng和20ng时不仅文库主要为正常主峰而且RFU值更好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。